Tierärztliche Hochschule Hannover. Friedrich-Loeffler-Institut Institut für Nutztiergenetik (Mariensee)

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Friedrich-Loeffler-Institut Institut für Nutztiergenetik (Mariensee) Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mit uterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer erfolgreichen Insemination INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Sonja Lucie Sophie Junge-Krämer Diepholz Hannover 2012

2 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. D. Rath, 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. D. Rath 2. Gutachter: Prof. habil. Dr. phil. nat. S. Steinlechner Tag der mündlichen Prüfung: Die vorliegenden Arbeit wurde durch die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl Stiftung, die Firma IMV- Technologies und die Gesellschaft der Freunde des Johann Heinrich von Thünen Institutes (vti) gefördert. Ein Beitrag aus dem virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen.

3 Für meinen Mann Mut ist nicht die Abwesenheit von Angst, sondern vielmehr die Einschätzung, dass es wichtigere Dinge gibt als die eigene Angst. Die Furchtsamen nehmen an, daß es die fehlende Angst ist, die es den Mutigen erlaubt, zu handeln, während die Ängstlichen nichts tun. Aber Handeln ist leicht, wenn man keine Angst hat. Etwas nicht tun, wenn man Angst hat, ist ebenfalls leicht. Etwas trotz seiner Angst zu tun, ist mutig. Ambrose Hollingworth Redmoon

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literatur Immunologische Aspekte der Reproduktion Generelle Aspekte der Reproduktionsimmunologie Uterine Immunantwort nach Insemination beim Schwein Spermienselektionsmechanismen und Spermienbindung im weiblichen Genitaltrakt Morphologie und Funktion des Uterus Topographie und makroskopischer Aufbau des Uterus beim Schwein Histologischer Aufbau des Uterus Zusammensetzung des Inseminates Spermien Seminalplasma Spermadhäsine Kapazitation Akrosomreaktion In dieser Arbeit näher betrachtete, immunologisch relevante, Gene CD PPAR-alpha Material und Methoden Synchronisation der Versuchstiere Gewinnung der verwendeten Ejakulate Gewinnung von Frischsperma Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma Spermauntersuchung- und Aufbereitung Computerassistierte Spermaanalyse (CASA)... 38

6 3.3.2 Morphologische, spermatologische Untersuchung der Besamungsportion Erstellung der Besamungsportionen Probengewinnung RNA-Präparation Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren (Nanodrop) RNA Bioanalyser Untersuchung Reverse Transkription Semiquantitative Real-Time-PCR Primerdesign Gelelektrophorese Mikroarray und Chipdesign Gewinnung von Uterusspülflüssigkeit Bestimmung der Anzahl von Spermien und Immunzellen in der Uterusspülflüssigkeit Probenentnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur Färbung Immunhistologische Nachweise an Kryostatschnitten Histologische Färbungen und bakteriologische Untersuchungen der Uteri Western-Blotting-Analyse Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung Statistische Auswertung Verbrauchsmaterialien und Reaktionskits Puffer und Lösungen Ergebnisse Reproduktionsbiologische Manipulationen Empfängertiere Quantitative und qualitative Bestimmung der Ejakulate Uterusspülung... 63

7 4.2.1 Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Besamungsportion Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in Abhängigkeit von der Zeit Transkriptom-Analysen RNA-Mikroarray-Analysen Semiquantitative Real-Time-PCR Immunhistochemische Untersuchungen Diskussion Diskussion zu Hypothese Diskussion zu Hypothese Diskussion zu Hypothese Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick Zusammenfassung Summary Anhang Verzeichnis der im Mikroarray geprüften Gene Abkürzungen der untersuchten Besamungsportionen in den Mikroarrayuntersuchungen / Boxplotgrafiken Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 1. Mikroarray Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 2. Mikroarray Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung...198

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9 Einleitung 1 Einleitung Das Hausschwein (Sus scrofa f. domestica) ist in den westlichen Industrienationen einer der wichtigsten Lieferanten von hochwertigem tierischen Protein und Fett für die menschliche Ernährung. Sowohl in der konventionellen als auch in der biologisch-dynamischen Schweinezucht wird für die Ferkelerzeugung heute zum größten Teil die künstlicher Besamung verwendet, welche die hygienischen Risiken der natürlichen Fortpflanzung bei gleichzeitiger Steigerung des genetischen Fortschrittes minimiert. Die zunehmende Bedeutung der künstlichen Besamung beim Hausschwein hat in den letzten 20 Jahren zu einer Optimierung des Besamungsmanagements mit einer annähernd 90%igen Fertilitätsrate geführt. Allerdings müssen hierfür Besamungsportionen mit mindestens 1x10 9 Spermien eingesetzt werden, was die Anzahl der Besamungsdosen, die aus einem Eberejakulat gewonnen werden können, deutlich reduziert (Ciereszko et al., 2000). Dieser Umstand limitiert auch die Etablierung neuer biotechnologischer Verfahren in der Schweinereproduktion, wie z.b. die Tiefgefrierkonservierung (Westendorf et al. 1975) oder geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien anhand der Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie. Für eine erfolgreiche Besamung mit einer reduzierten Spermienzahl je Besamungsportion ist es bis heute notwendig auf Techniken wie die tief intrauterine Besamung (5x10 6 Spermien je Uterushorn) oder eine laparoskopische Besamung in den Eileiter zurück zu greifen (Johnson, 1999, Krüger, 2000). Kürzlich publizierte Ergebnisse (Taylor et al., 2008, Matthijs et al., 2000) geben Hinweise darauf, dass es bei Sauen nach der Besamung zu einem Verbleib von Spermien im Uterus kommt. Des weiteren kann eine immunologische Reaktionen des Uterus beobachtet werden, die durch den Inseminationsvorgang, Komponenten der Besamungsportion oder die Spermien selbst stimuliert werden und sich zum Beispiel durch eine verstärkte Infiltration von Leukozyten in das Uteruslumen äußert (Matthijs et al., 2003, Rozeboom et al., 1998, Rozeboom et al., 1999). Sowohl die uterine Spermienretention als auch die immunologische Reaktion können Erklärungsansätze für den massiven Spermienbedarf einer erfolgreichen 9

