Mutation, Rekombination und Kartierung

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1 Mutation, Rekombination und Kartierung Mutationen Sind sprunghaft auftretende Veränderung der Erbinformation in Körperzellen (somatische Mutation) oder Keimzellen, die vererbbar ist. Diese Veränderung prägt sich phänotypisch unterschiedlich stark aus. Die durch eine Mutation verursachte Merkmalsänderung kann rezessiv sein und bei Individuen mit diploiden Chromosomensatz im Erscheinungsbild ohne sichtbare Auswirkung bleiben. Formen der Mutation: Mutationen in Körperzellen werden bei der Mitose an alle folgenden Zellgenerationen weitervererbt. Ein solches Individuum hat dann neben Zellen mit dem Ausgangsgenotyp auch solche mit der Mutation. Der Umfang der Veränderung des Individuums hängt von dem Entwicklungsstadium ab, in dem die Mutation aufgetreten ist. Mutationen in Keimzellen wirken sich auf das ganze, sich aus der befruchteten Eizelle entwickelnde Individuum aus. Durch die Mitosen während der Individualentwicklung wird die veränderte Erbinformation auf alle Körperzellen übertragen und bei der Fortpflanzung auf die Nachkommen vererbt. Mutationen außerhalb des Zellkerns: Veränderungen der DNA in Plastiden und Mitochondrien. Sie äußern sich in Funktionsstörungen der Plastiden oder in komplexen Störungen des Organismus (z.b. Auftreten panaschierter Blätter, Atmungsdefekte). Mutagene sind Faktoren, die die Mutationen auslösen (z.b. physikalische Einflüsse, chemische Stoffe). Mutagene wirken nicht zielgerichtet. Mutation Beispiele für Mutagene - radioaktive Strahlung, Röntgenstrahlen, UV-Strahlen - Temperatur, hohe Temperaturen, Kälteschocks - Gifte (Colchizin, Nikotin) - anorganische Gase Säuren - Industrieabgase, Nahrungsmittel,.. Mutationstypen Genmutationen (Veränderungen der Erbinformation eines Gens) Chromosomenmutationen (Veränderungen an Chromosomen, die mehrere Gene betreffen, z. B. Chromosomenbrüche - führen zum Strukturumbau der Chromosomen) Genommutationen (Veränderungen im Chromosomenbestand; häufig auf Störungen des Kernspindelapparates zurückzuführen) Mutationen Reparatur von Mutationen Da spontane Mutationen relativ häufig sind und in jeder Zelle auftreten können, werden sie durch spezifische Enzyme zum großen Teil repariert. Dabei werden fehlerhafte Strukturen der DNA herausgeschnitten und durch eine neue Basenpaarung ersetzt. Mutationen erhöhen die Variabilität einer Population sind eine Grundlage der Evolution sind häufig Ursache für Krankheiten und Fehlbildungen sind für die Pflanzenzüchtung von Bedeutung Mutationsraten Sind Mutationen eines Gens (DNA-Mutationen oder Gen -Mutationen als Folge von DNA-Mutationen im Regulatorbereich eines Operons ) also sehr unwahrscheinlich? - bei Bakterien beträgt die Mutationsrate ca. 1/ von Bakterien, der Art E.coli, besitzen 100 eine Mutation E. colis teilen sich unter optimalen Bedingungen alle 20 Minuten. Die Tabelle rechts zeigt die Vermehrung einer Ausgangszelle sowie die Zahl der Zellen mit einem mutierten X-Gen. Bereits nach zwölf Stunden sind in der 36. Generation über 3000 mutierte Zellen anzutreffen. Bei Eukaryoten muß man zwischen somatischen Mutationen und Keimbahnmutationen unterscheiden. Somatische Mutationen betreffen irgendwelche Körperzellen des Individuums und werden nicht auf d ie nachfolgende Generation übertragen. Für die Evolution spielen so lche somatischen Mutationen also keine Rolle. Anders sieht es bei den Keimbahnmutationen aus, also bei Mutationen in den Keimzellen (Ei-und Samenzellen). Die Mutationsrate beträgt bei Eukaryoten etwa 1/ , ist also zehnmal höher als bei Prokaryoten. Da Eukaryoten sehr viel mehr Gene haben als Prokaryoten, ist die Wahrscheinlichkeit, eine mutierte Keimzelle anzutreffen, ziemlich hoch. Ein Organismus mit Genen hätte bei der Mutationsrate von 1/ also 10% mutierte Keimzellen. Man nimmt an, daß beim Menschen ca. 10% bis 40% der Keimzellen mindestens ein mutiertes Gen besitzen. ungerichtete Mutationen Chemische Mutagenese Kassetten Mutagenese Misincorporation Mutagenese Spiked Oligonucleotide Primers

2 chemische Mutagenese chemische Mutagenese 2 Nitrose Säuren Reagiert mit den Aminen der Purine und Pyrimidine und es entstehen Diazonium-Derivate - Guanidin -> Xanthine (paart mit T) - Adenin -> Hypoxanthine (paart mit C) - Cytosin -> Uracil (paart mit A) Es werden Transitionen generiert (Purine <-> Purine und Pyrimidine <-> Pyrimidine) Reaktivität: C > A > G 6:2:1 DeaminiertCytosin zur Uracil (ph < 2,5) me 5-Cytosin ist geschützt Bei ph >6,0 werden stabile Intermediate gebildet (Hydroxyaminocytosin), welche sich mit Adenin paaren In beiden Fällen findet eine Transition statt (C-G Basenpaare werden in A-T konvertiert) Bisulfite Hydrazine Reagiert nur mit C, welches zu Uracil deaminiert Es werden die gleichen Transitionen gebildet wie bei Hydroxylaminen Die heterocyclischen Ringe von C und T werden aufgebrochen, wodurch es zu Fehlpaarungen während der Replikation der DNA kommt. Kassetten Mutagenese Es wird ein Pool an Oligonucleotiden synthetisiert, die in gleichen Mengen aus allen vier Basen in den ersten beiden Positionen bestehen und in der dritten nur aus G oder C (auch in gleichen Mengen) Dabei entstehen 32 Codons. Der zweite Strang der Kassette besteht aus Tri-Inosin (paart mit allen Basen) 5 - NN G / C I I I -5 Die entstandenen Kassetten werden dann in Gen, Plasmid, Promotor, durch Restriktion und Ligation eingesetzt. Misincorporation Mutagenese Hydroxylamine In vivo oder in vitro (PCR) werden Nukleosid- Analoga zu den normalen Nukleosiden angeboten (1-10% 10% im Verhältnis zu den normalen). Die Analoga können dann zu Fehl- paarungen, nachdem sie in die DNA eingebaut wurden, führen. Spiked Oligonucleotide Primers Beim DNA-Synthetisieren werden die einzelnen Nukleosid-Substrate mit den anderen Nukleosiden verunreinigt. Dadurch können bis zu 80 Basen große Zufalls Primer entstehen Die Primer werden dann in das Genom durch Restriktion und Ligation oder mittels PCR eingebaut Mutation im Laboralltag PCR mit einer Polymerase ohne Proofreading Funktion z.b. Taq-Polymerase sie macht alle 5x10 4 Basen einen Fehler

3 Gerichtete Mutation site-directed Mutagenese klassische site-directed Mutagenese Megaprimer Methode (single Tube) Primer Extension Methode Generation von Sets an Deletionsmutanten mit Exonuclease III bzw BAL 31 Linker-scanning Mutagenese In vitro Mutagenese Megaprimer Methode Primer Extension Methode Sets an Deletionsmutanten mit Exonuclease III bzw BAL 31 Rekombination

4 Rekombination Mechanismus der homologen Rekombination 1. Ausrichten von 2 homologen DNA Fragmenten 4. Strangbruch, Einwanderung, Exonuklease Homologe Rekombination während der Meiose Horizontaler Gentransfer: sexuelles Verhalten bei Bakterien - horizontaler Gentransfer - Reparatur von DNA Läsionen (TT-Dimere, Doppelstrangbrüche ) 2. Strangbruch 3. Eindringen von Einzelstrang (3 Ende) in benachbarten Duplex -> D loop Mechanismus der homologen Rekombination 5. Polymerase, Ligase 6. Schenkelwanderung (branch migration) Fehlpaarungen stoppen Rekombination TT-Dimere Welche Enzyme sind an der homologen Rekombination beteiligt? Komponenten wurden genetisch identifiziert: Mutationen, welche Rekombinationsfrequenz bei der Konjugation herabsetzen Gene erhielten den Namen rec (recombination) RecA Protein reca Gen reca - mutiertes Allel

