VIREN-I. Viren generell. I. Einleitung

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1 1 2 Viren generell I. Einleitung Viren können alle auf Zellen basierende Lebensformen infizieren: Eukaryoten (Wirbeltiere und wirbellose Tiere, Pflanzen und Pilze) und Prokaryoten (Eubakterien und Archaea). Viren, die Bakterien infizieren, nennen wir Bakteriophagen, oder kurz Phagen. Viren verursachen viele Menschenkrakheiten, von dem mit milden Symptomen verbundenen Schnupfen (Rhinoviren) bis zum tödlichen Tollwut (Tollwutvirus). Weiterhin, auch einige Krebskrankheiten werden von Viren (Retroviren, Papillomviren, usw.) verursacht. Viren können ernste gesellschaftliche Probleme hervorrufen: bestimmte Epidemien können das Leben von vielen Menschen verlangen, und auch die Verteidigung gegen diese Epidemien kann kostspielig sein. Früher hat Pocken (Poxvirus) grosse Epidemien verursacht, heute verlangt HIV (Retrovirus) eine riesige Anzahl von Opfern. Viren sind sehr vielfältige Organismen. Abweichend von anderen Lebewesen, viele Viren besitzen ein RNA-Genom. Sowohl die Viren mit RNA als Erbmaterial, als auch Viren mit DNA als Erbmaterial können einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure besitzen. Das Erbmaterial der Viren kann linear oder zirkulär sein. Die meissten Viren besitzen ein einziges Nukleinsäuremolekül, aber zb. die Influensaviren haben 7 oder 8 RNA-Moleküle. Die Viren haben generell ein haploides Genom, aber zb. HIV ist diploid (enthält zwei identische RNA- Moleküle). Es gibt solche Viren, die sich ins Wirtsgenom integrieren (Retroviren), die Mehrheit der Viren ist aber nicht dazu fähig. Die Virusnukleinsäure kann im Zellkern (Herpesviren, Adenoviren, Influensaviren) oder im Zytoplasma (Poxviren, die Mehrheit der RNA-Viren) repliziert werden. Viren, die im Zytoplasma repliziert werden, müssen ihre Vervielvältigung selbst verwirklichen, da der Replikationsapparat der Wirtszelle befindet sich im Zellkern. Die Virusinfektion kann produktiv (viele Virenpartikel entstehen), latent (der Virus verteckt sich vor dem Immunsystem), und abortiv (erfolglos) sein. Die Infektionsfähigkeit von einigen Viren hängt von der Anwesenheit von anderen Viren ab (zb. die Adeno-assoziierte Viren brauchen Komponenten, die von Adeno- oder Herpesviren als Helferviren produziert werden). Die von Viren verursachten Krankheiten können einen schnellen (Influensa), oder Jahre lang dauernden (HIV) Ablauf haben. Viren können nackt (die Nukleinsäure wird nur von einem Kapsid umgegeben), oder gehüllt sein. Der strukturelle Aufbau und die Replikationsstrategien der Viren können auch sehr vielfältig sein. Die Viren haben aber zwei gemeinsame Eigenschaften: (a) sie sind kleiner als 200 nm (Ausnahmen sind die Mimiviren und Mamaviren); (b) sie können sich ausschliesslich in der Wirtszelle replizieren (obligate Parasiten). Die Viren benutzen immer die folgenden Komponenten der Wirtszelle: (1) Bausteine, zb. Aminosäuren und Nukleotide; (2) Proteinsyntheseapparat (Ribosomen, trnas, usw.); (3) Energie in der Form von ATP. Viren unterscheiden sich in einer grundlegenden Eigenschaft von den Wirtszellen: eine neue Zelle stammt immer von einer existierenden Zelle, ein Virion (gereifter Virus) wird aber immer aus den in der Zelle gebildeten Komponenten während dem Zusammenbauprozess neu aufgebaut. Der Virus modifiziert die Zellfunktion, damit es seine eigene Replikationseffizienz steigern kann. Diese Modifikation beinhaltet die Bildung von neuen Membranstrukturen, die Hemmung der Expression von Genen der Wirtszelle und die Stimulierung von bestimmten zellulären Prozessen. Entdeckung der Viren Der erste Beweis auf die Existenz von Viren wurde von zwei Forschern (der niederländische Martinus Beijerinck und der russische Dimitrij Ivanowski) unabhängig von einander am Ende des XIX. Jahrhunderts geliefert. Sie haben Extrakte aus kranken Tabakblättern hergestellt, welche sie durch einen Filter filtriert haben, welcher Poren kleiner als Bakterien enthielt, dann haben sie mit dieser Lösung gesunde

