Einführung in die Mikrobielle Ökologie

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1 Einführung in die Mikrobielle Ökologie Zellzahl 2 Artenvielfalt Bakterien auf unserer Haut pro cm 2 = pro ( x ) µm 2 = 1 pro 100 x 100 µm 2 Biofilm auf Heuaufguss 1

2 Abstand der Bakterien im Wasser voneinander 10 6 Bakterien cm -3 = 10 3 Bakerien mm -3 1 mm 1 mm 1 mm bei gleichmäßiger Verteilung >0.1 mm Bakterien im Wasser unter dem Mikroskop pro ml = pro 20 µl unter einem Deckglas von 20 x 20 mm oder µm 2 = 2 pro Gesichtsfeld von 200 x 200 µm 2

3 Bestimmung der Zellzahl Gesamtzellzahl (total count): Alle Zellen Problem: Prokaryoten-Zellen erkennen Lebendzellzahl (live count): Zellen, die auf Agar oder in einer Flüssigkultur wachsen Problem: Wachstumsbedingungen Bestimmung der Gesamtzellzahl Wikipedia Zählkammer geeignet für Reinkultur, Blutkörperchen 3

4 Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe 2-5 ml einer Wasserprobe mit Bakterien werden in einem Reagenzglas mit ca. 200 µl einer partikelfreien 0.1% Acridinorange-Lösung 2 min lang gefärbt und dann durch ein mit Irgalanschwarzlösung (0.1%) vorgefärbtes 0.2 µm Nuclepore- Filter abfiltriert. Als Unterlage kommt auf den Filteruntersatz ein Cellulosemembranfilter. Das Nucleporefilter wird dann auf einem Objektträger getrocknet, mit einem fluoreszenzfreien Immersionsöl (z.b. Siliconöl) versehen und mit einem Deckglas bedeckt. Die Probe wird bei fluoreszenzfreier Ölimmersion unter dem Epifluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung betrachtet. Es werden pro Filter 10 Zählquadrate ausgezählt. Die Probenmenge sollte so gewählt sein, dass pro Zählquadrat ca Bakterien sichtbar sind. Bakterium auf Nuclepore- Filter, Raster-Elektronenmikroskopische Aufnahme (Henrik Sass) Hobbie, JE, Daley, RJ, Jasper, S. (1977) Use of Nuclepore filters for counting bacteria by epifluorescence microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 33: Prinzip: Spezifische Anfärbung von Nukleinsäuren, heute mit verschiedenen Farbstoffen, z.b. Acridinorange, DAPI, SybrGreen Fluoreszenzfarbstoffe für Nukleinsäuren Sediment, Phasenkontrast Acridinorange DAPI SybrGreen 4

5 The most-boring job... 1/5 5/5 Stacked CountThem Wo sind die Prokaryoten? Number of prokaryotes on Earth 4-6 * Cells in open ocean 1.2 * in marine sediments 3.5 * in soil 2.6 * sub-terrestrial * Annual production of cells a -1 Mean generation time in sediments 1-2 * 10 3 a Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ (1998) Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci USA 95:

6 Wo sind die Prokaryoten? Sediment depth (m) Prokaryoten in Pazifik- Sedimenten (ODP Leg 201, Barry Cragg) Bis 1600 m unter dem Meeresboden lebende Zellen nachgewiesen Viele Zellen sind tot Teaching... Courses... Ecophysiology of Anaerobes Methods Script 6

7 Bestimmung der Zellzahl Lebendzellzahl Problem: Oft wachsen nur % der lebenden Zellen zu zählbaren Kulturen heran Für Krankheitserreger und Indikator-Organismen gibt es erfolgreiche Verfahren Lebendzellzahl-Bestimmung Sebastian Herrmann 7

8 Lebendzellzahl-Bestimmung Beimpfung einer Mikrotiter-Platte unter Schutzgas-Atmosphäre Most Probable Number (MPN) Tafel zur statistischen Bestimmung der Lebendzellzahl aus drei Parallelen mit drei Verdünnungsstufen (American Health Association) 8

9 Reinkultur -> Vereinzelung von Zellen -> Kolonien mehrfach erneut ausstreichen -> Reinkultur = Abkömmlinge einer Zelle = Klon (mit Stammbezeichnung) Cyanobakterien- und Algenkulturen oft nicht axenisch, d.h. sie enthalten Begleitbakterien Mit wem haben wir es eigentlich zu tun? Taxonomie Ziel: System mit Übereinstimmung zur natürlichen Verwandtschaft, der Phylogenie vgl. Stamm bei Tieren 9

