Optimierung der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe

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1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie Experimentelle Unfallchirurgie Klinikum rechts der Isar Optimierung der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe Isabel F. Kerler Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler Eberhard-Karls-Universität Tübingen 2. Univ.-Prof. Dr. P. Biberthaler Die Dissertation wurde am bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am angenommen.

2 Meinen lieben Eltern

3 Inhaltsverzeichnis Inhalt 1 Abkürzungsverzeichnis Einleitung Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene Differenzierung von Ad- MSCs Supplemente zur osteogenen Differenzierung Phosphat- und Calciumlieferanten Vitamin D Dexamethason BMP 2 und BMP Zielsetzung Materialien und Methoden Verbrauchsmaterialien Geräte und Software Steriles Arbeiten Zellisolation Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen Zellzahlbestimmung Sulforhodamin B (SRB) Färbung Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten Zellzahl pro cm Kultur und Differenzierung Passagieren Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter Medien Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung Medienübersicht...39 Seite 1

4 Inhaltsverzeichnis BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mrna-ebene Isolation von mrna aus Zellen Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA Überprüfung der Integrität der RNA Synthese von komplementärer DNA (cdna) Polymerase Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarblue Assay Funktionelle Charakterisierung Nachweis osteogener Eigenschaften Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP) Alkalische Phosphatase (AP-) Färbung Van Kossa Färbung Alizarin Rot Färbung Nachweis chondrogener Eigenschaft: Alcianblau Kernechtrot Färbung Nachweis adipogener Eigenschaft: Ölrot O Färbung Densitometrische Auswertung Statistische Auswertung Ergebnisse Zellzahltest Chondrogene und adipogene Differenzierung mit industriell erzeugten Medien Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Oberflächenrezeptoren Vier Zusätze im osteogenen Basisdifferenzierungsmedium ,5 % FCS im Medium verspricht die besten Differenzierungserfolge Vitamin D 3 verbessert die osteogenen Differenzierungseigenschaften des Basisdifferenzierungsmediums, Dexamethason hingegen nicht Bestimmung nicht toxischer Vitamin D 3 Konzentrationen...80 Seite 2

5 Inhaltsverzeichnis Bestimmung nicht toxischer Dexamethason Konzentrationen Vitamin D 3 induziert die AP-Aktivität Beste Induktion der Matrixmineralisierung durch kombinierten Einsatz von Vitamin D 3 und Dexamethason BRE Reporterassay und Zugabe von BMP 2 und/oder BMP Zugabe von BMP 2 und/oder BMP 7 verbessert die AP-Aktivität nicht Zugabe von BMP 2 und / oder BMP 7 verbessert die Matrixmineralisierung nicht BRE Reporterassay Ad-MSCs exprimieren osteoblastentypische Gene nach osteogener Differenzierung Diskussion Zusammenfassung und Ausblick Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Informationen zu den Primern Alk Alk Alk Alk Alk TGF-ß-RII BMPRII IGF1R IGF2R RetinoidXR ß GAPDH BMP BSP MGP Seite 3

6 Inhaltsverzeichnis OSF Alkalische Phosphatase Osteoprotegerin BMP Osteopontin Osteocalcin Vitamin D Osteoprotegerin RANKL Literaturverzeichnis Danksagung Seite 4

7 Abkürzungsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis ActR-II...Aktivin Rezeptor Typ II ActR-IIB...Aktivin Rezeptor Typ II B Ad-MSCs...Adipose derived Mesenchymal Stem Cells (Fettgewebstammzellen) ALCAM...activated leukocyte cell adhesion molecule Alk...Activine-receptor like kinase AMHR-II...Anti Müller Hormon Rezeptor Typ II AP...Alkalische Phosphatase ATP...Adenosintriphosphat BMP...Bone Morphogenetic Protein BMPRII...Bone Morphogenetic Protein Receptor Typ II B-MSCs...Bone marrow derived mesenchymal stem cells (Knochenmarkstammzellen) bp...basenpaare BRE...BMP Response Element BSA...Bovines Serum Albumin BSP 2...Bone Sialoprotein 2 C2C12...murine Myoblasten Zelllinie Ca...Calcium ca....circa CD...Cluster of Differentiation cdna...komplementäre Desoxyribonukleinsäure cm...zentimeter cm 2...Quadratzentimeter CO 2...Kohlenstoffdioxid ddh 2 O...zweifach destilliertes, nicht steriles Wasser DEPC...Diethylpyrocarbonat Dex....Dexamethason Seite 5

8 Abkürzungsverzeichnis dh 2 O...destilliertes Wasser DMEM...Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO...Dimethylsulfoxid DNA...Desoxyribonukleinsäure D-PBS...Dulbecco s Phosphate-Buffered Saline EDTA...Ethylendiamintetraacetat EZM...extrazelluläre Matrix FACS...Fluorescence Activated Cell Sorting FCS...Fetales Kälberserum g...gramm g...vielfaches der Erdbeschleunigung GAPDH...Glycerinaldehyd-3-phosphat GMP-Richtlinien...Good Manufacturing Practice guidelines h...stunde H 2 O...Wasser HEPES...4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure HTM-Zellen...humane Trabekelwerkszellen IGF...insuline like growth factor kd...kilo Dalton M...Molar M-CSF...Macrophage Colony-Stimulating-Factor, dt.: Monozytenkolonien-stimuliernder Faktor MEM...Minimum Essential Medium Eagle Mg...Magnesium mg...milligramm MGP...Matrix gla Protein min...minute ml...milliliter mm...millimolar M r...relative molekulare Masse mrna...messenger Ribonukleinsäure Seite 6

9 Abkürzungsverzeichnis MSC...Mesenchymale Stammzelle N...biologische Replikate (Spenderanzahl) n...technische Replikate pro Spender NF-κB...nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells ng...nanogramm nm...nanometer nm...nanomolar nmol...nanomol OC...Osteocalcin OD...optische Dichte OP...Osteopontin OP-1...Osteogenic Protein-1 = BMP 7 OPG...Osteoprotegerin OSF 2...Osteoblast Specific Factor 2 OSS...Osteoblasten aus Spongiosa OSÜ...Osteoblastenkultur aus dem Kollagenaseüberstand PBS...Phosphate-Buffered Saline PCR...Polymerase Kettenreaktion ph...negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität pnp...4 Nitrophenol pnpp...4-nitrophenylphosphat PDIA3...Protein Disulfidisomerase A3 R²...Bestimmtheitsmaß RANK...Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B RANKL...Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B Ligand RLU...Relative Light Unit RNA...Ribonukleinsäure RT...Raumtemperatur RT-PCR...Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Seite 7

10 Abkürzungsverzeichnis runx2...runt-related transcription factor 2 s...sekunde S...Svedberg SDS...Sodiumdodecylsulfat Smad...Sma- and Mad-related protein srankl...löslicher Rezeptor Aktivator des Nuklearfaktor κ B Ligand SRB...Sulforhodamin B TBE...Tris-Borat-EDTA-Puffer TGF-β...Transforming Growth Factor β TGF-βRI...Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ I TGF-βRII...Transforming Growth Factor β Rezeptor Typ II TRIS...Tris(hydroxymethyl)-aminomethan V...Volt λ...einheit für die Wellenlänge des Lichts C...Grad Celsius µg...mikrogramm µl...mikroliter µm...mikrometer µm...mikromolar µmol...mikromol #...Probennummer Seite 8

11 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Knochenaufbau und Knochenstoffwechsel Das menschliche Skelett besteht durchschnittlich aus 208 Knochen. Es bildet zusammen mit knorpeligen Skelettelementen den passiven Stütz- und Bewegungsapparat des Körpers und erfüllt eine Schutzfunktion für die inneren Organe. Daneben stellen die Knochen den Bildungsort der Blutzellen dar, beteiligen sich an verschiedenen Stoffwechselprozessen und sind das größte körpereigene Phosphat- und Calciumreservoir (Felsenberg 2001, S. 488; Lüllmann-Rauch 2003, S. 133). Zur exemplarischen Darstellung des Knochenaufbaus wird ein langer Röhrenknochen, wie das Femur, näher betrachtet. An einem Röhrenknochen kann anatomisch ein Schaftbereich (Diaphyse) von einer proximalen und distalen Epiphyse unterschieden werden. Die beiden knorpeligen Epiphysenfugen grenzen während der Wachstumsphase den Schaft von den Epiphysen ab, verknöchern jedoch im Erwachsenenalter. Weitere makroskopisch erkennbare Merkmale sind die äußere, homogen erscheinende Rindenschicht (Substantia compacta) und die nach innen anschließende Substantia spongiosa. Die Spongiosa ist ein Gitterwerk aus dünnen, traktoriell ausgerichteten Platten und Bälkchen (Trabekel) dessen Zwischenräume von Knochenmark und Fett ausgefüllt werden. (Lüllmann-Rauch 2003, S ; Aumüller 2010, S ) Der Knochen besteht mikroskopisch betrachtet aus Knochenzellen und extrazellulärer Matrix, davon entfallen 70 % auf einen anorganischen und 30 % auf einen organischen Anteil. Der anorganische Teil besteht vor allem aus Hydroxylapatit-Kristallen sowie Chloride und Fluoride. Die organische Knochensubstanz wird zu 95 % aus Typ-I-Kollagenfibrillen (bestehend aus drei Ketten, die sich zu einer Tripelhelix vereinen) und zu 5 % aus nichtkollagenen Proteinen (siehe unten) gebildet (Felsenberg 2001, S. 488). Dieser Verbund aus druckfesten Mineralkristallen und zugfesten Kollagenfibrillen verleiht dem Knochen seine biegefeste Eigenschaft. Die wichtigsten nichtkollagenen Proteine des Knochens sind: - Osteoprotegerin (OPG) wird von Osteoblasten sezerniert, um den Knochen vor Abbau zu schützen. OPG ist der Schlüsselfaktor für die Inhibition der Osteoklastendifferenzierung, -fusion und -aktivität. Es bindet srankl und antagonisiert dieses dadurch (Haima 2013, S. 4). Glukokortikoide wirken umgekehrt: Seite 9

12 Einleitung sie hemmen die Bildung von OPG und stimulieren diejenige von RANKL, dadurch fördern sie den Knochenabbau (Brabnikova Maresova, Pavelka et al. 2012, S. 354; Clarke 2012, S. 167). - srankl wird von Osteoblasten sezerniert und ist der lösliche Rezeptor-Aktivator des nuclear factor (NF)-κB Liganden. Es stimuliert die Bildung reifer Osteoklasten und fördert somit den Knochenabbau. Die Zellaktivierung wird durch die Bindung von srankl an den osteoklastischen Membranrezeptor RANK (NF-κB) induziert (Haima 2013, S. 4). - Knochenspezifische Alkalische Phosphatase (AP) ist außen an der Plasmamembran von Osteoblasten lokalisiert. Dieses membrangebundene Enzym spielt bei der Mineralisation der extrazellulären Knochenmatrix eine wichtige Rolle; der Mechanismus ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. Außerdem kann AP als biochemischer Knochenmarker in der Beurteilung des Knochenumsatzes und zum Therapiemonitoring verwendet werden (hohe AP-Konzentrationen können ein Hinweis auf vermehrte Knochenneubildung sein)(haima 2013, S. 4). - Bone Sialoprotein (BSP) ist ein wichtiges Strukturprotein der Knochenmatrix und wird normalerweise nur in mineralisiertem Bindegewebe von Knochen und Zähnen exprimiert (Fisher, Whitson et al. 1983, S ). BSP 2 ist die im Menschen vorkommende Variante und ist auch bekannt unter cell-binding sialoprotein oder integrin-binding sialoprotein. BSP 2 unterstützt die Bindung von Osteoblasten an die EZM und stimuliert dadurch die Bildung von Hydroxylapatit-Kristallen (Mansson, Carey et al. 1995, S. 1071; Haima 2013, S. 4). - Osteocalcin wird von Osteoblasten in der Phase der Mineralisation sezerniert, ist Vitamin K-abhängig und kann durch Vitamin D 3 stimuliert werden. Es ist ein calciumbindendes Protein und zieht Osteoklasten an (Siddiqi, Burrin et al. 1997, S. 753; Haima 2013, S. 4). - Osteopontin ist ein Adhäsionsprotein, das Osteoklasten in der mineralisierten Matrix verankert. Osteopontin ist wie auch Osteonectin nicht knochenspezifisch, sondern findet sich noch in weiteren Geweben (Butler 1989, S. 123; Haima 2013, S. 4). - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden eine Ligandengruppe, die zur TGF-β- Familie gehört (Wozney 1989, S. 267). Sie fungieren als Zytokine und besitzen die Fähigkeit die Knochen- und Knorpelbildung zu induzieren und zu regulieren. Seite 10