2 3 4 Pflanzen erfolgreich infiziert. Das Infektionsexperiment wurde mehrmals nach einander durchgeführt (Proben wurden von den neu infizierten Pflanzen genommen, usw.) um die Möglichkeit ausschliessen zu können, dass die Krankheit von einem Toxin verursacht wird (das Toxin hätte sich verdünnt während den aufeinanderfolgenden Weiterimpfungen). Der Virus wurde später als Tabakmosaikvirus (TMV: tobacco mosaic virus) identifiziert. Das Wort Virus wurde erstmal von Beijerinck benutzt. In derselben Zeit wurde der erste Tiervirus, der Virus von Maul und Klauensäuche) entdeckt. Friedrich Löffler und Paul Frosch konnten die Krankeit von Tier auf Tier mit abfiltriertem Blutserum aus einem kranken Tier übertragen. Leben die Viren? Ein weit verbreitetes Bedünken ist, dass die Viren keine Lebewesen sind, da sie die auf das Leben charakteristischen Lebenserscheinungen ausserhalb der Zelle nicht produzieren. Die Situation ist aber ähnlich im Fall der Bakteriumsporen, die Bakterien werden doch nicht als leblos betrachtet werden. Herkunft der Viren Die Evolution der höheren Lebewesen kann oft aus den Fossilien rekonstruiert werden. Es gibt aber keine Fossilien von Viren. Sogar, wegen der extrem schnellen Evolution der Viren können wir nicht einmal ihre weiten Verwandschaften kartieren, - mit einem anderen Wort einen evolutionären Stammbaum aufbauen -, da die genetischen Spuren der Ähnlichkeit bis heute verloren gegangen sind. Diese Situation resultiert darin, dass mindestens zurzeit wir über die Herkunft von Viren und ihre Abstammungsrelationen nur spekulieren können. Es gibt vier Haupttheorien, die versuchen, die Herkunft der Viren zu erklären. Diese Theorien schliessen einander nicht unbedingt aus; wahrscheinlich erklärt die eine Theorie die Entstehung von bestimmten, die andere Theorie von anderen Virenfamilien richtig. 5 6 Die regressive Hypothese Vereinfachung von Zell-basierenden Lebewesen Die Viren sind degenerierte Lebensformen, welche die Mehrheit der für das selbstständige Leben nötigen Funktionen verloren haben und zu Parasiten geworden sind. Wahrscheinlich entstanden die Poxviren durch die Vereinfachung von prokaryotischen Zellen. Die progressive Hypothese Desertierte Nukleinsäuren Die Viren haben sich aus dem Genom der Wirtszelle herausgerissen, und dabei mehrere von dessen Elementen zusammenkombiniert. Wahrscheinlich sind die meissten (wenn nicht alle) Viren so entstanden. Die Symbiont-Hypothese Intrazelluläre Mikroorganismen Anhand der Vermutungen waren die Vorläufer der Viren, - ähnlich wie die Vorläufer von Mitochondrien und Chloroplasten -, zelluläre Organismen, die mit der Zelle in Symbiose eingegangen sind, später aber von dem Weg der Kollaboration abgestriffen und zu Parasiten geworden sind. Diese Theorie versucht das Problem zu lösen, wie das genetische Material der Viren entstanden ist. Die Antwort lautet: aus dem symbiontischen Zellorganellchen. Anhand Vermutungen hätte der grösste bekannte Virus, der Mimivirus so entsehen können (andere erklären die Herkunft dieser Viren mit der regressiven Hypothese). Die Virus zuerst Hypothese Herkunft unabhängig von der Zelle Die Viren sind in der Zeit der Ur- RNA-Welt entstanden, noch vor, - oder parallel mit -, den zellulären Lebensformen. Diebviren Es ist auf die Viren charakteristisch, dass sie Gene von einander und auch vom Wirtsorganismus stehlen können. Es ist nämlich einfacher ein schon funktionierendes Gen von jemandem anderen wegzunehmen, als ein neues Gen zu entwickeln. Als Beispiel wird der Herpes simplex Virus vorgestellt. Dieser Virus enthält auch Gene mit solchen Sequenzen, die sehr ähnlich mit der Wirtszelle sind. Die Produkte dieser Gene nehmen in der DNA-Replikation direkt teil, wie zb. die DNA-Polymerase, oder indirekt, durch die Herstellung von Nukleotiden die für die Synthese des neuen Stranges nötig sind, wie zb. die Enzyme Thymidin-Kinase und Ribonukleotid-Reduktase. Systematik der Viren Im Jahre 1966 wurde die Internationale Komitee der Virensystematik (International Committee on Taxonomy of Viruses; ICTV) mit der Absicht gegründet, dass es unter den bislang chaotischen Verhältnissen im Gebiet der Virensystematik und Nomenklatur Ordnung machen soll. Die Virologen haben für eine lange Zeit Widerstand gegen die Verwendung von bestimmten systematischen Kategorien, zb. Familie, Gattung und Art geleistet. Seitdem haben sich aber diese, für die Systematik der Lebewesen benutzte Kategorien auch in der Virologie eingebürgert. Das Problem ist mit der Erstellung von höheren systematischen Kategorien zb. Orden, Klasse und Phylum, da die Abstammungsverhältnisse der weit entfernten Gruppen nicht bekannt sind (der evolutionäre Stammbaum der Viren ist wurzellos, weil wir die gemeinsamen Vorfahren der Virenfamilien nicht kennen). Die Einordnung in niedrigere systematische Kategorien (Orden, Familie, Gattung) wurde früher an Hand morphologischer Gründen oder Ähnlichkeiten der Virusinfektion durchgeführt. Heute sichern die Genomsequenzierungstechniken mehr genauere Methoden für die Bestimmung der Verwandtschaft. Viren werden von zellulären Organismen dadurch auseinandergelegt, dass sie Kapsid oder Ribosomen kodieren (die Trennung von auf Zelle basierenden Lebewesen und Viren wäre vielleicht einfacher).

3 7 Das Baltimore-System (aufgestellt von David Baltimore) kategorisiert die Viren an Hand ihrer Genome (DNA, RNA, einzelsträngig, doppelsträngig) und Replikationsstrategie. Viren, die im Baltimore-System zu derselber Klasse gehören, sind nicht unbedingt miteinander verwandt. Es gibt 7 Baltimore-Klassen: I: dsdna-viren (zb. Adenoviren, Herpesviren, Poxviren) II: ssdna-viren (+)DNA (zb. Parvoviren) III: dsrna-viren (zb. Reoviren) IV: (+)ssrna-viren (zb. Picornaviren, Togaviren) V: (-)ssrna-viren (zb. Orthomyxoviren, Rhabdoviren) VI: (+)ssrna-viren mit DNA-Intermedier (zb. Retroviren) VII: dsdna-rt Viren (zb. Hepadnaviren) Bemerkung: intermedier = vorübergehende Form; Abkürzung: ds: doppelsträngig; ss: einzelsträngig; RT: reverse Transkriptase Viren und Krebs Viren, die Krebs verursachen können, nennen wir onkogene Viren. Die angenommene Rolle bei der Tumorbildung kann durch die Anwesenheit des Virus in Tumoren bewiesen werden. Bestimmte tumorbildende Viren integrieren sich ins Genom der Wirtszelle (Retroviren), während andere kommen als kovalent geschlossene Ringe ausserhalb des Chromosoms im Zellkern vor (Papillomviren, Hepatitis B Virus, Epstein-Barr Virus). Das Thema der onkogenen Viren wird im Vortrag Molekularbiologie der Krebsentstehung in Details bearbeitet (2. Semester). Viren, Vakzinen, antivirale Agenzien Dieses Thema wird im Vortrag Biotechnologie und rekombinante Gentechnologie bearbeitet. II. Struktur der Viren Den Virus ausserhalb der Zelle nennen wir Virion, den Virus innerhalb der Zelle nennen wir vegetativer Virus. Ein Provirus ist der sich in die DNA des Wirtes eingebaute Virus. Der Virus ist eigentlich ein sich auf die Einbringung von Genen spezialisierter, biologischer Apparat. Die Rolle der Proteine, die die Virusnukleinsäure umgeben ist die Schutz des Genoms und ihre Einbringung in die Zelle. Unter Kapsid verstehen wir regelmäßig angeordnete Proteinuntereinheiten mit Innenraum für die Verpackung der Nukleinsäure. Ihre kleineren morphologischen Einheiten sind die Kapsomere, welche sich aus Proteinen bestehen. Viele Viren verfügen auch über eine äussere Membrankomponente, welche wir Hülle nennen. Die Hülle stammt aus der Zytoplasmamembran der Wirtszelle oder aus der Membran des Golgi-Komplexes und kann unterschiedliche Virusproteine enthalten. Bei den gehüllten Viren befindet sich meisstens zwischen der äusseren Membran und dem Kapsid auch eine unstrukturierte (amorphe) Schicht, die wir Matrix (im Fall von Herpesviren Tegument) nennen. 8 Virusgenome Virione können ein oder mehrere Genome enthalten. Gegenüber von anderen Lebewesen, die Viren können nicht nur DNA-, sondern auch RNA-Genom haben. Weitere Besonderheit der Virengenome ist, dass sie nicht nur doppelsträngig, sondern auch einzelsträngig sein können, sowohl im Fall der DNA-, als auch im Fall der RNA- Viren. Diese Unterschiede weisen auf die polyphyletische Herkunft der Viren hin (Gegenteil: monophyletische Herkunft). Die lineare oder zirkuläre Struktur der Nukleinsäuren bedeutet weitere Vielfältigkeit. Die Genomgrösse der Viren zeigt auch eine grosse Variabilität auf. RNA-Viren besitzen in der Regel kleine Genome, während unter den DNA-Viren gibt es sowohl kleinere als auch grössere. Die Herpes- und Poxviren gehören zu den Viren mit grossem Genom. Die neu entdeckten Mimiviren sind riesig (bestehen sich aus mehr als eine Million Nukleotiden), sie haben eine DNA grösser als einige Mycoplasma Arten, die die kleinsten zellulären Organismen (Prokaryoten) sind. Die meissten Viren enthalten ein einziges Nukleinsäuremolekül, es gibt aber auch Viren, die 2 oder mehrere Nukleisäuren besitzen.

4 Das Vorkommen des segmentierten Genoms ist viel häufiger im Fall von RNA-Viren. Influensaviren sind typische Beispiele für Viren mit einem segmentierten Genom. Die Influensaviren enthalten 7 oder 8 (-)RNA Moleküle in einem einzigen Virion. Interessanterweise, der Brome Mosaikvirus packt ihre Erbmaterial-segmente in mehreren Virionen, so müssen alle von diesen Virionen eine Zelle infizieren, damit der Virus funktionsfähig ist. Das segmentierte Genom ist dadurch vorteilhaft, dass es neben den konventionellen Mechanismen (Mutation, genetische Rekombination) eine neue Möglichkeit für die Steigerung der genetischen Variabilität ermöglicht, nämlich den Austausch von Virussegmenten zwischen unterschiedlichen Virusstämmen. Deshalb sind die Influensaviren zu sehr schnellen genetischen Veränderungen fähig, welches sich zb. auch im relativ leichten Wirtswechsel zeigt. Der Virus von AIDS, HIV enthält ihr Erbmaterial in zwei Kopien, besitzt also eigentlich ein diploides RNA-Genom. Einige RNA- Viren bilden vorübergehend DNA aus ihren RNA-Molekülen mit Hilfe einer RNAabhängigen DNA-Polymerase (reverse Transkriptase). Andere Viren (zb. Influensa- und Polioviren) überschreiben die RNA direkt in RNA mit Hilfe ihrer RNA-abhängigen RNA- Polymerase Enzymen. Das genetische Material der sich ins Genom nicht integrierenden Viren befindet sich regelmässig im Zelkern, im Fall von langsamen Viren als sogenannte extrachromosomale DNA, welche mit einem anderen Wort auch Episom genannt wird. Die DNA von bestimmten Viren (zb. Poxviren) lokalisiert sich im Zytoplasma. Ins Genom der Wirtszelle können sich sowohl RNA-Viren (zb. HIV, nachdem das Erbmaterial in DNA kopiert wurde), als auch DNA-Viren (zb. Phage Lambda) integrieren. Das Genom von vielen Viren enthält wiederholende Sequenzen, welche in der Regel eine regulatorische Funktion ausüben: Promoters, Enhancers, Replikationsursprünge, usw. Die Viren mit linearem Genom enthalten wiederholende Sequenzen in der Regel an den Enden der Nukleinsäuren, die wir dementsprechend terminale Wiederholungen (Repeats) nennen. Wenn die Orientation der Wiederholungen identisch ist, sprechen wir über direkte Wiederholungen, wenn sie in miteinander entgegengesetzten Orientation stehen, sprechen wir über invertierte Wiederholungen. 9 Kapside Das Genom lagert sich im Virion in einem Proteinkapsid. Im Fall von einigen Viren bildet Genom und Kapsid (zusammen: Nukleokapsid) das Virion (zb. Adenoviren), bei anderen Viren ist das Kapsid von einer Hülle umgegeben. Das Virusgenom ohne Kapsid kann viel leichter inaktiviert werden, als das Virion mit Kapsidproteine. Diese Tatsache zeigt die eine Funktion des Kapsids, die Schutzfunktion. Eine andere Funktion des Kapsids bei nackten Viren (nackte Viren: haben keine Hülle, im Gegenteil zu gehüllten Viren) ist die Erkennung der Zielzelle und das Anheften (im Fall der Viren mit einer äusseren Membranhülle erfüllen die Hüllenproteine diese Aufgabe). Das Kapsid ist auch beim intrazellulären Transport wichtig. Das Kapsid wird aus vielen Proteinmolekülen aufgebaut, die artabhängig einerlei oder mehrerlei sein können. Die einerleie Proteine sind asymmetrisch, stehen aber zu einer symmetrischen Struktur zusammen. Die grosse Mehrheit der Viren kann an Hand der Kapsidsymmetrie in zwei Gruppen eingeteilt werden: helikale (aus Helix = Schnecke, ähnlich wie im Fall der DNA, hier ist es auch inkorrekt, der Ausdruck spiral wäre mehr passend) und ikosaedrische Viren. (1) Helikale Symmetrie Die Kapsidstruktur von vielen einzelsträngigen RNA-Viren zeigt so eine Symmetrie. Die RNA ist spiralförmig, und die Proteine binden dazu so, dass sie diese Struktur behalten. Das helikale Kapsid von mehreren einzelsträngigen Viren (zb. Viren von Masern und Influensa) ist von einer Hülle umgegeben, aber zb. das Kapsid des Tabakmosaikvirus ist nackt, nicht umgehüllt. Nur wenige DNA-Viren besitzen ein Kapsid mit helikaler Symmetrie (filamentöse Phagen). (2) Ikosaedrische Symmetrie Der Ikosaeder wird von 20 regelmässigen Dreiecken gebildet. Das Kapsid der meissten Viren ist ikosaedrisch. (3) Stock- und kegelförmige Kapside Neben den obengenannten existieren auch andere Kapsidformen, die viel mehr selten vorkommen. Zb. HIV-1 hat

5 10 kegelförmiges, Baculoviren (Insektparasiten) haben stockförmige Kapside. Die Virione in diesen beiden Gruppen sind gehüllt. Virionmembran (Hülle) Das Kapsid von vielen Viren ist von einer sich aus Lipiddoppelschicht bestehenden Membran umgegeben. In der Membran befinden sich in den meissten Fällen solche Proteine, die von dem Virusgenom kodiert sind. Diese Proteine helfen die Virusinfektion, hauptsächlich bei der Erkennung der Zielzellenoberfläche und beim intrazellulären Transport. Die Hülle ist im Fall von den meissten Viren kugelförmig, aber andere Formen können auch vorkommen. Die Hülle ist häfig bei den Viren von Tieren und Pflanzen, aber sehr selten können auch die Viren von Prokaryoten (Bakteriophagen) mit einer äusseren Hülle umgegeben sein. Die meissten Membranproteine sind glykosylierte Transmembranproteine (Glykoproteine). Viele Glykoproteine kommen in einer multimeren (sich aus mehreren Untereinheiten bestehenden) Form vor. Die Funktion von vielen Glykoproteinen ist die Verwirklichung der Fusion zwischen Virushülle und Zellmembran. Aber auch die Erkennung der entsprechenden Wirtszellen (Erkennung von art- und zellspezifischen Rezeptoren) ist die Aufgabe der Glykoproteine. Die meissten Virionmembrane stammen aus der Zytoplasmamembran oder aus den Membranen der Golgi-Transportvesikel, in welche virale Proteine eingebaut werden III. Virusinfektion Das Ziel des Virus ist dasselbe, als von allen anderen Organismen: das informationstragende Material in die Nachkommen zukommen zu lassen. Um dieses Ziel verwirklichen zu können, muss der Virus in die Zelle eindringen, dort seine Nukleinsäuremoleküle vervielfältigen, die entstehenden Virione zusammenbauen, sich aus der Zelle freisetzen und dann den ganzen Prozess neu beginnen. Die generellen Schritte der Virusinfektion sind die Folgenden: 1. Anheften an der Zelle (Adsorption) 2. Eindringen in die Zelle (Penetration) 3. Transkription der viralen Gene in mrnas 4. Translation der mrnas in Proteine 5. Replikation des Genoms 6. Zusammenbau des Genoms und die Proteine zum Virion 7. Freisetzung der Virione aus der Zelle Nicht alle der oben genannten 7 Prozesse erfolgen aber im Fall von allen Viren; weiterhin, die einzigen Schritte erfolgen nicht immer in der oben gezeigten Folge, und im Fall von einigen Viren kommen auch andere Schritte (zb. reverse Transkription) vor. Im Fall von vielen Viren laufen die Transkription, Translation, Genomreplikation, Zusammenbau und Freisetzung aus der Zelle gleichzeitig ab. Anheften des Virus an der Zelle Das Virion bindet einen oder mehrere Zelloberflächenrezeptorproteine. Die Erkennung des Rezeptors durch das Virion ist sehr spezifisch. Für die Infektion einer Zelle durch einige Viren ist auch die Bindung zu einem zweiten Rezeptor (Ko-Rezeptor) benötigt. Die durch den Virus erkannten Rezeptoren und Ko-Rezeptoren sind meisstens Glykoproteine, welche in der Zelle unterschiedliche Funktionen erfüllen. Die Bindung zu den Rezeptoren sichert, dass der Virus den entsprechenden Zelltyp der entsprechenden Spezies infiziert. Die Bindungsstelle der nackten Viren ist an der Oberfläche des Kapsids, manchmal in Vertiefungen (zb. Poliovirus), andersmal an den Schärfen (zb. Maul und Klauenseuchevirus). Andere nackte Viren benutzen spezialisierte Strukturen für die Bindung an der Zelloberfläche (zb. Adenoviren, Rotaviren).

