Biofilme: eine Gefahr für das Trinkwasser?

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1 Biofilme: eine Gefahr für das Trinkwasser? Hans-Curt Flemming Jost Wingender Biofilm Centre Universität Duisburg-Essen IWW Zentrum Wasserforschung Mülheim

2 Literaturangaben über Nachweis hygienisch relevanter Organismen in Trinkwasser-Biofilmen: Coliforme Bakterien Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa u. a. Pseudomonaden Legionella pneumophila Atypische Mykobakterien Aeromonaden Cryptosporidium, Giardia Amöben Enteroviren Biofilme als Habitat für Pathogene: flächendeckendes Hygiene-Risiko?

3 Beispiel Verteilungsnetz: Wo sind die Mikroorganismen? Annahmen zur Bestimmung der Biomasse (Zellzahlen, nicht KBE!): - Länge des Netzes: ca km - Durchschnittlicher Rohrdurchmesser: 200 mm - Durchschnittliche Koloniezahl in Wasser: 10 KBE/mL - Durchschnittliche Gesamtzellzahl im Wasser: 10 5 Zellen/mL - Durchschnittliche Koloniezahl auf Oberfläche: 10³ KBE/cm² - Durchschnittliche Gesamtzellzahl auf Oberfläche: 10 6 Zellen/cm -2 - Durchschnittliches Gewicht einer Zelle: g Gesamtvolumen: r 2 h = 5 x ml Biomasse in Wasserphase: 5 x Zellen => 5 x 10 2 g 5 % Gesamtoberfläche: 2 r h = ca cm 2 Biomasse auf Oberflächen: Zellen cm -2 = 10 4 g 95 % 95 % der gesamten Biomasse im Rohrnetz sitzt auf den inneren Oberflächen aber das Wasser wird analysiert!

4 Wo kommen die Keime her? Roh-/Trinkwasser (Infiltration durch vereinzelte Organismen, die im Biofilm ein günstiges Habitat finden) Kontamination aus Herstellung, Lagerung, Einbau von Werkstücken Rohrbrüche, Reparaturarbeiten, Personal Rückfluss von kontaminiertem Wasser über Schwitzwasser oder einströmende Luft in Wasserbehältern Mögliche Nährstoffquellen (Lebensgrundlage) Wasserinhaltsstoffe ausgelaugte mikrobiell verwertbare Stoffe aus Werkstoffen Stoffwechselprodukte der Begleitflora Verschmutzungen (im Rahmen von Rohrbrüchen und Reparaturarbeiten, beim Einbau, z. B.: Fett, andere Gleitmittel)

5 Gibt es ein hygienisches Risiko aufgrund der Biofilme auf den Rohr-Innenflächen von Verteilungsnetzen? Nur positive Befunde werden publiziert, keine negativen. Ergebnis: Ein einseitiges Bild der Realität Konsequenz aufgrund des Vorsorgeprinzips: Forschungs-Projekt Ziel: Rolle der Biofilme als Kontaminationsquelle für das Trinkwasser zu abzuschätzen und wirksame Gegenmaßnahmen abzuleiten * Wie schnell entwickeln sich Biofilme? * Enthalten sie hygienisch relevante Organismen? * Gibt es tatsächlich einen Handlungsbedarf? * Welche Möglichkeiten gibt es, Biofilme zu bekämpfen? -Erkennung (Analytik, Monitoring) -Beseitigung (Desinfektion, Reinigung) -Verhinderung (Inhaltsstoffe, Materialien)

6 Reinigung des Rohrs und Vorbereitung zur Entnahme Wasserproben vom Standrohr

7 Transport ins Labor

8 Bei dicken Belägen: Auskratzen mit einem angeschliffenen Rohr

9 Trinkwasser-Rohr mit Eisenbakterien

10 Mikroorganismen und EPS in Inkrustationsprodukten auf der Innenseite von Trinkwasser-Rohren. Filamente: Trocknungsartefakte der EPS

