Marine Mikrobiologie II

Transkript

1 Marine Mikrobiologie II Welche Arten dominieren das Ökosystem? Größenklassen, Arten Wie analysiert man die Populationen? Welche Leistungen sind nachweisbar? Aktivitäten Wachstumsraten Wodurch sind die Aktivitäten und Wachstum limitiert? Wie mißt man die Leistungen?

2 Die wichtigsten Gruppen: Größenklassen von Mikroben im Meerwasser Mesoplankton mm Microplankton µm Nanoplankton 2-20 µm Picoplankton µm Femtoplankton µm Phytoplankton Diatomeen Dinoflagellaten Mikroflagellaten Cyanobakterien Bakterioplankton Bakterien meist 0.03 bis 0.4 µm klein Zooplankton heterotrophe Nanoflagellaten Copepoden Wie analysiert man die Populationen? Phytoplankton (> Picopl.) im Mikroskop (Morphologie, Autofluoreszenz) Pigmente (Satelitenbilder, HPLC, Flowcytometrie) Bakterien: Kultivierung (MPN), Molekularbiologie (FISH, DGGE)

3 Verteilung von Chlorophyll im Ozean

4 UV Wind Oberfläche Bakterien Synechococcus Flowcytometrie Viren Mikrozooplankton Thermocline Prochlorococcus Picoeucaryoten NO 3 PO 4 Fe 20 m 80 m 150 m Chlorophyll FL3-Height Picoeucaryotes Synechococcus Prochlorococcus SSC-Height Abbildungen: Station Biologique de Roscoff CNRS and Université Pierre et Marie Curie, France Analyse von Bakteriengemeinschaften Kultivierung: MPN-Methode A B C Anreicherung D E F G H Kontrolle Parallele 1 Parallele 2 Parallele Ilsolierung Identifizierung

5 Welche Aktivitäten zeigen Mikroorganismen? Phytoplankton: Produktion im Mittel 68.7 g C org m 2 a -1 (etwa 1 Tafel Schokolade) Zooplankton: Freßraten von Flagellaten: Bakterien h -1 Bakterien: Ekto-, Exoenzyme, zersetzen Detrituspartikel und Polymere Merke: Bakterien haben keine Zähne! ingestierte Partikel werden stets osmotroph aufgenommen das ganze Gewässer dient als Nahrungsvakuole der Bakterien Effektive Aufnahme von N, P, Fe Welche Wachstumsraten zeigen Mikroorganismen? Phytoplankton abhängig von Jahreszeit, N, P Fe, Licht etc. (Temp.?) Bakterien Verdopplungszeit von 1-20 d Wodurch sind die Aktivitäen und Wachstum limitiert? Nicht grundsätzlich durch Licht, Temperatur, CO 2 Meist durch Nährstoffe: Fe > N > P > (Mn) (Si)

6 Wie mißt man die Aktivitäten, Probleme??? System ist im Fließgleichgewicht (Es tut sich fast nichts) Erhebliche Veränderung der Situation durch: Div. Kontrollen Substratzusatz Ausschluß von Größenklassen oder Licht etc. => Tracer in Spurenkonzentrationen am besten geeignet Wie mißt man die Aktivitäten? Messung von Primäproduktion: 14 CO 2 -Fixierung im Licht (minus Dunkelkontrolle) O 2 -Freisetzung (minus Dunkelkontrolle) Messung von Bakterienwachstum: 3 H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA) Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin) 35 S-SO 4 2- Assimilation ATP-Zunahme Messung von mikrobiellen Abbauvorgängen: CO 2 -Freisetzung O 2 -Aufnahme Umsatz von Modellsubstraten MUF (Methylumbelliferyl-Rest fluoresziert nach Abspaltung durch (Exo)-Enzym) Bestimmung des "Heterotrophen Potentials durch Einbau von zugesetzten markierten Substraten

7 Molekularbiologische Analyse von Bakteriengemeinschaften Die prokaryontisch 16S rrna - in allen lebenden Organismen vorhanden - hohe Kopienzahl - ausreichend lang (16S rdna: ca bp), V5 V6 V7 V8 - Mutation hat oft letale Wirkung - von Umweltbedingungen unabhängiger (konstanter) Selektionsdruck - Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert - Vergleich analoger, variablerer Sequenzabschnitte Die Evolution des Moleküls spiegelt die ihrer Träger wider ( molekulare Uhr ) 5 V9 V3 3 V1 absolut konserviert hoch variabel V2 E. coli, aber nicht in > 75% aller Bakterien Yves Van de Peer (1996), modifiziert Molekularbiologie: Analyse von Bakteriengemeinschaften (TGGE / DGGE) - Aufbau TGGE Elektrophorese % Trennprinzip DGGE / TGGE PCR-Produkt Doppelstrang [ C] T 1 T T 2 [cm] Linearer thermischer Gradient 70 % + Teilweise geschmolzen Einzelstränge Denaturierender Gradient parallel zur Elektrophoreserichtung

8 Schematischer Verlauf einer TGGE - Bakterien Reinkulturen Bakterien Gemeinschaften Elektrophorese + Temperatur-Gradient Fingerprinting von Bakteriengemeinschaften Umwelt-Probe Extraktion Sequenzierung 16S rdna/rrna Sequenzen PCR Nukleinsäuren DNA / RNA rt-pcr 16S rdna / rrna der Bakteriengemeinschaft Bildanalyse Digitalisierung DGGE TGGE Phylogenetische Zuordnung Fingerprints der Bakteriengemeinschaft Clusteranalyse