6 Eindringen in die Zelle (Penetration) Nach der Bindung zum Rezeptor muss der Virus durch die Zellmembran ins Zytoplasma eindringen. Diese Aufgabe können die Viren mit Hilfe von zwei Mechanismen lösen: (1) Fusion: die Virushülle und die Zellmembran fusionieren (zb. Herpesviren), wodurch das Nukleokapsid in die Zelle eingeschleust wird, die Hülle aber nicht. (2) Endozytose: der andere Weg der Penetration ist die Endozytose, wenn die Zellmembran den Virus umhüllt und ein Endosom bildet (siehe Folie). Die nackten Viren und auch mehrere gehüllte Viren penetrieren die Zelle durch Endozytose. Bemerkung: Endozytose ist ein natürlicher Prozess der Zelle, mit welchem es Nahrungsmittel und Erreger aufnimmt, die letzteren um sie zu vernichten. Es gibt mehrere Typen der Endozytose, aus denen die zwei häufigsten die clathrin- und caveolin-vermittelte Endozytose sind. Viele Viren nutzen diese zellulären Mechanismen für das Eindringen in die Zelle aus. Die darauffolgende Aufgabe des Virus ist das Entkommen aus dem Endosom. Das Endosom kann mit einem Lysosom fusionieren, wobei der Innenraum des Endosoms angesäuert wird. Die Zelle kann das ph durch das Einpumpen von H + -en weiter senken. Diese Ansäuerung ist das Signal für viele Viren (zb. Retroviren) für die Fusion der Hülle mit der Membran des Endosoms, wodurch das Kapsid ins Zytoplasma freigesetzt wird Intrazellulärer Transport Sowohl der Virus (Virion, Nukleokapsid, oder Nukleinsäure) ins Zytoplasma hineingeraten ist, muss es zur Stelle der Replikation gelangen, welche der Zellkern oder bestimmte Stellen des Zytoplasma sein können. Ein Teil der Viren nimmt den Transportsystem der Zelle (Mikrotubuli) für diese Aufgabe in Anspruch. Die meissten RNA-Viren replizieren sich im Zytoplasma; die Mehrheit von diesen brauchen keine Enzyme aus dem Zellkern, da sie die benötigten Enzyme selbst kodieren. Influensaviren sind die Ausnahmen, da sie das im Zellkern funktionierende Splicingapparat benötigen, deshalb wird ihr Genom in den Zellkern transportiert. Die Retroviren streben sich auch in den Zellkern, weil die mit Hilfe ihrer reversen Transkriptase gebildete DNA sich ins Wirtsgenom integriert. Die meissten retroviralen DNAs warten auf die Mitose, weil die Kernmembran dann vorübergehend zerfällt, so kann der Virus in die Nähe des Wirtsgenoms gelangen. Diese Viren können also nur sich teilende Zellen infizieren. Die DNA der zur Familie der Retroviren gehörenden Lentiviren (zb: HIV) kann aber mit Hilfe von durch seines Genoms kodierten Proteinen die Poren der Kernmembran durchdringen, so können diese Viren auch sich nicht teilende Zellen infizieren. Die Mehrheit der DNA- Viren repliziert sich im Zellkern. Ausnahmen sind zb. die Poxviren, die DNA von welchen im Zytoplasma synthetisiert wird. Das in den Zellkern kommende Genom muss in die Nähe der Kernmembran transportiert werden und dann durch die Kernporen durchdringen. Die Strukturproteine von mehreren Viren besitzen solche Sequenzen, welche die Bindung zu den Mikrotubuli ermöglichen. Die Herpesviren, Adenoviren, Parvoviren und Retroviren benutzen diesen Transportmechanismus der Zelle, um ihr Nukleokapsid von der Peripherie in die Nähe des Zellkerns zu transportieren. Die Bindung von bestimmten Komponenten des Kapsids zu unterschiedlichen Motorproteine wurde kartiert (siehe Folie). Die kleinen Viren (zb. Parvoviren) können durch die Kernporen durchdringen, die grösseren müssen aber ihr Kapsid vollständig oder partiell entfernen, damit ihre Nukleinsäure durch die Kernporen durchkommen kann. Modifiziertes zentrales Dogma Francis Crick hat im Jahre 1958 das Zentrale Dogma der Molekularbiologie als so ein Prinzip vorgeschlagen, welches die Replikation und Expression des genetischen Materials erklärt. Nach dem Zentralen Dogma wird die genetische Information in die Richtung DNA RNA Protein exprimiert und durch Kopieren von DNA in DNA von Generation auf Generation weitergegeben. Obwohl alle Aussagen des Dogmas auf die auf Zellen basierenden Lebensformen wahr sind, die Viren verletzen die Regel in mehreren Punkten: ein Teil der Viren mit RNA-Genom wird in DNA

7 16 17 kopiert (Retroviren), während andere Viren direkt, ohne DNA-Intermediär RNA bilden (Influensaviren). Bemerkung: die RNA DNA Umwandlung findet auch in eukaryotischen Zellen statt, mit Hilfe des reversen Transkriptase Enzyms, welches von den Retroelementen kodiert ist. Transkription (1) Die Transkription der eukaryotischen Zellen findet nach dem schon bekannten Mechanismus statt: zu den sich auf der DNA befindenden cis-regulatorischen Sequenzen bindend helfen die Transkriptionsfaktoren die RNA-Synthese durch RNA- Polymerase II. Im weiteren kommt am 5 Ende der prä-mrna eine Kappe (cap), am 3 Ende ein polya-schwanz., dann werden die Introns in unterschiedlichen Mustern ausgesplicet (alternatives Splicing). (2) Viren Die Transkription der in den Zellkern kommenden einzeloder doppelsträngigen DNA-Viren findet ebenso mit der Verwendung des Transkriptionsapparats der Wirtszelle statt. Die sich ins