SICH AUF DIE PROLIFERATION UND APOPTOSE VON

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1 GELEE ROYALE (RJ) UND Human Interferon-AlphaN3 (HuIFN-ΑlphaN3) WIRKEN SICH AUF DIE PROLIFERATION UND APOPTOSE VON CaCo 2 ZELLEN AUS UND VERINGERN IHR TUMORIGENES POTENTIAL IN VITRO FILIPIČ B. 1), GRADIŠNIK L. 2), PEREYRA A. 3), KOPINČ R. 3),JAKLIČ D. 3), POTOKAR J. 3) 1) Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slowenien, 2) Medizinische Fakultät, Universität Maribor, Taborska 8, 2000 Maribor, Slowenien 3) MEDEX D.O.O., Linhartova 049A, 1000 Ljubljana, Slowenien. 14 Th Apitherapy Congress,Expo and Workshops Passau 2016

2 ABSTRAKT Als Teil von Royal Jellys (RJ) biologischer Aktivität, wurden die Untersuchungen der möglichen Anti-Tumor-Aktivität durchgeführt, und deren mögliche Wechselwirkungen mit menschlichem Interferon-α (IFN-αN3), die für die Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt werden, und trotz seiner molekularen Mechanismen hinter seiner zytoreduktiven Aktion noch nicht bekannt ist. Der Zweck dieser Studie war die Untersuchung des Einflusses von RJ auf Hu IFN-αN3 induzierte Hemmung von Dickdarmkrebszellen (Caco-2) Proliferation, Caspase 9 - induzierte Apoptose und Abnahme des Caco-2-tumorigenen Potencials über die Messung des Tumorigenitätsindexes in vitro- und Hemmung des Caco-2 Microtumors. Alle Aktivitäten wurden analysiert mit dem RJ (0,1 g / 10 ml Kochsalzlösung ), Huifen-αN3 (1000 I.U. / ml) und verschiedenen Kombinationen zwischen ihnen im Verhältnis: 1: 1, 1: 2 und 2: 1 auf Caco-2-Zellen. Die erhaltenen Daten zeigten, dass RJ allein AP-Aktivität hat: 2,0 (0,005 g / ml), Huifen-αN3 hat AP-Aktivität von 2,5 ( I.U./ml). In der Kombination zwischen RJ und HuIFN-αN3 (2: 1), war die AP-Aktivität 3.5. Als der Pegel des Caspase 9 und das durch diesen induzierte Prozent der Apoptose gemessen wurde, wurden die höchsten 49% der apoptotischen Zellen gefunden. Bei der Analyse ihres tumorigenen Potentials in vitro durch den Tumorigenitätsindex wurde es herausgefunden, dass von der Kontrollebene Caco-2-Zellen von auf 0,279 reduziert wurden. Die Behandlung der zellulären Microtumoren Caco-2 mit der Kombination RJ: HuIFN-αN3 (1: 1, 1: 2 und 2: 1) in 2: 1 reduziert die Entwicklung der Microtumore.

3 Der Zweck dieser Studie war: 1.Die Untersuchung des Einflusses von RJ auf Hu IFN-αN3 induzierte Hemmung von Dickdarmkrebs zellen (Caco-2) Proliferation 2.Caspase 9 - induzierte Apoptose und Abnahme des Caco-2 tumorigenen Potencials über die Messung des Tumorigenitäts= indexes in vitro und 3.Hemmung von CaCo-2 Microtumors.

4 1. Material: Während der Versuche wurden die folgenden Materialien verwendet: (1) Menschliches Leukozyten-Interferon (HuIFN-α) (Sigma-Aldrich) 1000 IE / ml, (2) Royal Jelly-Frisch (Mižigoj) (RJ-F (M)) (MEDEX doo), 0,1g / 10 ml, (3) 10-Hidroxy-2-Decensäure (10-HDA) (Sigma-Aldrich) (100 μm/ml). Alle Reagenzien wurden in sterilem PBS (Phosphate Buffer Saline) aufgelöst, ph = 7,2 und dann durch den 0,2 μm Spritzenfilter filtriert (Millipore, USA), (4) Caco-2 (Colon Cancer Cells) Zellen wurden kultiviert im Eagle-Medium mit L-Glutamin und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamicin ) und mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Sigma-Aldrich). Die Zellkultivierung wurde in 96-Well-Schalen oder 25cm2 Flaschen (Sterilin, Deutschland) durchgeführt. 2. Methoden 2.1. Antiproliferative (AP) Aktivität In die 96er Well Mikrotiterplatten wurden die Proben hinzugefügt (200 μl), und sie wurden aus seriell verdünnt von 1: 2 bis 1: 4096 in dem Eagle-Medium mit L-Glutamin und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamicin ). Folgende Stoffe bzw. ihre Kombinationen wurden hinzugefügt: (a) RJ-F (M), (b) HuIFN-α, (c) 10-HDA, (c) RJ-F (M) + HuIFN-α: 1: 1, 1: 2,2: 1; (D) RJ-F (M) + 10-HDA: 1: 1, 1: 2, 2: 1; (E) HuIFN-α + 10-HDA: 1: 1, 1: 2, 2: 1. Nach den Substanzen wurden in dem Eagle-Medium