10 Einleitung Insemination beim Schwein sein. Die molekularen Steuerungsmechanismen dieser Prozesse sind allerdings bisher nicht bekannt. Ziel der Arbeit ist es daher, durch ein besseres Verständnis der Vorgänge im porcinen Uterus direkt nach Besamung neue Wege für die Optimierung des Besamungsmanagements beim Schwein aufzuzeigen. Dazu wurden auf Grundlage der aktuellen Literatur folgende Hypothesen aufgestellt: Die Retention von Spermien im Uterus wird durch deren Bindung an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und hat dadurch Auswirkungen auf spätere Ereignisse wie Implantation und Embryonalentwicklung. Zur Untersuchung genannter Hypothesen wurden im Rahmen dieser Arbeit Besamungsversuche mit unterschiedlich formulierten Besamungsportionen durchgeführt. Hierbei sollte zum einen ermittelt werden, wie sich der Verbleib von Spermien im periovulatorischen Uterus gestaltet. Des weiteren sollten diese Experimente die Regulation der Leukozyteninfiltration in Abhängigkeit von einzelnen Komponenten der Besamungsportion untersuchen. Zur Ermittlung der Effekte einzelner Ejakulatkomponenten, die für die Regulationen auf molekularer Ebene verantwortlich sind, wurde die Genexpression immunologisch relevanter Gene im Uterusepithel mittels RNA-Mikroarrays untersucht und durch Real-Time-PCR- Analysen sowie immunhistochemische Untersuchungen ergänzt. 10

11 Literatur 2 Literatur 2.1 Immunologische Aspekte der Reproduktion Generelle Aspekte der Reproduktionsimmunologie Durch die Ejakulation gelangen Spermien als körperfremde Zellen sowie auch körperfremde Proteine in den weiblichen Organismus und induzieren eine Immunantwort im Reproduktionstrakt. Die Regulation dieser natürlichen Abwehrreaktion ermöglicht die Manifestation einer Trächtigkeit bei gleichzeitiger Eliminierung defekter Spermien und Ejakulatbestandteile. Die molekularen Mechanismen und Signaltransduktionswege dieser Prozesse werden bis heute nur im Ansatz verstanden. Seit Mitte der 90er Jahre wird Gravidität als ein Th2-Phänomen angesehen (Lin et al., 1993), wobei Th2-Zellen IL-4 und IL-5 als wesentliche Faktoren für IgE- Produktion, Eosinophile und allergische Entzündungsvorgänge angesehen werden. Diese Hypothese beruht auf der Beobachtung einer Infektion trächtiger Mäuse mit dem Leishmania major Erreger, wobei diese Mäuse die Infektion durch eine Th1- Immunantwort erfolgreich bekämpfte, jedoch die Trächtigkeit mit einem Abort endete. Eine Th2-Immunantwort der infizierten Tiere sorgte dagegen für eine Persistenz der L. major-infektion und eine erfolgreiche Trächtigkeit der Tiere (Krishnan et al., 1996a, Krishnan et al., 1996b). Besonders Spontanabort und Präeklampsie scheinen zwei Komplikationen der Schwangerschaft im humanen Bereich zu sein, für welche eine Th1-Dominanz charakteristisch scheint (Hill et al., 1995). Als schwangerschafts-protektives Zytokin gilt TGF-ß2, weil es immunsupprimierende Eigenschaften besitzt (Clark et al., 1997, Clark et al., 1999). Neuere Daten wiederlegen die traditionelle These, dass die Th1-Zytokine generell schwangerschaftsgefährdend sind (Chaouat et al., 2002). Wichtig ist jedoch, dass viele Schwangerschaftskomplikationen mit einem Überwiegen der Th1-Zytokine in Zusammenhang stehen. In aktuellen Untersuchungen gilt besonders Interleukin 12 (IL12) als wichtigster Mediator der Interferon-y-Sekretion in der Th1-Immunantwort 11

12 Literatur (Fantuzzi et al., 1999, Seder et al., 1993). Antigenpräsentierende Zellen (APZ) sind die Hauptquellen von IL-12, wobei ihre Produktion abhängig und auch unabhängig von T-Zellen sein kann. In der Dezidua trächtiger Mäuse korreliert die Transkription von IL-12 mrna mit der Expression von IFN-y (Haddad et al., 1997), dem eine zwiespältige Rolle in der Gravidität zugeschrieben wird. Auf der einen Seite können natürliche Killerzellen (NK-Zellen) IFN-y absondern, wodurch eine Stimulierung von Makrophagen erfolgt, die als eine Quelle der embryotoxischen Nitric-Oxidase gesehen werden (Haddad et al., 1997). Andererseits kann die Expression einen positiven Einfluss auf den immunologischen Status der Mutter, spätere Schwangerschaften und auf die Prädisposition allergischer Abwehrmechanismen in der frühen Entwicklung der Nachkommen haben (Breckler et al., 2008). Maternale und paternale Anteile prägen das genetische Material der befruchteten Eizelle. Während bestimmter Entwicklungsabschnitte wird das embryonale Genom aktiviert und bewirkt hierbei eine Proteinsynthese, welche sich von der bis zu diesem Zeitpunkt codierenden maternalen mrna unterscheidet. Der sich entwickelnde Embryo bildet somit eine antigene Komponente, die sich vom Immunsystem der Mutter unterscheidet und zu einer Abstoßungsreaktion führen müsste. Untersuchungen hierzu vertreten die Hypothese, dass in der Frühgravidität die Zona pellucida eine physikalische Schutzbarriere bildet und somit den Konzeptus vor der Zerstörung durch entsprechende Antikörper oder auch zytotoxische T-Lymphozyten schützt (Gil et al., 2001, Warner et al., 1988). Auf der anderen Seite produziert der Embryo verschiedene Faktoren, die eine Aktivierung zytotoxischer Zellen unterbinden und weiterhin eine Veränderung des Leukozytenphänotyps bewirken. So findet im Falle der Gravidität eine Verschiebung von Th-1-Zellen zu Th-2-Zellen statt (Lin et al., 1993). Bedingt durch diesen Shift wird am feto-maternalen Interaktionspunkt die Produktion unterschiedlichster Wachstumsfaktoren und auch positiv induzierender Zytokine wie etwa IL-4, IL-5 und IL-10 angeregt, die somit ein Überleben und auch das Wachstum des Embryos ermöglichen (Emond et al., 1998, Fortin et al., 1997). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der trächtige Uterus eine Sonderstellung hinsichtlich der Immunantwort spielt und bedingt durch diese Sonderstellung ein Überleben und Wachstum des Embryos ermöglicht. 12

13 Literatur Im Rahmen von Immunantworten kann zwischen erworbenen und angeborenen bzw. adaptiven und nichtadaptiven Immunantworten unterschieden werden. Die angeborenen, nicht adaptiven Immunantworten benötigen im Vorfeld keinen Kontakt mit einem Antigen und führen unmittelbar, in einem Zeitraum von bis zu 4 Stunden, zu einer Immunantwort. Makrophagen, dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten und auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) spielen hierbei als Effektorzellen eine ausschlaggebende Rolle. Die erworbene adaptive Immunantwort entwickelt sich innerhalb mehrerer Tage und benötigt hierbei einen vorangegangenen Antigenkontakt. Wichtige Zellen dieser Immunantwort sind T- und B-Lymphozyten sowie antigenpräsentierende Zellen wie zum Beispiel Makrophagen und dendritische Zellen (Engelhardt et al., 1997, Janeway, 1995). Wodurch die roten Blutkörperchen eine homogene Population bilden. Im Gegensatz hierzu finden sich viele unterschiedliche Typen von weißen Blutkörperchen. Differenziert nach ihrem Erscheinungsbild werden sie in die drei Gruppen die Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten eingeteilt. Die Granulozyten enthalten einen großen Anteil an Lysosomen und Sekretionsvesikeln (auch als Granula bezeichnet). Sie werden anhand ihrer Morphologie und dem unterschiedlichen Anfärbeverhalten ihrer Zellorganellen in drei weitere Untergruppen gegliedert. Ihr unterschiedliches Anfärbeverhalten spiegelt auch die Differenzen in Chemie und Funktion wieder. Neutrophile Granulozyten, die wegen ihres gelappten Zellkerns auch polymorphkernige Granulozyten oder Leukozyten genannt werden, gehören zur größten Gruppe der Granulozytenpopulation. Sie phagozytieren und zerstören eingedrungene Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und gehören zum nichtadaptiven Immunsystem. Basophile Granulozyten scheiden zum Großteil Histamin aus und wirken bei der Bekämpfung von Entzündungs- und allergischen Reaktionen mit. Eosinophile Granulozyten sind an der Kompensation von parasitären Erkrankungen und der Modulierung allergischer Entzündungsprozesse beteiligt. Verlassen Monozyten den allgemeinen Blutstrom, reifen sie heran und werden zu Makrophagen. Zusammen mit den neutrophilen Granulozyten bilden sie die phagozytierenden Zellen im Organismus (Tabelle 1). Sie enthalten beide spezialisierte Lysosomen, welche mit neugebildeten Phagosomen verschmelzen. In 13

14 Literatur diesen Phagosomen werden eingeschlossene Mikroorganismen durch unterschiedliche Mechanismen und einer Mischung aus lysosomalen Hydrolasen unschädlich gemacht. Makrophagen sind im Vergleich zu den Neutrophilen jedoch sehr viel größer und langlebiger. In unterschiedlichen Geweben sind die Makrophagen dafür verantwortlich, dass alte, tote und beschädigte Zellen erkannt und beseitigt werden. Als einzige sind Makrophagen auch in der Lage, große Mikroorganismen wie etwa Protozoen zu phagozytieren. Monozyten sind weiterhin auch die Ausgangszellen für dendritische Zellen. Ihre überwiegende Tätigkeit ist jedoch nicht die Phagozytose, sondern sie haben sich darauf spezialisiert, den Lymphozyten fremde Antigene zu präsentieren und somit eine Immunantwort herbeizuführen. Lymphozyten unterteilen sich in zwei Untergruppen, welche beide an einer Immunreaktion beteiligt sind: die B- und die T-Lymphozyten (Tabelle 1). Die B- Lymphozyten produzieren Antikörper, die T-Lymphozyten steuern die Aktivität anderer weißer Blutkörperchen und zerstören virusinfizierte Zellen. Des Weiteren gibt es Lymphozyten-ähnliche Zellen, die als natürliche Killerzellen (NK-Zellen) bezeichnet werden (Alberts et al., 2004). 14

15 Literatur Tabelle 1: Hauptfunktionen der weißen Blutkörperchen Zelltyp Weiße Blutkörperchen (Leukozyten) Granulozyten Neutrophile (polymorphkernige Leukozyten) Eosinophile Basophile Monozyten Lymphozyten B-Zellen T-Zellen Natürliche Killerzellen Hauptfunktion des Zelltyps Phagozytieren und zerstören eingedrungene Bakterien Zerstören größere Parasiten und modulieren allergische Entzündungsprozesse Setzen bei bestimmten Immunreaktionen Histamin frei Werden zu Makrophagen der Gewebe, phagozytieren und verdauen Mikroorganismen, Fremdkörper und alte und geschädigte Zellen Bilden Antikörper Töten virusinfizierte Zellen und steuern Aktivität anderer Leukozyten Töten virusinfizierten Zellen und einige Arten von Tumorzellen Uterine Immunantwort nach Insemination beim Schwein Der Uterus ist nicht nur, aber vor allem während der Insemination antigenen Substanzen ausgesetzt. Ein immunologisches System ist hierbei ein wichtiger Schutz vor Infektionen. Die Präsenz von Leukozyten im Uterus zeigt dabei eine zyklusabhängige Modifikation (Bischof et al., 1994b, Kaeoket et al., 2002a). Die endokrinologisch gesteuerte Veränderung wird vor allem vom Östrogen und Progesteron reguliert (Rigby, 1967, Kunavongkrit and Malmgren, 1983). Des Weiteren konnte bei Jungsauen zyklusabhängige Anfälligkeit nach intrauteriner Applikation von Bakterien nachgewiesen werden (de Winter et al., 1994). Hierbei zeigten alle im Interöstrus mit Escheria coli infizierten Tiere eine Endometritis mit 15

