RNase P ein mögliches Antibiotika-Target?

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1 Wirkstoffforschung Von der RNA- zur Protein-Welt RNase P ein mögliches Antibiotika-Target? Prof. Dr. Roland K. Hartmann und Dennis Walczyk, Institut für Pharmazeutische Chemie, Philipps-Universität Marburg 6 q&more 02.13

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3 Wirkstoffforschung Die Evolution des trna-prozessierungsenzyms (RNase P) hat in den verschiedenen Bereichen des Lebens zu sehr unterschiedlichen architektonischen Lösungen geführt. So ist die bakterielle RNase P grundsätzlich anders aufgebaut als die menschlichen RNase P-Enzyme in Zellkern und Mitochondrien. Dieser strukturell-funktionelle Unterschied könnte zur Entwicklung neuer Antibiotika genutzt werden. Die zentrale Rolle von Proteinen in lebenden Zellen Nahezu alle Prozesse des Lebens ob im kleinsten Bakterium oder in einer hochkomplexen menschlichen Zelle werden auf molekularer Ebene durch Proteine, Proteinkomplexe oder Komplexe, die aus Proteinen und Ribonukleinsäuren (RNA) bestehen (sog. Ribonukleoproteine), bewerkstelligt und reguliert. Eine zentrale Rolle dabei spielt die sog. enzymatische Katalyse, mit deren Hilfe verschiedenste biochemische Reaktionen ermöglicht, beschleunigt und orchestriert werden. Proteine werden in einer komplizierten Fabrik (dem Ribosom, einem riesigen Ribonukleoprotein-Komplex) aus verschiedenen einzelnen Bausteinen (Aminosäuren) zusammengesetzt. Den Bauplan für das jeweilige Protein liefert dabei die Boten-RNA (mrna). Die Aminosäuren werden durch spezifische Transporter (trnas = Transfer- RNAs) am Ribosom abgeliefert. Die trnas sind also unentbehrlich für eine funktionierende Proteinsynthese und müssen durch eine Prozessierung nach ihrer Roh-Synthese in eine biologisch aktive Form überführt werden (Abb. 1). Es gibt in der Regel 20 verschiedene Aminosäuren und für jede Aminosäure mindestens eine spezielle trna, die in Abbildung 1 als verschiedenfarbige Schubkarren veranschaulicht sind. Ribonuklease P Abb. 1 Von der 5 -trna-prozessierung zum Protein. Die Vorläufer-tRNAs (dargestellt durch Schubkarren) werden von der RNase P prozessiert und so in ihren funktionsbereiten Zustand überführt. Anschließend erfolgt am Ribosom die Proteinsynthese. Der rote Sperrbalken illustriert die von uns verfolgte Strategie, neue Antibiotika zu entwickeln, die die Proteinbiosynthese auf der Ebene der trna-prozessierung hemmen. Für die Prozessierung der trnas nach ihrer Rohsynthese ist die Ribonuklease P (RNase P) unentbehrlich: Sie spaltet durch zielgerichtete Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung eine Verlängerung (5 -Flanke) der Vorläufer-tRNA ab, wodurch ein funktionales trna-ende entsteht. Die so entstandene trna kann nur in dieser maturen Form die Aminosäuren effizient zum Ribosom transportieren, weshalb dieser Prozess in vivo essenziell ist. Strukturell ist die bakterielle RNase P aus einer größeren katalytischen RNA- und einer kleinen Protein- Untereinheit aufgebaut; Letztere ist zwar nicht direkt an der Katalyse beteiligt, aber unter zellulären Bedingungen unverzichtbar [1]. Die Entdeckung der katalytischen Eigenschaften dieser RNA im Jahr 1983 durch Sidney Altman war seinerzeit ein absolutes Novum (Nobelpreis 1989 an S. Altman und Tom Cech). In der Folgezeit kristallisierte sich dann heraus, dass die Architektur der RNase P-Enzyme in den unterschiedlichen Domänen des Lebens (Bacteria, Archaea, Eukarya und eukaryontische Organellen) stark voneinander abweicht. So besitzt die 8 q&more 02.13

4 kernlokalisierte humane RNase P neben ihrer RNA- Komponente nicht nur einen Proteinkofaktor, sondern 10 verschiedene Proteinkomponenten. In Landpflanzen und humanen Mitochondrien wurden sogar reine Proteinenzyme ohne RNA-Untereinheit gefunden [2-3]. Es ergibt sich somit ein Bild, nach dem in der Evolution von Organismen, die sich von den Bakterien wegentwickelt haben, die Proteinlastigkeit der RNase P zugenommen hat [4-5]. Von der RNA- zur Protein-Welt Dieser gerade beschriebene evolutionäre Trend steht in Einklang mit der Hypothese, dass die frühe molekulare Evolution des Lebens auf dem Weg zur heute existenten proteindominierten Welt eine sog. RNA-Welt -Phase durchlaufen hat. Man nimmt an, dass das ursprüngliche Leben in dieser erdgeschichtlich kurzen Übergangsphase ausschließlich durch RNA-Polymere (vielleicht zusammen mit kleinen Peptiden) bewerkstelligt wurde, da RNAs sowohl Enzyme als auch genetische Informationsspeicher (wie z. B. bei RNA-Viren) sein können [6]. Nach dieser RNA-Welt-Hypothese entstanden erst später Proteine und damit Enzyme, wie wir sie heute kennen. So war möglicherweise auch die Ur-RNase P ein reines RNA-Enzym (= Ribozym; Abb. 2). Im Laufe der Evolution haben dann die Bakterien ein kleines Protein hinzurekrutiert, während die RNase P RNA der Archaeen davon unabhängig 5 gänzlich andere Proteinkomponenten akquiriert hat. In den eukaryontischen Kernen wurden diese Archaea-typischen 5 Proteine beibehalten und im Laufe der Evolution noch 4 5 weitere Proteine hinzugewonnen. Keines dieser archaealen/eukaryontischen Proteine besitzt eine erkennbare Ähnlichkeit zu dem bakteriellen RNase P-Protein (Abb. 2) [5]. Ausnutzen der evolutionären Unterschiede zur Antibiotikaentwicklung Eine zentrale Voraussetzung für die medizinische Verwendbarkeit solcher Wirkstoffe ist, dass sie zwar hochwirksam am Zielort sind, aber die entsprechenden Roland K. Hartmann, geb. 1956, ist Professor der Pharmazeutischen Chemie an der Philipps-Universität Marburg. Er studierte Biochemie an der Freien Universität Berlin, wo er 1988 mit dem Ernst Reuter-Preis für seine hervorragende Dissertation ausgezeichnet wurde. Seine Forschungsinteressen umfassen Ribozyme (insbesondere RNase P), regulatorische RNAs, RNA-Viren, Interaktionen von RNA mit Proteinen und kleinen Liganden, Aptamere, Antisense- Nukleinsäuren und RNA-Interferenz im Kontext von Krebs. Dennis Walczyk, geb. 1984, studierte Chemie an der Philipps-Universität Marburg. Seit 2012 ist er wissenschaftlicher Mitarbeiter und Doktorand in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Hartmann am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg und beschäftigt sich dort u.a. mit der Entwicklung von Inhibitoren der bakteriellen RNase P. q&more

5 Wirkstoffforschung menschlichen Enzyme unbeeinträchtigt lassen. Genau dies wäre hier der Fall, da sich die Architektur der humanen RNase P-Enzyme im Zellkern und in den Mitochondrien grundsätzlich von der bakterieller RNase P-Enzyme unterscheidet. Darüber hinaus erfüllt die RNase P die wichtige Bedingung, dass sie zu den 6 7 % jener bakteriellen Gene gehört [7-8], die für das Überleben der Mikroorganismen unverzichtbar sind. Die Voraussetzungen für eine Entwicklung RNase P-spezifischer Antibiotika erscheinen also günstig. Wir haben daher zunächst die Möglichkeit untersucht, die Funktion der katalytischen RNA-Komponente der bakteriellen RNase P zu hemmen. Dafür wurden Antisense-Oligonukleotide entwickelt, die affin und spezifisch an einen gut zugänglichen Bereich der RNA-Untereinheit binden, wodurch eine biologisch inaktive Konformation der RNA induziert und die Bindung der zu prozes sierenden Roh-tRNA (das Substrat) gehemmt wird. Kinetische Untersuchungen ergaben Hemmeffekte im niedrig-nanomolaren Bereich [7, 9]. Schließlich konnte diese Hemmung der bakteriellen RNase P auch in vivo nachgewiesen werden, wobei wir hier Oligonukleotid-Analoga, sog. peptide nucleic acids (PNAs) verwendet haben, die zudem an invasive Peptide gekoppelt wurden. Mit diesen Experimenten konnte erstmals eine spezifische und bakteriostatische Inhibierung der bakteriellen RNase P dokumentiert werden [10]. Allerdings ist auch die Proteinuntereinheit der bakteriellen RNase P ein attraktives Ziel für Inhibitoren, da sie ebenfalls für das Überleben der Bakterienzellen unabdingbar ist. Wir haben dazu unter Verwendung der bekannten Molekularstruktur des Proteins ein sog. computergestütztes Wirkstoffdesign durchgeführt, um Verbindungsklassen zu identifizieren, für die eine Bindung an das RNase P-Protein, insbesondere im Bereich seiner zentralen Furche, die an der Substratbindung beteiligt ist, vorhergesagt wird [11]. Eine identifizierte Molekülgruppe mit elongierter Struktur zeigte dann tatsächlich eine signifikante und spezifische Inhibierung der RNase P-Funktion in kinetischen In-vitro-Experimenten, allerdings liegt der bisher erzielte Wert für eine halbmaximale Hemmung noch im mikromolaren Bereich. Abb. 2 Evolutionäre Veränderung der RNase P-Enzyme in den verschiedenen Domänen des Lebens und Entwicklung von einem hypothetischen RNA-Enzym zu einem reinen Protein-Enzym. Modifizierte Abbildung nach [5]. Innerhalb der Eukarya hat eine Diversifizierung stattgefunden: In den Zellkernen (Nucleus) von Tieren (Animalia) findet man ein RNA-Enzym mit 10 assoziierten Proteinen, in den Mitochondrien dagegen ein reines Proteinenzym, das sich aus 3 verschiedenen Proteinuntereinheiten zusammensetzt. In Landpflanzen besteht die RNase P aus einem singulären Protein, sowohl im Kern als auch in den Mitochondrien und Chloroplasten. 10 q&more 02.13

6 Abb. 3 Dreidimensionale Darstellung des bakteriellen RNase P-Holoenzyms. Die P-RNA (blau) bildet mit dem P-Protein (anthrazit) einen Ribonukleoprotein-Komplex, an den sich die Vorläufer-tRNA (rot) anlagert. Der zu prozessierende Bereich der trna bindet dabei an die zentrale Furche des Proteins. Die Vergrößerung zeigt das P-Protein mit gebundenem Liganden (orange), der als Inhibitor fungieren soll. Ausblick Wir planen, die eben erwähnten, gegen die Proteinuntereinheit gerichteten Verbindungen im Rahmen einer Struktur-Aktivitäts-Untersuchung weiter zu optimieren. Dazu wird die dreidimensionale Struktur des Proteins im Komplex mit dem Inhibitor ermittelt, um so die Grundlage für das Design und die Synthese von derivatisierten Verbindungen mit höherer Affinität zu schaffen. Wir profitieren hierbei insbesondere von einer fruchtbaren Kooperation mit der organisch-synthetischen Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Diederich, die ebenfalls am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg angesiedelt ist. In einem weiteren Ansatz versuchen wir ebenfalls, die bereits skizzierten architektonischen Unterschiede zwischen RNase P-Enzymen auszunutzen. Mittels eines Bakterienstammes, der entweder die bakterielle RNase P oder die ausschließlich proteinabhängige RNase P aus A. thaliana für die trna-prozessierung verwendet, soll in einem Hochdurchsatzverfahren (high-throughput screening, HTS) eine Verbindung gefunden werden, die selektiv die Vermehrung der in Abhängigkeit von der bakteriellen RNase P wachsenden Bakterien stört. Ein solches Molekül wäre demnach nicht nur spezifisch für die bakterielle RNase P, sondern notwendigerweise auch Zellwand- und membrangängig. Hier ist eine Kooperation mit dem Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie in Berlin geplant. Wir hoffen somit, durch geschicktes Ausnutzen der strukturellen Unterschiede zwischen verschiedenen RNase P-Enzymen einen potenten Inhibitor finden und so einen Beitrag zur Entwicklung möglicher neuer Antibiotika leisten zu können. roland.hartmann@staff.uni-marburg.de Literatur [1] Hartmann, R.K. et al. (2009) Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 85, [2] Gobert, A. et al. (2010) Nat. Struct. Mol. Biol., 17, [3] Holzmann, J. et al. (2008) Cell, 135, [4] Evans, D. et al (2006) Trends. Biochem. Sci., 31, [5] Walker, S.C. (2008) Cell, 135, [6] Bartel, D.P. & Unrau, P.J. (1999) Trends. Cell. Biol., 9, M9-M13 [7] Willkomm, D. et al. (2003) Chembiochem, 4, [8] Commichau, F.M. et al. (2013) Mol. Biol. Syst., 9, [9] Gruegelsiepe, H. et al. (2003) Chembiochem, 4, [10] Gruegelsiepe, H. et al. (2006) J. Biol. Chem., 281, [11] Willkomm, D. et al. (2010) RNase P as a drug target. In F. Liu & S. Altman (Eds.), Protein Reviews, 10, Foto: istockphoto.de Horned_Rat, Ordination für Prävention und Regulationsmedizin, kfs-medizin.at q&more