13 Einleitung Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Nervengewebe und in der Genese fast aller Organe, wie beispielsweise Lunge, Niere, Haut oder Gonaden (Hogan 1996, S. 1580). Zum Beispiel tritt bei der genetisch vererbten Fibrodysplasia ossificans progressiva eine erhöhte BMP 4 Expression in Lymphozyten auf, die zur Verknöcherung von Muskelgewebe führt (Van den Wijngaard, Pijpers et al. 1999, S. 1432). - Proteoglykane sind sehr große Moleküle und bestehen zu 95 % aus Kohlenhydraten und 5 % aus Protein. Aufgrund der starken negativen Ladung können Proteoglykane besonders viel Wasser binden und erlangen dadurch raumfüllende Eigenschaften (Pschyrembel 2004, S. 1492). Die dreidimensionale Anordnung der EZM legt fest, ob es sich um einen Geflecht- oder Lamellenknochen handelt. Der Geflechtknochen, auch Faserknochen genannt, ist die unreife Vorstufe des Lamellenknochens und ist vor allem während der Knochenentwicklung oder Frakturheilung zu finden. Die Kollagenfibrillen sind in Bündeln miteinander verflochten, so dass man sich die Knochenstruktur wie verknöchertes Bindegewebe vorstellen kann. Im Verlauf des natürlichen Knochenumbaus wird der Geflechtknochen durch den biomechanisch hochwertigeren Lamellenknochen ersetzt. Die lamellare Anordnung der Matrixbestandteile sowie die enge räumliche Beziehung zwischen Gefäßen und Knochenlamellen werden besonders in der Kompakta deutlich. Beide Strukturen zusammen bilden eine Baueinheit, das sogenannte Osteon (Durchmesser µm, Länge bis zu 1 cm). Im Zentrum eines Osteons befindet sich der sogenannte Havers sche Kanal (Durchmesser mind. 20 µm), in dem neben Vene und Nerv ein Gefäßast der Arteria nutricia verläuft. Diese dringt von außen durch die Kortikalis in den Markraum ein und versorgt die Gefäße des Knochenmarks. Die Havers-Gefäße sind durch Gefäße in den querverlaufenden sogenannten Volkmann-Kanälen miteinander verbunden. Um das Havers-Gefäß sind 5-20 Speziallamellen konzentrisch angeordnet. Die Kollagenfibrillen laufen dabei spiralig um den Havers schen Kanal, während die Osteozyten zwischen den Lamellen eingemauert sind. Weiter unterscheidet man äußere und innere Generallamellen, sie sind nicht um ein Gefäß angeordnet und umgeben die Kompakta parallel zur äußeren und inneren Oberfläche. Schaltlamellen (interstitielle Lamellen) sind Reste unvollständig abgebauter Spezial- oder Seite 11

14 Einleitung Generallamellen und sind der Beweis für die stetigen Umbauvorgänge im Knochen. (Benninghoff 1985, S ; Lüllmann-Rauch 2003, S ; Schünke 2005, S. 35). In der gefäßlosen Spongiosa sind die flächigen Lamellen parallel zur Trabekeloberfläche angeordnet. Ein Trabekel ist höchsten 300 µm dick, somit können die Osteozyten per diffusionem von den Gefäßen aus dem Markraum versorgt werden (Lüllmann-Rauch 2003, S. 130). Osteon äußere Generallamellen Schaltlamellen Volkmann-Kanal mit Gefäßen Periost Havers scher Kanal mit Gefäßen Spongiosa Osteozyt Kompakta Abbildung 1: Mikroskopischer Aufbau eines Röhrenknochens Die Abbildung zeigt die Baueinheit eines Röhrenknochens, das Osteon; die versorgenden Blutgefäße verlaufen in der Kompakta in den präformierten längsverlaufenden Havers schen Kanälen und in quer angeordneten Volkmann-Kanälen; nach außen (links) schließt das Periost die Kompakta ab, nach innen (rechts) beginnt die Spongiosa. Modifizierte Abbildung nach Folgende drei Zelltypen werden unterschieden: 1. Osteoblasten entstehen über ihre Vorstufe, den Osteoprogenitorzellen, aus mesenchymalen Stammzellen. Ihre Hauptaufgaben sind die Bildung, Organisation und Mineralisierung der EZM sowie die Synthese von Kollagen und weiteren Knochenproteinen. Diese Aufgaben erfüllen sie in mehreren Arbeitsschritten: Zellproliferation: Bildung der EZM Seite 12

15 Einleitung Reifung der EZM: Synthese von Proteinen (z.b. knochenspezifische Alkalische Phosphatase) Mineralisation der EZM: die AP-Expression wird herrunterreguliert, dafür nimmt die Genexpression für Sialoprotein, Osteopontin und Osteocalcin zu nach der Fertigstellung der Knochenmatrix gibt es drei Optionen für die Osteoblasten: etliche werden von einer neu gebildeten Lamelle eingemauert und werden dadurch zu Osteozyten, über 50% sind überflüssig und gehen durch Apoptose zugrunde und die restlichen wenigen reihen sich in einem inaktiven Zustand in das Endost ein (Benninghoff 1985, S ; Lüllmann-Rauch 2003, S ). 2. Osteozyten werden bis auf eine schmale Zone, die mit Kollagen und interstitieller Flüssigkeit gefüllt ist, komplett von mineralisierter Matrix umgeben. Von jeder einzelnen Zelle gehen viele Knochenkanälchen (Canaliculi) ab, die mit den Nachbarzellen durch Gap junctions in Verbindung stehen. Dieses Hohlraumsystem gewährleistet per diffusionem die Aufrechterhaltung des Zellmetabolismus und die Kommunikation untereinander. Ihre Funktion ist noch nicht ausreichend geklärt, aber es konnte beobachtet werden, dass Areale, in denen die Osteozyten abgestorben sind, von Osteoklasten abgeräumt werden. (Benninghoff 1985, S. 139; Lüllmann- Rauch 2003, S ; Schünke 2005, S. 15) 3. Osteoklasten sind eine Spezialform der Makrophagen. Sie entstehen durch Fusion von bis zu 100 einkernigen Vorläuferzellen, die denen der Monozyten entsprechen und sind für die Knochenresorption verantwortlich. Die Arbeitsweise der Osteoklasten umfasst folgende Schritte: Mineralienauflösung: Osteoklasten bilden in dem Bereich, welcher der Knochenoberfläche aufliegt, einen Faltensaum zur Oberflächenvergrößerung. In dieser geriffelten Oberfläche befindet sich eine H + -ATPase mit der ein saures Mikromilieu (ph ca. 4,5) zur Auflösung der Calciumverbindungen erzeugt wird. Die komplette Lysezone ist nach außen durch eine Versiegelungszone abgegrenzt. Gleichzeitig sezernieren die Osteoklasten lysosomale Enzyme (z.b. Cathepsin K, Tartrat-resistentes Isoenzym der sauren Phosphatase = TRAP 5b) zur Zerlegung der organischen Matrix. Seite 13

16 Einleitung Osteoklasten nehmen die Matrix-Fragmente mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose auf, transportieren sie durch den Zellleib und schleusen sie auf der gegenüberliegenden, nicht osteoklastisch tätigen Seite wieder aus. Zur Proliferation von Osteoklastenvorläuferzellen sezernieren Osteoblasten Wachstumsfaktoren (TGF-, RANKL) und Zytokine (z.b. M-CSF) (Fuller, Lean et al. 2000, S. 2445). Zusätzlich interagieren die Blasten und Klasten über RANK direkt miteinander, was die Fusion und Reifung der Osteoklasten anregt. Osteoprotegerin aus den Osteoblasten unterbindet diese Interaktion. Nach Calcitoninbindung löst sich der Osteoklast von der Knochenmatrix und der Faltensaum verschwindet. (Benninghoff 1985, S ; Lüllmann-Rauch 2003, S ; Pschyrembel 2004, S. 1331) Das Endost überzieht die innere Knochenoberfläche. Es besteht aus einer dünnen Schicht von nicht-mineralisierten Kollagenfibrillen und einer Schicht lining cells. Diese umfassen mesenchymale Stammzellen, Osteoprogenitorzellen, ruhende Osteoklasten und blasten werden bei Umbau- oder Reparaturmaßnahmen aktiviert (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129). Das Periost überzieht die äußere Knochenoberfläche, ist gut vaskularisiert und innerviert. Es weist die gleichen Zellen wie das Endost auf. Jährlich werden etwa 10% der gesamten Knochenmasse umgebaut (remodelling), um das Skelett vor Materialermüdung zu schützen, Mikroschäden zu reparieren und es an die funktionelle Beanspruchung anzupassen. Neben den mechanischen Aspekten haben auch Hormone einen großen Einfluss auf den Knochenstoffwechsel (Lüllmann-Rauch 2003, S. 129): Östrogen hemmt die Osteoblasten-induzierte Rekrutierung der Osteoklasten, somit ist der Östrogenmangel bei postmenopausalen Frauen eine der maßgeblichen Ursachen für Osteoporose (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133). Parathormon aus der Nebenschilddrüse erhöht Osteoblasten-vermittelt die Rekrutierung und Aktivität der Osteoklasten, die durch eine gesteigerte Knochenresorption den Serumcalciumspiegel erhöhen (Lüllmann-Rauch 2003, S. 133; Haima 2013, S. 6). Calcitonin, das in den C-Zellen der Schilddrüse gebildet wird, ist der Gegenspieler des Parathormons. Durch direkte Osteoklastenhemmung bewirkt es eine schnelle jedoch Seite 14

17 Einleitung nur kurz dauernde Senkung der Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Serum (Benninghoff 1985, S. 147; Lüllmann-Rauch 2003, S. 133; Haima 2013, S. 6). Vitamin D 3 (siehe Kapitel 2.3.2) 2.2 Tissue Engineering: Klinischer Hintergrund und osteogene Differenzierung von Ad-MSCs Adäquate Therapiemöglichkeiten für Patienten mit größeren Knochendefekten, z.b. bedingt durch ein Trauma oder nach Tumorextraktion, die nicht durch körpereigene Reparaturmaßnahmen geheilt werden können, stellen ein großes Problem in der orthopädischen und unfallchirurgischen Versorgung dar. Der derzeitige klinische Standard ist die auto- und allogene Knochentransplantation (Kao and Scott 2007, S. 513). Für den Patienten ist die autogene Behandlungsmethode jedoch mit einem erhöhten Risiko für Infektion und Morbidität durch den zusätzlichen operativen Eingriff verbunden (Brawley and Simpson 2006, S. 342; Chen, Chen et al. 2006, S. 496; Silva, Cortez et al. 2006, S. 420; Chou, Mann et al. 2007, S. 199). Der Einsatz allogener Transplantate bringt die Gefahr einer Graftversus-Host Reaktion mit sich (Wheeler, Haynie et al. 2001, S. 251; Wheeler 2005, S. 36; Kode, Mukherjee et al. 2009, S. 377). Alternativ werden auch alloplastische Ersatzverfahren angewendet, die jedoch lediglich als Defektfüller dienen und bei einem ausbleibenden osteoinduktiven Einbauprozess sich lockern können. Im Tiermodel konnten große Knochendefekte durch Beschichtung der Implantate mit osteogenen Wachstumsfaktoren erfolgreich überbrückt werden (Pelled, Ben-Arav et al. 2010, S ; Vertenten, Gasthuys et al. 2010, S ). Übertragungsversuche in den klinischen Alltag sind bis jetzt allerdings gescheitert. Das Tissue Engineering eröffnet für diese Patientengruppe eine neue, risikoarme und vielversprechende Behandlungsmöglichkeit. Ziel ist nicht nur die Wiederherstellung der Funktionalität der betroffenen Extremität sondern eine vollständige Genesung durch den Einsatz körpereigener histogener Zellen auf biokompatiblen Trägermaterialien (Egana, Fierro et al. 2009, S. 1191; Schmidt-Rohlfing, Tzioupis et al. 2009, S. 786). Anfänglich kamen vor allem autogene primäre Osteoblasten zum Einsatz, die jedoch nicht in ausreichender Menge gewonnen werden konnten. Somit hat sich in den letzten Jahren die Verwendung mesenchymaler Stammzellen etabliert. Studien belegen das ubiquitäre Vorkommen mesenchymaler (adulter) Stammzellen in verschiedenen Geweben und Organen wie Seite 15

18 Einleitung Knochenmark, Muskel, Gehirn, Haut und subkutanem Fettgewebe (Kakudo, Shimotsuma et al. 2008, S. 191). Per definitionem charakterisiert man Stammzellen durch ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation und somit spielen sie eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der Homöostase im Knochen-, Knorpel-, Muskel-, Band-, Fett- und Stromagewebe (Bruder, Fink et al. 1994, S. 283). Ein weiteres Merkmal mesenchymaler Stammzellen ist deren Plastizität, d.h. sie sind in der Lage in verschiedene Gewebetypen zu differenzieren (Pittenger, Mackay et al. 1999, S. 143; Mizuno 2009, S. 56). Bezüglich der osteogenen Differenzierungslinie können sich mesenchymale Stammzellen in sogenannte Osteoprogenitorzellen, Vorläuferzellen einiger Knochenzellen, weiter differenzieren. Osteoprogenitorzellen stellen die Ausgangsform für die Weiterdifferenzierung in Osteoblasten, Osteozyten und lining cells dar (Clarke 2008, S. 134). Abbildung 2: Die mesenchymale Stammzelle (modifiziert nach Takada, Kouzmenko et al. 2009, S. 444) Die mesenchymale Stammzelle kann durch ihre Plastizität in unterschiedlich spezialisierte Gewebe differenzieren. Seite 16