16 Literatur vaginalem Ausfluss, wobei jedoch ein im Östrus befindliches infiziertes Tier nur einen geringgradigen vaginalen Ausfluss zeigte. In allen Zyklusstadien des porcinen Uterus finden sich im Oberflächenepithel, im Stroma und auch im Drüsenepithel des Endometriums Lymphozyten (Bischof et al., 1994a, Kaeoket et al., 2002b). Bischof stellte 1994 fest, dass neutrophile Granulozyten im präpuberalen Uterus zusammen mit T-Lymphozyten und Makrophagen die häufigste Zellpopulationen sind. Hierbei schrieb er diesen Zellen eine wichtige Rolle in der interaktiven, zyklischen zellulären Veränderung sowohl in der Struktur als auch der Funktion des Endometriums zu. Weiterhin stellte er eine lokale zelluläre Immunantwort bedingt durch diese Leukozytenpopulationen fest (Bischof et al., 1994a). Bei geschlechtsreifen Sauen nach Insemination ist im Proöstrus und Östrus ein starker Influx neutrophiler Granulozyten zu beobachten. Subepithelial sowie um Blutgefäße herum ist hierbei eine Ansammlung dieser Zellen zu finden. Im Oberflächenepithel sind sie nur vereinzelt vorhanden (Bischof et al., 1994a, Bischof et al., 1994b, Engelhardt et al., 1997, Kaeoket et al., 2002a, Kaeoket et al., 2003b). Beim Schwein ist nach Einbringen des Ejakulates ein schneller Einstrom neutrophiler Granulozyten in das Lumen und das Endometrium des Uterus nachweisbar (Lovell and Getty, 1968, Pursel et al., 1978, Rozeboom et al., 1998, Rozeboom et al., 1999). Zwar ist in vitro eine Hemmung der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten durch Seminalplasma beschrieben worden, doch kann die uterin auftretende Immunantwort auch durch Seminalplasma hervorgerufen werden (Bischof et al., 1994b, Rozeboom et al., 1999, Rozeboom et al., 2001b, Rozeboom et al., 2001a). Auch konnte nach Insemination mit Seminalplasma eine verstärkte Makrophageninfiltration gezeigt werden (Hadjisavas et al., 1994). Als häufigste Subpopulation finden sich im porcinen Endometrium Lymphozyten nach Insemination bzw. Seminalplasmaapplikation (Kaeoket et al., 2003c, Kaeoket et al., 2003a, Bischof et al., 1994b). Im Endometrium besamter Sauen konnten bis zu 11 Tage nach Insemination erhöhte Werte für CD2 CD4 und CD8 positive Zellen im Vergleich zu östrischen und unbesamten Tieren gefunden werden (Kaeoket et al., 2003b). Im Gegensatz hierzu wurden bei Untersuchungen nach dem Natursprung bei Jungsauen im Vergleich zu unbesamten Tieren für diese Zellen ein niedrigerer Wert 16

17 Literatur an Tag zwei und vier nach dem Östrus gefunden (Bischof et al., 1994b, Bischof et al., 1994a). Weiterhin wurden im Oberflächen- und Drüsenepithel des Endometrium eine höhere Anzahl an CD8 und CD4 positiven Zellen gefunden, während im oberflächlichen und auch tiefen Stroma des Epithels ein umgekehrtes Verhältnis dieser Zellpopulationen gefunden wurde (Kaeoket et al., 2003b, Kaeoket et al., 2003a). Ein Einfluss auf Mastzellen im Endometrium konnten bedingt durch die Insemination nicht nachgewiesen werden (Kaeoket et al., 2003b). Studien konnten weiterhin zeigen, dass Seminalplasmabestandteile mit dem Endometrium interagieren und somit eine Veränderung des Leukozyteninflux und der Zytokinexpression bewirken, wodurch ein Einfluss auf die Aufrechterhaltung der Gravidität, die Präimplantation und Embryonalentwicklung bestehen. Hiermit bietet sich eine molekulare Erklärung für die veränderten, erhöhte Wurfgrößen bei Schweinen an (O'Leary et al., 2004). Studien belegen eine entzündliche Veränderung der Reproduktionsorgane aller bisher untersuchten Säugetiere, wenn sie Seminalplasma ausgesetzt wurden. Den größten Einblick in die hierbei ablaufenden molekularen und zellulären Reaktionen erbrachten Studien an Nagern, wobei Seminalplasma nicht nur als Transport- und Nährmedium für Spermien anzusehen ist, sondern auch als Kommunikationsmittel zwischen weiblichen Genitaltrakt und Spermien dient, und eine Schlüsselrolle in der Konditionierung des weiblichen Reproduktionstraktes gegenüber einer Trächtigkeit darstellt. Bei Nagern ist Seminalplasma für den positiven Trächtigkeitsverlauf durch die Aktivierung entzündlicher und immunologischer Veränderungen im weiblichen Genitaltrakt verantwortlich. Hierdurch ergibt sich weiterhin eine positive Wirkung auf die Embryonalentwicklung und Implantation (Robertson, 2007). Beim Schwein ist bekannt, dass erst Minuten nach der Besamung die ersten Spermatozoen im Eileiter nachgewiesen werden können. Mehrere Stunden dauert es jedoch noch bis im kaudalen Isthmus befruchtungskompetente Spermien auszumachen sind (Hunter, 1981). Sowohl für Scheiden- als auch Uterusbesamer stellt der kaudale Isthmus des Eileiters ein funktionelles Spermienreservoir dar (Boyle et al., 1987). Innerhalb dieses Reservoirs werden die Spermien an unterschiedlichen Lokalisationen gespeichert. (Smith and Yanagimachi, 1991). Ein Anteil dieser Spermienpopulation findet sich 17