10 Was ist eine Art? Bei sexueller Fortpflanzung: Fortpflanzungemeinschaft, die fruchtbare Nachkommen erzeugt Bei Prokaryoten: Art anhand von diversen Merkmalen operationell definiert, heute zunehmend auf der Basis der 16 S rrna Taxonomie Taxonomie ist ein wichtiger Bestandteil der 'Autökologie' der Organismen Sollwerte für die Übereinstimmung innerhalb einer Art 95 % 70 % 98 % 10

11 Charakterisierung von Reinkulturen Physiologische Eigenschaften von Bakterien aus dem Stechlin-See (Henrik Sass) Artenvielfalt Wann wurde der Elefant entdeckt? 11

12 Wann wurde das größte Bakterium der Welt entdeckt? Mikrobiologisches Kolloquium am Das am besten untersuchte Molekül der Welt Struktur der 16 S-rRNA zweidimensional 12

13 Eignung der ribosomalen RNA für phylogenetische Analysen Ribosomen in jeder Zelle vorhanden (bis zu ), Einsatz von RNA-Sonden (Fluoreszenz-in situ-hybridisierung, FISH) Gen für rrna (rdna) 1x (manchmal mehrfach) vorhanden Elementare komplizierte Funktion erlaubt kaum grundlegende Mutationen. Andererseits wird durch einen Basenaustausch nicht eine Aminosäure eine Proteins verändert RNA lang genug für ausreichend Variationsmöglichkeiten, streng konservierte, variable und hypervariable Bereiche, erlaubt Analyse und Sondeneinsatz für weitläufig und näher verwandte Arten (diverse andere 'Fingerprint'-Techniken für sehr eng Verwandte) Langsame Evolution 'Molekulares Chronometer', je weniger Sequenzübereinstimmung, desto früher getrennte Entwicklung Phylogenetischer Stammbaum aller Lebewesen Wikipedia 13

14 Mundschleimhautzelle einer gesunden Oldenburger Studentin - Oberfläche 14

15 Wieviele Prokaryoten-Arten gibt es? Prokaryoten Eukaryoten Beschrieben (2008): ~ Mio Geschätzt (2008): Millionen Mio Anzahl der Arten in 30 g Waldboden (Reassoziationskinetik von DNA) Torsvik V, Goksoyr J, Daae FL (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl. Env. Microbiol. 56: Dykhuizen DE (1998) Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of bacteria? Antonie van Leeuwenhoek 73: : Sequenzen der 16 S-rRNA bestimmt Einige Arten global verbreitet, sehr viele sehr selten: Rare Biosphere (Microbial diversity in the deep sea and the underexplored "rare biosphere", Sogin et al., PNAS 2006) PCR PCR-Maschine (Thermocycler) 15

16 Prinzip der Polymerase Chain Reaction DNA-Doppelstrang 94 C Denaturierung - Schmelzen der DNA C Annealing - Primeranlagerung Kary B. Mullis, C Elongation - Kettenverlängerung n Analyse von Umweltproben basierend auf rrna Statt zu klonieren kann man oft auch mit PCR amplifizieren 16

17 Denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese, DGGE Isolates Sediment depth (mm) Isolates Vergleich von amplifizierten 16 S rrna-banden von Reinkulturen und Sediment (0-10 mm) aus Schiermonnikoog durch DGGE Elze Wieringa DGGE trennt nach Unterschieden der Sequenz, ohne dass man die kennen muss Bereits im obersten Zentimeter eines Sediment lassen sich verschiedene Bakterienarten in verschiedenen Schichten nachweisen. Molekularbiologische Ansätze (Auswahl) 16 S-rRNA: Ribosomen (FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) oder Gen der rrna (-> PCR) Gene, die Schlüsselenzyme codieren: z.b. Sulfitredukase von Sulfatreduzierern, Ammonium- Monooxygenase von Nitrifikanten etc. Metagenomik: Analyse des gesamten Genoms von einem Standort und Suche nach Schlüsselgenen und deren Nachbarn Messenger-RNA als Indikator für aktuell gebildete Enzyme Kombination mit Aktivitätsindikatoren: z.b. Stable-Isotope-Probing oder Autoradiographie 17

18 FISH Fluoreszenzin situ- Hybridisierung Nevskia ramosa Anaerobes methanoxidierendes Konsortium aus methanogenen Archaeen (rot) und sulfatreduzierenden Bakterien (grün) Boetius, A. et al.( 2000) A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407: Shallow versus deep biosphere Compiled by Bert Engelen Reinhard Wilms et al. (2007) Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are reflected by the distribution of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea. FEMS Microbiol Ecol 59: