Grün fluoreszierendes Protein (GFP) Entwicklungen bei den Fluoreszenzmarkern

Transkript

1 Grün fluoreszierendes Protein (GFP) Entwicklungen bei den Fluoreszenzmarkern Tilman Kottke Physikalische und Biophysikalische Chemie Universität Bielefeld Folien im Internet auf der Homepage der Physikalischen Chemie III

2 Grundlagen zur Fluoreszenz Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) Neuere Entwicklungen

3 Jablonski-Termschema Energie Schwingungsenergieniveaus elektronisch angeregter Zustand elektronischer Grundzustand Schwingungsenergieniveaus r GG Kernabstand nach Atkins (1990) Physikalische Chemie

4 Jablonski-Termschema Energie Eigenschaften der Fluoreszenz von Molekülen: - niedriger in Energie als Absorption (Stokes-Shift) - verzögert gegenüber Absorption - Schwingungsstruktur des elektronischen Grundzustands - erfolgt spontan Intensität der Fluoreszenz hängt ab von: - eingestrahlte Anzahl an Photonen - Franck-Condon-Faktor der Anregung Extinktionskoeffizient - Geschwindigkeit von Konkurrenzprozessen r GG Kernabstand

5 Konkurrenzprozess: Quenchen durch Stöße Moore und Hummel (1983) Physikalische Chemie Fluoreszenz-Quantenausbeute von NO 2 in Abhängigkeit vom Druck Löschung: M* + Q M + Q + kinetische Energie M*: angeregtes NO 2 Q: Quencher, NO 2 im Grundzustand

6 Fluoreszenz-Quantenausbeute Φ F Fluoreszenz: M* M + hν k 1 : natürliche Geschwindigkeitskonstante Löschung: M* + Q k 1 k 2 d[ M*] dt M + Q + kinetische Energie Geschwindigkeitsgesetz: = k1[ M*] k2[ M*][ Q] φ F = k 1 k1[ M*] [ M*] k [ M*][ Q] 2 = k 1 k + k 1 2 [ Q] beobachtete Geschwindigkeitskonstante k [ F = k1 + k2 Q] Φ F hängt vom Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten ab alle Moleküle fluoreszieren, typische Lebensdauer τ F = 1/k F ~ 10-8 s schnelle Konkurrenzprozesse verringern Φ F und τ F

7 Konkurrenz-Prozesse Fluoreszenz in Konkurrenz zu vielen anderen Prozessen: begünstigt durch: - strahlungslose Deaktivierung in den Grundzustand (interne Konversion IC) Umwandlung in interne Schwingungsfreiheitsgrade flexible Moleküle - Übergang in Triplettzustand (intersystem crossing ISC) Änderung des Spinzustands Schweratome über starke Spin-Bahn-Kopplung - Stoßdeaktivierung in der Gasphase Umwandlung in externe Freiheitsgrade der Translation - Schwingungsrelaxation in Lösung Umwandlung in externe Schwingungsfreiheitsgrade hohen Druck großes Dipolmoment des Solvens - Photoreaktion (z. B. Elektronentransfer) reaktive externe Gruppen schnelle Diffusion hohe Konzentration

8 Stokes-Shift Beitrag 1 Energie Energieunterschied von absorbierter und emittierter Strahlung aufgrund 1) vertikaler Übergang der Absorption und Emission (Franck-Condon-Prinzip) 2) Änderung der Molekülgeometrie im angeregten Zustand 3) strahlungsloser Zerfall im angeregten Zustand viel schneller als Fluoreszenz r GG Kernabstand

9 Stokes-Shift Beitrag 2 Im angeregten Zustand andere Geometrie des Moleküls Dipolmoment ändert sich Polares Lösungsmittel muss auf Änderung reagieren Solvensrelaxation Fluoreszenz Winter / Noll (1998) Methoden der Biophysikalischen Chemie Pfeile zeigen Dipolmomente von Molekül (Kasten) und Solvens (Ecken) Stokes-Shift bis zu Δλ = nm

10 Detektion der Fluoreszenz Aufbau: Monochromatische Lichtquelle Probe Linse Dispersives Element oder Filter Detektor M PM Walla (2009) Modern Biophysical Chemistry Problem: Streulicht zeigt ähnliche Ausbreitung wie Fluoreszenz in alle Raumrichtungen und muss abgetrennt werden Abtrennung der Fluoreszenz vom gestreuten Anregungslicht durch spektrale Verschiebung (Stokes-Shift)

11 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)

12 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) Aminosäuren, bilden 11 Faltblätter - Fluorophor gebildet durch intramolekulare Reaktion: Glycin Zyklisierung, Dehydratisierung, Oxidation Serin Tyrosin Emission im sichtbaren Spektralbereich - lässt sich in alle Organismen über DNA/RNA-Manipulation einbringen Markierung von Proteinen oder Strukurelementen in lebenden Zellen