18 Literatur unbeweglich gebunden in einer viskösen Masse im zentralen Lumen des Eileiters. Ein weiterer Teil ist am Boden der Epithelschleimhautfalten gebunden (Mburu et al., 1997). Veränderungen ähnlich eines Alterungsprozesses konnten an den Spermien beobachtet werden, die sich im Eileiterlumen befanden. Als Schutz vor dem Zilientransport bildet sich in den Schleimhautfalten des Eileiters ein zusätzliches Reservoir aus Spermien (Blandau and Gaddum-Rosse, 1974). Unterschiedliche Studien gehen davon aus, dass eine Voraussetzung für das Überleben und auch die Kapazitation der Spermien ein enger Kontakt zwischen dem apikalen Anteil des Spermienkopfes und dem Epithel des Ovidukts ist. Kohlenhydrat-Proteinbindungen sind hierbei vermutlich für die Vermittlung des Kontaktes zwischen den somatischen Oviduktzellen und den männlichen Gameten zuständig (Smith and Yanagimachi, 1991, Suarez, 2001, Hunter, 1995), da mehreren Forschergruppen der Nachweis einer Kohlenhydratbeteiligung an der Spermien-Oviduktepithelzell-Bindung gelang (Lefebvre and Suarez, 1996, Dobrinski et al., 1996, Petrunkina et al., 2001). Hierbei werden von Oviduktepithelzellen Oligosaccharide exprimiert, die über spezifische Proteine die Kohlenhydrate binden oder Lektin-ähnliche Moleküle der Spermien identifizieren (Suarez, 1998, Suarez et al., 1997). Unterschiedlicher Untersuchungen folgend können dem kaudalen Isthmus somit folgende, für die Befruchtung wichtige Funktionen zugeordnet werden: Selektion intakter und zur Befruchtung fähiger Spermien Aufrechterhaltung der Spermienvitalität bis zum Zeitpunkt der Ovulation Eine Verhinderung der Polyspermie, durch Begrenzung der Spermienanzahl am Ort der Befruchtung durch gezielte Lösung der Spermatozoen Regulation in Hinsicht auf Hyperaktivität und Kapazitation der Spermien Nicht nur die Bindung der Spermien am kaudalen Isthmus ist ein zentraler Mechanismus, sondern auch physikalische Vorgänge wie die Spermienfixierung innerhalb ödematöser Isthmusfalten verhindern den Spermienaufstieg in der präovulatorischen Zyklusphase (Hunter and Nichol, 1986). Im Östrus kommt es zu einer starken Schwellung der Falten des Oviduktepithels, wodurch sich das Lumen verengt und die ankommenden Spermien automatisch Kontakt zu den 18

19 Literatur Oviduktepithelzellen und ihren Rezeptoren erhalten. Bekannt ist, dass gebundene Spermien, welche schon präovulatorisch freigesetzt wurden, zum Zeitpunkt der Ovulation nicht mehr befruchtungsfähig sind (Hunter, 1995). Dies wird durch einen Verlust der nur begrenzten Energiereserven der Spermien bewirkt. Bei Eberspermien ist bekannt, dass diese Reserven maximal für 24 Stunden ausreichend sind, wobei eine Ovulation auch mehr als 24 Stunden nach der Insemination auftreten kann. Schon kapazitierte Spermien in der Besamungsportion sind aufgrund ihrer Veränderungen an der Plasmamembran dann in einer Phase der metabolischen Erschöpfung (Hunter, 1995) Spermienselektionsmechanismen und Spermienbindung im weiblichen Genitaltrakt Hinsichtlich des Begriffs Spermienselektion muss zunächst zwischen solchen Säugetierspezies unterschieden werden, die vaginal das Sperma absetzen und jenen die ihr Sperma direkt in den Uterus absetzen. Bekannt ist, das bei den Vaginalbesamern wie z. B. dem Rind, die Cervix eine Hauptbarriere für den Spermientransport darstellt (Mitchell et al., 1985). Ein retrograder Fluss des Cervixschleims bei Rind beseitigt hier einen Anteil der zentral in den Cervixkanal eingebrachten Spermien (Mullins and Saacke, 1989). Eine Selektion morphologisch und aber auch funktionell veränderter Spermien erfolgt bei Primaten und Wiederkäuern u. a. durch den Cervixschleim (Barros et al., 1984, Mitchell et al., 1985, Katz et al., 1989). Einigen Spezies wird in der Interaktion zwischen Cervixschleim und Spermien eine zentrale Rolle bei der Spermienkapazitation eingeräumt (Katz et al., 1989). Beim Wiederkäuer dient die Cervix auch als Spermienreservoir (Katz et al., 1989). Die utero-tubale Verbindung und der Eileiteristhmus dienen bei intrauteriner Samenablage nicht nur als Spermienreservoir, sondern auch als Selektionsbereich. Tiefgefrorene und wieder aufgetaute sowie tote Spermien verbleiben in diesem Bereich nur für eine kurze Zeitspanne im Vergleich zu frischen, lebenden Spermien (Pursel et al., 1978, Einarsson and Viring, 1973, Blandau and Gaddum-Rosse, 1974). Polson und Krzanowski (Polson et al., 1974) beobachtete bei Mäusen eine Selektion morphologisch veränderter Spermien durch die utero-tubale Verbindung. Eine 19

20 Literatur massive Reduktion der Spermienmenge erfolgt zwischen dem Ablageort und der Eileiterampulle. Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass nur ein geringer Anteil der inseminierten Spermien aus dem Eileiter zurückgewonnen werden kann und an der Befruchtung beteiligt ist (Rigby, 1966, First et al., 1968, Overstreet and Cooper, 1978). Unterschiedliche Angaben werden über den Zeitraum gemacht, in dem der weitaus größte Anteil der Spermien und des Seminalplasmas aus dem Uterus wieder eliminiert werden. Eine einheitliche Aussage wird dadurch erschwert, dass die Untersuchungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt werden. Unter anderem wurde beschrieben, dass bereits nach 15 Minuten nur noch die Hälfte der eingebrachten Spermien im Uterus zu finden ist (First et al., 1968). Andere Arbeiten beschreiben, dass zwei Stunden nach Bedeckung bzw. Besamung ein großer Anteil der Spermien und des Seminalplasmas schon wieder aus dem Uterus eliminiert wurde (Rigby, 1966). Nach Viring und Kollegen trat die Verringerung der Spermienzahl im Uterus erst 12 Stunden nach der Besamung ein (Einarsson and Viring, 1973, Viring, 1980, Viring and Einarsson, 1980). Der schnelle Verlust von Spermien und Seminalplasma aus dem Uterus ergibt sich zum Teil durch den Rückfluss durch den Cervixkanal (Einarsson and Viring, 1973, Viring and Einarsson, 1980, Pursel et al., 1978, Steverink et al., 1998), wobei ein Rückfluss von bis zu 70% des inseminierten Volumens und annähernd 25% der inseminierten Spermien innerhalb von zwei Stunden nach Besamung bei Sauen festgestellt wurde. Unter anderem sind für diesen Rückfluss Uteruskontraktionen in peristaltischen Wellen verantwortlich (Langendijk et al., 2005). Ein weiterer Einfluss der Reduktion der Spermatozoenzahl ergibt sich durch eine lokale Phagozytose, welche bei Sauen nach 8 Stunden, bei Jungsauen schon 2 Stunden nach der Insemination beobachtet wurde. Erste Phagozytoseprozesse wurden schon 30 Minuten nach Besamung durch die Einwanderung phagozytierender polymorphkerniger Leukozyten in das Uteruslumen beschrieben. (Pursel et al., 1978, Lovell and Getty, 1968). Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass der Rückfluss und die Phagozytose der Spermatozoen durch die extrem schnelle Reduktion der Spermien innerhalb der ersten vier Stunden nach der Insemination beeinflusst wird (Matthijs et al., 2003, Matthijs et al., 2000). Beim Schaf konnten Spermienverluste bei der Passage der 20