11 Dünne Beläge in PVC-Rohren, können nicht ausgekratzt werden

12 Besiedlungsdichten Ort Trinkwasserrohre (2-99 Jahre) Biofilm- Reaktor (18 Monate) weichdichtende Schieber (3 Wochen - 4 Jahre) Besiedlung (Zellen pro cm 2 ) Anteil kultivierbarer Bakterien (%) 4,1 x 10 5 bis 0,0004 bis 2,0 x ,4 3,6 x 10 6 bis 0,01 bis 2,6 3,1 x ,7 x 10 6 bis 2 bis fast 100 1,8 x 10 9 kultivierbare Bakterien (HPC, "heterotrophic plate count"): Bestimmung auf R2A-Medium, 20 C, 7 Tage Bebrütung

13 Besiedlung von 18 Trinkwasserrohren höhere Zelldichten an den Rohrwandungen im Vergleich zum Trinkwasser - Trinkwasser 1,9 x ,6 x 10 5 Zellen pro ml - Rohrinnenflächen 4,1 x ,0 x 10 8 Zellen pro cm² keine Korrelation zwischen Alter der Rohre und Besiedlung der Rohrinnenoberflächen Besiedlung (Zellen bzw. KBE/cm²) Zellzahl Koloniezahl Alter der Rohre (Jahre)

14 Einfluss des ph-wertes? Zellzahl bzw. Koloniezahl/cm² vs. ph-wert 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 HPC GZZ 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 #/cm² 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 ph-wert

15 Pilzbefunde in Rohrnetzproben KBE/cm 2 30,6 Im Mittel: 5,1 KBE/cm , ,1 0,8 2,1 1,3 4,4 4,8 0,3 2 5,3 4,8 3, Nr. Rohrprobe < ng < ng 1 Vorwiegend: Fusarium, Phialophora und Phoma Pilze gehören zur normalen Biofilm-Population im Verteilungsnetz Die gefundenen Arten haben kein oder nur sehr geringes pathogenes Potenzial

16 Junge Biofilme Rohr-Reaktor, modularer Aufbau, Einschub von Aufwuchsträgern aus verschiedenen Materialien

17 Besiedlungsdichte nach 18 Monaten Exposition Vergleich Wasserwerk/Netz: Gesamtzellzahl/cm² GZZ/cm² WW Netz Cu V4A PVC PE

18 Fälle aus der Überwachungspraxis: Lang anhaltende oder immer wiederkehrende Koloniezahlerhöhungen oder Coliformen-Befunde im Anschluss an Neuverlegungsmaßnahmen, die mit einer zeitlichen Verzögerung eintreten Desinfektionsmaßnahmen mit z. B. 50 mg/l Chlor oder 150 mg/l H 2 O 2 führen nur zu einer sehr kurzzeitigen Verbesserung der mikrobiologischen Trinkwasserbeschaffenheit. Bei kontinuierlicher Chlorung mit 0,1-0,3 mg/l Chlor, sind die Wasserproben mikrobiologisch nicht zu beanstanden. Sobald die Chlordosierung abgestellt wird, sind wieder coliforme Keime in den Wasserproben nachweisbar. Die aus einem Problemgebiet isolierten Coliformen gehören häufig derselben Art an. Die Isolate zeigen über einen längeren Zeitraum hinweg ein gleichbleibendes Stoffwechselprofil ( gleiche Quelle)

19 Symptome für Biofilm-Kontaminationen Vorgehen zur Lokalisierung von Biofilmen: 1. Gezielte Probenahmen 2. Ausbau verdächtiger Bereiche 3. Mikrobiologische Biofilm-Untersuchung

20 Schematische Darstellung des Schieberkreuzes Hydrant (aus dem die beanstandete Probe kam) EPDM-beschichtete Absperrschieber

21 Ausbau eines Rohrstückes mit Schieber

22 PE-Rohr EPDM 1) -beschichteter Schieberkeil 1) EPDM: Ethylene Propylene Diene Monomer

23 Biofilme auf einem EPDM 1) -beschichteten Schieberkeilen Verweilzeit im Netz: 7 Monate Verweilzeit im Netz: 11 Monate 1) EPDM: Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk

24 Biofilm auf einem Schieberkeil (REM-Aufnahme)

25 Flagellaten und Rädertierchen im Biofilm auf einem Schieberkeil Protozoen im Biofilm

26 Nematoden in Biofilm auf einem Schieberkeil Nematoden im Biofilm

27 Hausinstallationen: Polymere im Kontakt mit Trinkwasser Absperr-Armaturen Ausgleichsgefäße Beschichtungen, Anstriche Chemikalien-Mischgeräte Dichtungen Enthärtungsanlagen Filter Folien zum Auskleiden Gummidichtungen Isolierstücke Kaffeemaschinen Kleber Rohrbelüfter Schläuche Schwimmer Ventile Biofilm im Inneren eines Panzerschlauchs (U. Szewzyk, Berlin)

28 Einnistung von P. aeruginosa in TW-Biofilm log Koloniezahl auf R2A- Medium (KBE/cm²) Gesamtzellzahl (Zellen/cm²) Biofilm P. aeruginosa DSM auf C-F-C- Medium (KBE/cm²) Biofilm P. aeruginosa DSM in Arginin- Bouillon (MPN/cm²) 1 0 n. n. n. n. n. n. Kontrolle 1,5 Std. 1 Tag 7 Tage 14 Tage 21 Tage 28 Tage < 1 n. n. n. n. Ablauf P. aeruginosa DSM in Arginin- Bouillon (MPN/ml) Auch nach 28 Tagen ist P. aeruginosa noch im Biofilm nachweisbar. Ein weiterer Versuch zeigt ähnliche Ergebnisse (keine mehr im Ablauf, aber noch im Biofilm)

29 Zusammenfassung Biofilme kommen ubiquitär in Trinkwasserverteilungssystemen vor. Der größte Teil der Biomasse im Verteilungsnetz befindet sich an den Innenflächen der Trinkwasserrohre. Es handelt sich meist um eine relativ dünne, unregelmäßige Besiedlung in Form einzelner Zellen und von Mikrokolonien; es können manchmal auch flächendeckende Biofilme vorliegen. Die Population im Biofilm ist deutlich verschieden von der in der Wasserphase Auf neu installierten Materialien wird die Plateau-Phase der Biofilmbildung innerhalb von einigen Monaten erreicht.

30 Zusammenfassung Obligat pathogene Mikroorganismen sind in der Regel nicht vorhanden; fakultativ pathogene Mikroorganismen sind gelegentlich vorhanden (im zentralen Versorgungsnetz in relativ geringen Konzentrationen; Vermehrung möglich unter bestimmten Bedingungen wie Stagnation, günstige Nährstoffsituation, erwärmtes Wasser von großer Bedeutung in Hausinstallationen). Im Fall von Verschmutzungen: Einnistung und Persistenz in etablierten Biofilmen sowohl von obligat als auch fakultativ pathogenen Mikroorganismen über Tage bis Wochen. Einsatz von Desinfektionsmitteln unter praxisrelevanten Bedingungen kontrolliert Ausmaß der Biofilm-Bildung, führt aber nicht zur vollständigen Entfernung von Biofilmen.

31 Fazit: Nährstoff-Situation ist entscheidend Begünstigung der Etablierung hygienisch relevanter Organismen durch Materialien, die Nährstoffe abgeben Die Mengen, die mikrobielles Wachstum unterstützen, können erheblich geringer sein als in Migrationsversuchen erfassbar Erhöhte Migration bei Warmwasser! Eindeutig: hygienische Probleme in der Hausinstallation zu erwarten! Erforderliche nächste Schritte zur Vermeidung von Risiken in Verteilungsnetzen und Hausinstallation: Praxis-Untersuchungen und Risiko-Abschätzung Vermeidung abbaubarer Stoffe in der Rezeptur Sanierung: Desinfizierbarkeit von Biofilmen Rolle der Begleitflora bei Wachstums-Unterstützung hygienisch relevanter Organismen