Wirtsgenom integrierende RNA- Viren, die sich in einer DNA-Form integrieren, benutzen ebenso diesen zellulären Mechanismus, da sie im Zellkern in einer DNA-Form vorliegen. Andere, in den Zellkern kommende RNA-Viren (zb. Influensavirus) benutzen aber selbst kodierte, einzelsträngige (ss)rna-abhängige RNA-Polymerase für die Bildung der mrna. Die Influensaviren werden in den Zellkern transportiert, weil sie das Splicingapparat der Wirtszelle benötigen. Die sich ausserhalb dem Zellkern replizierenden Viren finden sich dem Problem gegenüber, dass im Zytoplasma keine für die Transkription (und Replikation) benötigte Proteine vorkommen, deshalb müssen sie diese selbst herstellen: die als RNA replizierende Viren synthetisieren RNA-abhängige RNA-Polymerasen, die DNA-Viren synthetisieren DNAabhängige RNA-Polymerasen. Bemerkung: die DNA-Viren kodieren auch DNA-abhängige DNA- Polymerases für ihre Replikation. Translation (a) Die zellulären mrnas werden auf der beschriebenen Weise abgelesen. Die kleinen Untereinheiten der Ribosomen binden das 5 Ende der mrna auf einer kappenabhängigen Weise, von dort aus finden sie das Codon der anfänglichen Aminosäure (Methionin AUG) mit Hilfe eines Scanningmechanismus, und dann beginnen sie die Translation mit Hilfe der anbindenden grossen ribosomalen Untereinheit und der Initiator trna-met. (b) Virale mrnas werden in den meissten Fällen grundlegend so abgelesen, wie die zellulären mrnas. Es gibt aber einige auf die Viren charakteristische, und von den Viren viel häufiger benutzte Mechanismen, nämlich: (1) IRES Viele virale mrnas enthalten keine Kappe, und werden deshalb kappenunabhängig abgelesen, was von den sogenannten IRES (internal ribosome entry site; interne Ribosomerkennungsstelle) Sequenzen gesichert wird. IRES befindet sich meisstens in der Nähe der 5 Enden der mrnas, und die Ribosomen können seine spezielle Sekundärstruktur erkennen. Mehrere Viren verwenden den auf IRES basierenden Translationsmechanismus, zb. Polioviren, Hepatitis A und C, Maul und Klauenseuchevirus, usw. Der Hepatitis C Virus bindet die kleine ribosomale Untereinheit zu sich. Die Polioviren ziehen die 40S ribosomale Untereinheit nicht direkt an, sondern durch einen Initiationsfaktor (eukaryotic Initiation Factor: eif), das elf-4g (siehe Folie). Andere Viren degradieren elf-4g, dieser Faktor ruft nämlich zusammen mit elf- 4E die Bindung der Kappe und polya hervor, welcher Schritt eine unentbehrliche Voraussetzung des Translationsstartes ist. Die Essenz der auf IRES basierenden Strategie ist also, dass die Viren durch die Kappe die Translation der zellulären mrnas hemmen können, oder sie die Initiationsfaktoren mit einer höheren Affinität an sich ziehen können. Kürzlich wurde es entdeckt, dass auch einige, meisstens bei der Stressantwort eine Rolle spielende, zelluläre Gene IRES Sequenzen benutzen, ein möglicher Grund dafür kann eben sein, dass dadurch die Viren die Funktion dieser Gene nicht hemmen können. (2) Bi- und polycistronische mrnas Alle zelluläre und die meissten viralen mrnas enthalten ein einziges Gen (Gen = Cistron, dessen kodierende Region der offene Leseraster* (open reading frame; ORF; der Begriff des Cistrons ist in diesem Zusammenhang noch erhalten geblieben)) ist. Es gibt aber solche Viren, die mrnas von welchen zwei oder mehrere ORFs enthalten. Auf vielen bicistronischen mrnas überlappen sich die ORFs, im Fall von anderen befindet sich das kleinere ORF innerhalb des grösseren. Diese Anordnungen können zwei Sinne haben: einerseits Raum zu sparen, andererseits die Geschwindigkeit der Translation zu regulieren. Das Ablesen des zweiten ORFs kann durch mehrerleien Mechanismen passieren: (i) Im Fall von schwachem (leaky) Scanning versieht das Ribosom ab und zu mal die Translationsstartseqenz (AUG), geht weiter bis zum nächsten AUG Kodon und beginnt es mit dem Ablesen am 2. ORF. Die zwei ORFs befinden sich in unterschiedlichen Leseraster, die zwei Proteine enthalten also keine gemeinsame Aminosäuren. (ii) Geschlitterte Termination, wenn das Ribosom das Stopcodon nicht erkennt und es mit der Translation weitermacht, das Ergebnis daraus ist die Entstehung von einem Proteinmolekül, welches länger als das

8 originelle ist. Das Ribosom geht über das Stopcodon, weil ein sogenanntes leserasterverschiebendes Signal auf der mrna mit bestimmter Wahrscheinlichkeit Schlittern verursacht, so entsteht im neuen Leseraster anstatt von dem Stopcodon das Codon einer Aminosäure. (iii) IRES Bei einigen Viren befindet sich die IRES-Sequenz zwischen den beiden ORFs der bicistronischen mrna; so diese Viren können neben dem kappeabhängigen Mechanismus auch von dem inneren Gen unabhängig die Translation initiieren Transport der neu synthetisierten Virusproteine Die neu synthetisierten Moleküle müssen zu bestimmten Stellen innerhalb der Zelle transportiert werden. mrnas werden aus dem Zellkern ins Zytoplasma transportiert (sofern sie im Zellkern gebildet werden); die viralen Proteine kommen vorwiegend in den Zellkern oder in die Zellmembran. Die