21 Literatur Spermien durch die Eileiter in die angrenzende Peritonealhöhle nachgewiesen werden (Mattner, 1968). Dieses beobachtete Phänomen wird ebenfalls ausgiebig beim Schwein diskutiert. Hierbei stützen sich die Diskussionen auf Ergebnisse, wonach schon 2 Stunden nach der natürlichen sowie auch der artifiziellen Besamung hohe Spermienzahlen aus dem proximalen Eileiterhälften zurückgewonnen werden konnten (Viring, 1980, Einarsson and Viring, 1973). 2.2 Morphologie und Funktion des Uterus Topographie und makroskopischer Aufbau des Uterus beim Schwein Der Uterus beim Schwein wird in die Abschnitte Gebärmutterhals (Cervix uteri), Uteruskörper (Corpus uteri) und die paarig vorliegenden Uterushörner (Corni uteri) des Uterus bicornis unterschieden. Neben dem Spermientransport ist der Uterus auch an der Implantation und Plazentation beteiligt und sorgt weiterhin für die Versorgung und Entwicklung des Embryos bzw. des Fötus (Nusshag, 1968). Am Ende der Gravidität ist der Uterus durch Kontraktion für die Austreibung der Frucht verantwortlich. Im Vergleich zum Menschen fehlt bei Schweinen der Bereich der Portio vaginalis cervicis, ein in die Vagina reichender Anteil der Cervix uteri. Um einen Verschluss gegenüber der Vagina zu erreichen, liegen daher beim Schwein im Lumen des Gebärmutterhalses (Cervix uteri) spezielle Gewebekissen (Pulvini cervicis) vor, die ähnlich einem Reißverschluss ineinander greifen Histologischer Aufbau des Uterus Die Uterusschleimhaut (Endometrium, Tunica mucosa) bildet beim Schwein und auch anderen Säugetieren unterschiedlich hohe Falten, die verstreichbar sind, und im Bereich des Corpus uteri besonders hoch vorliegen können. Die Tunica mucosa liegt der Uterusmuskulatur (Tunica muscularis) an, wobei der äußere Anteil der Uterusmuskulatur in das Mesometrium einzieht. Hier bildet sie die Serosamuskulatur, die an den Bewegungen des Aufhängeapparates des Uterus beteiligt ist. Als äußere Abgrenzung wird der Uterus vom Perimetrium, einem Überzug des Bauchfells umschlossen, der dem Mesometrium entstammt. 21

22 Literatur Die das Uteruslumen auskleidende Schleimhautschicht unterliegt starken zyklusabhängigen hypertrophen und hyperplasmatischen Veränderungen. Das einschichtige iso- bis hochprismatische Oberflächenepithel kann während des Zyklus zwei- bis mehrreihig werden (Nusshag, 1968, Kaeoket et al., 2002a). Auf das Oberflächenepithel folgt vom Lumen her gesehen die Lamina propria mucosae, welche vor allem die Uterusdrüsen und zellreiches, aber faserarmes Stroma endometrialis umfasst. In dieser Gewebeschicht finden sich besonders häufig im subepithelialen Bereich zahlreiche Immunzellen, wie z. B. Lymphozyten. Das Myometrium, die Tunica muscularis, wird aus einer inneren, zirkulär verlaufenden Schicht, dem Stratum circulare, und einer äußeren, longitudinal verlaufenden Schicht, dem Stratum longitudinale, gebildet. Beide Muskelschichten bilden zusammen ein Spiralsystem, welches die Uterusausdehnung während der Gravidität ermöglicht und auch für das anschließende Zusammenziehen post partum verantwortlich ist. Das Stratum circulare setzt sich nach kaudal in die Muskulatur der Tuba uterina fort, während es nach kranial in die Muskulatur der Cervix übergeht. Anteile aus dem Stratum longitudinale bilden nach kranial die Scheidenmuskulatur und verstärken mit die Theca subserosa. Ein bei anderen Haussäugetieren (Pferd, Hund, Katze) zwischen den beiden Muskelschichten vorliegendes Stratum vasculare ist beim Schwein nicht vorhanden (Nusshag, 1968). Das Perimetrium bildet die äußere Begrenzung des Uterus und besteht aus einem einschichtigen Plattenepithel, dem Mesothel, und einer lockeren Bindegewebsschicht. In dieser bindegewebigen Schicht verlaufen Blut- und auch Lymphgefäße sowie Nervenfasern des Sympathikus und Parasympathikus. Ein kompliziertes Faltungssystem befindet sich im Bereich der Schleimhaut der Cervix uteri. Dieses besteht aus Längs- und Querfalten, die als Primär- Sekundär- und auch Tertiärfalten bezeichnet werden. Sie dienen dem Verschließen und Öffnen des Uterus. Die einschichtigen, hochprismatischen Cervixepithelzellen bilden als zusätzlichen Verschluss der Cervix einen zähen Schleimpfropf (Nusshag, 1968, Kaeoket et al., 2002a). 22

