Praktikum Biologie für MedizinerInnen. Chromosomentheorie der Vererbung

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1 Praktikum Biologie für MedizinerInnen Chromosomentheorie der Vererbung

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3 Teil 1 Zellzyklus und Mitose Bei allen Eukaryoten erfolgt die Zellvermehrung durch mitotische Teilung. Nach der Wachstumsphase, in der die Zellen an Größe zunehmen, beginnt die Zellteilung. Dabei wird zuerst die DNA verdoppelt, anschließend kondensieren die Chromosomen und werden auf die Tochterzellen verteilt. Der Zellzyklus endet mit der Aufteilung des Cytoplasmas auf die beiden Tochterzellen (Cytokinese). Ablauf des Zellzyklus Während des Zellzyklus unterscheidet man die Interphase und die Mitose, während der die Chromosomen deutlich sichtbar werden und die Zellteilung erfolgt. Dabei ist von allen Zellzyklusphasen die Mitose der kürzeste Abschnitt und beansprucht nur 5-10% der Zeit des gesamten Zyklus. Die Interphase wird in verschiedene Abschnitte unterteilt: In der S-Phase erfolgt die DNA-Synthese. Als G 1 - und G 2 -Phase werden die Abschnitte vor der S-Phase bzw. vor der Mitose bezeichnet. Die Phasen des Zellzyklus: M: Mitose Interphaseabschnitte: G 1 : Interphase vor der DNA-Synthese (1 Chromatid) S: DNA-Synthese G 2 : Interphase nach der DNA-Synthese (2 Chromatiden) (G = gap) 1

4 Ablauf der Mitose bei der Lilie Lilium regale 2

5 Der Verlauf der Zellteilung läßt sich in drei voneinander abgrenzbare Phasen einteilen: 1. Interphase: Die Phase des Wachstums und der Verdoppelung der chromosomalen DNA. Jedes Chromosom besteht danach aus zwei identischen Chromatiden, die durch das Centromer (Kinetochor) zusammengehalten und in zwei Schenkel geteilt werden. Die Interphase gliedert sich in folgende Abschnitte: G 1 -Phase S-Phase G 2 -Phase G 0 -Zellen Präsyntheseabschnitt (vor der DNA-Synthese = 1 Chromatid) Abschnitt der DNA-Synthese Postsyntheseabschnitt (nach der DNA-Synthese = 2 Chromatiden) Zellen, die in der G 1 -Phase in einen Ruhezustand eingetreten sind und sich nicht weiter teilen. 2. Mitose: Die Verteilung der Chromatiden und die Kernteilung verläuft schrittweise über folgende Phasen: Prophase: - Die Chromosomen verkürzen sich. Die Chromatiden werden sichtbar. - Die Auflösung der Nukleoli und der Kernhülle beginnt. - Die Centriolen wandern zu den Zellpolen. Metaphase: - Die Chromosomen sind stark verkürzt und sind über die gesamte Länge verbunden. Sie liegen in der Äquatorialebene. - Der Spindelapparat wird ausgebildet. Anaphase: - Die Chromatiden werden an ihrem Centromer vom Spindelapparat auseinander gezogen und jeweils zu einem Pol transportiert, so dass sich an beiden Polen ein vollständiger Chromosomensatz befindet. Telophase: - Die Chromosomenhälften entspiralisieren und verlängern sich. Sie bilden das Chromatin. - Die Kernspindel wird abgebaut. 3

6 - Um jeden Tochterkern wird eine Kernhülle gebildet, und die Nukleoli werden aufgebaut. 3. Cytokinese: Die abschließende Phase der Zellteilung, in der auch das Cytoplasma halbiert wird und sich neue Zellwände bzw. Zellmembranen aufbauen: - bei den meisten Tieren durch seitliches Einschnüren mit Hilfe von Aktinfilamenten - bei vielen Pflanzen durch Bildung der Zellplatte aus der Mittellamelle. Als polyenergide Zellen werden Zellen bezeichnet, bei deren Teilung die Cytokinese nicht stattgefunden hat, so daß eine Zelle mit zwei oder mehr Kernen entsteht, z.b. Skelettmuskelzellen. Versuchsteil 1: Analyse der Mitosechromosomen der Küchenzwiebel Präparation mitoseaktiver Zellen der Wurzelspitze von Allium cepa (Küchenzwiebel) In sich teilenden Zellen wachsender Wurzelspitzen lassen sich Kerne in den verschiedenen Mitosephasen beobachten. Die Zwiebeln wurden auf wassergefüllte Becher gesetzt, so dass die Wurzelspitzen ins Wasser ragen. Nach einigen Tagen beginnen die Wurzelspitzen auszutreiben. Zur Untersuchung von Mitosestadien werden einige gekeimte Wurzeln an der Spitze (etwa 5 mm) abgeschnitten, mit einer Rasierklinge längs durchgeschnitten, in ein Eppendorfgefäß überführt und 50 µl Orcein- Essigsäure (Vorsicht: reizend) zugegeben. Achten Sie darauf, dass sich die Wurzelspitzen auch tatsächlich in der Färbelösung befinden und nicht am Deckel oder Gefäßrand kleben! (Eventuell mit einem Zahnstocher in die Farbe schieben). Das Gefäß wird verschlossen und 15 min bei 50 C inkubiert (Thermoblock). Nach der Inkubationszeit wird die Färbelösung abgegossen (Am besten auf einige übereinandergelegte Toilettenpapiere. - Achtung: Der Farbstoff färbt gut, auch Hände und Kleidung!!!). Die

