Untersuchung der Auswirkungen von Rapamycin auf die Leberregeneration und Neoangiogenese nach Teilleberresektion an der Ratte INAUGURAL- DISSERTATION

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1 Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung der Chirurgischen Forschung der Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie des Universitätsklinikums Münster Untersuchung der Auswirkungen von Rapamycin auf die Leberregeneration und Neoangiogenese nach Teilleberresektion an der Ratte INAUGURAL- DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin ( Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Uta Susanne Grothe (geb. Gallenkamp) aus Würzburg Hannover 2005

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. M. Fehr Prof. Dr. med. Dipl.- Ing. H. U. Spiegel 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. M. Fehr 2. Gutachter: Prof. Dr. Johannes H. Harleman Tag der mündlichen Prüfung: 3. Juni 2005

3 Meinem Mann

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literatur Leberanatomie und- mikroskopie Makroskopische Anatomie Mikroskopische Anatomie Mechanismen der Leberzellschädigung und Formen des Leberzelltodes Mechanismen der Leberregeneration Besonderheiten der Leberzellregeneration Mechanismen der Leberzellregeneration Lebertransplantation und Immunsuppression- ein historischer Rückblick Rapamycin- Eigenschaften und Anwendung Wirkmechanismus Indikationen und Anwendung Größenreduzierte Lebertransplantation und Rapamycin 40 3 Material und Methoden Versuchstiere und Studiendesign Versuchsgruppen und Medikation Pilotstudie- Rapamycin-Wirkspiegelbestimmung Versuchsdurchführung Pilotstudie Hauptstudie Methoden 48

6 3.4.1 Narkoseverfahren Chirurgisches Vorgehen Intravitalmikroskopie Bestimmung der Serumparameter Bestimmung der Gewebeparameter Statistik Deskriptive Statistik Analytische Statistik 63 4 Ergebnisse Pilotstudie Serumparameter Rapamycinspiegelbestimmung Hauptstudie Überlebensrate der Tiere Intravitalmikroskopie Serumparameter Histologie Immunhistochemie 89 5 Diskussion Ergebnisdiskussion 92 6 Zusammenfassung 99 7 Summary Literaturverzeichnis 103

7 9 Anhang I 9.1 Abkürzungsverzeichnis I 9.2 Tabellenanhang (Serumchemie Pilotstudie) III 9.3 Abbildungsverzeichnis IX 9.4 Tabellenverzeichnis X 9.5 Formelverzeichnis XI 9.6 Danksagung XII 9.7 Versuchsgenehmigung XIII

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9 1 1 Einleitung Rapamycin (Sirolimus, Rapamune ) ist ein Immunsuppressivum aus der Makrolid-Gruppe, das die T-Zell-Proteinsynthese durch Kinasen-Inhibition und Inhibition der intrazellulären Transduktion des nach Bindung von Interleukin-2 ausgelösten Proliferationssignals hemmt (PFITZMANN u. HUMMEL 2001, SAHIN et al. 2004). In der Klinik gewinnt Rapamycin als Immunsuppressivum für die Induktions- und Erhaltungstherapie nach Leber-, Nieren- und Herztransplantation aufgrund seiner antikanzerogenen Eigenschaften zunehmend an Bedeutung (CAMARDO 2003). Gerade Transplantatempfänger sind infolge der Behandlung mit Immunsuppressiva empfänglich für verschiedene Erkrankungen wie z. B. das Kaposi- Sarkom. Rapamycin scheint dagegen das Fortschreiten der Tumore bei gleichzeitiger effektiver Immunsuppression und Aufrechterhaltung der Transplantatfunktion zu inhibieren (CAMPISTOL et al. 2004, STALLONE et al. 2005). In experimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass Rapamycin auch das Wachstum von Primärtumoren und Metastasen hemmt (STEPHAN et al. 2004). Dieses wird wahrscheinlich über eine Inhibition der Tumor-Angiogenese, z. B. durch eine verminderte Freisetzung des Gefäßendothel-Wachstumsfaktors (vascular endothelial growth factor = VEGF), einem zentralen Regulator der Gefäßneubildung, vermittelt, möglicherweise jedoch auch durch eine direkte Proliferationshemmung der Tumorzellen (GUBA et al. 2002). In Analogie zur Wachstumshemmung von Primärtumoren und Metastasen durch Rapamycin können auch Auswirkungen auf die Leberregeneration bestehen, die in Hinblick auf die zunehmende Verwendung von Teillebertransplantaten, z. B. nach Lebendspende, als Maßnahme gegen den Spenderorganmangel, von großer klinischer Relevanz sind (WIESNER et al. 2003). Dieses trifft insbesondere auf Patienten mit Lebertumoren zu (TROTTER 2003), bei denen zum einen durch die Verwendung von Teillebertransplantaten die Wartezeit signifikant verkürzt und zum anderen durch die postoperative Immunsuppression mit Rapamycin ggf. die Tumor- Rezidivrate erniedrigt werden kann (KNETEMAN et al. 2005). Die Leberregeneration resultiert aus einem komplexen Zusammenspiel von Parenchym- und Nichtparenchymzellen und verschiedenen Wachstumsfaktoren und ist derzeit am partiellen Hepatektomie-Modell der Ratte am besten untersucht (PALMES u. SPIEGEL 2004).

10 2 Nach der Leberschädigung verlassen die Hepatozyten ihren Ruhezustand (G-0-Phase) und treten in die proliferativen Stadien des Zellzyklus ein. Dieses geschieht über ein sog. Priming, bei dem die Hepatozyten durch im Rahmen der Schädigung freigesetzte Priming- Faktoren (z. B. TNF-α, IL-6) gegenüber den Einflüssen von Wachstumsfaktoren (z. B. HGF, EGF, TGF-α) sensibilisiert werden. In der präreplikativen Phase (G-1-Phase) erfolgt die Duplizierung notwendiger Zellkomponenten und die Synthese neuer proliferationsspezifischer Moleküle. In Abhängigkeit von o.g. Wachstumsfaktoren wird dann in der nachfolgenden Synthesephase (S-Phase) die DNS repliziert. Anschließend erfolgt die postreplikative Phase (G2-Phase), in der die Zelle Moleküle synthetisiert, die zur nachfolgenden Zellteilung (Mitose, M-Phase) benötigt werden. Nach ein oder zwei Runden der Replikation verlassen die Hepatozyten den Zellzyklus und treten wieder in den Ruhezustand (G0-Phase) ein. Diese Terminierung der Leberregeneration wird durch Inhibitoren (z. B. TGF-β oder Activin A) vermittelt, welche die Regeneration stoppen, wenn die erforderliche funktionelle Kapazität wieder hergestellt ist und den metabolischen Anforderungen der Leber genügt. Die Regeneration der Nichtparenchymzellen, wie z. B. die Gefäßneubildung der Leber ist noch nicht so genau erforscht. Ihr Proliferationszyklus unterliegt einem anderen Zeitmuster als der von Hepatozyten. Während Ratten-Hepatozyten nach Hepatektomie nahezu sofort nach dem Ereignis in die G1-Phase eintreten, in die S-Phase nach Stunden und sich bereits nach weiteren 6-8 Stunden in der Mitosephase befinden, ist die Replikation von Nichtparenchymzellen um 24 Stunden verspätet. Dies ist auf eine verlängerte G1-Phase zurückzuführen. Die hepatische Neoangiogenese, d. h. Regeneration von sinusoidalen Endothelzellen, geht überwiegend von aus dem Knochenmark freigesetzten, zirkulierenden Hämangioblasten aus, die in die neu gebildeten Hepatozytencluster einwandern (MICHALOPOULOS u. DEFRANCES 1997). Unterschiedliche Wachstumsfaktoren, wie z. B. VEGF (vascular endothelial growth factor) oder Angiopoetin, stimulieren die Neubildung von sinusoidalen Endothel. VEGF wird hauptsächlich in den periportalen Hepatozyten zwei bis vier Tage nach partieller Hepatektomie exprimiert und spielt eine zentrale Rolle in der Neoangiogenese durch Steigerung der sinusoidalen Endothelzellproliferation aus den eingewanderten Hämangioblasten und Erhöhung der sinusoidalen Fenestrierung (REYNAERT et al. 2001).

11 3 Morphologisch zeigt sich aufgrund des Ungleichgewichtes der Replikationsrate an Hepatozyten und der umgebenen extrazellulären Matrix zunächst ein Verlust der normalen Leberarchitektur. Neu gebildete Hepatozyten sind in Clustern angeordnet ohne assoziierende Sinusoide. Erst zwei bis vier Tage nach partieller Hepatektomie kommt es zu einer Unterteilung der Hepatozyteninseln durch gefensterte Endothelzellen und Lebersternzellen (HSC). Bei Ratten sind die neu gebildeten Leberlappen sieben Tage nach partieller Hepatektomie übergroß und normalisieren sich erst zu einem späteren Zeitpunkt (ZIMMERMANN 2002). Ziel der Studie ist die Untersuchung der Auswirkungen von Rapamycin auf die Leberregeneration und Gefäßneubildung nach 2/3 Leberresektion. Zur Klärung der Fragestellung wurde aus folgenden Gründen das chirurgische Modell der Teilleberresektion an der Ratte gewählt. In der klinischen Praxis wird die Leberregeneration infolge unterschiedlichster Leberschädigung beobachtet. Eine Bearbeitung der Fragestellung im Rahmen einer klinischen Studie ist aufgrund der unterschiedlichen Faktoren, die die Leberregeneration beeinflussen wie Grunderkrankung, Komorbidität, Tageszeit, Patientenalter, sowie im Zuge der Teillebertransplantation die Transplantatgröße, der Ischämie/ Reperfusionsschaden, die postoperative Kombinations-Immunsuppression, Abstoßungsreaktionen usw. nicht standardisierbar durchführbar und aufgrund der engmaschigen Probengewinnung ethisch nicht vertretbar. Ebenso kann die Fragestellung mittels in-vitro Versuchen nicht bearbeitet werden, da in Zellkulturen zum jetzigen Zeitpunkt die komplexen Interaktionen zwischen Parenchym- und Nichtparenchymzellen während der Leberregeneration nicht reproduziert werden können (PALMES u. SPIEGEL 2004). Experimentelle Tiermodelle zur Untersuchung der Leberregeneration bieten daher einen Kompromiss zwischen klinischer Realität und experimenteller Vereinfachung des komplexen Prozesses. In der gesunden Leber ist die Zellproliferation ein seltenes Ereignis. Die Mitoserate der Hepatozyten liegt in diesem Zustand bei 1: Um nun eine Regenerationsantwort herbeizuführen, muss eine Leberschädigung induziert werden (PALMES u. SPIEGEL 2004). Dabei muss der Auslöser der Leberschädigung unter standardisierten Bedingungen gesetzt werden, da die Ausprägung der Regenerationsantwort variieren kann (LABRECQUE et al. 1978, DIEHL 1991). Um diesen Vorrausetzungen gerecht zu werden, werden nur männliche Zuchttiere des Lewis-

12 4 Stammes mit festgelegtem Gewicht und Alter, sowie identischem Ernährungsstatus verwendet. Vor Beginn der Versuche verbringen sie eine Woche der Akklimatisierung in 12- stündigem Hell- Dunkel- Rhythmus. Da die Leberregeneration einem zirkadianem Rhythmus unterliegt, wird die Induktion der Leberregeneration (im vorliegenden Fall durch Teilleberresektion) immer zur gleichen Tageszeit durchgeführt. Anästhesiemanagment und Analgesieregime unterliegen jederzeit demselben Muster. Die Gruppen I und II (Scheinoperation mit Vehikelapplikation, Scheinoperation mit Rapamycinapplikation) werden in jeden Versuchsschritt miteinbezogen, da die Verabreichung des Medikamentes, der operative Stress, die Manipulation der Leber sowie die Anästhesie, eine Leberzellregeneration in Form von DNA- Synthese auslösen können (MOOLTEN et al. 1970). Die Ratte an sich wird als ein etabliertes und weit verfügbares Labortier ausgewählt. Durch das Vorhandensein von Inzuchtstämmen (Lewis) sowie von Tieren mit einheitlichem mikrobiellem Status erreicht man ein Maximum an Reproduzierbarkeit der Versuche. Hinzu kommt, dass die Leberregeneration an keiner Species so erforscht ist wie an der Ratte und dass in der Arbeitsgruppe der chirurgischen Forschung das Modell der Leberresektion und zahlreiche andere Untersuchungsmethoden (Intravital-mikroskopie, Immunhistochemie, Serumchemie) an der Ratte etabliert sind. Zur Induktion der Leberregeneration kommen verschiedene Methoden in Frage. Dabei ist zwischen chirurgischen, hepatotoxischen und Modellen mit vorgeschädigter Leber zu unterscheiden. Durch Reduktion funktioneller Lebermasse mit Hilfe der Teilleberresektion wird die Regeneration der verbliebenen Restleber induziert. Das bereits in den dreißiger Jahren entwickelte Modell der 2/3 Hepatektomie an der Ratte durch HIGGINS und ANDERSON (1931) besitzt den Vorteil, das es ein großes Maß an Genauigkeit und Reproduzierbarkeit aufweist.- Die entnommene Leber nach 2/3 Resektion beträgt annähernd immer 68% der Ausgangsleber. Desweiteren handelt es sich um eine relativ einfache Operation, die lediglich grundlegende chirurgische Erfahrung voraussetzt. Bei sachgemäßer Ausführung der Operation wird die 2/3 Teilleberresektion von der Ratte ohne perioperative Mortalität toleriert. In Bezug auf die Fragestellung der vorliegenden Studie stellt dieses Modell ein ideales Werkzeug dar, da die Induktion der Leberregeneration zu einem Zeitpunkt stattfindet, von dem angenommen wird, dass sich alle Hepatozyten im Ruhestadium (G-0 Phase)