23 Literatur 2.3 Zusammensetzung des Inseminates Spermien Eberspermatozoen entsprechen in ihrem Aufbau den Spermatozoen anderer Nutztiertierarten. Das Spermium wird in einen Kopf, Hals und Schwanz unterteilt, wobei sich der Spermienschwanz wiederum in ein Mittel-, Haupt- und Endstück gliedert (Setchell, 1974, Evans and Setchell, 1978). Die Gesamtlänge eines Spermiums beträgt zwischen 50 bis 70μm. Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Säugerspermiums: Angepasst nach Rüsse and Sinowatz (1998 aus: anke /html/image001.gif) 23

24 Literatur Der Spermienkopf beinhaltet den Zellkern, in welchem die Desoxyribonukleinsäure als Träger der genetischen Information in Form sehr stark kondensierten Chromatins vorliegt (Monesi et al., 1978). Eine innere und äußere Kernmembran umgeben den Zellkern in seiner ovalen bis rechteckigen, seitlich abgeflachten Form. Die Kopfkappe, das Akrosom, bedeckt 2/3 des Kopfes. Dieses Akrosom wird aus den Vesikeln des Golgikomplexes gebildet. Es enthält hydrolytische Enzyme wie z. B. Akrosin und Hyaluronidase, die bei der Interaktion des Spermiums mit der Eizelle freigesetzt werden und die Penetration des Spermiums in die Oozyte ermöglichen. Das Halsstück fungiert als bewegliche Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz. Die Basalplatte, welche zwischen der Implantationsgrube des Kerns und dem proximalen Zentriol liegt, bildet die Kontaktstelle. Dieser Bereich wird vielfach auch als Gelenkkopf bezeichnet und ist eine Prädilektionsstelle für die Trennung des Spermienschwanzes vom Kopf während des Penetrationsprozesses. Der Spermienschwanz wird in ein Mittel- Haupt und Endstück unterteilt und entspringt als Achsenfaden am proximalen Zentriol des Spermienhalses. Eine für Geißeln typische radialsymetrische Struktur, bestehend aus neun Doppelmikrotubuli und weiteren neun Außenfibrillen, findet sich am Achsfaden. Die Energieversorgung wird im Spermium im Mittelstück von Mitochondrien bereitgestellt, die in einer einlagigen, spiralförmigen Schicht vorliegen. Das Hauptstück bildet den längsten Teil des Spermienschwanzes, wobei die Dicke der Außenfibrillen nach distal abnimmt. In diesem Bereich findet sich die sogenannte Ringfaserscheide, die aus einer Schicht fibrillärer Proteine besteht. Das Endstück befindet sich am Ende der Ringfaserscheide, wobei weder Mantelfasern noch eine Faserscheide vorhanden sind und in dessen Verlauf der Achsenfaden frei von Plasmalem umgeben wird. Alle Bereiche eines Spermiums werden von einer Plasmamembran umgeben, deren Zusammensetzung der Lipide der Funktion der einzelnen Spermienareale entspricht (Setchell, 1974, Evans and Setchell, 1978, Hinton et al., 1979) Seminalplasma Schon im Nebenhoden erwerben Säugetierspermatozoen die Fähigkeit eine Eizelle zu befruchten, direkt nach der Ejakulation geht die Eigenschaft aber zunächst 24

25 Literatur verloren, da sich Bestandteile des Seminalplasma während der Ejakulation wie eine Art Schutzhülle um die Spermatozoen legen, und die Spermien vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und frühzeitiger Kapazitation schützen (Shivaji et al., 2009). Das Seminalplasma bildet den flüssigen, spermienfreien Anteil des Ejakulates, das in den verschiedenen akzessorischen Organen des männlichen Genitaltraktes gebildet wird. Im Allgemeinen wird der Hauptanteil des Seminalplasmas durch die akzessorischen Drüsen (Ampulle, Samenblasendrüse, Prostata und Bulbourethraldrüse) sezerniert, wobei einzelne Volumen und die Zusammensetzung speziesabhängig sind. Im Seminalplasma finden sich unterschiedliche Komponenten, wie freie Aminosäuren, Monosaccharide, Lipide, Polyamide, Prostaglandine, Steroidhormone und Proteine als niedermolekulare Substanzen (Mann and Lutwak-Mann, 1982, von Rad, 2002), sowie eine unterschiedliche Anzahl Ionen (Na +, Cl -, K +, Mg 2+, und Ca 2+ ) (Hafez, 1976, Hafez, 1973, Hofny et al., 2010). Um das saure Milieu im weiblichen Genitaltrakt zu neutralisieren, liegt der ph-wert des Seminalplasmas im Bereich zwischen 7,2 und 7,8 (Setchell, 1974). Das Seminalplasma dient dem Transport, dem Schutz und der Ernährung der Spermien (Smith et al., 1988). Verschiedene Studien belegen weiterhin, dass Seminalplasma einen Einfluss auf die endometrialen Epithelzellen und somit auf eine immunologische Reaktion des weiblichen Genitaltraktes hat. Das Seminalplasma der Maus hat eine hohe Konzentration an TGF-ß, welches die Ausschüttung weiterer pro-inflammatorischer Zytokine in vivo und in vitro stimuliert (Tremellen et al., 1998). Studien belegen heute die Wichtigkeit der Zytokine für die Etablierung einer Gravidität, sowie des Kontaktes des Endometriums mit den Spermien und dem Seminalplasma. Vor allem in der humanen Anwendung der IVFund ICSI- Methode sind diese Mechanismen von hoher Bedeutung. Durch den hierbei fehlenden physiologischen Kontakt zwischen dem rezeptiven Endometrium und dem Ejakulat ließe sich gegebenenfalls die geringe Implantationsrate intakter Embryonen nach IVF und ICSI erklären. Die Beeinflussung der endometrialen Funktion nach Kontakt mit Spermien und Seminalplasma und einer hieraus resultierenden verbesserten Implantationsrate ist bisher nur in Ansätzen untersucht. Einzelne Studien jedoch stützen die Hypothese derartiger Mechanismen (Bellinge et al., 1986, Coulam and Stern, 1995). So ist bekannt, dass das Seminalplasma des 25