19 Einleitung Gimble et al. haben vorgeschlagen, dass Stammzellen für den Einsatz in der regenerativen Medizin folgende Kriterien erfüllen sollten (Gimble 2003, S ; Gimble, Katz et al. 2007, S ): zur Reduktion des perioperativen Risikos für den Spender müssen die Stammzellen durch minimal invasive Extraktionsmethoden gewonnen werden können aus dem zur Verfügung stehende Gewebe sollen mit standardisierten Methoden eine große Zahl von Zellen (im Millionenbereich) isoliert werden können eine Differenzierung in verschiedene Gewebe soll durch regulierbare und reproduzierbare Methoden gewährleistet werden Gewährleistung sicherer und effektiver auto- und allogener Transplantationsmöglichkeiten die Zellen müssen gemäß aktueller GMP-Richtlinien (Good Manufacturing Practice guidelines; EU-Richtlinie 2003/94/EC) verarbeitet werden können Traditionell werden MSCs aus dem Aspirat einer Knochenmarkbiopsie gewonnen. Diese ist jedoch sehr schmerzhaft, geht mit einem nicht zu unterschätzenden periinterventionellen Risiko für den Patienten einher und liefert nur eine geringe Menge an Material, wenn Folgeerscheinungen wie Anämien vermieden werden sollen (Bain 2003, S. 949). Subkutanes Fettgewebe hingegen kann leicht in Lokalanästhesie in ausreichenden Mengen entnommen werden. Es ist möglich aus einem Gramm Fettgewebe ca. 5 x 10 3 Zellen zu isolieren, etwa 500 mal so viel wie aus Knochenmark (Coleman 2006, S. 117). Zudem verringert der Gebrauch von adulten Stammzellen Akzeptanzprobleme der Methoden bei den Patienten oder Konflikte mit den aktuell geltenden Gesetzen in Deutschland. Allen geforderten Punkten kann mit Fettgewebsstammzellen nachgekommen werden und somit stellen sie eine gute Alternative zu den Knochenmarkstammzellen dar. Zur Überprüfung ob Ad-MSCs auch für das Tissue Engineering von Knochen verwendbar sind, werden sie auf ihre Oberflächenrezeptoreigenschaften untersucht und mit verschiedenen Substanzen stimuliert, um die osteogene Differenzierung zu induzieren. Für diese Arbeit wird abdominelles bzw. Hüftfett verwendet, das nach vorheriger Aufklärung und schriftlicher Zustimmung der Patienten während der Operation entnommen wird. Seite 17

20 Einleitung 2.3 Supplemente zur osteogenen Differenzierung Damit den Zellen auch die benötigten Nähr- und Signalstoffe zur osteogenen Differenzierung zur Verfügung stehen, werden verschiedene Supplemente für die nachfolgenden Experimente verwendet. Dies erfolgt einerseits in Anlehnung an bereits publizierte Protokolle zur osteogenen Differenzierung und andererseits durch den Einsatz von Substraten, die Osteoblastenkulturmedien zugesetzt werden (Hattori, Sato et al. 2004, S. 4; Kroeze, Knippenberg et al. 2011, S. 233) Phosphat- und Calciumlieferanten Hydroxylapatit-Kristalle bilden die Hauptkomponente des mineralisierten Matrixanteils und bestehen aus Calcium und Phosphat. Als Phosphatlieferanten werden -Glycerolphosphat (siehe Abbildung 3) und L-Ascorbinsäure-2-phosphat (siehe Abbildung 4) eingesetzt, wobei letzteres die Zugabe von HEPES (siehe Abbildung 5) erfordert, um einer ph-wert-entgleisung entgegenzuwirken. Das zweiwertige Calcium wird als Calciumchloridsalz (siehe Abbildung 6) zugegeben. Abbildung 3: β-glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (von Sigma Aldrich) Abbildung 4: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (von Sigma-Aldrich) Seite 18

21 Einleitung Abbildung 5: HEPES (von Sigma-Aldrich) Abbildung 6: Calciumchloriddihydrat (von Sigma Aldrich) Vitamin D 3 Vitamin D 3 (Cholecalciferol) (siehe Abbildung 7) ist ein Hormon, das im menschlichen Organismus die intestinale Ca 2+ -Aufnahme und dessen Einbau in den Knochen reguliert. Somit erhöht es die Effizienz des Calciums (Haima 2013, S. 6). Biochemisch handelt es sich dabei um ein Steroid, das durch UV-Licht oder enzymatisch in seine aktive Form, das 1,25- Dihydroxycholecalciferol umgewandelt wird. Die elementare Bedeutung von Cholecalciferol im Knochenstoffwechsel wird am Krankheitskomplex der Vitamin-D-Mangelerscheinungen deutlich. Eine Hypovitaminose führt zu Mineralisierungsstörungen des Skeletts und kann sich je nach Lebensalter in unterschiedlichen Krankheitsbildern äußern: Säuglinge und Kinder erkranken an der sogenannten Rachitis, bei der eine Störung der enchondralen Ossifikation vorliegt, die von schweren Knochendeformationen bis hin zu Tetanien und Krampfanfällen führen kann. Im Erwachsenenalter äußert sich dieser Vitaminmangel als Osteoporose (verminderte Knochensubstanz und mikroarchitektonischer Stabilitätsverlust) oder Osteomalazie (erhöhte Weichheit des Knochens und Verbiegungstendenz). Erstere kann Spontanfrakturen mit sich bringen, bei letzterer kommen als weitere Komplikation noch Deformationen hinzu (Pschyrembel 2004, S ; Rassow 2012, S. 278). Seite 19

22 Einleitung Abbildung 7: Cholecalciferol (von Sigma-Aldrich) Dexamethason Zusammen mit anderen Hormonen verzögern Glukokortikoide wie das Dexamethason (siehe Abbildung 8) in physiologischen Dosen das Längenwachstum von Röhrenknochen durch Proliferationshemmung von Osteoblasten und der Differenzierung von Knorpelzellen in den Epiphysenfugen (Rassow 2012, S. 595). Im medizinischen Alltag weisen sie ein weites Behandlungsspektrum für die verschiedensten Indikationen auf. Jedoch wird bei einer Langzeittherapie ihr immunsuppressives Potential von einer großen Anzahl unerwünschter Nebenwirkungen begleitet, die in ihrer vollen Ausprägung als Morbus Cushing bekannt sind. Im Bereich der Knochen können sehr hohe Dosen, auch wenn sie nur kurzfristig zum Einsatz kommen, zu Osteoporose oder aseptischen Knochennekrosen im Kopfbereich von Humerus und Femur führen (Kaiser 2002, S ). In vielen Publikationen konnte Dexamethason dennoch die osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen nicht nur induzieren sondern auch signifikant verbessern (Koehler, Alge et al. 2013, S. 4150; Ma, Zhang et al. 2013, S. 1403). Abbildung 8: Dexamethason Cyclodextrin-Komplex (von Sigma-Aldrich) Seite 20

23 Einleitung BMP 2 und BMP 7 Diese beiden Vertreter aus der Familie der BMPs werden seit einigen Jahren in Form von rekombinanten humanen Proteinen klinisch zur Anwendung gebracht. Zum Einsatz kommt dabei das rekombinante humane BMP-2 (rh-bmp-2) InductOs der Firma Wyeth und das rh- BMP-7 Osigraft der Firma Olympus vormals Stryker. Ersteres ist zugelassen bei akuten Tibiafrakturen sowie zur monosegmentalen anterioren lumbalen Spondylodese bei Erwachsenen mit degenerativem Bandscheibenvorfall und einem erfolglosen 6 monatigen konservativen Therapieversuch. Letzteres wird bei seit mindestens 9 Monaten bestehenden Pseudarthrosen nach Tibiafrakturen eingesetzt. Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind eine Ligandengruppe, die zur TGF-β-Familie gehört (Wozney 1989, S. 267). Im klinischen Alltag finden BMP 2 und BMP 7 Einsatz bei der Behandlung von großen Knochendefekten oder Frakturheilungsstörungen (Wildemann, Burkhardt et al. 2007, S. 1; Schmidmaier, Capanna et al. 2009, S. 41). BMP 2 ist ein potentes osteoinduktives Zytokin, das die Bildung von Knochen und Knorpel in Verbindung mit osteokonduktiven Trägern wie Kollagen und synthetischem Hydroxylapatit induziert. Zusätzlich zur osteogenen Aktivität spielt BMP 2 eine wichtige Rolle bei der kardialen Morphogenese (Hill 2013, S. 41). BMP 7 auch bekannt als Osteogenic Protein-1 oder OP-1 ist eine wirksame osteogene Substanz, die in Anwesenheit geeigneter Trägerstoffe (z.b. eines Kollagenschwammes oder synthetischem Hydroxylapatit) zur Behandlung von Knochendefekten eingesetzt wird. BMP 7 induziert die Knorpel- und Knochenbildung, ist an der Regulation des Calciumhaushaltes sowie der Knochenhomöostase beteiligt (Hill 2013, S. 41). Für die Signaltransduktion der Mitglieder der TGF-β Superfamilie werden jeweils ein TGF-β Rezeptor Typ I (Alk 1-7) und Typ II Rezeptor (TGF-β, ActR-II, ActR-IIB, BMPRII und AMHR-II) (Massague 1998, S. 753; Inman, Nicolas et al. 2002, S ) benötigt (siehe Abbildung 9). Die BMPs vermitteln ihre Signale lediglich über Alk 1, Alk 2, Alk 3 und Alk 6 der Typ I Rezeptoren sowie BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB der Typ II Rezeptoren. Nach Bindung des BMP-Liganden an einen der Typ I Rezeptoren verbindet sich dieser Komplex intrazellulär mit dem entsprechenden Typ II Rezeptor. Der konstitutiv aktivierte (phosphorylierte) Typ II Rezeptor aktiviert nun den Typ I Rezeptor durch die Übertragung des Phosphatrests (Piek, Heldin et al. 1999, S. 2109; Chen, Deng et al. 2012, S ). Der aktivierte Typ I Rezeptor erkennt die fünf zytoplasmatisch rezeptorregulierten Smad-Proteine (R-Smads 1, 2, 3, 5, 8). Seite 21

24 Einleitung Die Bindung eines BMP-Liganden aktiviert R-Smad 1, 5 und 8 (Piek, Heldin et al. 1999, S. 2109) wohingegen TGF-β, Nodal oder Activin über R-Smad 2 und 3 die Signaltransduktion vermitteln (Ross and Hill 2008, S ). Smad 4 wird nicht von Liganden kontrolliert und kann mit allen aktivierten R-Smads Komplexe bilden. Somit unterstützt es als commonmediator Smad-Protein (co-smad, Smad 4) bei der Signaltransduktion in den Zellkern. (Ross and Hill 2008, S ) Die I-Smads (Inhibitory Smads) bestehend aus Smad 6 und 7 wirken auf die Signalübertragung inhibierend. Diese binden zum einen an den Typ-I-Rezeptor und hindern somit die Aktivierung der R-Smads oder erkennen zum anderen direkt aktivierte R-Smads und beeinflussen dadurch die Komplexbindung mit co-smad. Smad 6 inhibiert die BMP- Signaltransduktion wohingegen Smad 7 zusätzlich den TGF-β- und Activin-Signalweg hemmt. (Ross and Hill 2008, S. 386, 393) TGF-βRI: - Alk 1 - Alk 2 - Alk 3 - Alk 6 BMP TGF-βRII: - BMPRII - ActR-II - ActR-IIB TGF-βRI TGF-β TGF-βRII P P Smad 1/5/8 Smad 1/5/8 Smad 2/3 Smad 2/3 Smad 6 Smad 7 Smad 4 Smad 4 R-Smad P Smad 4 Abbildung 9: Schematische Darstellung des BMP- und TGF-β Signallings Die Ligandenbindung aktiviert im Zellinneren die R-Smad Phosphorylierung, dabei übermitteln die BMPs ihre Aktivierung über Smad 1/5/8 und TGF-β über Smad 2/3, zusammen mit dem co-smad wird die Information in den Zellkern weitergeleitet. I-Smad 6 wirkt inhibitorisch auf das Smad 1/5/8 Signalling wohingegen Smad 7 beide Signalwege beeinflussen kann. (modifiziert nach Horbelt, Denkis et al. 2012, S. 470) Seite 22