7 gefärbten Wurzelspitzen werden mit einem Zahnstocher aus dem Eppendorfgefäß genommen und auf einen Objektträger gelegt. Geben Sie nun (mit der Plastikpipette) einen kleinen Tropfen 45% Essigsäure (Vorsicht: reizend) auf die Wurzelspitzen und legen Sie dann ein Deckglas auf. Nun wird das Präparat gequetscht. Dazu legen Sie etwas Toilettenpapier auf das Deckgläschen (damit wird die überschüssige Flüssigkeit aufgesaugt) und drücken dann mit dem Daumen auf das Deckglas (ohne es zu zerdrücken!). Das Präparat sollte während des Quetschens nicht seitlich verschoben werden. Die verwendete 45% Essigsäure bewirkt bei dieser Quetschtechnik das Aufquellen aller Zellstrukturen, wobei das Zellplasma seine Färbbarkeit mit basischen Farbstoffen verliert. Eine Kombination aus Essigsäure und bestimmten Farbstoffen erlaubt selektive Anfärbungen. Orcein färbt nur DNA (braunrot bis blaurot), nicht aber RNA. Nach dem Quetschen kann sofort mit der mikroskopischen Auswertung begonnen werden: * Untersuchen Sie Ihr Präparat auf verschiedene Kernteilungsstadien * Suchen sie in Ihren Präparaten die einzelnen Mitosestadien und fertigen sie Zeichnungen von ihnen an. * Versuchen Sie, in Ihren Zwiebelpräparaten den Mitoseindex zu bestimmen, d.h., bestimmen Sie den Anteil mitoseaktiver Zellen an den Gesamtzellen eines ausgewerteten Gewebebereichs. 5

8 Teil 2 Reduktion der Chromosomenzahl bei der Keimzelldifferenzierung Meiose (Reduktionsteilung) Der Chromosomensatz der Keimzellen wird während der Gametenbildung halbiert, so dass sich die ursprünglich diploiden Urkeimzellen zu haploiden Keimzellen entwickeln. Verschmelzen dann bei der Gametogamie (= geschlechtliche Fortpflanzung) zwei haploide, geschlechtlich unterschiedlich differenzierte Gameten (=Keimzellen) miteinander, entsteht eine diploide Zygote. Damit wird der diploide Chromosomensatz der Zelle wieder hergestellt. Neben der Reduktion des Chromosomensatzes, findet in der Meiose die Rekombination der Chromosomen statt. Man unterscheidet zwei Formen: Einerseits die freie Rekombination der Chromosomen durch die zufallsbedingte Verteilung der väterlichen und mütterlichen Chromosomen während der ersten meiotischen Teilung; andererseits die Rekombination durch Cross-over während der ersten meiotischen Teilung, die im Diplotän und der Diakinese der Prophase als Chiasmata sichtbar werden.

9 Meiose In der Meiose wird die Anzahl der Chromosomen vom diploiden auf den haploiden Chromosomensatz reduziert. Zur Vereinfachung ist hier nur ein Paar homologer Chromosomen dargestellt. Die DNA wird vor der ersten meiotischen Teilung repliziert, so dass jedes Chromosom in Form zweier identischer Chromatiden in die Meiose eintritt. In der Prophase I lagern sich die homologen Chromosomen aneinander (Bivalente). In diesem Stadium können Cross-over auftreten, die zur Rekombination der beteiligten DNA-Doppelstränge führen. Die homologen Chromosomen richten sich in der Metaphase I entsprechend der Lage des Spindelapparates aus. Sie trennen sich, und jedes wird bei der ersten Zellteilung auf eine der Tochterzellen aufgeteilt. Die erste meiotische Teilung führt demnach zur Reduktion des diploiden Chromosomensatz auf den haploiden Chromosomensatz. Jedes Chromosom besteht nach dieser Teilung noch aus zwei DNA-Doppelsträngen (d.h., aus zwei Chromatiden). Vor der zweiten meiotischen Teilung findet keine DNA- Replikation statt. In der zweiten Zellteilung werden die Tochterchromatiden eines jeden Chromosoms auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt. Diese Teilung entspricht demnach einer mitotischen Teilung. 7

