2. Biochemie Seminar

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1 2. Biochemie Seminar Rezeptorvermittelte Signaltransduktion (Rezeptortypen und Prinzipien: nucleäre Rezeptoren (Steroid- und Schilddrüsenhormone) - Lipophile Signalmoleküle können durch die Plasmamembran in die Zelle diffundieren und binden dort an intrazelluläre spezifische Rezeptorproteine. - Hierdurch entsteht ein Komplex aus dem Rezeptor und dem lipophilen Stoff (Hormon / Vitamin). - Dieser Komplex bindet an Promotorregionen und wirkt dann als Silencer bzw. Enhancer. - Hierdurch wird die Transkription positiv oder negativ beeinflusst. - Nucleäre Rezeptoren bestehen aus folgenden Strukturen: o am N-Terminus ein variabler Bereich, der essentielle Informationen zur Regulation der Genexpression enthält o eine DNA-Bindungsstelle, die eine hohe Homologie innerhalb dieser Rezeptorfamilie besitzt o eine Kern-Lokalisationssequenz o am C-Termin ist immer die Ligandenbindungsdomäne - Alle nucleären Rezeptoren binden die DNA als Dimere. Zwei konservierte DNA- Sequenzen aus je 6 Basen, die entweder auf dem gleichen DNA-Strang (direct repeats) oder auf den entgegengesetzten Strängen (inverted repeats) vorliegen, dienen als Andockstellen. - Inverted repeats werden von Steroidhormonrezeptoren genutzt, die in homodimerer Form binden (z.b. Glucocorticoidrezeptor und Östrogenrezeptor); direct repeats von Rezeptoren, die in heterodimerer Form binden (z.b. Vitamin D 3, Retinsäure und Schilddrüsenhormone). - Die Spezifität der Rezeptoren wird bei den inverted repeats durch kleine Unterschiede in der Basenfolge und bei den direct repeats durch einen unterschiedlichen Abstand zwischen den Erkennungssequenzen (zwischen 1 und 5 Basen) sichergestellt. - Meistens enthalten die DNA-Bindungsdomänen Cystein-reiche Sequenzen, welche Zink-Ionen koordinativ binden und deshalb als Zinkfingermotive bezeichnet werden. - Aktivierungsmechanismen: o in heterodimerer Form bindende Rezeptoren für Vitamin D 3, Retinsäure und Schilddrüsenhormone Die Rezeptoren sind ausschließlich nucleär lokalisiert. In Abwesenheit der Liganden reprimieren sie als Monomere die Transkription bestimmter Gene. Sobald ein Ligand bindet, erfolgt eine Konformationsänderung. Hierdurch wird der zweite Rezeptor rekrutiert (es entsteht die heterodimere Form) und es kommt zur Aktivierung der Transkription. o Rezeptoren für Steroidhormone In Abwesenheit ihrer Liganden sind sie zytoplasmatisch lokalisiert. Sie sind oft an Proteine (Hsp90) gebunden, hierdurch wird die DNA- Bindungsdomäne blockiert. Bei Bindung des Liganden dissoziiert das Hsp90 ab und es entsteht die homodimere Form, welche dann an die DNA binden kann. - siehe Abb und 25.5 Löffler Seite 764 / 765 UV 1 von 14 TJW

2 Liganden-regulierte Ionenkanäle als Rezeptoren - Es handelt sich hierbei immer um Membranproteine. Ihre Aufgabe ist der nicht-atpabhängige Transport verschiedener Ionen durch die Plasmamembran. - Sie sind nicht spannungsabhängig und ihr Öffnungsverhalten hängt von der Bindung eines spezifischen Liganden ab. - Es gibt sowohl intra- als auch extrazellulär aktivierte Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. - Diese Kanäle vermitteln die schnellsten bekannten zellulären Reaktionen auf Signalstoffe, da unmittelbar nach Bindung des Liganden eine spezifische Antwort erfolgt (Öffnen bzw. Schließen des Kanals). - Die Erzeugung eines intrazellulären Boten- oder eines zweiten Signalstoffes (second messenger) für die Signaltransduktion ist nicht notwendig. - Die Grundstruktur der durch extrazelluläre Liganden-aktivierten Kanäle ist gleich. Sie bestehen aus 5 Untereinheiten, die jeweils aus einem integralen Membranprotein mit 4 Transmembrandomänen besteht. Der N- sowie der C-Terminus liegen extrazellulär. Zusätzlich findet sich eine große cytoplasmatische Schleife. Membranrezeptoren - Wenn ein Ligand als first messenger extrazellulär an diesen Rezeptortyp bindet, dann kommt es zu einer intrazellulären Reaktionskaskade, die meist die Bildung eines intrazellulären Botenstoffes einschließt (sog. second messenger ). - Es werden drei Arten unterschieden: o G-Protein-gekoppelte Rezeptoren o Rezeptor-Tyrosinkinasen und Rezeptor-Serin/Threoninkinasen o Rezeptoren mit assoziierten Kinasen - G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren o Sie durchspannen die Membran siebenmal. (andere Bezeichnung heptahelicale Rezeptoren) o Sie bilden die größte Familie der Membranrezeptoren. o Aufbau: Proteine aus ca Aminosäuren Molekularmassen zwischen 40 und 90 kda N-Terminus extrazellulär, C-Terminus intrazellulär oft intrazelluläre Schleife zwischen der 5. und 6. Transmembrandomäne o Teile der besagten intrazellulären Schleifen sind am Transduktionsprozess verantwortlich, an dem immer heterotrimere G-Proteine beteiligt sind. o Diese G-Proteine sind über eine covalente Verknüpfung mit einem hydrophoben Molekül in der Zellmembran verankert. - Rezeptor-Tyrosinkinasen und Rezeptor-Serin/Threoninkinasen o Es handelt sich um integrale Membranproteine mit einer Transmembranhelix. o Der N-Terminus befindet sich extra- und der C-Terminus intrazellulär. o Die Bindung des Liganden erfolgt extrazellulär. Die Weiterleitung erfolgt über spezifische, nicht-covalente Wechselwirkungen. o Der Rezeptor für TGF-β ist besonders. Hier werden nicht Tyrosin-, sondern Serin-Seitenketten phosphoryliert. - Rezeptoren mit assoziierten Kinasen o Diese Rezeptoren besitzen Ähnlichkeit mit den zuvor genannten. Allerdings liegt die enzymatische Aktivität nicht am selben Protein vor, sondern ist als separates Protein konstitutiv an den Membranrezeptor gebunden. o Dieser Rezeptor vermittelt die Signale von einem Großteil der Interleukine und Interferone, aber auch von Wachstumsfaktoren. UV 2 von 14 TJW

3 o Die Bindung des Liganden erfolgt ebenfalls extrazellulär an speziellen Bereichen. o weiteres siehe Löffler Seite siehe Abb Löffler Seite 768 Insulin-Rezeptor - tetrameres integrales Membranprotein aus je zwei identischen Untereinheiten der Struktur α 2 β 2, welches jeweils ein Insulinmolekül bindet - Die Molekülmasse beträgt 460 kda. - Die einzelnen Untereinheiten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. - Für die Insulinbindung sind die beiden nicht in der Plasmamembran integrierten α- Untereinheiten verantwortlich. Die β-untereinheiten sind typische Rezeptor- Tyrosinkinasen. - Aktivierung o Die Bindung des Insulins löst eine Konformationsänderung aus. o Diese aktiviert die Tyrosinkinase im cytosolischen Abschnitt der β- Untereinheit. o Hierdurch wird die ATP-abhängige Autophosphorylierung mehrerer Tyrosinreste der β-untereinheit in Gang gesetzt. o Durch die Phosphorylierung des Tyrosin 960 wird eine spezielle Bindungsstelle für das Insulinrezeptorsubstrat-1 geschaffen. Das Insulinrezeptorsubstrat ist ein sog. docking-protein. Es sind drei homologe Formen bekannt (1,2 und 4). Die Molekülmassen liegen zwischen 130 und 190 kda. o IRS1 und IRS2 werden nun von der Insulinrezeptor-Tyrosinkinase an zahlreichen Tyrosinresten phosphoryliert. o Nun entwickeln sich an den Phosphotyrosinresten des IRS1 und des IRS2 weitere Bindungsstellen für andere Proteine, v.a. die Phosphatidylinositol-3- Kinase (PI3K) sowie das Protein GRB2. o PI3K bindet mit seiner regulatorischen Untereinheit p85 an IRS1. Hierdurch wird die katalytische Untereinheit p110 des Enzyms aktiviert. o Diese Untereinheit phosphoryliert nun Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP-4,5-P 2 ) zu Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP-3,4,5-P 3 ). o Nun binden an das modifizierte Membranphospholipid v.a. zwei Enzyme: phosphoinositide-dependent kinase (PDK), diese wird aktiviert und phosphoryliert die Proteinkinase B (PKB) an Seryl- und Threonyl-Resten, hierdurch wird dieses Enzym aktiviert. Es muss hierfür aber zwingend an PIP-3,4,5-P 3 gebunden haben. o Nun schafft PKB die notwendige Voraussetzung für die Translokation von Glut4 in die Plasmamembran. o Allerdings reicht dies alleine nicht aus. Die anderen Mechanismen sind kompliziert und zum Teil unklar. o siehe Abb Löffler Seite 822 UV 3 von 14 TJW

4 Second Messenger im zellulären Signaltransfer: Prinzip der Rezeptoraktivierung - Da alle biologischen Plasmamembranen für hydrophile Stoffe eine unpassierbare Barriere darstellen und nur lipophile Stoffe ungehindert ins Innere gelangen können, muss ein Mechanismus vorhanden sein, der extrazellulär Signale, die über hydrophile Stoffe vermittelt werden, in die Zelle bringen kann. - Das Signal muss somit übersetzt werden. Außerdem kann es über bestimmte Mechanismen stark verstärk werden, sog. Signalamplifikation. - In der Zelle müssen die unterschiedlichen Signale dann zusammengefügt werden und die korrekte biologische Antwort erzeugt werden, sog. Signalintegration. - Das allgemein Prinzip ist folgendermaßen: o Bindung eines Liganden an einen extrazellulären Rezeptor (first messenger) o Konformitätsänderung des Rezeptors, welche ebenfalls zu einer Oligomerisierung führen kann. o Initiation einer intrazellulären Signalkaskade - Dies führt zu folgenden möglichen Antworten: o Rekrutierung von Signalproteinen an den Rezeptor o Aktivierung / Inaktivierung von Enzymen