25 Einleitung Die Arbeitsgruppe um Kang schleuste in C2C12-Zellen einen rekombinanten Adenovirus, der alle 14 BMPs exprimiert. Anschließend injizierten sie diese in den Quadrizeps von Nacktmäusen. In den Gruppen von BMP 2, 6, 7 und 9 (siehe Abbildung 10) konnten sie sowohl radiologisch als auch histologisch die Ossifikation des Muskels an dieser Stelle nachweisen (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314). Abbildung 10: orthotope Ossifikation bei BMP 2, 6, 7 und 9 C2C12 Zellen mit rekombinantem Adenovirus, der alle 14 BMPs exprimiert, wurden in den Quadrizeps der Nacktmäuse injiziert. Nach 3 Wochen konnte röntgenologisch bei den mit BMP 2, 6, 7 und 9 stimulierten Gruppen Knochengewebe nachgewiesen werden (Kang, Sun et al. 2004, S. 1314). Kontrollgruppe: GFP = Grün Fluoreszierendes Protein, das Dreieck zeigt die Injektionsstelle Lange Zeit waren nur BMP 2 und BMP 7 rekombinant herstellbar und für die klinische Anwendung zugelassen, deshalb beschränken wir uns auf diese beiden Faktoren. Seite 23

26 Zielsetzung 3 Zielsetzung Knochenmarkstammzellen waren lange die vielversprechendste Quelle von mesenchymalen Stammzellen. Sie sind jedoch nur in geringen Mengen verfügbar, wenn das hämatopoetische Gleichgewicht nicht zerstört werden soll. Zusätzlich ist deren Extraktion mit einem nicht zu vernachlässigenden interventionellen Risiko verbunden. Ziel dieser Arbeit war es deshalb mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe zu isolieren und diese osteogen zu differenzieren. Ad-MSCs sind in großen Mengen verfügbar und können risikoarm und einfach von jedem Patienten gewonnen werden. Zur Überprüfung welche Substanzen von den Zellen aufgenommen werden können, müssen diese zunächst mittels Bestimmung von Oberflächenrezeptoren charakterisiert werden. Anschließend sollen die Zellen mit verschieden zusammengesetzten Medienkonstellationen stimuliert werden, um ein osteogenes Differenzierungsprotokoll zu erstellen. Ein weiteres Ziel ist es möglichst preisgünstige Supplemente zu verwenden, was vor allem für den späteren klinischen Einsatz eine entscheidende Rolle spielt. Abschließend werden die differenzierten Stammzellen bezüglich ihrer exprimierten osteoblastentypischen Gene noch mit primären Osteoblasten verglichen. Im Überblick sollen also folgende Ziele verfolgt werden: 1. Grundcharakterisierung der Ad-MSCs: a. Expression von Oberflächenrezeptoren b. chondrogene Differenzierung c. adipogene Differenzierung 2. Erstellung eines optimierten osteogenen Differenzierungsprotokolls durch Testung verschiedener osteogener Mediensupplemente auf: a. AP-Aktivität b. Matrixmineralisierung c. Expression osteoblastentypischer Gene Bei der Charakterisierung der osteogenen Eigenschaften dienen primäre humane Osteoblasten als Goldstandard. Seite 24

27 Materialien und Methoden 4 Materialien und Methoden 4.1 Verbrauchsmaterialien Material Aqua Spüllösung (ddh 2 O) Cell Culture Flask 175 cm² with filter cap Cell scraper 13 mm blade, 20 mm blade Cellstrainer Cryo-Tubes 2 ml Cuvetten: Uvette nm, µl DMSO Einmalspritzen, 2-teilig, steril, 10 ml, 20 ml Ethanol 70 % zur Desinfektion Ethanol 99,8 % Formaldehyd Glaspipette, serologisch, steril 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml HCl zum Einstellen des ph Wertes Konische Röhrchen, Polypropylen, steril, 15 ml, 50 ml NaOH zum Einstellen des ph Wertes Pasteurpipetten Glas groß 230 mm, 150 mm PCR 8er-Strips mit separatem Deckelstreifen, PP, autoklavierbar, DNase-, DNA- und RNasefrei Pipettenspitzen ept.i.p.s. Standard μl, μl, μl Safe-Lock Reaktionsgefäße 0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml Skalpell Steriles Wasser Sterilfilter Wasserstabil Hersteller/Bezugsadresse DeltaSelect, Dreieich SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe PAA, München PAA, München PAA, München Eppendorf, Hamburg Sigma, München B. Braun Melsungen AG, Melsungen Apotheke, MRI Apotheke, MRI Apotheke, MRI SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe Merck, Darmstadt BD Falcon, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Merck, Darmstadt NeoLab, München Brand GmbH & Co KG, Wertheim Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg B. Braun Melsungen AG, Melsungen B. Braun Melsungen AG, Melsungen PAA, München Carl Roth, Karlsruhe Zellkulturplatte, 48 Vertiefungen, Flachboden mit Deckel BD Falcon, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Flachboden mit Deckel SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea bestellt bei PAA Laboratories GmbH, Cölbe Zellkulturschalen Falcon, Zellkulturschalen 10 cm Corning Omnilab, München Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Materialien Seite 25

28 Materialien und Methoden 4.2 Geräte und Software Gerät 8-Kanal Pipette Research (variabel) 300 μl Absaugpumpe: Vacusafe comfort Autoclav: 2540 SL Bench BioPhotometer Einkanal Pipette Research (variabel) 2,5 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl ELISA-Reader: FluoStar OMEGA Gel Kammer: Wide Mini Sub Cell 6R Graph Pad Prism Image J Inkubator: Hera Cell 150 Intas Gel Jet Imager Kühl- und Gefrierschränke - 80 C - 20 C No Frost Premium + 4 C profi line Laborabzug-7561 DIN Klasse 2 Luer-Zange Magnet Mixer: MR Hei-Mix L Mastercycler ep gradient S Hersteller Eppendorf AG, Hamburg IBS Integra Biosciences, Fernwald Systec, Wettenberg BDK (Luft- und Raumtechnik GmbH), Sonnenbühl-Genkingen Eppendorf, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg BMG LabTec, Bio-Rad Laboratories GmbH, München NIH, USA-Bethesda Haereus, Thermo Fisher Scientific Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen Sanyo, Bad Nenndorf Liebherr, CH Bulle Liebherr, CH Bulle Köttermann Systemlabor, D-Uetze/Hänigsen Materialwirtschaft Klinikum MRI Heidolph, Schwabach Eppendorf AG, Hamburg Microsoft Excel Microsoft Office 2010 Mikroskope: Axiovert 40 CFL Zeiss, Berlin Eclipse TS 100 Zeiss, Berlin Mikrowelle NanoDrop 1000, Spectrophotometer Neubauer Zählkammer Ph-Meter: PB-11 Photo-Dokumentation für PCR-Gel pipetus Pipettierhilfe PowerPac HC Power Supply Primer Blast Vortex-Genie 2 Vortex-Genie 2 Waage: EG NM Wasserbad Zentrifugen : Centrifuge 5804R Centrifuge 5417R Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Geräte TechnoStar, Bremen Thermo Scientific, USA Wilmington Carl Roth, Karlsruhe Sartorius, Göttingen Intas, München Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt Bio-Rad Laboratories GmbH, München Scientific Industries, US-New York Carl Roth, Karlsruhe Kern & Sohn, Balingen-Frommern Memmert Gmbh Co Kg, Schwabach Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Seite 26

29 Materialien und Methoden 4.3 Steriles Arbeiten Zur Vermeidung von Kontaminationen aber auch zum Eigenschutz werden die Zellen ausschließlich unter sterilen Bedingungen isoliert und kultiviert. Dafür werden alle Versuche in einer sterilen Werkbank durchgeführt. Ein vertikaler, laminarer Luftstrom mit eingebauten HEPA (high efficiency particulate air) Filter und UV-Lampe, die am Ende eines jeden Arbeitstages für 30 min eingeschaltet wird, ermöglichen nahezu keimfreies Arbeiten. Zusätzlich ist gründliches Händewaschen vor Arbeitsbeginn, das Tragen von Handschuhen und die Händedesinfektion mit Ethanol 70 % essentiell. Zu Beginn der Tätigkeit werden die Flächen der Werkbank sowie alle verwendeten Materialien mit Ethanol 70 % abgesprüht. Nicht sterile Lösungen, die mit den Zellen in Kontakt kommen, werden entweder steril filtriert oder bei 120 C für 20 min autoklaviert. (Schantz and Ng 2004, S. 4-7) 4.4 Zellisolation Isolation und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe Benötigte Materialien: DMEM High Glucose (4,5 g/l) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mm stabilem Glutamin FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) (für alle nachfolgenden Versuche gilt: FCS muss vor der Verwendung für 30 min auf 56 C erhitzt werden, um das Komplement zu inaktivieren) Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22) Durchführung der Methode: Herstellung des Ad-MSC Kulturmediums mindestens 24 h vor Beginn der Isolation, um eine mögliche Kontamination ausschließen zu können: Endkonzentration 500 ml DMEM 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L Seite 27

30 Materialien und Methoden Das Fettgewebe wird gewogen und in einer Zellkulturschale mit steriler Pinzette und Skalpell zerkleinert. Anschließend gibt man das Fett in ein 50 ml Reaktionsgefäß, füllt mit D-PBS auf, vermischt beides gut durch vorsichtiges Schütteln und zentrifugiert alles für 10 min bei 430 x g, 22 C, ohne Beschleunigung oder Bremse. Das Fettgewebe schwimmt nach der Zentrifugation oben und die auszuwaschenden Blutbestandteile haben sich als Pellet am Boden gesammelt. Nun wird D-PBS und Pellet mit einer autoklavierten Glaspipetten abgesaugt und der Waschschritt zwei- bis dreimal wiederholt, um eine Verunreinigung der Kultur durch andere Zellarten zu minimieren. Zwischenzeitlich kann die Kollagenase-Lösung hergestellt werden, man benötigt 1 ml Lösung pro 1 g Fett: Endkonzentration 0,6 mg Kollagenase CLS II 0,06 % 1 ml D-PBS miteinander vermischen und die Lösung durch einen Sterilfilter zum Fettgewebe geben. Um optimale Voraussetzungen für die Kollagenase zu schaffen inkubiert man das Gefäß im Wasserbad (37 C) für min unter wiederholtem Schütteln bis eine Fettemulsion entstanden ist. Zum Stoppen der Enzymwirkung in diesem Ansatz gibt man nun 10 ml Kulturmedium zu, mischt es durch vorsichtiges Schwenken unter und zentrifugiert alles für 10 min bei 600 x g, 22 C mit einer mittleren Beschleunigungs- und Bremsstärke. Das oben aufschwimmende Fett kann mit der Pinzette abgenommen und der flüssige Überstand abgesaugt werden. Das Pellet wird mit 12 ml warmem D-PBS resuspendiert und, um verbleibendes Bindegewebe zu entfernen, durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 200 µm in ein neues 50 ml Gefäß gefiltert. Nach Zugabe von 15 ml Kulturmedium kann die Zellsuspension in eine Kulturflasche mit 175 cm 2 gegeben werden. Inkubation der Zellen bei 37 C und 5 % CO 2 mit anschließendem Mediumwechsel nach h, um nicht adhärente Zellen (z.b. Erythrozyten) zu entfernen, danach im Intervall von 5 Tagen wechseln. Sind am Folgetag im Lichtmikroskop viele frei schwimmende Zellen zu erkennen ist ein Waschschritt mit D-PBS vor der erneuten Mediumzugabe empfehlenswert. Seite 28

31 Materialien und Methoden Isolation und Kultivierung von Osteoblasten aus Knochen Benötigte Materialien: MEM-EARLE PAA, Pasching, Austria (E15-024) HAM S F-12 PAA (E15-016) FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) Glutamin PAA (M11-006) L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960) ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891) Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Kollagenase Typ: CLS II 330 U/mg Biochrom AG, Berlin (CII-22) Durchführung der Methode: Herstellung des MEM-EARLE/HAM s F12 Kulturmediums vor Beginn der Isolation: 1. L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung Endkonzentration 128 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat (MW: 289,54 g/mol) 0,05 mm 10 ml D-PBS sterile Filtration 20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 C aufbewahren 2. β-glycerolphosphat Stocklösung Endkonzentration 108 mg ß-Glycerolphosphat (MW: 216,04 g/mol) 0,05 mm 10 ml D-PBS sterile Filtration 20 Aliquots á 0,5 ml abfüllen und bei -20 C aufbewahren 3. MEME/HAM s F12 Kulturmedium Endkonzentration 500 ml einer 1:1 Mischung aus MEME und HAM s F12 50 ml FCS 10 % 5 ml Penicillin/Streptomycin 100 U/L 0,5 ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat Stocklösung 0,005 mm 0,5 ml ß-Glycerolphosphat Stocklösung 0,005 mm Seite 29