32 Dank an: Verbundpartner im Projekt Biofilme in der Trinkwasser-Verteilung Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF) RWW, Stadtwerke Düsseldorf, Duisburg, Berlin, WTV Astrid Dannehl für wichtige technische Hilfe

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34 Einnistung von hygienisch relevanten Bakterien in bestehende Biofilme Testorganismen Nicht mucoider Pseudomonas aeruginosa DSM Mucoider Pseudomonas aeruginosa SG81 Testsystem Kleinreaktor mit paraffinierten Objektträgern Testbedingungen Trinkwasserdurchfluss von 50 ml/min Biofilmwachstum über 14 Tage in Trinkwasser Variierende Inkubationsbedingungen Untersuchungsparameter Koloniezahl auf R2A (20 C, 7 Tage) Gesamtzellzahl (DAPI) Koloniezahl Pseudomonas aeruginosa (CFC, 36 C, 48 h, Bestätigung mit Cetrimid-Agar und anschließendem Oxidase-Test) Most Probable Number (MPN) Pseudomonas aeruginosa mittels Arginin- Bouillon (36 C, 48 h, Bestätigung wie bei CFC) Proteingehalt des Biofilms und der EPS (Lowry) Kohlenhydratgehalt des Biofilms und der EPS (Dubois) LIVE-DEAD-Färbung (CLSM)

35 Kleinreaktor Objektträger Ablauf Zulauf Aufsicht auf einen, mit Objektträgern bestückten, Kleinreaktor ohne Deckel

36 Paraffinierte Glasobjektträger Paraffinbeschichtung Mattierter Rand des Objektträgers

37 Versuchsapparatur Zulaufschlauch mit Aluminiumfolie ummantelt Kleinreaktor mit Aluminiumfolie ummantelt Ablaufschlauch mit Aluminiumfolie ummantelt

38 LIVE-DEAD-Färbung: Bei den Bildern 1a 5a, wo nur Rotfärbung zu erkennen ist, die Propidiumiodid-Färbung (geschädigte Zellen) dargestellt, in den Bildern 1b 6b, wo nur Grünfärbung zu erkennen ist, die SYTO 9-Färbung (alle Zellen) dargestellt. In den Bildern 1c 6c wurde das resultierende Überlagerungsbild aus beiden Komponenten dargestellt. Bei den Bildern handelt es sich um optische Schnitte.

39 Schlussfolgerungen P. aeruginosa kann sich unter gewissen Voraussetzungen in bereits bestehende Biofilme aus Trinkwasserbakterien einnisten. Ausschlaggebend ist eine - Neutralisation von hemmenden Wasserinhaltsstoffen - Kontaktzeit mit dem Biofilm (>12 h) - Anwesenheit von Nährstoffen schützt vor Inhibition Je länger die Kontaktzeit, desto höher die Wahrscheinlichkeit, sich einzunisten

40 Erfassung des Kontaminationspotentials von Biofilmen in der Verteilung von Trinkwasser Verbundprojekt des BMBF Beteiligte: Hygiene-Institut der Universität Bonn (Prof. Exner, Schirmherr) IWW Mülheim und Universität Duisburg (Prof. Flemming, Koordination) Univ. Tübingen (Prof. Botzenhart) Umweltbundesamt, Bad Elster (Dr. Feuerpfeil) Ernst-Rodenwald-Institut Koblenz (Dr. Michel, Dr. Hoffmann) Universität Düsseldorf (Priv.-Doz. Dr. Schulze-Röbbecke) Hygiene-Institut der Universität Bonn (Prof. Schoenen) Universität Düsseldorf (Prof. Schultze) Universität Frankfurt (Prof. Schubert) TU Berlin (Prof. Szewzyk) Stadtwerke Düsseldorf (Dr. Rohns) RWW, BWV, WTV, Stadtwerke Duisburg

41 - Was sind Biofilme? - Wo gibt es Biofilme im Trinkwasser? - Verbundprojekt-Ergebnisse - Einnistungsversuche - Hausinstallation