durch covalente Modifikationen o Bildung von second messengern - Hieraus resultieren o Veränderung der Genexpression o Veränderung des Stoffwechsels o Veränderung des Cytoskeletts und der Migration o Veränderung der Proliferation oder Apoptose o Differenzierung der Zelle - Rezeptoraktivierung o Rezeptorkinasen und Rezeptoren mit assoziierten Tyrosinkinasen werden erst durch Dimerisierung oder Oligomerisierung aktiviert. o Eine einzelne Transmembranhelix kann extrazelluläre Konformationsänderungen nur schlecht weitergeben. Man erreicht eine Oligomerisierung, indem man einen multivalenten Liganden benutzt. D.h. einen Liganden, der mit mehreren Rezeptorproteinen gleichzeitig interagieren kann. o Es ist jedoch nicht genau bekannt, wie die Bindung des Liganden zur Aktivierung führt. o Bei G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren ist die Oligomerisierung für die Aktivierung eher unwichtig. o Hier kommt es zu einer Veränderung der Transmembranhelices zueinander. Die Änderung wird von dem trimeren G-Protein registriert, welches daraufhin reagiert. Rekrutierung von Effektorproteinen - Nachdem das extrazelluläre Signal über einen hydrophilen Liganden in ein intrazelluläres Signal umgewandelt wurde, werden auf der cytosolischen Seite an der Plasmamembran Effektorproteine benötigt. Diese müssen das Signal in der Zelle weitergeben. Hierfür gibt es folgende Mechanismen: o Protein-Protein-Wechselwirkungen o Protein-Membranlipid-Wechselwirkungen o Lipidanker - Protein-Protein-Wechselwirkungen UV 4 von 14 TJW

5 o Es werden an den aktivierten Rezeptor weitere Signalproteine rekrutiert. Diese treten untereinander in Wechselwirkung. o Dies wird über Interaktionsdomänen ermöglicht. Diese binden an phosphorylierte Aminosäureketten oder an Proteinabschnitte mit definierten Aminosäuresequenzen. o Es ist eine 1:1 Übertragung und keine Signalverstärkung! o siehe Abb Löffler Seite Protein-Membranlipid-Wechselwirkungen o Diese Art der Rekrutierung kann durch eine Modifikation von Membranlipiden erreicht werden. o Bestimmte Lipidkinasen phosphorylieren hierbei Membranlipide. (z.b. die Phosphatidylinositid-3-Kinase phosphoryliert Phosphatidylinositolphosphate) o Dieser Mechanismus spielt eine wichtige Rolle beim anti-apoptotischen PI3K/PKB-Signalweg. - Lipidanker o Außerdem können Proteine über einen Lipidanker an eine Membran gebunden werden. o Hierzu gibt es verschiedene Verfahren, siehe hierzu im Zettel des 1. Seminares. mitogen-aktivierte Proteinkinase-Kaskade (MAPK) - Es handelt sich hierbei um einen weit verbreiteten Signalweg. - Es gibt drei Familien, die in zwei Gruppen aufgeteilt werden: o bei Wachstumsprozessen aktivierte Kinasen ERK1 und ERK2 (extracellular signal regulated kinases) o bei extrazellulärem Stress und durch pro-inflammatorische Cytokine aktivierte Familie p38-kinasen JNK-Familie - Die o.g. Kinasen können nicht direkt von Membranrezeptoren aktiviert werden. Sie sind das Endglied einer Kette von Aktivierungen. o MAP-Kinase Kinase Kinase (MAP3K) aktiviert o MAP-Kinase Kinase (MAP2K) aktiviert o MAP-Kinase (MAP1K) = ERK1 / ERK2 / p38-kinase / JNK-Familie - MAP3K ist immer eine Serin/Threoninkinase Aktivierung der MAP2K über Phosphorylierung an Seryl- und / oder Threonylresten - MAP2K ist eine dual-spezifische Kinase (besitzt eine Serin/Threoninkinase und eine Tyrosinkinaseaktivität; sehr selten) Aktivierung der MAPK über die Phosphorylierung eines Tyrosin-X-Threonin-Motivs o ERK: X = Glutamat o p58: X = Glycin o JNK: X = Prolin - MAPK ist eine Serin/Threoninkinase Aktivierung der Substrate über Phosphorylierung eines Seryl- bzw. Threonylrestes. - Damit dieses Prinzip funktioniert kann, müssen alle Kinasen in enger räumlicher Nähe zueinander stehen. Hierzu gibt es ein sog. Scaffold-Protein (= Gerüst-Protein). Es bindet alle drei Kinasen gleichzeitig. - Diese Signalweitergabe führt zu einer riesigen Signalamplifikation, da es ca MAP3K- aber ca MAPK-Moleküle gibt. - Zur Auslösung der gesamten Kaskade ist die Aktivierung der kleinen G-Proteine der Ras- und der Rho-Familie notwendig. UV 5 von 14 TJW