32 Materialien und Methoden Das Knochenfragment (in dieser Arbeit werden ausschließlich Femurköpfe verwendet) gibt man in eine Zellkulturschale. In ein 50 ml Reaktionsgefäße (A) werden 40 ml D-PBS vorgelegt. Da man zum Bearbeiten des Knochens diesen in die Hand nehmen muss, ist die Verwendung von sterilen Handschuhen erforderlich. Nun mit einer Knochenzange nach Luer kleine Fragmente aus dem Spongiosa- und Markbereich gewinnen und sofort in das vorbereitete Gefäß (A) geben (der restliche Knochen muss als Sondermüll entsorgt werden). Zum Waschen der Knochenstücke füllt man das Gefäß (A) bis 50 ml mit D-PBS auf, verschließt und schwenkt es vorsichtig und saugt mit einer sterilen Glaspipette Fetttröpfchen und D-PBS ab. Diesen Waschvorgang wiederholt man solange bis der Knochen weitestgehend fett- und blutfrei ist. Als nächstes bereitet man die Kollagenase-Lösung zu, man benötigt 1 ml Lösung pro 1 ml Knochen: Endkonzentration 0,7 mg Kollagenase CLS II 0,07 % 1 ml D-PBS miteinander vermischen und steril filtriert in Gefäß (A) geben. Anschließende Inkubation im Wasserbad bei 37 C für eine Stunde unter mehrmaligem Schwenken. Den Überstand aus Gefäß (A) abnehmen und in ein neues Gefäß (B) geben, die Knochenfragmente in (A) werden dann noch weitere zweimal mit D-PBS gewaschen und die Waschlösung wieder in (B) überführt. Gefäß (B) zentrifugiert man für 10 min bei 600 x g, 20 C ohne Beschleunigung oder Bremse, saugt den Überstand ab und resuspendiert das Pellet in 25 ml MEME/HAM s F12 Medium. Abschließend gibt man die Zellsuspension in eine Kulturflasche mit 175 cm 2, diese aus dem Kollagenaseüberstand stammenden Osteoblasten tragen die Bezeichnung OSÜ. Die Knochenfragmente aus Gefäß (A) füllt man ebenso in ein Zellkulturflasche (175 cm 2 ) und gibt 25 ml Medium hinzu, die Zellen, die aus der Spongiosa heraus wachsen werden als Osteoblasten aus der Spongiosa (OSS) bezeichnet. Beide Flaschen werden nun bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert. Mediumwechsel am nächsten Tag und dann alle 5 Tage. Seite 30

33 Materialien und Methoden 4.5 Zellzahlbestimmung Sulforhodamin B (SRB) Färbung SRB bindet unter sauren Bedingungen an Oberflächenproteine und findet Verwendung bei der Erstellung von Wachstumskurven, Toxizitätstests und der Normalisierung von Enzymaktivitäten ohne die Zellen dabei zu lysieren. Benötigte Materialien: Ethanol 99,8 % Apotheke, MRI Essigsäure 99,8 % Sigma, München (695084) Sulforhodamin B Natriumsalz Sigma (S9012) TRIS (hydroxymethyl)-aminomethan Sigma (T87602) Durchführung der Methode: Herstellung der benötigten Lösungen: 1. 1 % Essigsäurelösung Endkonzentration 10 ml Essigsäure 1 % 990 ml ddh 2 O 2. Sulforhodamin B (SRB-) Lösung Endkonzentration 1 g Sulforhodamin B (MW: 580,65 g/mol) 0,4 % 250 ml 1 % Essigsäurelösung Lösung ist wiederverwendbar in brauner Flasche lagern mm ungepufferte TRIS-Lösung (ph = 10 10,5) Endkonzentration 1,2 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 10 mm 1 L dh 2 O Zu Beginn saugt man das Medium von den Zellen ab und fixiert diese für 1 h bei -20 C mit Ethanol. Das Ethanol wird wieder abgesaugt und die Zellen mit SRB-Lösung bedeckt: 50 µl pro Well einer 96-Well-Platte 300 µl pro Well einer 48-Well-Platte 600 µl pro Well einer 24-Well-Platte Seite 31

34 Materialien und Methoden Zur Inkubation der Färbelösung die Platte lichtdicht abdecken und für 30 min auf den Schwenkinkubator stellen. Anschließend wird die wiederverwendbare SRB-Lösung zurück in die Flasche gegeben und der überschüssige, nicht gebundene Farbstoff viermal mit 1 % Essigsäurelösung abgewaschen. Im Lichtmikroskop ist nun eine pinke Färbung der Zellen zu erkennen (siehe Abbildung 11). Abbildung 11: Zellen nach SRB-Färbung Lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen nach Färbung mit SRB-Lösung (Vergrößerung: 10 X). Zur Quantifizierung das SRB vollständig auf dem Schwenkinkubator mit 10 mm ungepufferter TRIS-Lösung lösen 100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 200 µl pro Well einer 48-Well-Platte 400 µl pro Well einer 24-Well-Platte und die optische Dichte (OD) bei = 565 nm (OD des SRB) (siehe Abbildung 12) und = 690 nm (Störeinflüsse, z.b. durch eventuelle Beschädigungen an der verwendeten Platte) messen. Zur Berichtigung der Messwerte bildet man die Differenz aus beidem: OD 565 nm OD 690 nm. Das Ergebnis stellt eine relative Bestimmung der Oberflächenproteine der fixierten Zellen dar und dient somit als relative Zellzahlbestimmung (Skehan, Storeng et al. 1990, S. 1107). Seite 32

35 Absorption Materialien und Methoden Wellenlänge [nm] Abbildung 12: Spektraluntersuchung der SRB-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der SRB-Lösung bei 565 nm. Arbeitsschritt Lösung Dauer / Temperatur Fixierung Ethanol 1 h / -20 C Färbung SRB-Lösung 30 min, lichtdicht, Shaker / RT Waschen 1 % Essigsäure 4 x Farbstoff lösen / Quantifizierung 10 mm ungepufferte TRIS-Lösung Tabelle 3: Arbeitsschritte der SRB-Färbung Übersicht über die einzelnen Arbeitsschritte der SRB-Färbung. bis der Farbstoff vollständig gelöst ist / RT Zellzahlbestimmung (Neubauer Zählkammer) und Aussäen einer bestimmten Zellzahl pro cm 2 Benötigte Materialien: Neubauer Zählkammer Laboroptik GmbH, Bad Homburg Trypan blau 0,5 % Biochrom AG, Berlin (L6323) Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Ethanol 70 % Apotheke MRI Seite 33

36 Materialien und Methoden Durchführung der Methode: Zum Aussäen einer bestimmten Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit, muss erst die Gesamtzellzahl der Zelllösung nach dem Resuspendieren des Pellets ermittelt werden. Dazu entnimmt man der Zellsuspension 30 µl und vermischt diese gut mit 30 µl Trypan blau Stocklösung: Endkonzentration 1 ml Trypan blau 0,5 % 0,125 % 3 ml D-PBS Beschriftungsfeld Zählnetze Grundplatte Außensteg Deckglas Interferenzlinien Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer Die schematische Darstellung zeigt die Interferenzlinien, die zwischen Zählkammer und Deckglas entstehen, wenn man dies nach Befeuchten mit der Atemluft mit sanftem Druck von vorne aufschiebt (modifiziert anhand der Herstellerangaben). Vergrößerte Darstellung der Zählnetze siehe nächste Abbildung. Die speziell für Zellzählungen entwickelte Neubauer Zählkammer (siehe Abbildung 13) wird wie folgt vorbereitet: zuerst Zählkammer und Deckglas mit Ethanol säubern. Anschließend beides mit Atemluft befeuchten und das Deckglas mit sanftem Druck von vorne auf die Zählkammer schieben (Vorsicht: Bruchgefahr des Deckglases). Die Ausbildung von Interferenzlinien ( Regenbogenlinien ) auf beiden Außenstegen zeigt, dass das Deckglas richtig aufsitzt und somit der Abstand zwischen Mittelsteg und Deckglas 0,1 mm beträgt. Nun gibt man die Trypan blau-zelllösung mit einer Pipette an die Grenze zwischen Deckglas und Zählkammer, welche durch die Kapillarwirkung in den Spalt zwischen Deckglas und Kammerboden gesogen wird. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen Kammer und Deckglas verbleiben. Die so beschickte Zählkammer kann nun unter dem Mikroskop ausgezählt werden, wobei blau gefärbte Zellen tot sind und nicht mitgezählt werden. Seite 34

37 Materialien und Methoden Abbildung 14: Vergrößerte Darstellung des eingravierten Zählnetzes auf einer Neubauer Zählkammer (modifiziert anhand der Herstellerangaben) (a) schwarze Punkte: Zellen, die mitgezählt werden, graue Punkte: Zellen, die nicht mitgezählt werden (b) empfohlene Zählrichtung (c) großes Quadrat (insgesamt 9 pro Zählnetz) (d) kleines Quadrat (insgesamt 16 in jedem großen Quadrat eines Zählnetzes) Alle Zellen, die innerhalb der 16 kleinen Quadrate plus diejenigen, welche auf bzw. an zwei der vier Begrenzungslinien liegen werden in Pfeilrichtung zusammengezählt. Auf diese Weise werden die je neun großen Quadrate der zwei Zählnetze ausgezählt, anschließend addiert und die Zellzahl wie folgt berechnet: Gesamtzellzahl G: Anzahl der lebenden Zellen L: Vitalität VI [%]: n: Mittelwert aller gezählten Zellen m: Mittelwert aller lebenden Zellen VF: Verdünnungsfaktor (hier: 2) V: Volumen der Zellsuspension 10 4 : Faktor der Zählkammer Seite 35

38 Materialien und Methoden Um eine definierte Anzahl von Zellen pro cm² auszusäen, wird als nächstes die insgesamt benötigte Zellzahl B berechnet: Mit dem letzten Rechenschritt ermittelt man die Menge an Zellsuspension, die in das Behältnis zuzugeben ist. 4.6 Kultur und Differenzierung Passagieren Benötigte Materialien: Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Trypsin-EDTA (1 X) PAA (L11-004) Kulturmedium für die jeweilige Zellart Durchführung der Methode: Als Erstes das Kulturmedium mit einer sterilen Glaspipette absaugen und 20 ml warmes D-PBS für 5 min in die Flasche geben, um Mediumreste, die das Trypsin inaktivieren würden, auszuwaschen. Bei sehr hoher Konfluenz ( %) sollte dieser Waschschritt ein zweites Mal wiederholt werden. Nach erneutem Absaugen der Waschlösung Trypsin (2 ml auf eine 175 cm² Flasche) hinzugeben, durch Schwenken verteilen bis der Boden vollständig bedeckt ist und die Flasche für 5 min bei 37 C inkubieren lassen. Zum Lösen von noch am Plastik adhärenten Zellen vorsichtig mit der Handinnenfläche gegen die Seitenwände klopfen. Mikroskopisch kontrolliert man ob alle Zellen eine kugelige Form angenommen haben und frei in der Flüssigkeit schwimmen, dies sind sichere Zeichen, dass sie sich vom Boden gelöst haben. Ist das nicht der Fall muss die Inkubationszeit um 5 min verlängert werden. Um nun das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen gesammelt in ein Reaktionsgefäß überführen zu können, die Zellen mit warmem Kulturmedium vom Flaschenboden spülen. Dazu 15 ml Seite 36

39 Materialien und Methoden Medium in eine serologische Pipette aufnehmen, dabei die Flasche so halten, dass der Flaschenhals schräg nach oben zeigt und mehrmals mit diesen 15 ml Medium die Zellen vom Flaschenboden abspülen. Anschließend die Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß geben und für 7 min bei 600 x g, RT mit mittlerer Beschleunigungs- und Bremsstärke zentrifugieren. Nach dem Absaugen des Überstands und Resuspension des Zellpellets in warmem Zellkulturmedium werden die Zellen gezählt (siehe Kapitel 4.5.2) und auf neue Flaschen oder Schalen verteilt Adipogene und chondrogene Differenzierung mittels industriell hergestellter Medien Benötigte Materialien: Preadipocate Growth Medium (PGM)-2 Bulletkit (PT-9502 & PT-8202) Lonza, Walkersville (PT-8002) Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (Ready-to-use) PromoCell, Heidelberg (C-28012) Durchführung der Methode: Der Versuch wird mit Ad-MSCs zweier Spender durchgeführt. Zuerst wird pro Spender eine 48-Well Platte mit Ad-MSCs bestückt. Nach 12 h wird jede Platte zur Hälfte mit dem adipogenen und chondrogenen Medium (200 µl pro Well) beimpft und für 22 Tage bei 37 C und 5 % CO 2 kultiviert, wobei alle 4 Tage die Differenzierungsmedien erneuert werden. Die im Anschluss durchgeführten Färbungen sind in den Kapiteln und beschrieben Herstellung verschiedener Medien für die osteogene Differenzierung Benötigte Materialien: L-Ascorbinsäure-2-phosphatsesquimagnesium Salzhydrat (MW: 289,54 g/mol) Sigma, München (A8960) ß-Glycerolphosphatdinatrium Salzhydrat (MW: 216,04 g/mol) Sigma (G9891) HEPES (MW: 238,31 g/mol) Sigma (H4034) Calciumchloriddiyhdrat (MW: 147,02 g/mol) Sigma (C3881) Dexamethason (MW: 392,47 g/mol) Sigma (D2915) Cholecalciferol (MW: 384,65 g/mol) Sigma (95230) Seite 37