10 Prophase der ersten meiotischen Teilung Die Prophase der ersten meiotischen Teilung läßt sich in mikroskopisch deutlich voneinander unterscheidbare Stadien aufteilen, denen auch eindeutige Funktionen zugeordnet werden können. Leptotän: Die einzelnen Chromosomen lassen sich mit zunehmender Spiralisierung unterscheiden. Die Telomere werden an der Kernmembran fixiert. Zygotän: Der synaptonemale Komplex, der für die exakte Paarung der homologen Chromosomen verantwortlich ist, wird ausgebildet. Pachytän: Die Bivalente mit ihren vier Chromatiden werden sichtbar. Diplotän: Der synaptonemale Komplex wird aufgelöst. Die homologen Chromosomen beginnen auseinanderzuweichen. Cross-over werden in Form von Chiasmata sichtbar. Diakinese: Die homologen Chromosomen weichen weiter auseinander.

11 Oogenese des Menschen Während der Eientwicklung im embryonalen Ovar setzen die diploiden Keimzellen (Oogonien), welche die Oozyten bilden, ihre mitotischen Teilungen für kurze Zeit fort. Diese Zellen durchlaufen einen ersten Reifungsprozess zu den primären Oozyten (oder Oozyten 1. Ordnung), die sich mit einem einschichtigen Zellverband umgeben und den Primärfollikel bilden. Zu diesem Zeitpunkt haben die Oozyten schon die erste meiotische Teilung eingeleitet, die in der Prophase vorerst zum Stillstand kommt. Die primäre Oozyte nimmt jedoch nach der Pubertät um das 1000fache an Masse zu, erfährt eine weitere Entwicklung (Ausbildung des mehrschichtigen Granulosaepithels und der Zona pellucida) zum Sekundärfollikel und später unter beträchtlicher Vermehrung der Follikelflüssigkeitzum Tertiärfollikel, auch Graafscher Follikel genannt. Hier tritt der Follikel in eine weitere Ruheperiode ein, die dann durchschnittlich alle 28 Tage von einem Tertiärfollikel beendet wird und zur Entwicklung eines sprungreifen Follikels mit einer befruchtungsfähigen Eizelle führt. Erst während dieser letzten Reifungsperiode des Tertiärfollikels wird kurz vor dem Follikelsprung die erste meiotische Teilung 9

12 vollendet und die zweite meiotische Teilung bis zur Metaphase eingeleitet. Erst nach der Befruchtung wird die Meiose abgeschlossen. Aus beiden meiotischen Teilungen geht jeweils nur eine große Zelle hervor, aus der dann das Ei entsteht, sowie eine kleine Zelle, der so genannte Polkörper. Schnitt durch einen Tertiärfollikel Schematische Darstellung der Eireifung Ei mit Zona pellucida und Corona radia

13 Spermatogenese des Menschen Keimzellen, die sich zu Spermien entwickeln, dringen in den embryonalen Hoden ein und werden in der G 1 -Phase des Zellzyklus (Mitose!!) angehalten. Erst nach der Geburt beginnen sie, sich wieder mitotisch zu teilen und eine Stammzellpopulation (Spermatogonien) zu bilden. Aus diesen gehen nach der Geschlechtsreife in mehreren (mitotischen) Teilungsschritten Spermatozyten 1. Ordnung hervor, in denen die erste meiotische Teilung abläuft. Die zweite meiotische Teilung erfolgt dann in den Spermatozyten 2. Ordnung, die sich zu den reifen Spermien differenzieren. Im Gegensatz zur Eizellproduktion bei der Frau, können Spermien daher beim erwachsenen Mann in unbegrenzter Anzahl produziert werden 11

14 Versuchsteil 2: Meiose am Beispiel der Pollenentwicklung der Lilie (Lilium candidum) Oogenese und Spermatogenese * Zeichnen Sie schematisch die Anordnung eines Chromosoms bzw. eines Chromosomenpaares (mit den Spindelfasern) während der Metaphase einer mitotischen Teilung sowie während der ersten und zweiten meiotischen Teilung. * Skizzieren Sie in den DNA-Gehalt einer Zelle im Verlauf einer Mitose und während beider meiotischer Teilungen. * Sehen Sie sich die verschiedenen Stadien der Prophase der ersten meiotischen Teilung in den Dauerpräparaten der Lilie an und skizzieren Sie diese. Achten Sie dabei bitte insbesondere auf die Stadien Diplotän und Diakinese, bei denen Sie, als Folge der Crossover, die Chiasmata beobachten können. * Sehen Sie sich die Oogenese am Beispiel des Katzenovars (das dem des menschlichen Ovars sehr stark ähnelt) und die Spermatogenese am Beispiel einer Käferart (Anasa) an.