sich in die verschiedenen Membrane einbauenden Proteine enthalten Signalsequenzen, welche spezifische hydrophobe Aminosäuren enthalten, und meisstens am N-terminalen Ende der Proteine lokalisiert sind, aber auch im inneren der Proteine vorkommen können. Die Mehrheit der im rauen ER synthetisierten Proteine kommt ins Golgi, wo sie glykosyliert werden und in die Zellmembran (oder eventuell in die Kernmembran im Fall von sich im Zellkern replizierenden Viren) eingebaut werden. Die Hülle der durch Endozytose freigesetzten Viren entsteht aus der Zytoplasmamembran, die virale Proteine enthält. Wenn der Virus im Zellkern repliziert wird, werden viele viralen Proteine hier transportiert. Diese Proteine enthalten NLS (nuclear localization signal) Sequenzen. Auch die aus dem Zellkern ins Zytoplasma kommenden Proteine enthalten Signalsequenzen, welche wir NES (nuclear export signal) nennen. Das Rev Protein von HIV enthält sowohl NLS, als auch NES Sequenzen. NLS sichert das Gelangen von Rev in den Zellkern, während NES sichert das Gelangen von Rev und der dazu gebundene RNA ins Zytoplasma. RNAs verlassen den Zellkern durch die Kernporen mit Hilfe von unterschiedlichen Exportinproteinen Replikation des Virusgenoms Die DNA-Viren kopieren sich gewöhnlich direkt zur DNA, während die RNA-Viren direkt zur RNA. Es gibt aber zwei Ausnahmen der obigen Regel: (1) sie umwandeln ihr RNA-Genom mit Hilfe des reverse Transkriptase Enzyms in DNA, zb. die Retroviren; (2) die Hepadnaviren, welche zwar DNA-Viren sind, trotzdem benutzen sie ein RNA-Intermediär für ihre Replikation. Die plussträngigen Genome haben eine mit der mrna entsprechende Sequenz (bei RNA-Viren T - U Austausch!), während die minussträngigen Viren komplemetär mit der mrna sind. Die einzelsträngigen DNA- Viren werden vor der Replikation doppelsträngig. Die (+) RNA-Viren haben zwei Typen: (i) Viren der Klasse IV replizieren ihr (+) RNA-Genom durch ein ( )RNA Intermediär, während die Viren der Klasse VI ihr (+)RNA- Genom durch DNA-Intermediär. Die Viren der Klasse VII stellen ihr DNA-Genom interessanterweise durch ein RNA-Intermedier her. Die DNA-Synthese beginnt am Replikationsursprung und läuft entlang der Replikationsgabel. Der eine DNA-Strang ist der Leitstrang, der andere ist der Folgestrang, welcher die Okazaki-Fragmente bildet. Das ist der klassische semikonservative Weg der Repliakation. Einige Viren bilden aber ihr Erbmaterial auf einer konservativen Weise. Einige DNA-Genome sind linear, andere sind ringförmig (zirkulär). Einige, originell lineare Genome werden vor der Replikation zirkulär. Also, viele DNAs replizieren sich in einer zirkulären Form, welche zwei Hauptwege hat: Theta (θ) und Sigma (σ) Typ der Replikation. Der Sigma-Typ der Replikation ist auch als rollender Ring bekannt. Mehrere Viren kombinieren die beiden Strategien: im frühen Infektionsstadium vervielfältigen sie mit der Theta-Typ-Replikation die Anzahl der DNA- Ringe, welche in der späten Phase Replikationsweg wechseln, und mit dem rollender-ring-typ der Replikation sogenannte Konkatamere (DNAs, welche viele Virusgenome enthalten) erzeugen, welche von den spezifischen Enzymen des Virus in einheitliche Stücke geschnitten werden, die gleich ins Kapsid eingepackt werden (zb. Herpesviren und T4 Phage). Zusammenbau und Freisetzung (1) Zusammenbau des Nukleokapsids Unter dem Zusammenbau der einzelsträngigen RNA-Viren mit einer helikalen Struktur verstehen wir die Bindung der Kapsidproteine zum spiralen Nukleinsäuremolekül. Viren mit einer ikosaedrischen Symmetrie stellen meisstens ein leeres Kapsid (Pro-Kapsid = Vorkapsid) her. Das Kapsid steht aus ihren Elementen spontan in der Zelle zusammen, sogar meisstens auch in einer zellfreien Lösung. Demnächst gerät das Virusgenom in einer Kopie ins Prokapsid hinein; und gleichzeitig oder danach geht das Prokapsid durch Modifikationen, und das reife Kapsid entsteht. Das Genom gelangt durch einen Kanal ins Kapsid, in der Regel mit Hilfe

9 23 von einem oder mehreren Enzymen. Besonders im Fall der RNA-Viren ist es eine interessante Frage, wie das Kapsid die virale RNA von der zellulären RNAs unterscheiden kann. Zum Beispiel, in einer mit Retrovirus infizierten Zelle macht das Virusgenom weniger als 1% der RNA-Moleküle aus. Auf den Nukleinsäuren befindet sich ein Verpackungssignal, welches die beim Zusammenbau teilnehmenden Enzyme erkennen. Auf den einzelsträngigen Viren dienen häufig die Sekundärstrukturen im Genom als Verpackunssignal, im Fall von grösseren, dopplesträngigen Viren ist dieses Signal durch Sequenz kodiert. Das Kapsid von solchen komplexen Viren kann in vitro (im Reagenzglas) nicht zusammenstehen, dazu brauchen sie nämlich sogenannte Gestell machende (scaffolding) Proteine, welche nicht am Aufbau des Virions teilnehmen, sondern nach der Erfüllung ihrer Aufgabe vom Pro-Kapsid entfernt werden. Die komplexen Viren verpacken ihre DNA sehr eng, im Kapsid von einem Herpesvirus ist der Druck etwa zehnmal so hoch wie in einer Sektflasche. (2) Entstehung der Hülle Die