40 Materialien und Methoden DMEM High Glucose (4,5 g/l) PAA, Pasching, Austria (E15-883) mit 2 mm stabilem Glutamin FCS Gold EU approved (FCS) PAA (A15-151) 100 U/L Penicillin/Streptomycin PAA (P11-010) DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma (41639) Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA (H15-002) Durchführung der Methode: Zu Beginn werden die Stocklösungen für die einzelnen Substanzen angesetzt, dabei sollte deren Konzentration so gewählt werden, dass sich einerseits der Stoff vollständig löst andererseits aber nur eine kleine Menge zum Ad-MSC Kulturmedium (Herstellung siehe Kapitel 4.4.1) zugeben werden muss. Am besten eignen sich daher Lösungen die 100- bis 2000fach so hoch konzentriert sind wie die gewünschte Endkonzentration. Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die verwendeten Konzentrationen in den jeweiligen Stocklösungen und Differenzierungsmedien. Substrat [c] Stocklösung [c] im Differenzierungsmedium Lösungsbasis L-Ascorbinsäure-2-phosphat 100 mm 200 µm Ad-MSC Kulturmedium HEPES 2,5 M 25 mm Ad-MSC Kulturmedium ß-Glycerolphosphat 1 M 10 mm Ad-MSC Kulturmedium CaCl 2 1,5 M 1,5 mm Ad-MSC Kulturmedium Dexamethason 100 µm 100 nm D-PBS Cholecalciferol 10 mm 5 µm DMSO Tabelle 4: Mediensupplemente Konzentrationen der Stocklösungen und Differenzierungsmedien sowie Lösungsbasen für das jeweilige Mediensupplement. Der Mediumwechsel von Ad-MSC Kulturmedium erfolgt in einem 5 tägigen und der von Differenzierungsmedium in einem 4 tägigen Intervall. Seite 38

41 Materialien und Methoden Medienübersicht Ad-MSC Kulturmedium: Funktion: DMEM High Glucose (4,5 g/l) mit 2 mm stabilem Glutamin U/L Penicillin/Streptomycin + 10 % FCS Kultur der Ad-MSCs Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS: Funktion: DMEM High Glucose (4,5 g/l) mit 2 mm stabilem Glutamin U/L Penicillin/Streptomycin + 2,5 % FCS Basis zur Herstellung der verschiedenen Medien zur osteogenen Differenzierung und als Kontrolle Basisdifferenzierungsmedium: Funktion: Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS µm L-Ascorbinsäure-2-phosphat + 25 mm HEPES + 10 mm β-glycerolphosphat + 1,5 mm CaCl 2 Induziert die osteogene Differenzierung und wird zur Optimierung mit weiteren Supplementen (Dexamethason, Vitamin D 3, BMP 2 und BMP 7) kombiniert Optimiertes osteogenes Basisdifferenzierungsmedium Differenzierungsmedium: + 5 µm Vitamin D 3 Funktion: Medium, das die besten Ergebnisse bei der osteogenen Differenzierung von Ad-MSCs erzielt Seite 39

42 Materialien und Methoden BRE: Smad 1/5/8 Reporterassay Zur Analyse des TGF-β Signallings werden die Zellen mit Adenovirus Typ 5 infiziert. Das BMP Response Element (BRE) dient als Promotor, an den phosphoryliertes Smad1/4 als Transkriptionsfaktor bindet (Hata, Seoane et al. 2000, S. 230). Mit Ad5-BRE-Luc infizierte Ad- MSCs bilden Luciferase, wenn Smad1/4 phosphoryliert, also der Smad1/5/8-Signalweg vom BMP-Liganden aktiviert wird (siehe Abbildung 15). BMP Rezeptoraktivierung durch Ligandenbindung Alk 1 TGF-βRII Smad 1 Smad 5 Smad Smad 8 Phosphorylierung Smad 4 Luciferase Substrat Lichtsignal Luciferase Expression BRE Reporter Sequenz Abbildung 15: Smad 1/5/8 Luciferase Reporter Assay Nach Rezeptoraktivierung wird der Smad 1/5/8-Komplex phosphoryliert und induziert zusammen mit Smad 4 die Luciferase Expression. Das anschließend zugesetzte Luciferase Substrat wird von der gebildeten Luciferase gespalten wobei ein Lichtsignal entsteht (in Anlehnung an: Massague 2000, S. 170). Benötigte Materialien: Ad5-BRE-Luc Virus bereitgestellt von Prof. S. Dooley Rekombinantes Humanes BMP 2 PeproTech, Hamburg (120-02) Rekombinantes Humanes BMP 7 PeproTech, Hamburg (120-03) Cell Culture Lysis reagent 5 x und Promega, USA (E153A) Luciferase Substrate Seite 40

43 Materialien und Methoden Durchführung der Methode: Ad-MSCs werden in jedem Well von zwei 12 Well Platten ausplattiert und für 24 h inkubiert. Auf 7,5 ml Ad-MSC Kulturmedium 2,5 % FCS gibt man 600 µl Virussuspension und beimpft jedes Well mit 300 µl dieses Ansatzes. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt und entsprechend der S2-Richlinien autoklaviert entsorgt. Nach Entfernung des Virusüberstandes gelten S1-Richtlinien. Je zwei Wells werden mit 500 µl verschiedener Konzentrationen von BMP 2 und/oder BMP 7 (siehe Tabelle 5) stimuliert. Als Grundmedium für die verschiedenen BMP-Konzentrationen und für die Kontrollgruppe wird das Basisdifferenzierungsmedium verwendet. Nach 48 stündiger Inkubation bei 37 C und 5 % CO 2 werden die Zellen lysiert. Der Zelllysepuffer muss vor Gebrauch im Verhältnis 1:4 mit ddh 2 O verdünnt werden. Das Medium wird abgesaugt und je 30 µl Lyselösung werden in ein Well gegeben, durch Schwenken auf dem Wellboden gut verteilt und anschließend friert man die Platten bei -80 C für mindestens 12 h ein. Nun können die Zellen entweder mit einer Pipettenspitze oder einem zugeschnittenem Zellschaber vom Wellboden abgekratzt werden und in je ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert werden. Anschließend werden die Proben bei 4 C und g für 10 min zentrifugiert. Für die Luciferasemessung werden 10 µl vom Überstand in eine 96 Well Platte gegeben, für die Lowry Proteinmessung (siehe Kapitel 4.6.6) benötigt man 2 µl pro Well. BMP 2 BMP 7 BMP , 10, 50, 100 ng/ml 5, 10, 50, 100 ng/ml 5, 10 ng/ml Tabelle 5: Verwendete BMP-Konzentrationen Eingesetzte BMP-Konzentrationen bei der Überprüfung der Aktivierung des TGF-β Signallings mittels BRE Reporterassay. Vor Zugabe des Luciferasesubstrates sollten die Einstellungen am Elisa reader vorgenommen werden: Lumineszenz Messung des durch die Luciferase gebildeten Lichtes mit einem maximalen gain (4000); da die Enzymaktivität ihren Peak zeitabhängig erreicht, wird die Messung mindestens sechs Mal wiederholt, um einen aussagekräftigen Mittelwert zu erhalten. Die Messwerte werden in Relative Light Units angegeben (RLU). Zur Berechnung der RLU pro µg Protein benötigt man die Proteinmenge der gemessenen Proben (siehe Kapitel 4.6.6). Die gemessene RLU jedes einzelnen Wells wird durch die Seite 41

44 Materialien und Methoden dazugehörige Proteinmenge geteilt, abschließend wird noch der Mittelwert aus allen einzeln gemessenen RLU/µg Protein für jede BMP-Konzentration und -Konstellation ermittelt Normalisierung der Luciferasemessung mittels Lowry Proteinmessung Die Proteinmenge wird mittels der von Lowry veröffentlichten Folin Phenol Methode bestimmt (Lowry, Rosebrough et al. 1951, S ). Benötigte Materialien: Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, München (A4503) Na-K-Tartrat Sigma (228729) CuSO 4 *6H 2 O Sigma (31293) Na 2 CO 3 Sigma (S2127) 1 M NaOH Merck, Darmstadt (109137) Folin Reagenz Sigma (47641) Durchführung der Methode: Herstellung der benötigten Lösungen: µg/µl BSA Stocklösung: Endkonzentration: 50 mg BSA 10 μg/μl 5 ml ddh 2 O Zur Berechnung der Standardkurve benötigt man verschiedene BSA-Konzentrationen, die wie in Tabelle 6 dargestellt, zubereitet werden: BSA Stocklösung 8 μg/μl 6 μg/μl 4 μg/μl 2 μg/μl 1 μg/μl 0 μg/μl 10 μg/μl BSA Stock 800 μl 600 μl 400 μl 200 μl 100 μl 0 μl ddh 2 O 200 μl 400 μl 600 μl 800 μl 900 μl 1000 μl Tabelle 6: Pipettierschema der BSA-Konzentrationen zur Erstellung der Standardkurve Übersicht über die verschiedenen Konzentrationen von BSA Stock und ddh 2 O zur Erstellung einer Standardkurve. Aliquots der BSA Stocklösung können bei -20 C gelagert werden. 2. Na-K-Tartrate Stocklösung: Endkonzentration: 2 g Na-K-Tartrate 2 % 100 ml ddh 2 O in brauner Flasche lagern Seite 42

45 Materialien und Methoden 3. CuSO 4 Stocklösung: Endkonzentration: 1 g CuSO 4 * 6 H 2 O 1 % 100 ml ddh 2 O in brauner Flasche lagern 4. Na 2 CO 3 Stocklösung: Endkonzentration: 20 g Na 2 CO 3 2 % 900 ml ddh 2 O 100 ml 1 M NaOH 100 mm 5. Lösung A: Endkonzentration: 20 µl Na-K-Tartrate Stocklösung 1 % 20 µl CuSO 4 1 % 1,96 ml Na 2 CO 3 98 % immer frisch vor Gebrauch herstellen! 6. Lösung B: Endkonzentration: 100 µl Folin Reagenz 1 mg/dl 2,9 ml ddh 2 O immer frisch vor Gebrauch herstellen! Es werden je 2 µl der Probe in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Zur gleichzeitigen Erstellung der Standardkurve werden als Triplikate je 2 µl jeder BSA Konzentration (Tabelle 6) in ein Well einer 96 Well Platte pipettiert. Dann gibt man 150 µl Lösung A in jedes Well (Probe und Standardkurve) und lässt alles für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden 30 µl von Lösung B zugegeben, gut gemischt, um eine Präzipitatbildung zu vermeiden, und es folgt ein weiterer Inkubationsschritt von 1 2 h bei Raumtemperatur. Anschließend ist zu beobachten, wie sich die gelbe Lösung allmählich blau verfärbt. Je intensiver die Blaufärbung umso mehr Protein ist in der Probe. Die Absorption wird mit dem Elisa Reader bei = 750 nm gemessen. Seite 43

46 OD [ = 750 nm] Materialien und Methoden Zur Berechnung der Proteinmenge muss zuerst die Geradengleichung anhand der Standardkurve (siehe Abbildung 16) ermittelt werden. Nun wird die Geradengleichung nach x aufgelöst, die gemessenen Werte für y eingesetzt. Als Ergebnis erhält man die Proteinmenge der Probe in µg/µl. Zum Beispiel: 0.6 Standardkurve BSA y = 0,05905x + 0,04360 R 2 = 0, BSA [µg/µl] Abbildung 16: Beispiel einer Standardkurve der BSA-Lösung Das Diagramm zeigt ein Beispiel für eine Standardkurve der BSA-Lösung, dabei ist auf der Abszisse die BSA-Konzentration in µg/µl und auf der Ordinate die Absorption bei λ = 750 nm dargestellt. Seite 44

47 Materialien und Methoden 4.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR): Charakterisierung auf mrna- Ebene Isolation von mrna aus Zellen Benötigte Materialien: peqgold TriFast Peqlab, Erlangen ( ) Chloroform Roth, Karlsruhe (6340.1) Isopropanol Apotheke, MRI 70 % und 99,8 % Ethanol Apotheke, MRI Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma, München (D5758) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Borsäure Sigma (B7901) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) SIGMA (E51343 Glycerol Sigma (G5516) Isopropanol Apotheke, MRI Bromphenol Blue Sigma (114391) ddh 2 O Apotheke, MRI Durchführung der Methode: Folgende Lösungen müssen vor Beginn der Isolation hergestellt werden: 1. DEPC H 2 O Endkonzentration 1 ml DEPC 0,1 % 1 l ddh 2 O für 1 h bei 37 C inkubieren, anschließend autoklavieren und abkühlen lassen X Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) Endkonzentration 540 g TRIS-aminomethan (MW: 121,14 g/mol) 0,89 M 275 g Borsäure (MW: 61,83 g/mol) 0,89 M 37,3 g EDTA (MW: 372,24 g/mol) 20 mm 5 L H 2 O auf ph 8,3 einstellen Seite 45