6 G-Proteine - Hierbei handelt es sich um Guaninnucleotid-bindende Proteine (G-Proteine). - Sie haben Bedeutung bei hormonellen und bei nicht-hormonallen Signaltransduktionsmechanismen. - G-Proteinen kommen in den folgenden zwei Zuständen vor: o GTP-gebundenes G-Protein o GDP-gebundenes G-Protein - Wenn ein G-Protein mit GTP beladen ist, dann beschreibt dieser Zustand die aktive Form. In dieser Form können sie Proteine aktivieren. - Um in die GDP-beladene Form überzugehen, wird die intrinsiche GTPase-Aktivität benutzt. Diese wird meist durch das sog. GTPase-aktivierende Protein induziert. - Für die erneute Aktivierung des G-Proteins muss das GDP zunächst abdissoziieren. Hierzu ist mein ein Guanidinaustauschfaktor (GEF) vorhanden. - Das Guanin-freie G-Protein hat eine sehr große Affinität zu GTP. - Es werden drei Gruppen von G-Proteinen unterschieden: o heterotrimere G-Proteine, die durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktiviert werden o kleine G-Proteine o Translationsfaktoren mit ubiquitärem Vorkommen - siehe Tab Löffler Seite 774 second messenger - Es gibt Signalwege, die zur Synthese oder Freisetzung eines zweiten Botenstoffes führen, der sich im Cytoplasma verteilt. Diesen bezeichnet man als second messenger. - Zum Beispiel aktivieren bestimmte G-Proteine die membranständige Adenylatcyclase. Diese synthetisiert camp aus ATP. Ein aktiviertes Enzym kann viele tausend Moleküle camp generieren, somit wird das Signal amplifiziert. - cgmp entsteht analog zu camp. Die Umsetzung des GTP erfolgt durch Guanylatcyclasen. Diese löslichen Moleküle werden über Stickstoffmonoxid aktiviert. - Außerdem gehören zur Gruppe der second messenger: o Inositoltriphosphate (IP 3 ) o Diacylglycerin (DAG) o Calcium - Beispiel: o Die Phospholipase C spaltet Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat zu DAG und IP 3. IP 3 regt den Calciumausstrom aus dem endoplasmatischen Reticulum an. o DAG und Calcium aktivieren dann die Proteinkinase C, welche eine zelluläre Antwort induzieren kann. o siehe Abb Löffler Seite 775 Regulation von der Ca 2+ -Konzentration im Cytosol - Da die Calicumkonzentration entscheidend ist für viele zelluläre Prozesse (Glykogenabbau in Leber und Muskulatur etc.), muss sie sehr genau reguliert werden. - Mechanismen für die schnelle Bereitstellung: o IP 3 -aktivierte Calciumfreisetzung aus dem ER o Ryanodin-Rezeptoren des sarkoplasmatischen Reticulums o spannungsregulierte Calciumkanäle zur Aufnahme aus dem extrazellulären Raum (die Öffnungswahrscheinlichkeit kann durch camp-abhängige PKA Phosphorylierung zunehmen) UV 6 von 14 TJW

7 o Liganden-regulierte Calciumkanäle zur Aufnahme aus dem extrazellulären Raum (Liganden sind meist Hormone.) - Mechanismen für den Export von Calcium aus dem Cytosol: o Ca 2+ -ATPase in der Plasmamembran o Na + /Ca 2+ -Antiport, welcher sekundär aktiv die Na + /K + -ATPase nutzt o eine im ER lokalisierte Ca 2+ -ATPase o ein System, welches bei Calciumüberladung die Akkumulierung von Calcium in den Mitochondrien ermöglicht - Durch diese Systeme kann sichergestellt werden, dass die Konzentration an Calcium in der Zelle unter physiologischen Bedingungen niedrig ist. - siehe Abb Löffler Seite 776 Signaltransduktionsmechanismus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren - Es sei noch einmal wiederholt, dass die Rezeptoren dieser Familie typischerweise über sieben Transmembranhelices verfügen. Die extrazelluläre Schleife ist für die Ligandenbindung und die intrazelluläre Schleife die Rekrutierung des trimeren G- Proteins übernimmt. - Zum Verständnis siehe Abb Löffler Seite Die Aktivierung erfolgt in folgenden Schritten: o Das heterotrimere G-Protein besteht aus einer α-, β-, γ-untereinheit, wobei das GDP an die α-untereinheit gebunden ist. o Sobald ein Ligand an den Rezeptor bindet, wirkt dieser als Guaninnucleotidaustauschfaktor (GEF). Hierdurch wird GDP gegen GTP getauscht. o Das aktivierte G-Protein zerfällt in seine α- und βγ-untereinheit. o Entweder die α- oder die βγ-untereinheit assoziieren mit dem Effektorprotein und aktivieren oder deaktivieren es. o Eine intrinsische GTPase, welche durch das GTPase-aktivierende Protein (GAP) unterstützt wird, hydrolisiert GTP zu GDP an der α-untereinheit. Daraufhin assembliert diese wieder mit der βγ-untereinheit und dem Rezeptor. Jetzt ist der Ausgangszustand wiederhergestellt. Signaltransduktionsmechanismus des Adenylatcyclase-Systems - Glucagon, Adrenalin und Serotonin bedienen sich zum Beispiel dem Adenylatcyclase- System. Hierbei bindet der extrazelluläre Ligand (first messenger) an einen G-Protein gekoppelten-rezeptor. Dieser aktiviert über das heterotrimere G-Protein die katalytische Domäne der Adenylatcyclase. Diese katalysiert dann folgende Reaktion: o ATP 3,5 -cyclo-amp + Pyrophosphat - Earl Sutherland entdeckte als Erster, dass camp als intrazellulärer Vermittler der Wirkung vieler Hormone eine bedeutende Rolle spielt. Deswegen wird es als second messenger bezeichnet. - Steigerung der camp-konzentration: o Aktivierung der α-untereinheit des heterotrimeren G-Proteins. In diesem Fall handelt es sich um ein stimulierendes G-Protein, somit trägt es den Namen G s α. o Diese Untereinheit aktiviert nun das Adenylatcyclase-System. - Senkung der camp-konzentration: o Aktivierung der α-untereinheit des heterotrimeren G-Proteins. In diesem Fall handelt es sich um ein inhibierendes G-Protein, somit trägt es den Namen G i α. o Diese Untereinheit deaktiviert nun das Adenylatcyclase-System. - Die βγ-untereinheit hat folgende Aufgaben: UV 7 von 14 TJW

8 o Wichtig für die Interaktion mit dem Rezeptor o Inhibition der spontanen Dissoziation des GDP, somit Erfüllung der Funktion eines guanine nucleotide dissociation inhibitor (GDI) o Aktiviert / hemmt verschiedene Formen der Adenylatcyclase o Aktiviert weitere Effektorenzyme wie Phospholipase C o Steuert die Aktivität von Ionenkanälen o Reguliert die an der Signalabschaltung beteiligten G-Protein-gekoppelten- Rezeptorkinasen - Funktionen des camp o Aktivierung der Proteinkinase A o Aktivierung einiger CNGs (cyclic nucleotide gated channels) o Aktivierung von bestimmten GEFs, die kleine G-Proteine aktivieren - Die Proteinkinase A ist ein tetrameres Enzym. Es enthalt zwei regulatorische (R) und zwei katalytische (C) Untereinheiten, deren Substratbindungsstellen durch die regulatorischen Untereinheiten belegt sind. Sobald jeweils 2 camp-moleküle an jede R-Untereinheit gebunden haben, dissoziieren die die C-Untereinheit ab. Nun sind die Substratbindungsstellen freigelegt. - Auch die Transkription von bestimmten Genen (z.b. die Schlüsselenzyme der Gluconeogenese) wird durch erhöhte Spiegel an camp angeregt. Hierfür gibt es eine Promotorregion, die als CRE (camp response element) bezeichnet wird. CREB (camp response element binding protein) ist ein dimeres Protein mit einer Leucin- Zipper-Struktur. Es liegt im Zellkern vor und wird durch die PKA phosphoryliert. Jetzt bindet es mit dem Transkriptionsfaktor TFIID und der RNA-Polymerase II und die Transkription von Zielgenen wird induziert. Signaltransduktionsmechanismus des Phospholipase C-Systems - Die Rezeptoren für Katecholamine, Acetylcholin, Histamin, Angiotensin und viele andere führen nach Bindung des jeweiligen Liganden über ein heterotrimeres G- Protein zur Aktivierung der Phospholipase Cβ, die in mehreren Isoformen vorliegt. - Die Phospholipase C spaltet nun Phosphatidylinositol-4,5-bisphoshat (PIP 2 ) in Inositol-3,4,5-trisphosphat (IP 3 ) und Diacylglycerin (DAG). PIP 2 wird durch zweimalige ATP-abhängige Phosphorylierung aus Phosphatidylinositol gebildet. - Über IP 3 wird Ca 2+ aus dem endoplasmatischen Reticulum freigesetzt. - DAG verbleibt in der Membran und aktiviert zusammen mit Ca 2+ die Proteinkinase C. Signaltransduktionsmechanismus der Rezeptor-Tyrosinkinasen - Die Rezeptor-Tyrosinkinasen sind modulartig aufgebaut. Sie enthalten alle eine cytoplasmatische Tyrosinkinase-Domäne. Die extrazellulären Domänen unterscheiden sich. - Bedeutende Beispiele für diese Art der Rezeptoren sind der VEGFR (vascular endothelial growth receptor). Dieser spielt eine zentrale Rolle für die Angiogenese ( Tumortherapie). Auch der Insulinrezeptor gehört in diese Klasse! Außerdem werden folgende wichtige Signalwege aktiviert: o Ras/Raf/MAPK-Weg o Phosphatidylinositid-3-Kinase-Weg o Phospholipase Cγ-Weg - Konsequenzen der Bindung eines Liganden: o Aktivierung der cytoplasmatischen Tyrosinkinase-Domäne mit einer daraus resultierenden Phosphorylierung cytoplasmatischer Tyrosylreste des Rezeptors. UV 8 von 14 TJW

9 o Die so entstandenen Phosphotyrosinmotive sind spezifische Bindungsstellen für SH 2 -Domänen oder PTB-Domänen. o Die so rekrutierten Proteine lösen die weiteren Signalkaskaden aus. - Es kann auch zu Vernetzungen mit anderen Rezeptoren kommen, dies wird als receptor crosstalk bezeichnet. Signaltransduktionsmechanismus der Rezeptor-Serin/Threoninkinasen - Nach Ligandenbindung erfolgt hier im Unterschied zum Tyrosinkinase-Rezeptor eine Phosphorylierung an Serin- bzw. Threoninseitenketten der Signalproteine. - Alle Cytokine, die über einen solchen Rezeptor arbeiten, gehören zur Gruppe der transforming growth factor β-familie (TGFβ). Diese lässt sich in drei Gruppe unterteilen: o TGFβ-Isoformen TGFβ1 bis TGFβ3 wachstumsinhibierende Wirkung profibrotische Wirkung anti-inflammatorische Wirkung o Gruppe der bone morphogenetic proteins (BMP) Bildung von Knochen- und Knorpelgewebe o Aktivine Erythropoese Neuralentwicklung im Stadium der Gastrulation - Signaltransduktion am Beispiel von TGFβ-Rezeptoren: o TGFβ-Moleküle binden als Dimere an den Rezeptor. o Die Bindung des dimeren TGFβ-Moleküls an den TGFβ-Typ-II-Rezeptor ist Voraussetzung dafür, dass ein Dimer aus TGFβ-Typ-I-Rezeptoren rekrutiert wird. o Der Typ-II-Rezeptor ist dauernd aktiv und phosphoryliert nun den Typ-I- Rezeptor. o Der Typ-I-Rezeptor leitet nun das Signal an intrazelluläre Effektorproteine weiter, sog. Smad-Proteine. o Das Hilfsprotein SARA (Smad anchor for receptor activation) rekrutiert die R- Smad-Proteine (receptor activated Smads) Smad 2 und Smad 3 an den Typ-I- Rezeptor. SARA tritt in Wechselwirkungen mit dem Typ-I-Rezeptor und mit den R-Smad-Proteinen. o Nun wird das R-Smad-Protein an bestimmten Serinresten phosphoryliert. o Hierdurch ergibt sich eine Dimerisierung und eine Assoziation mit einem Co- Smad (common partner Smad), dem Smad 4. o Durch diese Anlagerung ist eine Translokation des entstehenden Heterotrimers in den Nucleus möglich. o Im Nucleus treten weitere Transkriptionsfaktoren hinzu und die Transkription wird ermöglicht. o Es gibt auch eine feedback-inhibition, welche durch das I-Smad-Protein (inhibitory Smad), Smad 7, vermittelt wird. Es verhindert die Phosphorylierung und Dimerisierung des R-Smad-Proteins. o siehe Abb Löffler Seite 790 Regulation des Signaltransduktions-Rückkopplungsmechanismus - Die Termination eines Signalsprozesses ist genauso bedeutend wie die Initiation selbst. Ein Ausfall hat eine ähnliche Folge wie eine Hyperstimulation. Zum Beispiel führt die Überstimulation eines pro-inflammatorischen Cytokins von einer akuten zur chronischen Entzündung. UV 9 von 14 TJW

10 - Zellen reagieren zum Beispiel auf eine Cytokinstimulation nur transient (=vorübergehend). Hierfür existieren mehrere Rückkopplungsmechanismen, um die Signaltransduktion bei andauernder Stimulation zu dämpfen bzw. zu hemmen. - Folgende Mechanismen stehen zur Verfügung: o Rezeptoren können Liganden-abhängig durch Endozytose internalisiert werden. G-Protein gekoppelte-rezeptoren werden hierzu an Serin bzw. Threoninseitenketten phosphoryliert. Dies erfolgt über sog. second messenger-kinase oder über G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK). Über die Phosphoylierung können Protein der Arrestin-Familie rekrutiert werden. Die Funktion von Arrestin besteht in der Verhinderung der neuen Bindung von trimeren G-Proteinen. Hieraus resultiert eine Desensitisierung. Meist ist die Internalisierung jetzt Voraussetzung für die Dephosphorylierung und den erneuten Einbau in die Plasmamembran. o Abbau der stimulierenden Cytokine durch Proteasen. o Inhibitorische Proteine können an aktive Signalsubstanzen binden. Liganden können durch lösliche Rezeptoren abgefangen werden. Kinasen können durch spezifische Inhibitoren gehemmt werden. Transkriptionsfaktoren können durch Bindung an Inhibitorproteine an der Kerntranslokation und / oder der DNA-Bindung gehindert werden. - siehe Abb Löffler Seite 806 Membranstruktur und Transportmechanismen: Funktion und Aufbau von Membranen - Membranen: o trennen Zellen von ihrer Umgebung o vermitteln Zellkontakte o dienen der Kompartimentierung (Trennung von Stoffwechselräumen) - Membranen sind aufgebaut aus: o Proteinen o amphiphilen Lipiden o covalent gebundene Kohlehydrate (2-4%) - Aufbau als Lipiddoppelschicht - Proteine sind entweder eingebettet oder assoziiert o integrale Transmembranproteine bestehen häufig aus mehreren hydrophoben α-helicalen Tansmembransegmenten, deren Seitenketten ein- oder beidseitig in der Lipiddoppelschicht verankert sind (diese können dann Zwischenräume für z.b. Kanäle bilden) o periphere Membranproteine interagieren mit den hydrophilen Köpfen der Lipide oder den äußeren Domänen der integralen Membranlipide - Lipide sind asymmetrisch verteilt, abhängig von Biosynthese oder durch eine energieabhängige Umverteilung. - Lipidzusammensetzung ist organellenspezifisch. - Durch laterale Wechselwirkungen können Mikrodomänen gebildet werden, sog. Rafts sind schwimmende Funktionseinheiten von Proteinen. - Ausgleich erfolgt durch flip-flop spontan (nicht bei Gangliosiden) oder mit Hilfe von Flippasen. UV 10 von 14 TJW

11 - Auf der Außenseite befinden sich bevorzugt: o Phosphatidylcholin o Sphingomyelin o Glykolipide - Auf der Innenseite: o Phosphatidylinositol o Phosphatidylserin o Phosphatidylethanolamin - Änderungen dieser Zusammensetzungen können zur Apoptose führen. Synthese von Membranen - Membranlipide werden im glatten endoplasmatischen Retikulum gebildet. - Enzyme für die Phospholipidbiosynthese sind in der Membran des ger verankert o Sphingomyelin wird auf der luminalen Seite gebildet. o Phosphoglyceride werden an der cytosolischen Seite produziert. - Mechanismen für den Austausch von Membranlipiden sind: o Diffusion (wegen geringer Löslichkeit eher selten) o Transport mit Lipidtransferproteinen (einzelne Phosphoglyceride zum Mitochondrium) o Vesikeltransport (zum Golgi-Apparat und zur Plasmamembran) o Membranfusion (einzelne Membrananteile werden währen deiner reversiblen Fusion ausgetauscht) - Lipidzusammensetzung innen und außen hängt von der Ausprägung spezifischer Transporter ab. o Flippasen: ATP-abhängiger Transport von Phospholipiden von äußeren zum cytosolischen Blatt der Membran o Floppasen: ATP-abhängiger Transport vom inneren ins äußere Blatt o Scramblasen: ATP-unabhängig sorgen für Gleichverteilung in der Membran Wie gelangen Phospholipide zur Membran - s.o. hätte ich mal früher lesen sollen Transport durch die Membran - Membranen sind relativ durchlässig für hydrophobe Substanzen und kleine amphiphile Moleküle (Ethanol). - Neue Untersuchungen zeigen, dass es auch für gelöste Gase Transportproteine gibt. - Membranen sind undurchlässig für geladene hydrophile Moleküle und für Makromoleküle. - Für die selektive Aufnahme und den Transport von Stoffen lassen sich unabhängig von Energieverbrauch drei Transporttypen unterscheiden o Uniport: Transport eines Teilchens in eine Richtung o Antiport: Für den Transport eines Teilchens wird ein anderes in Gegenrichtung transportiert o Symport: mindestens 2 Teilchen werden gleichzeitig in die gleich Richtung transportiert - Strukturell unterscheidet man zwei Grundtypen: o Kanäle: Transportproteine bilden Poren in der Membran, die Kanaltyp abhängig geöffnet oder geschlossen werden o Carrier-vermittelte Transportproteine: sind mit spezifischen Bindungsstellen ausgestattet, Bindung des Liganden löst Konformationsänderung aus - Nach den Transportmechanismen lassen sich unterscheiden: UV 11 von 14 TJW

12 o einfache Diffusion: durch Gap junctions, Kanalproteine und Porine (oder bei membrangängien Stoffe) findet ein Teilchentransport entlang eines Gradienten statt, reguliert wird nur (wenn überhaupt) die Öffnung oder Schließung des Kanals o erleichterte Diffusion (Carrier-vermittelte Diffusion): passive Diffusion mit Hilfe eines Carrierproteins o primär aktiver Transport: energieverbrauchender Transport gegen ein Konzentrationsgefälle, ATP Spaltung ist direkt mit dem Transportprozess gekoppelt o sekundär aktiver Transport: unter ATP Verbrauch wird ein Gradient geschaffen (primärer chemischer Gradient), dieser Gradient liefert die Energie für den sekundär aktiven Transportvorgang - Ausflug ATPasen: o F-ATPasen: Nanoturbinen der ATP-Synthese im Mitochondrium [Na + Uniport / H + Uniport] o V-ATPasen (vakuolär): Zur Ansäuerung von Lysosomen und Endosomen [H + Uniport] o P-ATPasen (passager): [Na + /K + -ATPase, H + /K + -ATPase, Ca 2+ -ATPase] - ABC-Transporter: Verhinderung von Aufnahme toxischer Substanzen (Pharmaka), Tumorresistenz gegen Zytostatika, Ausscheidung von Gallensalzen, Bilirubin und Phosphatidylcholin in Primärgalle [MDR(MRP) multi drug resistance, CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator] Pathobiochemie der Signaltransduktion: virale / zelluläre Onkogene (Ras) - Dieses kleinen G-Protein liegt in 30% aller menschlichen Krebsformen in einer mutierten, konstitutiv aktiven Form zu. Beim Prostatakarzinom liegt die Rate bei nahezu 100%. - Hauptsächlich ist es in das Zellwachstum eingeschaltet und verhindert apoptotische Prozesse. Hauptaktivatoren sind Wachstumsfaktoren. - Ras wechselt, wie ein Schalter, zwischen den Zuständen an und aus; entweder ist GTP gebunden oder das GTP ist zu GDP hydrolysiert. - Nur im GTP gebundenen Zustand, kann es mir anderen Proteinen interagieren. - Eine Punktmutation führt nun dazu, dass die GTPase-Aktivität von Ras wegfällt. Hierdurch ist der Wechsel zwischen der aktiven GTP-Form und der inaktiven GDP- Form nicht mehr möglich. Es kommt folglich zu einer Akkumulation von aktivem Ras in der Zelle und es werden permanent wachstumsstimulierende Signale ausgesendet. - Bislang sind keine Medikamente vorhanden, die gegen onkogenes Ras gerichtet sind. Toxinwirkungen auf G-Proteine (Cholera & Pertussis) - Choleratoxin des Erregers Vibrio cholerae o Dieses Toxin führt zu einer ADP-Ribosylierung der G s α Unterheit. Diese wird hierdurch irreversibel aktiviert und das Adenylatcyclase-System wird in einen daueraktiven Zustand überführt. Es kommt zu einem massiven Überschuß des second messengers camp. o Durch den Überschuss an camp kommt es zu einem vermehrten Einbau des CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Ein Verlust an Chlorid-Ionen in das Lumen ist die Folge. Außerdem kommt es zu einer Hemmung des Na + /H + -Austauschers und des Na + -Kanals (ENaC). Folge ist UV 12 von 14 TJW

13 eine Na + -Rückresorptionsstörung und ein Na + -Verlust. Zusätzlich werden die Tight junctions zwischen den Enterozyten durchlässig. o Hierdurch ergeben sich massive Durchfälle und Elektrolytverluste. Aufgrund der Ursache können diese kaum durch Trinken kompensiert werden. - Toxin von Bordetella pertussis (Keuchhusten) o Hier wird die G i α Untereinheit ADP-ribosyliert. Die Folge ist eine dauerhafte Inaktivierung. Auch hier kommt es dann zu einer Daueraktivierung der Adenylatcyclase, allerdings über einen anderen Mechanismus. o Im Trachealepithel führt das zu einer Steigerung der NaCl- und Wassersekretion. Der Zusammenhang mit dem Krankheitsbild ist allerdings noch nicht zufriedenstellend geklärt- Tumorpromoterwirkung von Phorbolestern - Die Aktivierung der Proteinkinase C erfordert ein komplexes Zusammenspiel. Sie kann Diacylglycerin bzw. Calcium aktiviert werden. (weiteres siehe weiter oben) - Phorbolester sind pflanzlichen Ursprungs und können die aktivierende Form von DAG nachahmen. - Allerdings sind Phorbolester nur sehr schwer abzubauen. Dies führt zur Aktivierung der PKC über einen längeren Zeitraum. Deswegen können sie als Tumorpromotoren wirken. Myasthenia gravis (= schwere Muskelschwäche) - Es handelt sich um eine seltene neurologische Erkrankung. Ursächlich ist der Verlust der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren an der motorischen Endplatte. Hierdurch ist die neuromuskuläre Ankopplung nachhaltig gestört. - Die Folgen sind eine Schwäche und schnelle Erschöpfung der quergestreiften Muskulatur. Die Folgen können tödlich sein. - Die erste Beschreibung stammt von 1672 von Thomas Willis. Die genauen klinischen Symptome wurden zwei Jahrhunderte später durch Erb und Goldflam beschrieben. Der Name wurde 1895 von Jolly geprägt. - Im Serum von ca. 85% der Myasthenia gravis-patienten konnten erhöhte Spiegel von AChR-spezifischen Antikörpern (IgG) nachgewiesen werden. Dieser Nachweis gelang allerdings erst Die Wirkungsweise der Antikörper ist vielfältig. Einige aktivieren das Komplementsystem und führe zur Lyse der Muskelmembran. Anderen verbrücken zwei AChR-Rezeptoren und führen somit zur Degradation. - 75% der Patienten weisen Thymusabnormalitäten auf, so dass eine Entfernung bei einigen erfolgreich war. - Da es sich um eine Autoimmunkrankheit handelt, ist die Immunsuppression ein probates Mittel zur Therapie (z.b. mit Steroiden oder Azathioprinen). - Neben der Immunsuppression ist ebenfalls noch die symptomatische Therapie mit Cholinesterasehemmern (= Neostigmin) sinnvoll. - Die Prävalenz liegt bei ca. 100 bis 200 Erkrankungen auf 1 Million Einwohner. - Die Krankheit beginnt meistens mit Beschwerden der Oculomotorik (= Doppelbildersehen / Lidschwäche); aber auch Schluck- und Sprechstörungen sind häufig. Ein Beginn mit einer Arm- und / oder Beinschwäche ist selten. Noch seltener ist eine Manifestation an der Rumpfmuskulatur. Neurotoxine (Curare) - Das Pflanzengit Curare wird aus Curarea bzw. Strychnos toxifera oder Chondrodendron tomentosum gewonnen. UV 13 von 14 TJW

14 - Die tödliche Wirkung ergibt sich über die Lähmung der quergestreiften Muskulatur. Das Gift verhindert die Öffnung der nikotinischen AChR durch Bindung als kompetitiver Hemmstoff. Hierdurch wird die Öffnungswahrscheinlichkeit der Rezeptoren vermindert. - Als Antidot können Stoffe wirken, die die ACh-Konzentration im synaptischen Spalt erhöhen können (z.b. Cholinesterasehemmer). - In der heutigen Medizin wird der Wirkstoff benutzt, um eine Relaxation der Muskulatur bei Operationen zu erreichen. Allerdings findet er auch Anwendung in der Therapie bei Tollwut, Epilepsie, Tetanus und M. Parkinson. - Andere Neurotoxine stören ebenfalls die Neurotransmission. Dies geschieht ebenfalls durch Hemmung von bestimmten essentiellen Ionenkanälen (n-acrhr etc.) - Beispiele hierfür sind: o α-bungarotoxin: bindet irreversibel an den postsynaptischen n-acrhr o β-bungarotoxin: bindet an der Präsynapse und verhindert die Ausschüttung von Ach o α-dendrotoxin: spezifischer Inhibitor spannungsgeregelter schnell aktivierender K + -Kanäle o α-latrotoxin: wirkt auf die Freisetzung von Neurotransmittern mit mind. 3 Domänen 1. Porenbildung für Ca 2+ und andere Bivalente 2. mit Neurexin (Docking-Protein für synaptische Vesikel) interagierende Domäne 3. Domäne wirkt auf Latrophilin, einen G-Protein gekoppelten Rezeptor o weitere siehe n/neuro_krank.vlu/page/vsc/de/ch/8/bc/neurotransmission/neurotox1.vscml.ht ml UV 14 von 14 TJW