13 5 befinden. Die Induktion der Leberregeneration durch Hepatektomie führt zum zeitgleichen Eintritt der Hepatozyten in den Zellzyklus. Da der Beginn der DNA- Synthese 24 Stunden nach 2/3 Resektion ein Maximum erreicht, liefert dieses Modell ein entsprechendes Zeitfenster zur Untersuchung der Interaktion des Inter- und Intrazellularraumes sowie der Parenchym-und Nichtparenchymzellen. Auf dieser Grundlage lässt sich adäquat die Wirkung von Rapamycin auf das Regenerationsverhalten der Leber überprüfen. Die im Abdomen verbleibende Restleber wird zum Zeitpunkt der Resektion nicht direkt geschädigt. Somit ist sie in der Lage, sich zu regenerieren, ohne dem Einfluss gleichzeitig ablaufender Leberzellnekrose- oder Inflammation ausgesetzt zu sein, wie es in anderen Resektionsmodellen der Fall sein kann (s. u.) (SAKAMOTO et al. 2000). Auch eine Teillebertransplantation ist aufgrunddessen auszuschließen, da möglicherweise auftretende Akutnoxen (Ischämie- Reperfusionsschaden, Rejektion) die Beantwortung der Fragestellung verfälschen können. Ein weiteres Verfahren, die Regeneration der Leber zu induzieren, stellt das Ligieren eines Astes der Pfortader dar, in dessen Folge es zur Atrophie und Apoptose in den okkludierten Leberlappen und zur kompensatorischen Hyperplasie in den nichtokkludierten Leberlappen kommt. Es handelt sich um ein unkompliziertes und einfach reproduzierbares Modell, welches im Gegensatz zur Teilleberresektion reversibel ist und zwei gegensätzliche Prozesse in einem Tier vereint. Es eignet sich jedoch eher zur Prüfung spezieller klinischer Probleme (z. B. des hepatotrophen Effektes des Portalvenenblutes auf die Leberregeneration), denn zur Untersuchung der vorliegenden Fragestellung (KRUPSI et al. 2002, LEE 1999). Dasselbe gilt für eine weitere die Leberregeneration hervorrufende chirurgische Technik. Im Hunde-Modell mit hereditärem, angeborenem Portosystemischen Shunt wird nach Verschluss der Shunt- Gefäße die Regeneration induziert, wodurch die Leber innerhalb von zwei- bis drei Wochen ihre volle Größe erreicht (MURPHY et al. 2001, MEYER et al. 1999). Leberregeneration ohne Leberzellverlust wird als direkte kompensatorische Hyperplasie bezeichnet und wird durch die intravenöse Verabreichung von Bleinitrat hervorgerufen. Da diese Methode im Gegensatz zur Regeneration nach Teilleberresektion eine Veränderung der Expression von Wachstums- und Tumorfaktoren nach sich zieht und in diesem Zusammenhang u.a. das Verhalten von VEGF nicht eindeutig geklärt ist, wurde die Anwendung derselben ausgeschlossen (COLUMBANO u. SHINOZUKA 1996, KUBO et al. 1996). Bei Acetaminophen, Chlorkohlenwasserstoff (CCl 4 ), D- Galactosamin, Ethanol und Thioacetamid (TAA) handelt es sich um Toxine, die

14 6 Leberschädigung (Hepatitis) und Zelltod des Parenchyms hervorrufen (RAHMAN u. HODGSON 2000). Sie werden im hepatotoxischen Modell am häufigsten angewendet, um eine experimentelle Leberregeneration zu induzieren. Vorteil dieser Modelle ist, dass sie im Gegensatz zur Hepatektomie leichter durchzuführen und von beträchtlicher klinischer Relevanz sind. Während bei der Teilleberresektion die verbleibenden Leberazini intakt bleiben, können durch gezielten Einsatz der Hepatotoxine periportale sowie perizentrale Zellschäden hervorgerufen und so verschiedenste Lebererkrankungen simuliert werden (akutes Leberversagen, Leberfibrose- und zirrhose). Nachteilig wirkt sich jedoch die geringe Reproduzier- und Standardisierbarkeit aus- das Ausmaß des Leberschadens und der Regeneration können demzufolge beträchtlich variieren (BOLESTA u. HABER 2002). Abbildung 1-1: Tiermodelle der Leberregeneration.

15 7 Um die Auswirkung von Rapamycin auf die Leberregeneration (z. B. nach Leberresektion oder größenreduzierter Lebertransplantation) mit größtmöglicher Genauigkeit zu überprüfen, ist somit das Modell der 2/3 Leberresektion, bei dem die verbleibende Zellpopulation stimuliert wird und simultan in den Zellzyklus eintritt, am besten geeignet (Abbildung 1-1). Bereits in der Mitte des 17. Jahrhunderts begann die direkte Darstellung der Morphologie und Mikrozirkulation in verschiedenen Organen sowohl am Tier als auch am Menschen. Zum heutigen Zeitpunkt erlaubt die moderne intravitale Videofluoreszenzmikroskopie die Visualisierung und quantitative Analyse lebender Zellen und ihrer dynamischen Wechselwirkungen in der Mikrozirkulation (MESSMER u. KROMBACH 1998) und ist somit ein adäquates Mittel die Leberregeneration zu beurteilen. Die fortschreitende Entwicklung der Technik hat nicht nur zur Verbesserung der Bildqualität, sondern auch zur Erweiterung des Spektrums intravitalmikroskopischer Methoden beigetragen. So ist es mit Hilfe dieses Verfahrens möglich, physiologische und pathophysiologische Prozesse in unterschiedlichen Organen (Leber, Niere, Darm, Lunge, Synovia etc.) darzustellen (KUEBLER et al. 2000, VEIHELMANN et al. 2001). Es gibt zwei Techniken der Intravitalmikroskopie, die Transillumination und die Epiillumination. Bei der in der vorliegenden Studie gewählten Epifluoreszenzmethode wird die oberflächliche hepatische Morphologie und Mikrozirkulation beurteilt. Vorteil dieser Methode besteht in der Möglichkeit, die gesamte Unterfläche des linken Leberlappens (z. B. nach Scheinoperation und Resektion) zu betrachten. Dabei geht man davon aus, dass die Beobachtungen repräsentativ für das gesamte Organ sind, da es nur geringe Unterschiede in der Morphologie der oberflächlichen und tiefen Leberläppchen gibt. Selbstverständlich ist eine standardisierte Versuchsdurchführung Vorraussetzung für eine erfolgreiche Untersuchung. Einflüsse durch Manipulation während der Operation bzw. der Auslagerung der Leber sind zu vermeiden, da jede Beeinträchtigung auf dem Videobild zu sehen ist und die Ergebnisse verfälscht. Demgegenüber steht die Transillumination, die lediglich zur Untersuchung dünner Gewebeabschnitte genutzt werden kann und somit das zur Verfügung stehende Areal auf eine 0,5-1 mm breite Zone am Rand des linken Leberlappens begrenzt (BAATZ et al. 1995). Dieses Randgebiet reagiert besonders empfindlich auf mechanische Schädigung. Zudem wird nur ein kleines Areal erfasst, welches nicht repräsentativ für das ganze Organ sein kann. Unter Verwendung spezieller Filtersätze im Mikroskop können mit Hilfe unterschiedlicher fluoreszierender Farbstoffe selektiv markierte

16 8 Gewebebestandteile (Zellen, Plasma) dargestellt werden. Die Verfügbarkeit verschiedenartiger Fluoreszenzmarker für die ex vivo und in vivo Färbung hat die Möglichkeiten der Intravitalmikroskopie von der rein morphologischen Analyse zur Untersuchung komplexer physiologischer und pathophysiologischer Prozesse erweitert (MENGER u. LEHR 1993). Fluoreszenzfarbstoffe sind Moleküle, die durch Licht bestimmter Wellenlänge angeregt werden und daraufhin Licht längerer Wellenlänge emitieren. Diese Eigenschaft der Farbstoffe wird in Industrie, klinischer Praxis und Forschung genutzt. Für die Intravitalmikroskopie stehen u.a. Natrium- Fluoreszein, Bisbenzamid H33342, Rhodamin 6G, Acridinorange, FITC- (Fluoreszeinisothiozyanat) markierte Substanzen, Propidium Iodid und Latex Beads zur Verfügung. Durch die Applikation von Natrium- Fluoreszein können Sinusoide als dunkle Bereiche und Hepatozytenstränge als helle Areale dargestellt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Sinusoiddichte sowie der Leberzellbalkenbreite ist diese Färbung demnach ideal geeignet und wurde somit in der vorliegenden Arbeit verwendet. VOLLMAR et al. haben 1996 eine neue Methode der Hepatozytenmarkierung eingeführt: Bisbenzamid H33342 ist einfach zu verabreichen und erlaubt im vorliegenden Versuch eine schnelle und exakte intravitalmikroskopische Analyse der Hepatozytenanzahl. Obwohl zur Zeit nur wenig Arbeiten über die Aktivierung und Morphologie der Ito- Zellen in der sich regenerierenden Leber vorhanden sind, ist deren Beteiligung an der Leberregeneration voll akzeptiert (BALABAUD et al. 2004). Da Ito- Zellen aufgrund ihrer Vitamin- A- Einlagerung eine helle, schnell verblassende Autofluoreszenz aufweisen, benötigt man zu deren intravitalmikroskopischen Darstellung keinen speziellen Fluoreszenzfarbstoff (MABUCHI et al. 2004). Nach Aufnahme der Bilder auf Videoband erfolgen sämtliche Analysen der Regenerationsparameter off-line, wodurch der Beobachtungszeitraum des Versuchs auf ein Minimum reduziert wird. Ein möglicher phototoxischer Effekt wird auf diese Weise weitestgehend vermieden. Aus der Stabilität der Daten (z.b. Regenerationsparameter, Serumchemie) der Kontrollgruppen sowie anderer experimenteller Studien lässt sich schließen, dass die gewählten Farbstoffe und Operations- bzw. Untersuchungstechniken nur einen zu vernachlässigenden Einfluss auf die Regeneration bzw. Leberfunktion besitzen. Somit stellt die in dieser Studie angewandte Intravitalmikroskopie eine angemessene Methode zur Untersuchung der Leberregeneration dar.

17 9 Als Arbeitshypothese wird angenommen, dass Rapamycin die Leberregeneration und Neoangiogenese verzögert. Die Erkenntisse dieser Studie sollen den klinischen Einsatz von Rapamycin u.a. nach größenreduzierter Lebertransplantation optimieren und sicherer machen. So ist es vorstellbar, dass im Falle einer durch Rapamycin bedingten Verzögerung der Leberregeneration entweder die Regenerationsfähigkeit und Neoangiogenese therapeutisch stimuliert oder das Immunsuppressionsschema angepasst wird.

18 10 2 Literatur 2.1 Leberanatomie und- mikroskopie Die Leber (Hepar, Jecur) ist als unpaares Organ angelegt. Sie entwickelt sich aus Entoblasten des Duodenums zu Leberdrüsenschläuchen mit einem galleabführenden Kanalsystem (DAHME u KÄUFER- WEISS 1988). Die Leber ist die größte Drüse des Körpers und liegt bei der Ratte annähernd in der Transversalebene an der Facies abdominalis des Zwerchfells. Mit ihrer Facies visceralis liegt sie den Baucheingeweiden auf. Die Oberfläche der Leber ist durch ihren Bauchfellüberzug glatt und glänzend (SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1987). In Abhängigkeit vom Blutgehalt, dem Lebensalter, der Beschaffenheit der Nahrung und dem Ernährungszustand des Tieres ist ihre Farbe rot-braun (DAHME u. KÄUFER- WEISS 1988), die Konsistenz derbfest-elastisch leberartig. Bei einheitlicher Ernährung und identischer Rasse besteht bei der Ratte eine gute Korrelation zwischen dem Gewicht der Ratte und dem der Leber. Nach WAYNFORTH (1980) beträgt das Lebergewicht bei der Lewis-Ratte ca. 3% des Körpergewichtes. Die Struktur der Leber steht in enger Beziehung zur Multiplizität ihrer komplexen Funktionen. So sind die Hämodynamik, die metabolische Heterogenität der Hepatozyten sowie die Struktur ihrer funktionellen Einheiten Voraussetzung für die Aufrechterhaltung der mannigfaltigen Funktionen der Leber. 1. Die Leber besitzt eine doppelte Blutversorgung (s.u.) a. funktionell durch die V. portae b. nutritiv durch die A. hepatica 2. In Abhängigkeit von den anatomischen bzw. funktionellen Beziehungen der Leber können drei Baueinheiten angenommen werden (s.u.) a. Leberläppchen (Lobulus hepaticus, Zentralvenenläppchen) b. Area portalis (Pfortaderläppchen, periportales Läppchen) c. Leberazinus

19 Makroskopische Anatomie Lobierung Die Leber ist durch Fissuren (Incisurae interlobares) in einzelne Lappen (Lobi hepatis) unterteilt. Bei der Ratte setzt sie sich aus vier Lappen zusammen (GREENE 1968), die über eine parenchymatöse Achse um die V. cava caudalis herum miteinander in Verbindung stehen: 1. Lobus (hepatis) sinister 2. Lobus (hepatis) dexter 3. Lobus (hepatis) quadratus 4. Lobus (hepatis) caudatus Durch die Fissura umbilicalis ist der trapezförmige Lobus quadratus in einen linken und einen rechten Anteil unterteilt. An dieser Stelle setzt auch das Lig. falciforme als Aufhängeband des Lobus quadratus an und stellt somit eine Verbindung zum Diaphragma dar. Der rhombenförmige Lobus sinister verdeckt den Lobus caudatus und wird zum Teil selbst vom Lobus quadratus verdeckt. Durch eine tiefe Fissur wird der Lobus lateralis dexter in zwei gleichgroße, pyramidenförmige Anteile untergliedert. Der Lobus caudatus wird ebenso durch eine tiefe Fissur in zwei Anteile gegliedert, zwischen denen der Ösophagus verläuft. Gefäßversorgung Die Leber erhält zum einen nährstoffreiches Blut über die Pfortader (Vena portae) aus den unpaaren Bauchorganen und zum anderen sauerstoffreiches Blut über die Leberarterie (Arteria hepatica), die als eine der Endäste der A. coeliaca arterielles Blut an das Organ abgibt. Hierbei übernimmt die V. portae annähernd 70%, die A. hepatica nahezu 30% der Lebergesamtdurchblutung (SCHIFF u. SCHIFF 1993). Die V. portae verläuft im Lig. hepatoduodenale und tritt ebenso wie die A. hepatica in die Leberpforte (Porta hepatis) ein. Von hier aus spaltet sie sich in ihre Lappen- und Segmentäste auf. Die Äste unterschiedlicher Ordnung verteilen das Blut bis zu den Vv. interlobulares. Diese verlaufen zwischen den Leberläppchen. Über Rami terminales wird das sinusoidale

20 12 Kapillarnetz aus den Vv. interlobulares versorgt. Die A. hepatica schließt sich auf dem Weg zur Leberpforte der V. portae an. Der mediale und craniale Anteil des Lobus sinister wird zusätzlich von der A. hepatica sinistra versorgt, die sich aus der A. gastrica abzweigt und entlang des Ösophagus zur Cranialseite des Lobus sinister verläuft. Die Aufspaltung der beiden Gefäße in ihre Lappen- und Segmentäste erfolgt bis zu den Aa. interlobulares weitestgehend entsprechend der der V. portae. Die Interlobulararterien ergießen sich jedoch nicht nur in das intralobuläre sinusoidale Kapillarnetz sondern auch in das interlobuläre Gewebe. Die A. hepatica und ihre Äste liegen zwischen dem Gallengang und seinen Abgängen und der V. portae und ihren Abgängen; A. hepatica, V. portae und der Gallengang (bzw. ihre Aufzweigungen) verlaufen stets gemeinsam zu den einzelnen Lebersegmenten (SCHIFF u. SCHIFF 1993). Das arterielle und das portalvenöse Blut vermischen sich beim Eintritt in die Sinusoide. Der Abfluß des Leberblutes erfolgt dabei über die Lebervenen (Vv. hepaticae). Hierbei wird das Kapillarblut von den Zentralvenen (Vv. centralis) innerhalb der Leberläppchen aufgenommen. Die Zentralvenen stoßen am Außenrand des Läppchens senkrecht auf eine Schaltvene. Schaltvenen verlaufen entlang der Läppchenbasis und vereinigen sich zu Sammelvenen. Vergleichbar mit der arteriellen bzw. portalvenösen Blutversorgung schließen sich diese Sammelvenen segment- und lappenweise zusammen und das Blut fließt schließlich retrogard in die Vv. hepaticae. Die Lebervenen finden Anschluss an die caudale Hohlvene (V. cava caudalis) (SCHIFF u. SCHIFF 1993). Bänder Die Bänder der Rattenleber sind sehr fein ausgeprägt. Das kleine Netz (Omentum minus), das sich aus den Ligamenta hepatogastricum und hepatoduodenale zusammensetzt, zieht von der kleinen Krümmung des Magens (Curvatura ventriculi minor) zur Visceralfläche der Leber und ist mit der Leberpforte verbunden. Als Verbindung zum Zwerchfell besteht das sichelförmige Ligamentum falciforme hepatis, welches ventral an der Leber entspringt und diese an der Bauchwand und dem Zwerchfell befestigt. Das Ligamentum falciforme hepatis enthält die obliterierte Nabelvene als Lig. teres hepatis. Eine weitere Verbindung zum Zwerchfell stellt das Ligamentum coronarium hepatis dar. Es entspringt ventral und lateral am Austritt der V. cava caudalis aus der Leber. Sowohl der Lobus hepatis sinister als auch der

21 13 Lobus hepatis dexter sind über das Ligamentum triangulare sinister bzw. dexter, welche von der Leber nach dorsolateral ziehen, mit dem Zwerchfell verbunden. Gallenblase Die Ratte besitzt keine Gallenblase (CASTAING et al. 1980, RUBARTH 1958). Die Gallengänge der Leberlappen vereinigen sich zum Ductus choledochus. Dieser verläuft im Ligamentum hepatoduodenale. Der 12 bis 46 mm lange und im Durchmesser einen Millimeter breite Ductus choledochus verläuft dorsal am Duodenum und ventral an Teilen der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) entlang. Gänge der Bauchspeicheldrüse münden in den Ductus choledochus. Der Gallengang mündet etwa 20 mm distal vom Pylorus in einer einen Millimeter hohen Papille in das Duodenum Mikroskopische Anatomie Die Leber ist von einer subserösen, bindegewebigen, dünnen Kapsel (Capsula hepatis s. Capsula fibrosa perivascularis), der Glissonschen Kapsel, umgeben. Ihre Ausläufer strahlen von der Porta hepatis ausgehend als feines Bindegewebsgerüst in das Leberinnere ein, gliedern das Parenchym der Leber als interlobuläres Bindegewebe in Läppchen und umschließen die Gefäße der Glissonschen Trias. Als Glissonsche Trias bezeichnet man die an den Kontaktkanten benachbarter Leberläppchen verlaufenden Aa. und Vv. interlobulares und die interlobulären Gallengänge. Insgesamt ist der Bindegewebsanteil der Rattenleber, z.b. gegenüber dem des Schweines, sehr gering. Es gibt drei Konzepte zur Strukturierung des Leberparenchyms: das Leberläppchen, das Portalvenenläppchen, den Leberazinus (Abbildung 2-1). Abbildung 2-1: Gliederung der Leber. A: periportale Läppchen mit Lebertrias B: Leberazini mit zonaler Gliederung nach Rappaport C: klassisches Leberläppchen mit Zentralvene 1: periportale Zone 2: midzonale Zone 3: perizentrale Zone (LIEBICH 1999)

22 14 Leberläppchen Die anatomische Grundeinheit der Leber stellt das Leberläppchen dar (KRISTIC 1991) (Abbildung 2-2). Die charakteristische Stuktur wird bestimmt durch die radiäre Anordnung der Leberzellbälkchen und Sinusoide. Im Querschnitt umschreibt es idealerweise ein Sechseck, dessen Zentrum von einer abführenden Zentralvene gebildet wird. Die periportalen Felder zwischen drei bis vier Leberläppchen enthalten die Gefäße der Glissonschen Dreiecke. Die Läppchen besitzen eine Höhe von ca. 2 mm, einen Durchmesser von ca. 1 mm und setzen sich aus Leberzellplatten, bestehend aus ein bis maximal zwei Hepatozytenlagen, die ein dreidimensionales Gerüst ergeben, zusammen. Im Inneren der Läppchen bilden Gitterfasern ein zartes Raumnetz, in das die Hepatozyten eingebettet sind. Zwischen ihnen liegen die Leberkapillaren (Sinusoide), ebenso ein feinmaschiges dreidimensionales Kapillarnetz bildend. Sie werden von den Endästen der Triasgefäße (Terminalgefäße) gespeist und streben dem Zentrum des Läppchens zu, um hier als Zentralvene zusammenzufließen. Die Sinusoide besitzen im Unterschied zu normalen Kapillaren keine Basalmembran (JUNQUEIRA u. CARNEIRO 1989); ihre Innenauskleidung besteht zum größten Teil aus Endothelzellen, jedoch kommen des weiteren Kupffer- Zellen, Ito- Zellen und Pitzellen vor. Zelluläre Poren und interzelluläre Öffnungen bringen das Kapillarlumen mit dem perikapillaren Spalt (Dissescher Raum, Spatium perisinusoideum) in Verbindung. Auf diese Weise entsteht ein Maximum an Kontaktfläche zwischen Leberzellen und Leberkapillaren. In den Disseschen Raum ragen die Mikrovilli der Leberzellen, somit stellt er einen direkten Kontakt der Hepatozyten zum Blut her. Die Sinusoide anastomosieren miteinander durch Öffnungen in den Leberzellplatten, den sogenannten intersinusoidalen Sinusoiden (VONNAHME 1993). Die Grenzplatte schließt das Leberläppchen gegen das interlobuläre Bindegewebe ab, lässt jedoch sehr kleine Öffnungen für den Durchtritt der Terminalgefäße frei. Die Gliederung der Leber in Leberläppchen folgt einer strukturell- deskriptiven Einteilung.

23 15 Abbildung 2-2: Klassisches Leberläppchen. ACap: arterielle Kapillaren BD: Gallengang HP: Hepatozytenplatten IlA: interlobuläre Arterie IlV: interlobuläre Vene InV: interlobuläre Venolen LP: Lamina terminalis LS: Lebersinusoide O: interzelluläre Öffnungen PC: Trias SV: sublobuläre Vene VCap: venöse Kapillaren (KRSTIC 1991) Portalvenenläppchen Im Gegensatz zur aufgeführten Gliederung des Leberparenchyms in Leberläppchen, begründet sich die Gliederung der Leber in Portalvenenläppchen auf funktionelle Zusammenhänge. Das Portalvenenläppchen wird von drei Zentralvenen begrenzt, die sich um einen im Innern liegenden Gallengang gruppieren. Auf diese Weise bezeichnet es den Versorgungsbezirk bzw. den Parenchymbereich, dessen Sekret (Galle) in den gemeinsamen interlobulären Gallengang (Ductulus interlobularis bilifer) fließt. Die Gliederung der Leber in Portalvenenläppchen legt den funktionell- sekretorischen Drüsencharakter der Leber dar (VONNAHME 1993). Leberazinus Als weitere funktionelle Einheit steht dem Leberläppchen der Leberazinus nach Rappaport gegenüber. Hierbei veranschaulichte Rappaport die mikrozirkulatorische Bedeutung des Azinus (RAPPAPORT 1976). Ein Azinus wird von einer Geweberegion gebildet, deren Achse aus einem Gefäßbündel zuführender Terminaläste der Pfortader und der Leberarterie sowie einem terminalen Gallengang besteht. Diese vaskuläre Grenzscheide entspricht damit annähernd einer Seite des Sechsecks des Leberläppchens. Anfang und Ende der Gefäßachse bildet jeweils ein Glissonfeld. Weitere Eckpunkte des Azinus bilden zwei benachbarte

24 16 Zentralvenen. Die Sinusoide ziehen radiär von der Achse des Azinus zu den Zentralvenen. Die um die Sinusoide angeordneten Hepatozyten bilden drei metabolische, unterschiedlich gut durchblutete Zonen. Die Sinusoide werden in Richtung auf die Zentralvene mit abnehmender Geschwindigkeit vom Blut durchflossen. Zone 1 umfaßt die Hepatozyten, die unmittelbar um die Azinusachse angeordnet sind und die somit zuerst mit dem die Leber versorgenden Blut in Kontakt treten. Zone 1 wird infolgedessen von sauerstoffreichem, arterio- portalem Mischblut relativ schnell durchströmt. In Zone 2 vermindern sich Sauerstoffgehalt und Durchströmungsgeschwindigkeit. Aufgrund der Modifikation des Blutes in Zone 1 und 2 ist es schlüssig, dass die Hepatozyten der Zone 3 im Zentralvenenbereich am vulnerabelsten auf Hypoxie, Nährstoffmangel und Blutdruckschwankungen reagieren. Zone 2 ist dabei keine statische Größe, sondern je nach Versorgung variabel. Die Beziehung Leberläppchen- Azinus lässt sich nach Rappaport folgendermaßen gliedern (Abbildung 2-1): Periportale Zone Zone 1 Midzonale Zone Zone 2 Perizentrale Zone Zone 3 Die Gliederung der Leber in Azini folgt einer funktionell- stoffwechselaktiven Beurteilung. Gallengangssystem Die von den Leberzellen gebildete Gallenflüssigkeit wird in ein gesondertes Drainagesystem abgegeben. Dieses netzähnlich verbundene System besteht aus Gallenkapillaren, welche keine eigene Wandung besitzen. Die Kapillaren werden somit nicht durch Endothelien begrenzt, sondern bilden sich aus modifizierten Oberflächenmembranen der Hepatozyten (LIEBICH 1999), wobei durch Erweiterung des interzellulären Raumes ein tubuläres Gangsystem ausgespart wird. Dieses Gangsystem nimmt die Gallenflüssigkeit auf, wird als Gallenkanälchen (Canaliculus bilifer) bezeichnet und besitzt einen Durchmesser von ein bis zwei µm. In der Peripheri der Läppchen gehen die Canaliculi biliferi in, von einem einschichtigen isoprismatischen Epithel ausgekleidete, Gallengänge (Ductuli biliferi) über. Diese kleineren Gallengänge leiten die Galle gegen den Blutstrom an den Ecken des Leberläppchens, bzw. in der Achse des Leberazinus entlang, in einen interlobulären größeren Gallengang (Ductus interlobularis bilifer). Dieser bildet zusammen mit den Vv. und Aa.

25 17 interlobulares die Glissonsche Trias. Durch den Zusammenfluß der Ductuli interlobularis biliferi bildet sich letztlich der Ausführungsgang (Ductus hepaticus), der an der Leberpforte das Organ verlässt. Zellulärer Aufbau der Leber Das Lebergewebe setzt sich aus einem zellulären Volumen von etwa % und einem Extrazellulärraum (Sinusoide, Dissescher Raum, Gallengänge, extrazelluläre Matrix) von ca %. zusammen (GRESSNER 2003). Von den Zellen nehmen die epithelialen Parenchymzellen (Hepatozyten) etwa 74 Vol. % ein, ungefähr 6 Vol % bilden die mesenchymalen, sinusoidalen Nicht- Parenchymzellen. Diese Gruppe setzt sich zusammen aus sinusoidalen Endothelzellen (2,6 %), v. Kupffer- Zellen (2 %), Ito- Zellen (1,4 %) und den Pit- Zellen (1-3 %) (VANDERKERKEN et al. 1990). Hepatozyten: Hepatozyten sind µm große, polygonale Zellen, die einen der Art und dem Umfang ihrer vielfältigen Leistungen entsprechenden adäquaten Zellorganellenbestand aufweisen. Nicht selten besitzen sie zwei, oder, entsprechend ihres Funktionszustandes, sogar mehrere polyploide Kerne. Auffallend ist die große Anzahl an Mitochondrien, (bis zu 3000/ Zelle und bis zu 20 % des Zytoplasmavolumens). Sie stehen dem Stoffwechsel als Energielieferanten zur Verfügung, an die Matrix sind die Enzyme des Zitratzyklus, der Atmungskette und der β- Oxydation gebunden. Die Funktion des rauhen endoplasmatischen Retikulums, welches als dichtes Netz vorliegt, ist die Proteinsynthese (Globuline, Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren, etc.). Das diffus im Zytoplasma verteilte, glatte endoplasmatische Retikulum ist beteiligt am Fettstoffwechsel, wie z.b. der Synthese von Lipoproteinen, Triglyceriden, Phospholipiden, Cholesterin und freien Fettsäuren. Desweiteren nimmt es eine zentrale Rolle bei der Biotransformation endogener und exogener toxischer Substanzen, sowie der Synthese von Steroidhormonen, ein. Ebenso ist es für die Produktion und Ausscheidung der Galle zuständig, wobei Cholesterine zu Gallensäuren bzw. Gallensalzen umgewandelt werden und gemeinsam mit Wasser und Bilirubin in die Gallenkanälchen abtransportiert werden. Die im rauhen und glatten endoplasmatischen Retikulum synthetisierten Substanzen werden im Golgi- Apparat gespeichert und weitergeleitet. Der Golgi-Apparat ist zugleich Bildungsort intrazellulärer Membranen und einer Vielzahl von Enzymen. Innerhalb der Zelle befinden sich zahlreiche paraplasmatische Einschlüsse wie Glykogen und Fettvakuolen.

26 18 Kupffer- Zellen: Eine Sonderform der endothelialen Wandauskleidung bilden v.- Kupffer- Zellen (Macrophagocyti stellati). Sie besitzen Zytoplasmafortsätze, die ihnen gelegentlich ein sternförmiges Aussehen verleihen. Häufig sind ihre Zytoplasmafortsätze am Kapillarendothel der gleichen, aber auch der gegenüberliegenden Seite reversibel angeheftet, oder sie durchdringen die Kapillarwand und ragen in den Disseschen Raum. Als Bestandteile des Mononukleären Phagozytensystems (MPS) können sie in dieser charakteristischen Fangstellung phagozytotische Aufgaben übernehmen, indem sie dem vorbeiströmenden Blut zirkulierende Zellfragmente, Mikroorganismen, gelöste Substanzen oder geschädigte Blutzellen entnehmen. Desweiteren sind sie aktiv am Abbau des Hämoglobins aus Erythrozyten beteiligt. Die Kupffer- Zellen machen etwa ein Drittel der Sinusoidwandzellen aus und sind v.a. an strategisch bedeutsamen Punkten wie z.b. im periportalen Bereich angesiedelt. Kennzeichnend für diese Zellen ist ein Reichtum an Organellen insbesondere von Phagosomen, Lysosomen und Peroxisomen. Ito- Zellen: Diese Nicht- Parenchymzellen befinden sich subendothelial im Disseschen Raum. Es handelt sich bei diesen Zellen um spezifische interstitielle Zellen der Leber, die Vitamin- A-haltige Lipoidtropfen enthalten und deshalb als Fettspeicherzellen bezeichnet werden. Die Ito-Zellen können in zwei unterschiedlichen Funktionszuständen vorliegen- als aktive und als ruhende Zellen. Im ruhenden Zustand speichern sie mit dem Blut angeschwemmte Fetttröpfchen in Vakuolen. In den aktivierten Zustand werden die Ito-Zellen durch Botenstoffe wie TNF-α, IL-1, TGF-β etc. überführt. Sie besitzen in diesem Status unterschiedliche Aufgaben. Zum einen können sie mit ihren, kontraktile Filamente enthaltenden, Zytoplasmafortsätzen, die die Endothelzellen der Sinusoide umfassen, das Lumen der Sinusoide verkleinern (MARZI et al. 1993). Zum anderen besitzen sie ähnlich wie die Kupferzellen die Fähigkeit, sich in Fibroblasten umzuwandeln, die extrazelluläre Matrix produzieren und folglich die Möglichkeit der Synthese von Bindegewebe besitzen. Von Bedeutung ist dies v.a. bei pathologischen Prozessen mit vermehrter Faserbildung. Pit- Zellen: Diese Nicht- Parenchymzellen sind in das Endothel der Sinusoide eingelagert. Sie besitzen als Lymphozyten immunologische Funktion, wobei sie als natürliche Killerzellen fungieren.

27 Mechanismen der Leberzellschädigung und Formen des Leberzelltodes Die gesunde Leber ist zur Regeneration befähigt. Unterliegt die Leber jedoch einer schwerwiegenden Schädigung und entwickeln sich infolgedessen erhebliche Störungen des Zellstoffwechsels, so kommt es zu regressiven Veränderungen der Zelle und zu proliferativen Reaktionen im benachbarten Gewebe (Entzündung, Reparation, Regeneration). Je nach Art, Dauer und Schwere der einwirkenden Noxe, endet die Leberzellschädigung schließlich im Zelluntergang durch Nekrose oder Apoptose. Die Leber setzt sich aus verschiedenen Zelltypen zusammen, die einerseits unterschiedlich sensibel auf die schädigenden Noxen reagieren, und andererseits selbst durch Freisetzung von Zytokinen, zytotoxischen Mediatoren, Radikalen etc. den Zelltod beeinflussen und vorantreiben können. So kommt es neben der primären Schädigung der Leberzellen durch die initiale Noxe zu einer sekundären Schädigung im Sinne eines Circulus vitiosus. Grundsätzlich existieren unterschiedliche Wege des Zellunterganges von Leberzellen, die Nekrose und die Apoptose. Die initialen Schritte bei Nekrose und Apoptose verlaufen (bis zum mitochondrialen Permeabilitätsübergang s.u.) weitestgehend gleich (CROMTON 2000, RAUEN u. DE GROOT 2002). In Abhängigkeit unterschiedlicher Einflüsse (Art und Schwere der Noxe, ATP- Verfügbarkeit etc.) wird der Weg in die eine oder andere Richtung beschritten. Der Begriff der Apoptose bezeichnet ein charakteristisches morphologisches Erscheinungsbild des Zelltodes. Physiologisch zeigt sich dieses Bild u.a. beim programmierten Zelltod in der Embryonalentwicklung, es kann jedoch auch durch einen pathologischen Stimulus induziert werden. Die Apoptose geht mit einer Schrumpfung der Zelle, einer Kondensation des Chromatins und des Zellkerns, einer Fragmentation des Zellkerns sowie einer Ausschleusung von Kernfragmenten und Organellen in sich abschnürenden Vesikeln, sog. apoptotischen Körperchen, einher (DESAGHER u. MARTINOU 2000, GILL et al. 2002, PADANILAM 2003). Durch rezeptor- vermittelte Phagozytose kommt es zur Aufnahme der apoptotischen Zellfragmente (COTRAN et al. 1999). Es gibt drei grundsätzliche Wege der Apoptoseinduktion: der rezeptorvermittelte (sog. Todesrezeptoren ) Weg

28 20 der mitochondriale Weg der über das endoplasmatische Retikulum ausgelöste Weg noch unbekannter Bedeutung (DESAGHER u. MARTINOU 2000, GILL et al. 2002, PADANILAM 2003) Zu den Todesrezeptoren gehören u.a. Fas- Rezeptoren (APO- 1/ CD 95) und der TNF- Rezeptor (TNFR1) (RAUEN u. DE GROOT 2004). Über Bindung der Liganden kommt es im weiteren Verlauf zur Ausbildung der Caspase 3. Diese spaltet zahlreiche zelluläre Substrate und bewirkt so Cytoskelettveränderungen, DNA- Fragmentation und Kernmodifikationen. Der mitochondriale Weg der Apoptose wird über diverse Trigger initiiert oder blockiert. Hierzu zählen Proteine der Bax- Familie bzw. der Bcl- 2- Familie. Über eine Porenbildung der Mitochondrienmembran kommt es zur Freisetzung pro- apoptotischer Faktoren. Die wichtigsten dieser pro- apoptotischen Faktoren sind AIF (apoptosis inducing factor) und Cytochrom c. AIF gelangt direkt in den Zellkern und bewirkt dort einen Teil der apoptotischen Kernveränderungen. Cytochrom c ist beteiligt an der Ausbildung eines Apoptosoms, welches wiederum die Aktivierung der Caspase 3 beeinflußt (s.o.) (RAUEN u. DE GROOT 2004). Der gesamte Prozess der Apoptose ist stark reguliert, aktiv und energieabhängig. Bei funktionell intakter Plasmamembran kommt es nicht zur Freisetzung intrazellulärer Bestandteile in das umliegende Gewebe und folglich nicht zu einer Entzündungsreaktion. Demgegenüber steht die passiv ablaufende Nekrose. Die Nekrose ist gekennzeichnet durch Schwellung der Zelle sowie der Zellorganellen und Verlust der Permeabilitätsbarriere der Plasmamembran. Die daraus resultierende Freisetzung zellulärer Bestandteile in den Extrazellulärraum führt durch Aktivierung von Entzündungsmediatoren (z.b. Histamin, Kinine) zur Induktion einer Entzündungsreaktion, wodurch es bei der Nekrose eher zur Zerstörung ganzer Gewebeareale denn einzelner Zellen kommt. Klinisch auffällig wird die Leberzellschädigung durch einen Anstieg der Transaminasen (ASAT/GOT, ALAT/GPT) als Marker der Hepatozytenschädigung, einem Anstieg der Cholestaseparameter (AP und γ- GT) sowie durch eine erhöhte Aktivität der Laktatdehydrogenase (LDH) als Zeichen für eine hypoxische Zellschädigung. Eine Beeinträchtigung der Synthesefunktion verdeutlicht die Veränderung der Albuminwerte sowie eine Einschränkung der Blutgerinnungsfunktion (Quick, AT III, PCHE). Die Verringerung

29 21 der Entgiftungskapazität der Leber wird durch einen Anstieg von Bilirubin und Ammoniak (NH 3 ) klinisch angezeigt.

30 Mechanismen der Leberregeneration Das Geheimnis des Feuers den Göttern des Olympus geraubt, beschwor Prometheus den Zorn des Zeus auf sich, den Herrscher über Götter und Menschheit. Zeus strafte Prometheus, indem er ihn an den Mount Caucasus ketten ließ, an dem er von einem Adler gepeinigt wurde. Dieser Adler nagte nun an Prometheus Leber, welche, sobald sie verschlungen ward, sich sogleich erneuerte (IRMSCHER u. JOHNE 1982). Die erstaunliche Regenerationsfähigkeit der Leber wurde wie diese Sage zeigt, bereits in der griechischen Mythologie beschrieben. Bewiesen wurde sie durch das 2/3 Partial- Hepatektomie Modell an Nagern, welches 1931 von Higgins und Anderson wegbereitend war (HIGGINS u. ANDERSON 1931). Nach der chirurgischen Entfernung von zwei Dritteln der Leber, vergrößert sich die verbliebene Restleber bis die ursprüngliche Lebermasse wieder hergestellt ist. Das Wort Regeneration ist in diesem Fall irreführend, da die Leber nicht nachwächst ähnlich der Regeneration von Extremitäten bei Amphibien. Es handelt sich vielmehr um eine kompensatorische Hyperplasie. Die Größe der entstehenden Leber ist hierbei durch die Antwort des Organismus festgelegt Besonderheiten der Leberzellregeneration Der Mensch besitzt mit der Leber das einzige vitale Organ, das nach unterschiedlichsten Schädigungsformen die Fähigkeit zur kompletten Wiederherstellung der Organarchitektur und gewebespezifischer Funktionen besitzt (MICHALOPOULOS u. DEFRANCES 1997). Obwohl reife Hepatozyten langlebig sind (Lebensspanne ca. zwölf Monate) und normalerweise selten Zellteilung unterliegen, erhalten sie sich die Möglichkeit, als Antwort auf toxische Schädigung und Infektion zu proliferieren. Beim gesunden Erwachsenen wird der Untergang von Leberzellen durch permanente Proliferation anderer Hepatozyten kompensiert und somit eine gleichbleibende Leberzellmasse sichergestellt (DIEHL u. RAI 1999). Im Unterschied dazu unterliegt die Hepatozytenreplikation bei Rodentia einem zirkadianem Rhythmus mit einem Aktivitätsmaximum in der Dunkelperiode (SOUTO u. LLANOS 1985, MATSUO 2003). Im gesunden Organismus wird die Menge an Lebergewebe genau reguliert. Je nach Funktionsanforderung des Körpers wird das Verhältnis zwischen Leberzellproliferation und Leberzelluntergang verschoben. Normalerweise verweilen die

31 23 Hepatozyten im Ruhestadium (G 0- Stadium), in dem sie ihre Synthese-, Entgiftungs- und sekretorischen Funktionen ausüben (ASCHER et al. 1993). Durch eine Schädigung der Leber werden die intakten Hepatozyten (ebenso wie weitere Zellen der Leber) durch freigesetzte wachstumsregulierende Faktoren aktiviert. Das Lebergewebe nimmt solange zu bzw. ab, bis durch ein optimales Verhältnis zwischen Leberzell- und Körpermasse eine einwandfreie Stoffwechselfunktion gesichert ist (KOUNTOURAS et al. 2001). Normalerweise regeneriert sich die Leber nicht wie erwartet über Stamm- oder Vorläuferzellen (MICHALOPOULOS u. DEFRANCES 1997), sondern über Proliferation der vorhandenen reifen Hepatozyten. Kommt es jedoch zu einer Leberzellschädigung, in deren Folge die Proliferationsantwort der Hepatozyten ungenügend erfolgt, wird ein sekundäres Proliferationskompartiment aktiviert, das aus hepatischen Stammzellen oder ihren Nachfolgern besteht (den sog. oval-cells ) (FAUSTO 2000, 2001). Diese undifferenzierten Leberzellen proliferieren und erzeugen aktiv Tochterzellen, die sich wiederum in reife Hepatozyten ausdifferenzieren (MICHALOPOULOS 1994, THORGEIRSSON 1996). Der Beginn der DNA-Synthese der Hepatozyten verläuft synchron, startet in Zellen, die die Portalvene des Leberläppchens umgeben (höchste Proliferationsaktivität (SKULLMAN et al. 1990) und schreitet in Zellen in Richtung auf die Zentralvene fort. Die ungewöhnlich hohe Regenerationsfähigkeit der Leber im Vergleich zu anderen Organsystemen des Organismus, lässt sich mit ihrer beträchtlichen Replikationskapazität erklären. Die Hepatozyten sind in der Lage, bis zu 80 Zellteilungen zu durchlaufen, wohingegen Säugetierzellen normalerweise bereits nach Zellteilungen altern (FAUSTO 2001). Meist muss die Leber ihre volle Regenerationskapazität jedoch nicht ausnutzen, nach Rückantwort des Organismus kehren die Hepatozyten oft nach 1-2 Zellteilungen in ihren Ruhezustand (G-0- Stadium) zurück (FAUSTO 2000). Im Verlauf der Leberregeneration muss die Leber ihre organspezifischen Funktionen aufrechterhalten. Diese Notwendigkeit unterscheidet das molekularbiologische Ereignis der Leberregeneration von dem des fetalen oder neoplastischen Wachstums, bei dem die Expression der wachstumsspezifischen Gene eine höhere Priorität als die Expression von gewebespezifischen Genen besitzt. Auf diese Weise ist die gesunde Leber in der Lage, nach extremer Schädigung wie der 2/3 Hepatektomie unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Funktion, innerhalb von ca.2 Wochen (Ratte) bis Monaten (Mensch) vollständig zu

32 24 regenerieren (DIEHL u. RAI 1999, MICHALOPOULOS 1994). Der überwiegende Teil an experimentellen Studien über Leberzellregeneration ist an in vivo- Modellen untersucht worden (KONIARIS 2003), v.a. unter Verwendung genmanipulierter Tiere und an experimentellen Modellen der partiellen Hepatektomie (COURT et al. 2002). In vitro- Experimente, z. B. mit primären Hepatozytenkulturen, erwiesen sich häufig als technisch schwer durchführbar, da Hepatozyten nach Isolation nur für kurze Zeit vital und differenziert bleiben, bevor sie ihre hepatozyten-typische Funktion und Morphologie verlieren (RUNGE 2000). Desweiteren können primäre Hepatozytenkulturen die komplexen Interaktionen zwischen Parenchym- und Nicht- Parenchymzellen nicht simulieren. Die Gesamtheit der Versuche jedoch ergaben und geben neue Einblicke in die Mechanismen der Regulation der Leberregeneration und der physiologischen Lebermasse und sind ein Beitrag zur Entwicklung neuer Angriffspunkte zur Stimulation der Leberzellregeneration Mechanismen der Leberzellregeneration Im Prozeß der Leberregeneration nach Leberschädigung sind folgende Punkte von ausschlaggebender Bedeutung: Die Signale, die die ersten Ereignisse des Regenerationsprozesses auslösen Beibehaltung der Architektur und Funktion der Leber während der Regeneration Die Signale, die verantwortlich sind für die Beendigung der Wachstumsphase, wenn die Lebermasse wiederhergestellt ist. Dabei vollzieht sich die Leberregeneration über die Proliferation der bestehenden reifen Hepatozyten und Nicht- Parenchymzellen (s.u.) sowie über ein periportales Stammzellkompartiment im Falle einer unzureichenden Proliferationsantwort der Hepatozyten (s.o.). Durch Teilleberresektion oder einer anderen Form der Leberzellschädigung werden unterschiedliche Signale gleichzeitig zur und von der Leber ausgesendet. Vom GIT stammende Faktoren wie Lipopolysaccharide (LPS) werden hochreguliert und erreichen die Leber über den portalen Blutzufluss. Sie aktivieren hepatische Nicht- Parenchymzellen und steigern die Produktion von (TNF)α und (IL)-6. Weitere Faktoren werden vom Pankreas (Insulin), von der Nebennierendrüse (Norepinephrin), vom Duodenum (EGF), von den