5 mit L-Glutamin und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamicin ) die Zellen (Caco-2) (10 4 Zellen / Vertiefung / 100 μl) und 10% FCS (fötales Kälberserum ) (Sigma- Aldrich) hinzugefügt. Getrennt davon wurden die Zellen ohne Substanzen hinzugefügt (Cell Control). Die Mikrotiterplatten wurden für 72 h bei 37 o C in 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Nach drei Tagen wurden die Überstände entfernt, und die Zellen wurden mit der Zugabe von 100μl/well von 10% Formalin und PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) fixiert. Nach zwei Stunden wurde das Fixiermittel entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Danach wurde 2% Rhodamin B (100 μl/well) für 15 Minuten zugegeben. Das Rhodamine B wurde dann entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und luftgetrocknet. Auf den getrockneten Platten wurde OD bei 550 nm gemessen. Die AP-Aktivität wurde mit dem Brunnen und der Zeile bestimmt, wobei eine 50% Hemmung des Zellwachstums entdeckt wurde Wachstumsrate In vitro Wachstumstest. Wachstumstests wurden mit einer zuvor beschrieben Methode durchgeführt. Zellen wurden in einer Dichte von 3000 Zellen pro Well ausgesät. Drei Replikatplatten wurden hergestellt (über Nacht, Tag 3 und Tag 5). Die Platten wurden für den geeigneten Zeitraum inkubiert, bevor sie mit 4% Formaldehyd [v / v in ausgewogener Salzlösung (BSS)] fixiert wurden, gefärbt mit 0,5% (w / v) Kristallviolett und gewaschen. Der Fleck wurde extrahiert mit 10% (v / v) Essigsäure und Absorptionen berechnet unter Verwendung eines Platten Spektrophotometers (EL x 800, Bio- Tek, Wolf Laboratories, York, UK). Die Erhöhung des Prozentes des Zellwachstums wurde unter Verwendung der über Nacht Platten als Referenz berechnet Apoptose-Assay Morphologie der behandelten Zelle Nuclei wurde nach Fixierung der Zellen für 30 min mit 3% Paraformaldehyd und PBS untersucht. Die Zellen wurden mit 1 μg/ml DAPI (Roche) und PBS für 20 Minuten gefärbt, zweimal mit PBS, eingedeckt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMRB FLUO) beobachtet. Das Verfahren wurde bei Raumtemperaturen durchgeführt.

6 2.4. Tumorigenität Index in vitro Alle Zelllinien wurden kultiviert in Williams-Medium-E (Flow Laboratories, Rockville, MD) mit 10% (vol / vol) fötalem Rinderserum (Flow) und 50 ug Gentamycin (Schering Corp., Kenilworth, NJ) pro ml. Dieses Medium enthielt 1,5 mm Calcium und wurde als "High-Calcium" Medium bezeichnet. Low Calcium Medium wurde durch die Kombination von calciumfreien Williams Medium E mit fötalem Rinderserum (10% v / v), das mit Chelex Ionenaustauscherharz vorbehandelt wurden, hergestellt, um Calcium zu entfernen. Die endgültige Gesamtcalciumkonzentration des Mediums mit behandeltem Serum war 0,02 mm. Für höhere Calciumkonzentrationen wurden geeignete Mengen an CaC12 zu diesem Medium hinzugefügt. 2.5 Caspase 9 Test Der Caspase-9 Test wurde durch das Caspase-9 kolorimetrische Prüfungskit beurteilt, gemäß der Herstelleranleitungen (R und D System). Alle Tests wurden dreifach durchgeführt

7 Antiproliferative Aktivität Die folgenden Ergebnisse der AP-Aktivität und Konzentrationen an AP50 wurden gewonnen: (a) R J-F(M): 2,0 (0,005g/ml), (b) HuIFN-α: 2,5 (208,33 I.U./ml), (c) 10-HDA: 1,5 (37,5 μm/ml), (č) RJ-F(M) + HuIFN-α: 1:1= 0,8, 1:2=0,5, 2:1=3,8; (d) RJ- F(M)+10-HDA= 1:1=1,8; 1:2=1,5; 2:1=1,5; (e) HuIFN-α + 10-HDA: 1:1=2,1; 1:2= 0,5; 2:1=2,3. (Abbildung 1) ABBILDUNG 1: Wirkung von RJ-FM), Hu IFN-alpha, 10-HDA und deren Kombinationen auf die Proliferation der Caco-2 Zellen.

8 Die Ergebnisse von dem Wachstum rate und Tumorigenität Index in vitro zeigen, dass RJ: IFN-αN3 (2: 1) zeigen die höchste Verringerung der zellulären (Caco-2) Wachstumsrate (275/420 in der Steuerung) und die höchste Verringerung des Tumorigenitäts Indexes in vitro (0.892/ in der Steuerung ).

9 Die Bestimmung des % der Apoptose von Zellen CaCo 2 als höhstes im Falle von RJ: IFN-αN3 (2: 1) das 49/11 in Kontrolle war. Wenn der Pegel der Caspase - 9 analysiert wurde, wurde 2.1 / 1.0 gefunden.

10 Schlussfolgerungen Aus den durchgeführten Experimenten können wir schließen: 1. Die antiproliferative Aktivität von Caco-2 Zellen wurde stark durch die Kombination von RJ: IFN-αN3 (2: 1) beeinflusst, um 3.8 Nummer der Well mit 50% Zellwachstumshemmung. 2. Die Ergebnisse von dem Growth Index und Tumorigenität Index in vitro zeigen, dass RJ: IFN-αN3 (2: 1) zeigen die höchste Verringerung der zellulären (Caco-2) Wachstumsrate (275/420 in Kontrolle) und die höchste Verringerung des Tumorigenität Indexes in vitro (8.892/ und Kontrolle). 3. Die Bestimmung des % der Apoptose von Zellen CaCo 2 als höhstes im Falle von RJ: IFN-αN3 (2: 1) das 49/11 in Kontrolle war. Wenn der Pegel der Caspase - 9 analysiert wurde,wurde 2.1 / 1.0 gefunden.