5 Enzyme der homologen Rekombination Komplementärer Strangaustausch durch RecA: : 352 AS, funktioniert als Multimer. Bindung an Einzelstrang-DNA in Gegenwart von ATP RecBCD: Exonuclease, Helicase und Endonuclease an chi- Sequenzen Branch migration wird durch das RuvAB Protein stimuliert. Bindung von ruva (2 Tetramere an Überkreuzungsstelle), dann Ausbildung des ruvab Komplexes, der unter ATP Verbrauch branch migration vorantreibt Auflösung der Hollidaystruktur durch RuvC Funktion von reca RecA ist ein multifunktionelles und ubiquitäres Enzym, reguliert Synthese und Aktivität der Enzyme der DNA-Reparatur (SOS- Induktion, umud), katalysiert die homologe Rekombination und rekombinative Mutagenese. Ein homologes Protein Rad51 wurde in Eukaryoten einschließlich des Menschen entdeckt. Homologe Paarung: : Das reca-protein, MGW , bindet zuerst an eine Region einzelsträngiger DNA (ssdna). Ein Filament von reca-proteinen ordnet sich um die ssdna an. Das reca-ssdna-filament bindet dann an die DNA-DoppelhelixDoppelhelix. Das reca Protein sucht die DNA Doppehelix schnell nach einer Sequenz ab, die komplementär zu ssdna ist. Die ssdna paart jetzt mit dem komplementären Strang der Doppelhelix. recakatalysiert die Strangassimilation,, die von der ATP-Hydrolyse angetrieben wird. Das Produkt der Reaktion "Heteroduplex" besteht aus einem Dopppelstrang und einer einzelsträngigen Schleife und hat die Gestalt des Buchstabens D ( D-loop structure ). RecAMutanten haben eine um 10-4 herabgesetzte Rekombinationshäufigkeit. Branchmigration: Wanderung der Kreuzungsstelle (branchmigration) durch Verdrängung des gepaarten Bereichs eines Stranges durch den bisher ungepaarten Bereich desassimilierten Einzelstrangs. Phasen: : Die durch RecAkatalysierte Reaktion läßtsich in drei Schritte einteilen: Eine langsame präsynaptische Phase in der RecAan Einzelstrang-DNA polymerisiert Eine schnelle Paarungsreaktion zwischen Einzelstrangregion und komplementärer Doppelstrang-DNA. Ausbildung einer Hetero-Duplex-Verbindung Langsamer Ersatz eines Strangs aus Duplex unter Ausbildung einer langen Heteroduplex-Region. RecA-DNA Nucleoprotein Filament Der RecBCD- Endonuklease-Komplex 28 kd recbcd Komplex: 3 UE mit relativen Molmassen von 140, 130, und 60 kd; kodiert von recb, recc, recd. Er wird auch als Exonuclease V bezeichnet, weil er in Gegenwart von niedrigen Konzentrationen ATP sowohl einzelsträngige als doppelsträngige DNA von den Enden her abbaut. DNA-Helicase Funktion n (kodiert durch recb), d.h. Fähigkeit Doppelstränge unter Spaltung von ATP zu entwinden. Während das Enzym an der DNA entlangwandert, entwindet es den vor ihm liegenden Teil des Doppelstrangs. Da es den gebundenen DNA -Strang relativ langsam entläßt, entstehen DNA- Moleküle mit 2 Einzelstrangschleifen. Endonuclease -Funktion bevorzugt, wenn in einem der beiden Stränge die Sequenz 5 CTGGTGG (chi -Sequenz ) vorkommt. Die Spaltung erfolgt 4-6 Nukleotide auf der 3 Seite der chi-sequenz. Solche Sequenzen sind bevorzugt alle 5000 bp im E.coli Genom vorhanden. Chi- Sequenzen sind bevorzugte Orte (hot spots) der Rekombination. RecA? bindet spezifisch an ssdna? 1 RecA Monomer per 5-6 Nukleotide? Bindung an DNA ist nicht sequenzspezifisch (Rückgrat) Modell der Funktion von recbcd: 1. Bindung an ein Doppelstrang-Ende 2. Entwindung und Windung mit unterschiedlichen Raten, so daß zwei Einzellstrangschlaufen entstehen 3. endonukleolytische Spaltung eines Einzelstrangs in der Nähe der chi-sequenz 4. Fortschreiten des Enzyms, so daß sich das 5 Ende der geschnittenen Schleife zum Doppelstrang zurückbilden kann, während das 3 Ende als Einzelstrang freibleibt und verlängert wird. Beachte, daß alle einzelsträngigen Abschnitte mit ssb-protein bedeckt sind. RecBCD Pathway Modell der generellen Rekombination durch den recbcd pathway DNA- Fragment rekombiniert mit einem circulären Chromosom. Dabei wird eine gerade Zahl von Strangaustauschen benötigt um den Ring wiederherzustellen. RecBCD (Exonuclease V) bindet an ds DNA Enden und entwindet die DNA unter Ausbildung einer Schleife ("looptail") und dann einer Doppelschleifenstruktur, die sich an der DNA entlang bewegt. Nach Erreichen einer richtig orientierten chi site (recombinational hotspot) schneidet das Enzym einen DNA- Strang, unter Bildung eines Einzelstrang 3 Endes.. Dieses Einzelstrang-Ende Ende wird elongiert unter weiterer Entwindung. D-loop-Bildung und Strangassimilation: : Unterstützt von RecA und ssb Proteinen,, das 3 Ende dringt in eine homologe ds DNA ein und bildet einen D-loop aus. Spaltung des D-loops, möglicherweise durch Exonuclease V; Durch Strangpaarung unterstützt durch reca und ssb Proteinen wird eine Holliday Verbindung erzeugt. Auflösung der Holliday-Struktur, wahrscheinlich durch recg (oder ruvab). Ein Paar rekombinanter Moleküle mit hybrider DNA flankiert mit DNA mit parentaler (links oder rekombinativer (rechts) Konfiguration wird gebildet. Die Produkte von ruva und ruvb verstärken die Bildung der von RecA katalysierten 3-Strang Heteroduplex Strukturen: RuvA erkennt die Struktur der Holliday junction; RuvB ist eine ATPase, die den Motor der branch migration darstellt. Die Geschwindigkeit der branch migration kann bp/sec betragen. RuvC kodiert für Endonuklease, die Holliday junctions spezifisch erkennen und spalten kann. Dadurch Auflösung ("resolution") der junction. Unabhängig von reca.