meissten gehüllten Viren nehmen sich während der Freisetzung (Exozytose) mit der Zytoplasmamembran um. Die Zytoplasmamembran wird vor der Freisetzung mit viralen Proteine (Glykoproteine) vollgepackt, dadurch werden diese Proteine zum Teil der Hülle. Die Hülle der Herpesviren stammt aus der Membran der Transportvesikel, also letztendlich aus der Membran des Golgi-Apparates. Die Hülle von einigen Viren stammt aus der Kernmembran (zb. einige Rhabdoviren), indem einige andere Viren es neu synthetisieren (zb. Poxviren). (3) Freisetung Die Bakteriophagen verdauen die infizierten Bakteriumzellen mit Hilfe von ihren Enzymen (Lyse = Auflösen). Die Tierviren lysieren die Zelle nicht, obwohl sie in einer sehr späten Phase der Infektion auch auf diesem Weg die Zelle verlassen können. Im letzteren Fall ist es aber nicht sicher, ob sie infektionsfähig werden, da sie entweder eine Hülle aus der Zellmembran durch Exozytose kriegen müssen, oder bei anderen Viren (zb. Herpesviren) eben umgekehrt, sie müssen die aus dem Transportvesikel stammende, äussere Membran durch Fusion mit der Zytoplasmamembran abnehmen. Ablauf der Virusinfektion und Immunantwort Bislang ging es um das Drehbuch der Virusinfektion, wo der Virus sich in der Zelle repliziert, und letztlich die entstandenen Virione die Zelle verlassen. Das nennen wir produktive Infektion, welche, wenn es mit der Zerstörung der Zelle endet (meisstens ist es der Fall), als lytische Infektion genannt wird. Die Zellen können die Virusinfektion nach der Freisetzung der Virione für eine kurze (HIV) oder längere Zeit (Hepatitis B) überleben. Manchmal ist die Virusinfektion nicht produktiv, was unterschiedliche Gründen haben kann. Im Fall einer latenten Infektion (zb. die -Herpesviren in bestimmten Nervenzellen) kann das Virusgenom in der Zelle sogar lebenslang anwesend sein, ohne die Bildung von reifen Virionen. Der Virus versteckt sich in diesem Fall vor dem Immunsystem, und wird nur auf bestimmten Effekten (zb. Stress) aktiviert. abortive Infektion bedeutet im wesentlichen eine erfolglose Infektion. Der langfristige Kampf zwischen dem Wirt und dem Virus ist eigentlich ein Bewaffnungsrennen, im Laufe von dem die Viren versuchen, mit komplizierten Tricks den Wirtsorganismus hochzunehmen. Der Wirtsorganismus verteidigt sich gegen die Viren einerseits mit zellulären Mechanismen, andererseits mit Hilfe des Immunsystems. Die übermässige Virulenz, also die Zerstörung des Wirtes ist in der Regel nicht in der Interesse der Viren. Diese Situation kann oft im Fall des Wirtswechsels beobachtet werden: zb. der Verwandte des HIV, der SIV (simian immunodeficiency virus) (HIV stammt daraus) verursacht nicht den Tod der Schimpansen. Im Fall der Influensa ist die Situation ähnlich, die neu entstandenen Stämme sind extrem gefährlich. Die Interesse des Influensavirus ist, dass der Mensch aufrecht bleibt und die Krankheit verbreitet. Die Erreger (nicht nur Viren), welche von irgendeinem Vektor (zb. Insekten) verbreitet werden,

10 profitieren aber daraus, wenn sie in je grösserer Anzahl im Körper (Blut) des Wirtes anwesend sind, und dadurch werden diese Erreger erbarmungslos gegen den Wirt und verursachen oft tödliche Infektionen. Stichwortverzeichnis Endemie: sich an ein bestimmtes Gebiet beschränkende Krankheit Epidemie (epi bedeutet "zwischen"; demos bedeutet "Volk") Über Epidemie sprechen wir, wenn das Vorkommen einer bestimmten Krankheit in einer Population im Vergleich zu ihrem früheren Vorkommen steigt. Die Krankheit ist nicht unbedingt infektiös. Krebs, Herzkrankheit, Influensa sind alle Beispiele auf Epidemien. Die Epidemie kann sich an eine Region beschränken oder kann global sein, in diesem Fall sprechen wir über Pandemie. Offener Leseraster (open reading frame; ORF): die kodierende Region des Gens, beginnt mit ATG (kodiert Methionin) und endet mit einem der 3 Stopcodons. Über ORFs können wir nur im Fall von intronfreien Genen sprechen, da die Introne in der Regel Stopcodons enthalten. Die Bakteriumgene und die reifen eukaryotischen mrnas enthalten ORFs. Pandemie (pan auf griechisch ist "alles" + demos "Mensch") ist die Verbreitung einer Krankheit in grösseren Regionen, Kontinenten oder auf der ganzen Welt. Die weit verbreitete Epidemie ist noch keine Pandemie, es ist festgelegt, über wievielen Erkrankungen nennen wir eine Epidemie als Pandemie. Während der Geschichte gab es eine Reihe von Pandemien, zb. Pocken oder Tuberkulose; unter den jetzigen Epidemien sind HIV und das Influensa aus dem Jahre 2009 bemerkenswert. Natürliches Reservoir: die Spezies, in welcher ein Virus für eine lange Zeit existieren kann; also der langfristige Träger, Wirt des Erregers einer Infektionskrankheit. Der Virus verursacht in den Reservoiren meisstens eine subklinische Infektion, also der Träger trägt den Erreger symptomlos. Wenn so ein Reservoir entdeckt wird, ist es möglich, den ganzen Lebenszyklus der Infektionskrankheit und des Pathogens aufzuklären, dadurch wird die Vorbeugung und Kontrolle der Krankheit viel einfacher. NOTIZEN: