Moderne Diagnostik als Grundlage für zielgerichtete Therapien in der Onkologie

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1 12 DIAGNOSTIK CME Moderne Diagnostik als Grundlage für zielgerichtete Therapien in der Onkologie Silke Laßmann 1,2 und Martin Werner 1,2 1 Institut für Klinische Pathologie, Dept. für Pathologie, Universitätsklinikum und Comprehensive Cancer Center Freiburg 2 Deutsches Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK) und Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Heidelberg Mit dem zunehmenden Verständnis molekularer Veränderungen von Tumoren sowie deren Einfluss auf die Tumorentstehung und -progression wurden vermehrt molekulare Zielstrukturen für eine zielgerichtete ( targeted ) Therapie identifiziert. Die entsprechenden, gegen bestimmte Moleküle gerichteten Medikamente wirken jedoch nur in Patienten, deren Tumorzellen eine jeweils spezifische genetische Alteration aufweisen. Mit der Entwicklung solcher zielgerichteten Therapien hat sich die Möglichkeit ergeben, den Therapieerfolg durch Nachweis der relevanten molekularen Veränderungen in Tumorzellen abschätzen zu können. Die begleitende Diagnostik für eine zielgerichtete Therapie untersucht dabei zum einen Veränderungen der zu hemmenden Moleküle auf Ebene von Genen oder Proteinen in Tumorzellen. Damit kann zunächst überhaupt das Molekül und/oder seine eventuelle spezifische Veränderung, gegen das dieses spezielle Medikament gerichtet ist, nachgewiesen werden (z.b. Her2/neu- Genamplifikation/-überexpression für Herzeptin bei Mammakarzinomen oder EGFR Mutationsanalysen für Erlotinib bei Lungenkarzinomen). Dies betrifft Faktoren für primäres Therapie-Ansprechen, bzw. Therapieresistenz: Liegt die Zielstruktur des spezifischen Medikaments überhaupt in der Mehrheit der Tumorzellen vor? Liegt die Zielstruk- tursovor,dassdasmedikamentbin- den und aktiv wirken kann oder sind Genveränderungen vorhanden, die die Wirksamkeit des Medikaments einschränken? Zum anderen können Veränderungen in wichtigen, der Zielstruktur nachgeschalteten zellulären Signalwegen bestimmt werden, die eine Therapie-Resistenz gegen das Medikament verursachen (z.b. K-RAS-, N- RAS- Genmutationen für Cetuximab oder Panitumumab bei kolorektalen Karzinomen). Hierunter fallen Faktoren für nachgeschaltete Resistenzen: Gibt es Veränderungen in den mit der Zielstruktur eng verbundenen Molekülen der Tumorzellen, die die Wirkung des Medikaments umgehen/ausschalten können? Für die Analyse der Therapie-relevanten Faktoren, die vor einer zielgerichteten Therapie vorgenommen werden muss, hat die molekulare Tumorpathologie innovative Werkzeuge entwickelt [1]. Immunhistochemische Färbeverfahren erlauben die Quantifizierung von Genprodukten, also Proteinen wie z.b. Her2/neu als Zielstruktur von Herzeptin in Tumorzellen von Mamma- und Magenkarzinomen [2, 3]. Gen-Amplifikationen (also vermehrte Genkopienzahl; z.b. Her2/neu) und Gen-Translokationen (z.b. EML4-ALK, CD74-ROS1) werden auf Einzelzell-Ebene im diagnostischen Schnittpräparat über das Verfahren der In Situ Hybridisierung nachgewiesen und spielen eine wichtige Rolle bei Mamma-, Magen- [2, 3] und Lungenkarzinomen [4] ( Tab. 1). Der Nachweis von Genmutationen, -deletionen oder -inversionen Therapie-relevanter Gene (z.b. EGFR, K-RAS, N- RAS bei Lungenkarzinomen und kolorektalen Karzinomen) erfordert die Anwendung von Polymerase Kettenreaktion-basierten (PCR) und nachfolgenden Sequenzier- Verfahren. Hierzu müssen die Tumorzellen zuvor unter dem Mikroskop aus dem diagnostischen Schnittpräparat herausgelösten werden [1]. Eine Übersicht der aktuell in Leitlinien verankerten oder in Studien empfohlenen molekularpathologischen Untersuchungen zur Abschätzung eines Erfolges einer zielgerichtetentherapiegibt Tabelle 1. Das generelle Vorgehen in der klinischen Pathologie für die Therapie-Prädiktion ist exemplarisch für nicht-kleinzellige Lungenkarzinome in Abbildung 1 aufgeführt. Standardisierte und zeitnahe Multiparameter-Analytik kleinster Gewebeproben Basis für Moderne Diagnostik in der klinischen Pathologie In den letzten Jahren wurden zunehmend molekulare Veränderungen identifiziert, die einen Einfluss auf das Ansprechen von Tumorpatienten auf bereits zugelassene oder neue zielgerichtete Therapien ha- CMExtra 01/2015

2 DIAGNOSTIK 13 Erkrankung Untersuchung Gen (Genabschnitte, bzw. Exone) Epitheliale Tumoren Wertigkeit der Veränderung/en für Therapieansprechen Inhibitor (Zielstruktur) Lungenkarzinom FISH 2p23 ALK Crizotinib (ALK, ROS, MET) CISH 7q31 FISH 10q11 FISH 6q22 MET-Amplifikation RET-Translokation (RET/CCDC6, RET/KIF5B, RET/NCOA4 ROS1-Translokation (ROS1/CD74, ROS1/ SLC24A2, ROS1/FIG) Erlotinib (EGFR), Tivantinib (MET) Crizotinib (ALK, ROS, MET) Onartuzumab (MET) Vandetanib (RET), Cabozantinib (RET) Crizotinib (ALK, ROS, MET) Mutationsanalyse EGFR (Exone 18-21) od. Negativ Erlotinib (EGFR), Gefitinib (EGFR) Mutationsanalyse KRAS (Exone 2, 3, 4) Negativ Erlotinib (EGFR), Gefitinib (EGFR) Ridaforolimus (mtor) Selumetinib (MEK) Tivantinib (MET) Trametinib (MEK) Mutationsanalyse HER2 (Exon 20-Insertionen) Afatinib (EGFR/HER2) Mutationsanalyse PI3KCA (Exone 9, 20) Negativ Erlotinib (EGFR), Gefitinib (EGFR) Mutationsanalyse BRAF (Exon 15) Dabrafenib Kolorektales Karzinom Mutationsanalyse KRAS (Exone 2, 3, 4) Negativ Mutationsanalyse NRAS (Exone 2, 3, 4) Negativ Mutationsanalyse BRAF (Exone 11, 15) Negativ Mutationsanalyse HER2 (Exon 20) Negativ Mutationsanalyse PI3KCA (Exone 9, 20) Negativ Cetuximab, Panitumumab Farnesyl Transferase- Inhibitoren Cetuximab (EGFR), Panitumumab (EGFR) Aspirin Mammakarzinom C-/S-/FISH 17q11.2 HER2/neu Trastuzumab (HER2) Magenkarzinom C-/S-/FISH 17q11.2 HER2/neu Trastuzumab (HER2) Melanom Mutationsanalyse BRAF (Exone 11, 15) Vemurafenib (BRAF V600E) Mesenchymale Tumoren Gastrointestinaler Stromatumor Mutationsanalyse KIT (Exone 9, 11) Imatinib-Mesylat (bcr-abl, KIT, PDGFR) Mutationsanalyse KIT (Exone 9,11) Imatinib-Mesylat (bcr-abl, KIT, PDGFR) Mutationsanalyse PDGFRa (Exon 18) Imatinib-Mesylat (bcr-abl, KIT, PDGFR) Tab. 1: Moderne Diagnostik für zielgerichtete Therapien in der klinischen Pathologie. Die Tabelle listet die aktuellen Therapierelevanten molekularpathologischen Untersuchungen und prädiktiven Marker für solide Tumoren. Die genannten Mutationsanalysen lassen sich in Basket -Analysen zusammenstellen. Fett = aktuelle Leitlinien; normale Schrift = bereits Anforderungen; Kursiv = in Diskussion/translationale Forschung/klin. Studien. 01/2015 CMExtra

3 14 DIAGNOSTIK ben. Dies gilt sowohl bei Erstlinien als auch Zweitlinien-Therapiekonzepten. Die molekularpathologischen Untersuchungen von prädiktiven Markern in der klinischen Pathologie steigen jedoch nicht nur durch Zulassung neuer zielgerichteter Therapien für bestimmte Tumortypen sondern auch durch die Notwendigkeit, zunehmend mehr Fall 1: EGFR Sequenzierung ALK FISH Pathologische Klassifikation Histologie Ggf. Immunhistochemie 1. Befund Einzelmarker für die bereits zugelassene zielgerichtete Therapien durchführen zu müssen. So wurde z.b. für die Vorhersage eines Therapieansprechens von EGFR-Inhibitoren (insbesondere Panitumumab) beim metastasierten kolorektalen Karzinom der zunächst einzelne hotspot von einem KRAS Genabschnitt (Exon 2) in der Folge auf Molekularpathologische Diagnostik In situ Hybridisierung(en), z.b. ALK Mikrodissektion und Mutationsanalysen, z.b. EGFR Exon 19 Deletion Fall2: EGFR Sequenzierung ALK FISH Auswertung 2. Befund Exon 19 Wildtyp Abb. 1: Integrierte molekularpathologische Analysen am Beispiel des nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms: Zunehmend kleinste Gewebeproben werden sequentiell histologisch, immunhistochemisch und molekularpathologisch untersucht. Fall 1 trägt eine EGFR Exon 19 Deletion (überlappende Kurven) und ist negativ für die ALK Gen- Translokation (gelbe Fusionssignale). Fall 2 zeigt eine EGFR Exon 19 Wildtypsequenz und eine ALK Gen-Translokation (getrennte grüne und rote Signale, Bruch ). Hotspots von je 3 KRAS (Exon 2,3,4) und 3 NRAS (Exon 2,3,4) Genabschnitten erweitert [5]. Hinzu kommt (meist noch in klinischen Studien), dass unabhängig vom Tumortyp auf sämtliche bekannte prädiktive Marker aller bislang zugelassenen zielgerichteten Therapien getestet wird, um so eine sehr individualisierte und innovative Therapiestratifizierung vornehmen zu können. Als Konsequenz müssen in der Diagnostik zunehmend mehr prädiktive Marker in einer Tumorprobe analysiert werden. Damit ist die in einigen Pathologien bereits begonnene Umstellung von zeitund kostenintensiver Stufendiagnostik hin zu einer Multiparameter- Analytik (s.u.) eine zentrale und zukunftsweisende Entwicklung. Steht hierfür Gewebe aus Operationspräparaten zur Verfügung, ist ausreichend Material für die vielfältigen Untersuchungen vorhanden. In vielen Fällen existiert jedoch lediglich das für die histologische Sicherung mittels diverser endoskopischer oder stanzbioptischer Verfahren entnommene Gewebe, das häufig nur sehr geringe Mengen an Tumorzellen enthält. Hieran müssen dann zusätzlich zur histologischen Diagnostik molekularpathologische Untersuchungen zur Abschätzung des Erfolges einer zielgerichteten Therapie durchgeführt werden. Dies bedeutet, dass für die Vielzahl von histologischen, immunhistochemischen und molekularpathologischen Untersuchungen in der diagnostischen Pathologie häufig nur wenig Gewebe vorliegt. In Einzelfällen mit sehr kleinen Biopsien und/oder nur sehr geringem Tumorzellgehalt kann daher das diagnostische Gewebe für alle notwendigen Untersuchungen zu knapp sein. Es besteht daher die Herausforderung, eine komplexe Multiparame- CMExtra 01/2015

4 DIAGNOSTIK 15 ter-analytik zu etablieren und dies häufig an nur geringen Tumorzellmengen durchzuführen. Dabei müssen die Aspekte der Qualitätssicherung berücksichtigt und die Befunde zeitnah erhoben werden. Eine Lösung hierfür ist die Etablierung eines einheitlichen Nachweisverfahrens (inkl. Laborschritte und detaillierte Laborprotokolle) für alle DNA-Sequenzen, was den Einsatz von weitestgehend automatisierten und nach täglichen Bedarf zusammengesetzten Warenkorb ( Basket -)-Analysen erlaubt. Dies ermöglicht einen dynamischen und flexiblen Ablauf mit Sicherung einer zeitnahen Diagnostik. Ein ähnliches Komplexität und Lösungskonzepte moderner Diagnostik in der klinischen Pathologie Die zunehmende Komplexität der prädiktiven molekularpathologischen Diagnostik erfordert ein Umdenken. Es ist notwendig, die bisherigen Abläufe der histologischen, immunhistochemischen und molekularpathologischen Diagnostik zu modifizieren. Betrachtet man den Zuwachs an molekularpathologischer Multiparameter-Analytik allein am Beispiel der Genmutationsanalysen, so können zwei mögliche Lösungsansätze ( Abb. 1) verfolgt werden: 1) eine lt. Einsender stratifizierte Warenkorb ( Basket )-Analyse oder 2) die Multiparameter-Analytik über (targeted) Next Generation Sequencing (tngs): Pathologische Klassifikation Histologie Ggf. Immunhistochemie 1. Befund Molekularpathologische Diagnostik In situ Hybridisierung(en), z.b. ALK, ROS, MET, RET Mikrodissektionund Mutationsanalysen, z.b.egfr,kras,nras, BRAF, PIK3CA HER2. Standard bisher (Für jede Probe, bzw. DNA) z.b. Mutationsanalysen EGFR (Ex18,19, 20, 21), KRAS (Ex2) Basket Analyse (Für jede Probe, bzw. DNA) z.b. Mutationsanalysen EGFR (Ex18,19, 20, 21), KRAS (Ex2) NGS Technologie (multiple Proben, bzw. multiple DNAs) z. B. Mutationsanalysen für Multi Genpanel(z.B. 8 oder 48 Gene*) 1. Lösungsansatz Basket -Analysen: Die Sanger Sequenzierung stellt seit vielen Jahren den Goldstandard für die Mutationsanalyse in vielen Pathologien dar (siehe unten Qualitätssicherung/Ringversuche). Der Nachteil ist, dass für jede einzelne zu untersuchender DNA-Sequenz (Gen oder Genabschnitt) ein individuell abgestimmtes Nachweisverfahren etabliert werden muss, welches sich erheblich von den diversen Nachweisverfahren anderer DNA- Sequenzen unterscheitet ( Abb. 2). Dies macht eine Vereinfachung und Automatisierung der Laborprozesse bei steigendem Probenund Analysespektrum bislang unmöglich. Einzelsequenzen Sequenz Auswertung 2. Befund Sequenzdatensätze Abb. 2: Konzepte der Multiparameter-Analytik in der molekularpathologischen Diagnostik*. Links: Sanger-Sequenzierung (Standard bisher); Mitte: Warenkorb ( Basket ) -Analyse; rechts: targeted Next-Generation-Sequenzier-Technologie (NGS) mit *8 Genen (lt. aktueller Leitlinien für zugelassene gezielte Therapien) und für 48 Gene (8 Gene lt. Leitlinien plus 40 weiteren Tumor-assoziierten Genen, z.b: GNAQ, GNAS, TP53). *Detaillierte Informationen über die Autoren am Institut für Klinische Pathologie, Universitätsklinikum Freiburg. 01/2015 CMExtra

5 16 DIAGNOSTIK Vorgehen ist in klinischen Pathologien bereits bei den automatisierten, Hochdurchsatz-Färbungen in der Histologie und Immunhistochemie im Einsatz. Dass genau solche optimierten Warenkorb -Analysen für die aktuell wichtigen Mutationsanalysen (BRAF, EGFR, HER2, KIT, KRAS, NRAS, PDGFRA, PIK3CA) möglich sind, erläutert in Abbildung Lösungsansatz Next Generation Sequencing - Technologie Anders als bei den o.g. Warenkorb -Analysen ist das Prinzip des Next Generation Sequencing (NGS) die Anwendung einer neuen Sequenziertechnologie [6]. Hier können in einem Nachweisverfahren, bzw. Laboransatz mehrere ausgewählte DNA-Sequenzen (gezielte Gene, bzw. Genabschnitte; targeted NGS ), das Exom (alle für Proteine kodierenden DNA-Sequenzen, bzw. Gene) oder Genom (alle DNA-Sequenzen) zusammen analysiert werden ( Abb. 2). Die NGS- Technologie erlaubt dabei zusätzlich auch die gemeinsame Analyse multipler (Patienten-) Proben. Damit wird klar, dass die NGS-Technologie eine optimale Lösung für die Hochdurchsatz-, Multiparameter- Analytik von zunehmenden Zahlen an prädiktiven Markern und Tumorproben darstellt. Nach unserer Erfahrung ist die NGS-Technologie für targeted NGS in der täglichen Routinediagnostik gut einsetzbar. So gelingt es, unmittelbar Therapierelevante Gene, bzw. deren hotspot -Sequenzregionen (z.b. BRAF, EGFR, KIT, KRAS/NRAS, PDGFRA) aus verschiedensten Gewebepräparaten im reduzierten tngs Ansatz zeitnah und kostengünstig für die Therapiestratifizierung zu bestimmen. Ebenso können über dieses Verfahren einzelne Gene abgedeckt werden, die aufgrund fehlender Therapie-relevanter Hotspot Sequenzregionen für die Einzelanalyse zu aufwendig wären. Aktuell ist hier z.b. auch die Einführung der BRCA1/2 Mutationsanalyse per tngs für die Prädiktion eines Ansprechens auf von Olaparib zu nennen. Im Gegensatz dazu gibt es beim tngs im größeren Umfang (>100 Gene) oder auch beim Exom-basierter NGS noch Optimierungsbedarf bezüglich spezifischer technischer Fragen sowie auch der Umsetzung daraus erzielter Geninformationen in tatsächlich realisierbare Therapieoptionen.. Neben Optimierung der NGS-spezifischen Laborprozesse für die unterschiedlichsten Typen von Gewebeproben (v.a. kleinste Biopsien; entkalkte Gewebeproben) ergeben sich vor allem Notwendigkeiten für eine 1. Umstrukturierung der IT-/LIS- Systeme (v.a. Bereitstellung/Sicherung komplexer Datensätze), 2. Diskussion um Auswertung der komplexen Datensätze (z.b. Notwendigkeit Bioinformatik), 3. Standardisierung von auf NGS- Datensätzen beruhenden Befunden für die interdisziplinäre Interpretation und Therapiestratifizierung, 4. Validierung und Qualitätssicherung der NGS-Nachweisverfahren und Plattformen für die Routinediagnostik sowie 5. Klärung ethischer Fragen bei evtl. Einsatz der NGS-Technologie für Exom und Genom-Analysen. Genau diese Fragen und technologische Weiterentwicklung für eine NGS-Technologie basierte Hochdurchsatz-, Multiparameter-Analytik werden aktuell in ausgewählten klinischen Pathologien (Universitätsklinika in Berlin, Freiburg, Heidelberg, München, Tübingen) in einem Verbundprojekt im Deutschen Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK) analysiert. Interdisziplinarität Die interdisziplinäre Vernetzung von klinischen, pathologischen und zunehmend aus Hochdurchsatz-, Multiparameter-Analytik gewonnenen molekularpathologischen Befunden ist in der modernen Diagnostik für die Therapiestratifizierung onkologischer Patienten unabdingbar. Eine Weiterentwicklung der interdisziplinären Tumorkonferenzen ist hierfür zukünftig ganz entscheidend.. Klar ist, dass dazu auch die Vernetzung von bildgebenden (z.b. klinischen/radiologischen, pathologischen/histologischen) mit molekularpathologischen (z.b. Multiparameter-Analytik) Datensätzen wichtig wird, insbesondere die auch Weiterentwicklung von Big-Data -Konzepten in der interdisziplinären Onkologie. Qualitätssicherung Mit der steigenden Komplexität und Anzahl der Untersuchungen in der klinischen Pathologie sowie mit der zunehmenden Bedeutung histologischer/molekularpathologischer Befunde für die Therapiestratifizierung von onkologischen Patienten, ist die bestehende Qualitätssicherung in der Pathologie weiterhin entscheidend. Hierzu zählen insbesondere die durch Ringversuche der Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Berufsverbandes Deutscher Pathologen, e.v., gesicherten analytischen Verfahren sowie auch die durch die spezifische Facharztausbildung gesicherte Expertise der Pathologen in molekularpathologischer Diagnostik. Zusammenfassung Die hier skizzierte komplexe Multiparameter-Analytik der klinischen Pathologie zeigt, dass eine sichere, zeitnahe und kosteneffiziente Diagnostik von Tumorproben nur durch kontinuierliche Optimierung CMExtra 01/2015

6 DIAGNOSTIK 17 und Anpassung des Analysespektrums und der Analyseprozesse an neue Rahmenbedingungen und erweiterte Therapiekonzepte möglicht wird. Ein verstärkter Austausch zwischen Pathologen und Onkologen ist dazu zukünftig noch wichtiger als bislang. Literatur 1. Bang YJ. Advances in the management of HER2-positive advanced gastric and gastroesophageal junction cancer. J Clin Gastroenterol Sep;46(8): Douillard JY, Oliner KS, Siena S, Tabernero J, Burkes R, Barugel M, Humblet Y, Bodoky G, Cunningham D, Jassem J, Rivera F, Kocákova I, Ruff P, Błasi ska- Morawiec M, Šmakal M, Canon JL, Rother M, Williams R, Rong A, Wiezorek J, Sidhu R, Patterson SD. Panitumumab- FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer. N Engl J Med Sep 12;369(11): Lassmann S, Werner M. Predictive pathology in routine diagnostics of solid tumors. Histol Histopathol Mar;27(3): Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, Chitale DA, Dacic S, Giaccone G, Jenkins RB, Kwiatkowski DJ, Saldivar JS, Squire J, Thunnissen E, Ladanyi M. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. Arch Pathol Lab Med Jun;137(6): Ulahannan D, Kovac MB, Mulholland PJ, Cazier JB, Tomlinson I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br J Cancer Aug 20;109(4): Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, Dowsett M, McShane LM, Allison KH, Allred DC, Bartlett JM, Bilous M, Fitzgibbons P, Hanna W, Jenkins RB, Mangu PB, Paik S, Perez EA, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, Hayes DF. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American society of clinical oncology/college of american pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol Nov 1;31(31): Dieser Beitrag wurde ebenfalls in der ONKOLOGIE heute publiziert. Korrespondenzadresse: Prof.Dr. med. Martin Werner Department für Pathologie - Ludwig-Aschoff-Haus - Institut für Klinische Pathologie UniversitätsklinikumFreiburg Breisacher Str. 115a, Freiburg Prof. Martin Werner Prof.Dr. Silke Laßmann CME BEQUEM UND EINFACH Alle CME Artikel finden Sie online auf unserem neuen CME-Portal unter 01/2015 CMExtra

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