6 Funktion von ruvab und ruvc Involviert in späte Phasen der Rekombination. Die Produkte von ruva und ruvb verstärken die Bildung der von RecA katalysierten, am 3 -Strangende lokalisierten Heteroduplex Strukturen. RuvA erkennt die Struktur der Holliday junction; RuvB ist eine ATPase, die den Motor der branch migration darstellt. Die Geschwindigkeit der branch migration kann bp/sec betragen. RuvC kodiert für Endonuklease, die Holliday junctions spezifisch erkennen und spalten kann. Dadurch Auflösung ( resolution ) der junction. Unabhängig von reca. RecA und RecBCD RecA-abhängiger Strangaustausch zwischen partieller und vollständiger Duplex-DNA. Ein verbundenes Molekül ("joint molecule ") mit der selben Struktur wie ein Rekombinations - Intermediat wird gebildet RecBCD Endonuclease ereicht eine chi Sequenz. Dort wird ein endonukleolytischer Schnitt gemacht. Verlust von RecD, Verbleib der Helicase Aktivität RuvABC Komplex katalysiert Schenkelwanderung Rekombinationsfrequenz während der Konjugation Wild-typ 1 reca recbcd Fusion zweier zirkulärer DNA Moleküle Austausch von DNA Fragmenten zwischen 2 DNA Molekülen

7 Homologe Rekombination D-Loop Cre loxp Entdeckt in der Bacphage P1 Anwendbar auch in Hefe und Säugetierzellen loxp Site ist 34 bp lang (zwei inverted repeats von je 13bp) Kartierung Kartierung Replika Plattierung Entstand in der Mikrobiologie zur Charakterisierung verschiedener Bakterien-Stämme Früher wurden Bakterien an Hand von biologischen Besonderheiten, Unterschiede im Phänotyp, eingeteilt und vom Wildtyp unterschieden Heute werden alle Organismen durch ihre Nucleotid- Sequenz charakterisiert Heutzutage ist die Kartierung von Genomen eher ein Gebiet der Bioinformatik

8 Unterbrechung der Paarung Unterbrechung der Paarung ein Hfr-Stamm mit den genetischen Eigenschaften thr +, leu +, gal +, lac +, ton R, azi R, str R wird mit einer F - -Empfängerzelle kultiviert die thr -, leu -, gal -, lac -, ton S, azi S, str S ist Zu veschiedenen Zeitpunkten werden Proben der Kultur entnommen und auf verschiedene Mangelmedien ausplattiert So lässt sich ein zeitliche Auflösung der Anordnung der Genmarker ermitteln Kartierung in der Gegenwart Das Genom eines Organismus wird kultiviert, eine cdna-bank wird angelegt Die cdna-bank wird mehrmals sequenziert Die Ergebnisse der Sequenzierung werden miteinander verglichen und am Computer werden die einzelnen Fragmente (halb-)automatisch zusammengefügt Die gewonnene Sequenz wird mit anderen bekannten Sequenzen auf Homologien verglichen, wodurch sich die ersten Gene bestimmen lassen Die weiteren Ergebnisse sind ein Zusammenspiel aus Forschung mit RNA und Proteinen, wodurch sich der Ort der Gene im Genom zurückverfolgen lässt