13 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) M. Chalfie (2008) Nobel Lecture GFP-Fluoreszenz-Mikroskopiebild eines lebenden Wurms Suzuki et al. (2003) Neuron 39, 1005 Schema der Nervenzellen, die Mechanosensoren enthalten Barondeau et al. (2005) Biochemistry 44, Faltblätter umgeben den Fluorophor Ortsinformation über das Protein MEC-17-GFP Funktionelle Information

14 Nobelpreis für Chemie 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien Foto: dpa for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP M. Chalfie (2008) Nobel Lecture Chalfie et al. (1994) Science 263, 802

15 Erklärung der günstigen Eigenschaften des GFP Eigenschaft - hohe Quantenausbeute (79 %) Hypothesen zur Erklärung Unterdrückung von konkurrierenden Prozessen: -IC rigider Fluorophor -ISC Schweratome fehlen im Fluorophor - Schwingungsrelaxation zwar polare aber auch starre Umgebung durch Protein - Photostabilität -Photochemie Hülle verhindert Diffusion zum Fluorophor keine schnellen Reaktionen innerhalb des Proteins wie Isomerisierung und e - -Transfer - mässiger Stokes-Shift von (~38 nm, deprotoniert) - polare Umgebung und hohes Übergangsdipolmoment (7 D) - aber: mässig flexible Umgebung Grundlage für Weiterentwicklungen - Emissionswellenlänge durch Mutanten und Varianten veränderbar - Energie-Abstand der Zustände variierbar durch Umgebung und Konjugation R. Tsien (2008) Nobel Lecture

16 Neuere Entwicklungen

17 Verbesserungen beim GFP: rsegfp Schaltbares EGFP durch Mutation weiteroptimiert: reversible switcheable enhanced GFP rsgfp Zwei langlebige Zustände, durch Licht hin- und herschaltbar, nur einer fluoresziert: Vorteile: Sehr hohe Photostabilität Schnelle Schaltbarkeit 1200 Zyklen bis 50 % gebleicht Belichtung mit 488 nm Grotjohann et al. (2011) Science 478, 204 Vergleich der Schaltbarkeit mit bestem bisherigen System (Dronpa)

18 Anwendung des rsegfp Vielfach wiederbeschreibbarer Datenspeicher durch Proteinschicht fixiert in Polyacrylamid Grotjohann et al. (2011) Science 478, Grimms Märchen als ASCII-Binärcode, optisch geschrieben und ausgelesen durch Konfokalmikroskopie (1.8 MB mit DVD-Schreibdichte) großes Potenzial für Entwicklung des GFP, allerdings weitgehend durch Screening

19 Konkurrenz zu GFP durch andere Proteine Ziel: möglichst langwellige Emission - weniger Streuung dringt tiefer in Gewebe ein - weniger Autofluoreszenz höherer Kontrast Optimierung: Mutante einer Chromophor-Bindedomäne des Bacteriophytochroms 708 nm Rockwell et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol. 57, 837 Fluorophor Biliverdin Produkt aus dem Abbau von Häm Shu et al. (2009) Science 324, 804 Anregungs- und Emissionspektren des mutierten Bacteriophytochrom

20 Konkurrenz zu GFP durch andere Proteine Fluoreszenz-Tomographie- Aufnahme einer Mäuseleber mittels Bacteriophytochrom Shu et al. (2009) Science 324, 804 GFP-basierte Emitter im Fernroten nicht verfügbar, Chance für alternative Proteine

21 Kleine Moleküle als Floureszenzmarker Selektivität: Si-Rhodamin-Spiroverbindung reagiert auf HOCl, nicht auf andere reaktive Sauerstoffspezies farblos, nicht fluoreszierend farbig, stark fluoreszierend Koide et al. (2011) JACS 133, 5680 Rationales Design: - Si statt O für Rotshift der Emission - R als wasserlösliche Gruppe - Spiroverbindung für Selektivität - hoher Kontrast durch entstehende Konjugation kleine Moleküle bieten maßgeschneiderte Eigenschaften

22 Lifetime Gating über Metall-Fluoreszenz Ziel: lange Lebensdauer: Konkurrenz-Beiträge wie Autofluoreszenz lassen sich durch Schalten (Gating) des Detektors entfernen bisheriges, rationales Design: lange natürliche Lebendauer von Lanthanoid-Komplexen Alternative: Gold-Nanopartikel einfacher Zugang zu deutlich längeren Lebensdauern als organische Farbstoffe Shang et al. (2011) Small 7, 2614 Fluoreszenz-Abnahme in Lösung und in der Zelle Eigener Anwendungsbereich, da Lebensdauer von GFP-Emission nicht so variabel

23 Weiterführende Literatur Lehrbücher der Physikalischen Chemie Lakowicz (2006) Principles of fluorescence spectroscopy M. Chalfie (2008) Nobel lecture, R. Tsien (2008) Nobel lecture, Shaner et al. (2007) Advances in fluorescent protein technology, J. Cell. Sci. 120, 4247