48 Materialien und Methoden 3. PCR Ladepuffer (5 X) Endkonzentration 1 mg Zyanoblau 25 ml 10 X TBE 5 X 5 ml Glycerol 10 % 20 ml H 2 O Während der gesamten Isolation ist unter dem Abzug zu arbeiten, da einige der verwendeten Substanzen gesundheitsschädlich sind. Die Zellen wurden bis zu einer nahezu 100 %igen Konfluenz kultiviert. Zu Beginn wird das Medium vorsichtig von den Zellen gesaugt, TriFast zugegeben und gleichmäßig über den Boden verteilt: 500 µl TriFast / 25 cm² Zellkulturflasche 1000 µl TriFast / 75 cm² Zellkulturflasche 1500 µl TriFast / 175 cm² Zellkulturflasche Die Zellen werden gründlich mit einem Zellschaber vom Plastikboden abgeschabt und die Suspension in ein steriles Eppendorf-Gefäß überführt. Soll die Isolation zu einem anderen Zeitpunkt fortsetzen werden, können die Zellen bei -80 C eingefroren werden, andernfalls wird die Zelllösung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen nachfolgenden Bearbeitungsschritten werden die Proben stets auf Eis gelagert. Nach Zugabe von 100 µl Chloroform je 500 µl TriFast wird alles für 15 s vermischt und eine weitere Inkubationspause von 5-10 min eingelegt. Während der anschließenden Zentrifugation bei x g, 4 C für 10 min wird in einem weiteren Eppendorf-Reaktionsgefäß 250 µl Isopropanol je 500 µl TriFast vorbereitet. Nach der Zentrifugation den RNA-haltigen Überstand (obere, klare Schicht) (Abbildung 17 a) vorsichtig in das bereitgestellte Eppendorf-Gefäß pipettieren. Beides wird vermischt, für 10 min auf Eis inkubiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die RNA setzt sich unten als gelartiges meist nicht sichtbares Pellet ab (Abbildung 17 b). Seite 46

49 Materialien und Methoden a b RNA DNA Proteine RNA Abbildung 17: (a) Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt (b) gelartiges Pellet enthält RNA Das linke Reaktionsgefäß ist eine schematische Darstellung der Phasentrennung nach dem ersten Zentrifugationsschritt, wobei der wässrige Überstand die RNA enthält. Rechts ist ein Gelpellet am Gefäßboden zu erkennen, das sich nach Zentrifugation des RNA-Überstands mit Isopropanol vermischt, absetzt. Die flüssige Phase über der RNA wird abgeschüttet, 1 ml Ethanol 70 % zugegeben, im Anschluss wieder wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Diesen Waschschritt ein weiteres Mal wiederholen, danach das Pellet in 30 µl DEPC H 2 O resuspendieren und den verbleibenden Alkohol bei offenem Deckel verdampfen lassen (10-15 min). Die RNA wird bei -20 C gelagert bis sie genutzt wird Bestimmung von Menge und Reinheit der RNA Diese beiden Kriterien werden mit dem NanoDrop Spectrophotometer bestimmt. Zu Beginn muss das Gerät geeicht werden, dazu ermittelt man den Blindwert von DEPC-H 2 O. Anschließend je 1 µl der zu messenden Probe auftragen und gleichzeitig die optische Dichte bei 230, 260 und 280 nm messen. Anschließend berechnet das Programm folgende Quotienten: 260/280: diesen Quotienten nennt man auch primären Reinheitsparameter. Der Richtwert für reine DNA liegt bei 1,8 und für reine RNA bei 2,0. Liegen diese Werte niedriger, spricht dies für eine Verunreinigung durch Proteine, Phenol oder andere Stoffe, die bei 280 nm absorbieren. Seite 47

50 Materialien und Methoden 260/230: dieser Quotient repräsentiert den sekundären Reinheitsparameter. Der Sollwert liegt zwischen 1,8 bis 2,2. Niedrigere Werte können z.b. durch eine Verunreinigung mit Kohlenhydraten und / oder Phenol verursacht sein. Zusätzlich berechnet das Programm über eine modifizierte Beer-Lambert Gleichung die RNA- Menge in ng/µl. Für weitere Informationen zum Gerät siehe Benutzerhandbuch Überprüfung der Integrität der RNA Mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) wird die Intaktheit der mrna überprüft. Zunächst wird anhand der in Kapitel bestimmten RNA-Menge berechnet, welches Volumen der RNA-Probe 0,5 µg RNA enthält. Das ermittelte Volumen der Probe wird mit DEPC-H 2 O bis auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 3 µl PCR- Ladepuffer werden 10 µl von jeder Probe und 2 µl des puc19-markers auf ein 1,5 %iges Agarosegel geladen und für 40 min bei 60 V an den Power Supply angeschlossen. In der anschließenden Fotodokumentation zeigt die intakte mrna zwei klare Banden (28S und 18S ribosomale RNA), ist sie jedoch degradiert sind nur weiße Schlieren zu erkennen. Ein Beispiel für intakte RNA zeigt Abbildung 18. Proben Marker 28S 18S Abbildung 18: Beispiel einer Gelelektrophorese mit intakter RNA (invers dargestellt) Rechts ist der puc19-marker zu erkennen. Die aufgetragenen RNA-Proben weisen je 2 Banden, 28S und 18S ribosomale RNA auf, was für die Intaktheit der RNA spricht. Seite 48

51 Materialien und Methoden Synthese von komplementärer DNA (cdna) Zur Charakterisierung der Zellen mittels PCR muss nun die zuvor gewonnene mrna in cdna umgeschrieben werden. Benötigte Materialien: Transcriptor High Fidelity cdna synthesis Kit Roche, Basel ( ) DEPC-H 2 O (Herstellung siehe Kapitel 4.7.1) Durchführung der Methode: Siehe bitte mitgelieferte Gebrauchsanweisung. Ziel ist es 1 µg RNA in einem Arbeitsgang umzuschreiben. Die so hergestellte cdna wird mit DEPC-H 2 O auf eine Endkonzentration von 5 ng/µl verdünnt und bei -20 C gelagert. Eine anschließende PCR (siehe Kapitel 4.7.5) mit dem Primer für Glycerinaldehyd-3- phosphat-dehydrogenase (GAPDH), dem house keeping gene, das in jeder Zelle vorhanden ist, gibt Aufschluss über die Intaktheit und relative Quantität der cdna Polymerase Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase Kettenreaktion ermöglicht die selektive in vitro Amplifikation bestimmter DNA-Abschnitte durch Nachahmung der in vivo DNA-Replikation. Benötigte Materialien: Primer forward und reverse MWG Operon 10 X Reaktionspuffer BD Axon,Kaiserslautern (22466) (Mg 2+ -frei, Detergenz-frei) Magnesiumchlorid 25 mm Axon,Kaiserslautern (22466) Taq Polymerase 1000 U Axon,Kaiserslautern (22466) dntp-mix 10mM je Nukleotid Axon,Kaiserslautern (24478) Durchführung der Methode: Die Primer wurden mit dem auf verfügbaren Primer Blasts erstellt und von MWG Operon hergestellt (weitere Informationen zu den verwendeten Primern siehe Kapitel 10). Die in Pulverform gelieferten Primer müssen vor dem Gebrauch in DEPC-H 2 O gelöst werden. Das vom Hersteller empfohlene Mischungsverhältnis findet man auf einer mitgelieferten Liste (in unserem Fall 50 pmol/µl). Die Stocklösung sollte bei -80 C gelagert werden und Seite 49

52 Materialien und Methoden wird für die PCR im Verhältnis 1:10 mit DEPC-H 2 O verdünnt. Die Verdünnung kann wie alle anderen PCR Reagenzien bei -20 C aufbewahrt werden. Die nachfolgende Tabelle beinhaltet die benötigten Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß zur Durchführung der PCR. Reagenz Menge/Reaktionsgefäß Template 5 µl (bei schwachem Signal kann die Menge erhöht werden, DEPC-H 2 O Volumen anpassen) DEPC- H 2 O 8,4 µl (bei Erhöhung des Templatevolumens anpassen: Template + DEPC-H 2 O müssen 13,4 µl ergeben) 10 X Reaktionspuffer BD 2 µl Magnesiumchlorid 2 µl Primer forward 1 µl Primer reverse 1 µl dntp-mix 0,5 µl Taq Polymerase 0,1 µl Gesamtvolumen 20 µl Tabelle 7: PCR-Reagenzien und Volumina pro Reaktionsgefäß Liste der PCR-Reagenzien mit den entsprechenden Mengenangaben pro Reaktionsgefäß. Nun werden alle PCR-Zusätze in der aufgelisteten Reihenfolge in spezielle RNase-freie Reaktionsgefäße pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass sowohl die verwendeten Substanzen als auch der hergestellte Ansatz stets auf Eis zu lagern sind. Als Probentemplate wird cdna von Ad-MSCs, als positive Kontrolle primäre humane osteoblastäre cdna und als negative Kontrolle DEPC H 2 O verwendet. Die Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler (siehe Tabelle 8) sowie eine Zykluszahl von 35 wurden nach einigen Probedurchläufen für alle getesteten Primer einheitlich beibehalten. Phase Temperatur Dauer 1. Erste Denaturierung 95 o C 4 min 2. Denaturierung 95 o C 30 s 3. Primerhybridisierung variabel 30 s 4. Elongation 72 o C 30 s 5. Letzte Elongation 72 o C 10 min Tabelle 8: Zeit- und Temperatureinstellungen am Mastercycler Einzelne PCR-Phasen mit den benötigten Temperatur- und Zeiteinstellungen am Mastercycler. 35 X Seite 50

53 Materialien und Methoden Im Denaturierungsschritt werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen der DNA aufgebrochen. Die erste Denaturierung, auch Initialisierung genannt, dauert jedoch länger als alle darauf folgenden, um zu gewährleisten, dass nur noch DNA-Einzelstränge vorliegen und die Primer vollständig voneinander getrennt sind. Als nächstes folgt die Primerhybridisierung, bei der sich die Primer ( Startpunkte der Replikation ) an die DNA anlagern. Die dabei benötigte Temperatur ist für die einzelnen Primer unterschiedlich. Sie hängt maßgeblich von der Primerlänge sowie von der Anzahl der durch drei Wasserstoffbrücken verbundenen Guanin-Cytosin Basenpaare ab, je mehr G-C Paare umso höher ist die Hybridisierungstemperatur. In der letzten Phase, der Elongation, amplifiziert die thermostabile DNA-Polymerase die Einzelstränge zu Doppelsträngen. Die Temperatur hängt von der verwendeten Polymerase ab. Man geht davon aus, dass die DNA-Polymerase etwa 1000 bp/min anlagern kann, dementsprechend ist die Dauer des Elongationsschritts anzupassen. Die Dauer des letzten Elongationsschritts sollte wieder länger gewählt werden, um noch nicht vollständige Amplifikationen abzuschließen. Durch das exponentielle Wachstum der DNA-Stränge sind nur etwa 35 Wiederholungen der Schritte 2-4 nötig, um ausreichend Kopien für weitere Versuche zu erhalten. In der nachfolgenden Tabelle sind die Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und Amplicongröße für jeden Primer aufgelistet: Seite 51

54 Materialien und Methoden Gen Forward Primer Sequenz 5' -> 3' Reverse Primer Akzessionsnummer Hybridisierungstemperatur [ C] Amplicongröße [bp] BMP / TGF-β Signalweg Alk 1 / TGF-β-RI (Smad1/5/8) NM_ GCT CAG ACA CGA CAA CAT CC ATT GCG GCT CTT GAA GTC G Alk 2 / activin A type II receptor precursor NM_ CTT GCA TTG CTG ACT TTG G CCA ATT TCC TCC TCA AAT GG Alk 3 / BMPR-IA NM_ CAC TGC CCC CTG TTG TCA TAG ATC CTG TTC CAA ATC ACG ATT GT Alk 5 / TGF-β-RI (Smad2/3) NM_ TGT TGG TAC CCA AGG AAA GC AAC ATC GTC GAG CAA TTT CC Alk 6 / BMPR-IB NM_ CTT TTG CGA AGT GCA GGA AAA T TGT TGA CTG AGT CTT CTG GAC AA TGF-β-RII NM_ ATG CTG CTT CTC CAA AGT GC AGG TTG AAC TCA CGT TCT GC Bone morphogenetic protein receptor, type II (BMPRII) Insulin-like growth factor-rezeptoren Insulin-like growth factor 1 receptor precursor (IGF-I R) Insulin-like growth factor 2 receptor (IGF-II R) Vitamin D Rezeptoren NM_ CCA CCT CCT GAC ACA ACA CC GAC CTT GTT TAC GGT CTC CTG NM_ TCG ACA TCC GCA ACG ACT ATC AGG GCG TAG TTG TAG AAG AGT TT NM_ GTG GAA GTG TGG ATA TTG TCC AG ACA GCT CAC TGT TGT GTT GAA Retinoid X Rezeptor NM_ TGG GCT CTC CCT TTC CAG T GAT TGC ACA TAG CCG TTT GCC Vitamin D Rezeptor NM_ GAC ATC GGC ATG ATG AAG GAG GCG TCC AGC AGT ATG GCA A House keeping Gene Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase NM_ GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG Seite 52

55 Materialien und Methoden Gen Forward Primer Sequenz 5' -> 3' Reverse Primer Akzessionsnummer Hybridisierungstemperatur [ C] Amplicongröße [bp] Osteoblastäre Marker Alkalische Phosphatase (AP) NM_ ACG TGG CTA AGA ATG TCA TC CTG GTA GGC GAT GTC CTT A Bone morphogenetic protein 2 precursor (BMP 2) Bone morphogenetic protein 4 preprotein (BMP 4) NM_ CCC CCT ACA TGC TAG ACC TGT CAC TCG TTT CTG GTA GTT CTT CC NM_ TGG TCT TGA GTA TCC TGA GCG GCT GAG GTT AAA GAG GAA ACG A Bone Sialoprotein 2 (BSP 2) NM_ TGA CTC ATC CGA AGA AAA TGG AG CTG GAT TGC AGC TAA CCC TGT Matrix gla protein (MGP) NM_ AGA TGG AGA GCT AAA GTC CAA GA GTA GCG TTC GCA AAG TCT GTA Osteocalcin (OC) NM_ CAC TCC TCG CCC TAT TGG C GCC TGG GTC TCT TCA CTA CCT Osteopontin / BSP1 NM_ CTC CAT TGA CTC GAA CGA CTC CGT CTG TAG CAT CAG GGT ACT G Osteoprotegerin (OPG) NM_ CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AGG TTA GCA TGT CCA ATG TG Osteoblast Specific factor 2 (OSF 2) NM_ TAA GTT TGT TCG TGG TAG CAC C GTG TGG GTC CTT CAG TTT TGA TA RANKL NM_ TCC CAA GTT CTC ATA CCC TGA CAT CCA GGA AAT ACA TAA CAC TCC Tabelle 9: Informationen über die verwendeten Primer Tabellarische Auflistung von Akzessionsnummer, Primersequenzen, Hybridisierungstemperatur und Amplicongröße für das jeweilige Gen Nach Ablauf des PCR-Programms werden die Proben mittels Gelelektrophorese (siehe Kapitel 4.7.6) ausgewertet. Seite 53

56 Materialien und Methoden Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden mittels eines Agarosegels, das in einer ionischen Pufferlösung liegt und an ein elektrisches Feld angeschlossen ist, die DNA- bzw. RNA-Stränge ihrer Größe nach getrennt. Zusätzlich wird ein Marker aufgetragen, dessen DNA-Fragmente validiert sind und somit als Referenz eine Größeneinschätzung der untersuchten Proben erlaubt. Benötigte Materialien: peqgold Universal Agarose Peqlab, Erlangen ( ) Borsäure Sigma, München (B7901) TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Sigma (T87602) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma (E51343) Ethidiumbromid Lösung 500 µg/ml Sigma (E1385) puc19-marker ready-to-use Roth, Karlsruhe (T149.1) Durchführung der Methode: Herstellung des 1 X TBE: 1:10 Verdünnung des 10 X TBE (siehe Kapitel 4.7.1) mit dh 2 O. Hauptbestandteil des Gels ist das Polysaccharid Agarose, dessen Moleküle ein engmaschiges Netz bilden, das die Wanderung der geladenen Teilchen erschwert. Die Porengröße dieses Netzes lässt sich durch Konzentrationsänderungen der Agarose variieren. Üblich sind Agarosekonzentrationen zwischen 1,5 bis 2 %, wobei für kleine geladene Teilchen ein hoher Agaroseanteil im Gel gewählt werden sollte und umgekehrt. Für die nachfolgenden Versuche wurde ausschließlich 1,9%iges Agarosegel verwendet (nur am speziell eingerichtetem Ethidiumbromidplatz arbeiten, Nitrilhandschuhe verwenden und Verbrauchsmaterialien sowie Gel im Sondermüll entsorgen): Endkonzentration 1,9 g Agarose 1,9 % 100 ml 1 X TBE aufkochen lassen, bis die Agarose vollständig gelöst und eine klare Flüssigkeit entstanden ist. Nach der Zugabe von 7 µl Ethidiumbromid das Gel auf den vorbereiteten Gelschlitten gießen und abkühlen lassen (ca. 30 min). Nun den Kamm, der kleine Taschen im Gel ausspart, vorsichtig herausziehen und den Schlitten in die mit 1 X TBE gefüllte Kammer einsetzen. Die Kammer muss mindestens bis 0,5 cm über dem Niveau der Geloberfläche mit Puffer aufgefüllt werden. Seite 54

57 Materialien und Methoden Zum Befüllen der einzelnen Taschen wird die Probe (20 µl) mit 5 µl Ladepuffer (puc19- Marker ready-to-use) vermischt und 8 µl dieser Mischung in die Tasche pipettiert. Sind alle Proben in die Taschen eingebracht, die Kathode probennah und die Anode probenfern anschließen und die Einstellungen am Power Supply vornehmen. Als Standardeinstellung wurde in dieser Arbeit eine Spannung von 90 V für 30 min gewählt. Zur Auswertung und Fotodokumentation wird der Intas Gel Jet Imager verwendet. bp Primerdimer (2x) Abbildung 19: Beispielbild einer Gelelektrophorese (invers dargestellt) Links ist eine inverse Darstellung eines Gelelektrophoresebildes mit deutlich sichtbaren Primerdimeren zu sehen, rechts ist eine Referenzabbildung des puc19-markers vergrößert abgebildet. 4.8 Vitalitäts- und Viabilitätsbeurteilung mittels alamarblue Assay alamarblue ist ein wasserlöslicher, gering toxischer Indikator zur quantitativen Bestimmung von Zellproliferationsraten und hilft bei der Viabilitätsbeurteilung nach toxischen Einflüssen auf die Zellen. Wachsen die Zellen so geben sie Wasserstoffionen an ihre Umgebung ab und reduzieren diese dadurch. Findet jedoch kein Wachstum statt so bleibt das Umgebungsmilieu oxygeniert. Der alamarblue -Mechanismus beruht auf einer Redox- Reaktion, bei aktivem Zellmetabolismus (viele H + -Ionen vorhanden) wechselt der wasserlösliche Indikatorfarbstoff Resazurin vom oxygenierten Zustand (blau, nicht fluoreszierend) in die reduzierte Form Resorufin (rot, fluoreszierend) (vgl. Herstellerangaben). Seite 55

58 Materialien und Methoden Benötigte Materialien: alamarblue Reagenz Biozol, Eching (BZL727) Dulbecco s PBS (D-PBS) (1 X) ohne Ca & Mg PAA, Pasching, Austria (H15-002) Durchführung der Methode: Dem Medium wird 1/10 seines Volumens an alamarblue Reagenz zugegeben und die Zellen bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert. Bei hohem Zellmetabolismus kann der Farbumschlag bereits nach 30 min sichtbar sein. Abschließend wird die Resorufinfluoreszenz bei = 544 nm und = 590 nm gemessen. Die Viabilität wird immer als prozentuale Angabe im Vergleich zur Kontrollgruppe aufgeführt. 4.9 Funktionelle Charakterisierung Nachweis osteogener Eigenschaften Zum Vergleich der verschiedenen osteogenen Differenzierungsmedien und zum Nachweis der abgelaufenen Matrixmineralisierung werden folgende Methoden herangezogen: Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (AP) Die Alkalische Phosphatase ist ein in Leber, Knochen und Plazenta produziertes Enzym und kann vor allem im wachsenden Knochen und Gallenflüssigkeit in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus beruht auf einer Phosphatabspaltung durch die Alkalische Phosphatase. Das farblose Substrat 4 Nitrophenolphosphat (pnpp) wird in das gelb gefärbte 4 Nitrophenol (pnp) umgesetzt. Benötigte Materialien: 4 Nitrophenolphosphatdinatriumsalz Sigma, München (71768) Hexahydrat (pnpp) -20 C 4 Nitrophenollösung (pnp) 10 mm Sigma (N7660) Glyzin Sigma (G8898) Trizma-base Sigma (T1503) Magnesiumchlorid Hexahydrat (MgCl 2 * 6 H 2 O) Sigma (M2670) Seite 56

59 Materialien und Methoden Durchführung der Methode: Herstellung des AP-Aktivitätspuffers (ph = 10,5): Endkonzentration 3,75 g Glyzin (MW: 75,07 g/mol) 50 mm 12,11 g Trizma-base (MW: 121,12 g/mol) 0,1 M 203 g Magnesiumchlorid (MW: 203,31 g/mol) 1 M 1 L H 2 O ph auf 10,5 mit NaOH einstellen Nun berechnet man das benötigte Volumen: 100 µl pro Well einer 96-Well-Platte 250 µl pro Well einer 48-Well-Platte 500 µl pro Well einer 24-Well-Platte Nach Ermittlung des benötigten Gesamtvolumens kann die gleiche Menge Substratlösung zubereitet werden: AP- Endkonzentration 2 mg 4 Nitrophenolphosphat (MW: 371,12 g/mol) 2 mg/ml 1 ml AP-Aktivitätspuffer (ph = 10,5) Zuvor muss zur Bestimmung des Substratumsatzes der AP folgende Standardkurve (siehe Abbildung 20) pipettiert und photometrisch die Extinktion bei λ = 405 nm ermittelt werden. 500 µl von µl von µl von µl von µl von µl von µl von µm 500 µm 250 µm 125 µm 62,5 µm 31,25 µm 15,62 µm 7,81 µm 0 jeweils 500 µl AP-Aktivitäts-Puffer vorlegen 900 µl AP-Aktivitäts-Puffer µl 4 Nitrophenollösung 10 mm 1000 µl AP-Aktivitäts-Puffer Abbildung 20: Schema zum Pipettieren der AP-Aktivität Standardkurve Pipettierstandards, die zur photometrischen Bestimmung des Substratumsatzes der AP-Aktivität benötigt werden. Seite 57

60 OD [ = 405 nm] Materialien und Methoden Somit kann jedem Extinktionswert eine bestimmte Substratkonzentration zugeordnet werden. Die Werte können dann mittels der Software Microsoft Excel in einem Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen werden, wobei die Substratkonzentration auf der Abszissenachse und die Extinktion auf der Ordinate dargestellt wird. Durch die Messpunkte wird eine Gerade gelegt und deren Funktion in der Form bestimmt (siehe Abbildung 21). 3 Standardkurve AP-Aktivität 2 1 y = 0,005407x + 0,06280 R 2 = 0, pnp [µm] Abbildung 21: Beispiel einer Standardkurve für die AP-Aktivität Standardkurve der AP-Aktivität, wobei auf der x-achse die Konzentration des 4 Nitrophenol (pnp) aufgetragen wird und auf der y-achse die dazugehörigen gemessenen Extinktionswerte. Die Geradengleichung wird wie folgt nach x aufgelöst werden: Zur Ermittlung der Substratkonzentration der Proben in µm muss der gemessene Extinktionswert für y eingesetzt werden. Das Kulturmedium vorsichtig von den Zellen absaugen, die AP-Substratlösung hinzugeben und alles bei 37 C inkubieren. Gleichzeitig wird AP-Substratlösung ohne Zellen zur Seite 58

61 Absorption Materialien und Methoden Ermittlung des Blindwertes und als negative Kontrolle inkubiert. Zur Messung werden immer 100 µl pro Well in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Inkubationszeit variiert je nach vorhandener Enzymmenge (30 min bis Stunden), sobald jedoch eine Gelbfärbung erkennbar ist, kann mit einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von = 405 nm (siehe Abbildung 22) die gebildete 4 Nitrophenolmenge genau bestimmt werden. Durch Verrechnung mit den Blindwerten (AP-Substratlösung ohne Zellen) und Einsetzen der Extinktionswerte für y in die oben angeführte Gleichung ergibt sich die Substratkonzentration in µm. Wellenlänge [nm] Abbildung 22: Spektraluntersuchung der AP-Substrat-Lösung Die Abbildung zeigt das Absorptionsmaximum der AP-Substrat-Lösung bei 405 nm Zum Normalisieren der AP-Aktivität auf die Zellmenge folgt im Anschluss eine Sulforhodamin B Färbung (siehe Kapitel 4.5.1). Seite 59