26 Literatur Eberejakulates mit dem Reproduktionstrakt der inseminierten Sau interagiert und die Befruchtungschance positiv beeinflusst. Hierbei werden dem Seminalplasma regulierende Funktionen zugeschrieben, welche die essentiellen Befruchtungsschritte, wie etwa Freisetzung der Oozyten, den Spermientransport im weiblichen Reproduktionstrakt und die Spermienkapazitation, zeitlich optimieren (Waberski et al., 1997, Waberski et al., 1999). Weitere Studien bestätigten die Wirkung des Seminalplasmas auf die T- und B-Zellproliferation, die Phagozytoseaktivität von polymorphkernige Granulozyten (PMN) und Makrophagen sowie die Unterdrückung der Aktivität von natürlichen Killerzellen (Thaler, 1989). Weitere Funktionen werden heute diskutiert, zumal die Charakterisierung der Seminalplasmaproteine weit fortgeschritten ist. Dabei haben Proteine der drei dominanten Eiweiße der FnII Typ-Familie, CRISP-Proteine und Spermadhäsine II entscheidenden Einfluss FnII Typ-Proteine Hierbei handelt es sich um eine Gruppe homologer Proteine, die heparin- und gelatinebindende Domänen enthalten, die allgemein auch als Fibronectin Typ II Domänen bezeichnet werden. Die FnII-Proteine des Rindes (Bovine Seminal Plasma Proteins; BSP-1, -2, -3 und BSP30) sind in ihren Funktionen besonders gut untersucht (Manjunath and Sairam, 1987). Ihre Synthese findet in der Samenblase statt, sodass sie erst bei der Ejakulation mit der Spermienmembran in Kontakt kommen. Die BSPs binden über Interaktion von Phospolipiden fest an die Membran, werden nicht von der Membran abgelöst und wirken durch eine Heparinbindung als positive Regulatoren der Kapazitation CRISP-Proteine (Cystein-Rich Secretory Proteins) Die Mitglieder dieser Proteinfamilie zeichnen sich durch 16 hochgradig konservierte Zystein-Reste aus und bilden dabei eine kompakte Domäne am C-terminalen Ende (Eberspaecher et al., 1995). Erstmals wurde ein Protein dieser Familie bei der Ratte nachgewiesen und in Folge als DE/AEG-Protein (acidic epidymal glycoprotein) beschrieben (Cameo and Blaquier, 1976). Aus dem Nebenhodenkörper der Maus wurde das homologe Protein CRISP-1 isoliert. Bei Equiden zeigt das HSP-3 eine 26

27 Literatur sehr starke Sequenzhomologie zu CRISP-1, und wird somit gleichfalls der CRISP- Familie zu geordnet. Bei den Pferden gehören die CRISP-Proteine, anders als bei Maus und Ratte, zu den dominierenden Proteinen des Seminalplasmas (Schambony et al., 1998). Ihre Synthetisierung geschieht im Nebenhoden und der Ampulle, wobei sie fest an die postakrosomale Membran und das Mittelstück des Spermienschwanzes binden. Eine direkte Beteiligung an der Gameteninteraktion durch die DE/AEG-Proteine wurde bei der Ratte nachgewiesen. Hierbei inhibiert das DE-Protein konzentrationsabhängig die Gametenfusion, nicht jedoch die Gamentenbindung (Rochwerger et al., 1992). Beim Pferd konnte eine Korrelation zwischen der Fertilitätsrate und der Anzahl der auf der Spermienmembran gebundenen Proteine nachgewiesen werden (Schambony et al., 1998) Spermadhäsine Spermadhäsine gehören einer Proteinfamilien an, deren Moleküle eine Masse von 12-15kDa besitzen. Spermadhäsine sind spermienoberflächenassoziierte Eiweiße, die der Kapazitation und der Gametenerkennung dienen (Calvete et al., 1993, Rodriguez-Martinez et al., 2010). Die Primärstruktur wird dabei von Aminosäuren und einer homologen Anordnung von zwei Disulfidbrücken zwischen jeweils benachbarten Cysteinresten gebildet (Einspanier et al., 1994). Es wurde nachgewiesen, dass Spermadhäsine von ihrer Struktur zu einer Familie von ontogenetisch regulierenden Proteinen gehören, welche durch die sogenannte CUB- Domäne charakterisiert werden (Bork and Beckmann, 1993). Spermadhäsine besitzen die Fähigkeit, spezifisch an Kohlenhydrate zu binden, wobei sie mit den bisher bekannten Lektinen keinerlei Gemeinsamkeiten zeigen. Deshalb werden sie mittlerweile als eine neue Gruppe von Lektinen bezeichnet. Bisher identifizierte porcine Spermadhäsine sind: AWN-1, AWN2, AQN-1, AQN-3, PSP-1, PSP-2 27

28 Literatur Spermadhäsine verfügen über verschiedenste Möglichkeiten biochemische Prozesse zu modulieren. Sie sind in der Lage, über die Kohlenhydratbindungsmöglichkeit hinaus, Glycoaminoglycane, Phospholipide und Serinproteinaseinhibitoren zu binden (Calvete et al., 1994). Sie sind bestrebt, sulfatierte Glukosaminoglykane und Heparin zu bilden und wirken somit regulativ auf Kapazitationsfaktoren (Calvete et al., 1994). Eine sehr wichtige Rolle der Spermadhäsine besteht in der Bindung der Gameten, welche über die apikale Region des Spermienkopfes vermittelt wird, in dem die Spermadhäsine lokalisiert sind (Calvete et al., 1993, Dostalova et al., 1994). Weitere Studien gehen davon aus, dass die Spermadhäsine PSP I und II die Aktivierung von PMN s und somit einen proinflammatorischen Prozess beeinflussen. In ihrer Hypothese gehen sie davon aus, dass es durch PSP I und II zu einer Vermittlung von Entzündungsprozessen nach der Besamung kommt, wobei die nach einer Besamung einströmende erste Spermienfraktion im Eileiteristhmus ein Reservoir bildet und frei von PSP I und II ist. Ein Einstrom von PMNs in das Lumen folgt nicht. Die physiologische Bedeutung von PSP I und II im Uterus und der immunologischen Reaktion nach Besamung wird diskutiert. So scheint die Balance zwischen der Rekrutierung von Mastzellen und Neutrophilen als Reaktion auf entzündliche Reize moduliert durch PSP I und II einen erheblichen Einfluss auf die biochemischen Details der durch Makrophagen induzierten Entzündungsreaktion und deren Regulation auf die Existenz von Mastzellen zu haben (Assreuy et al., 2002, Assreuy et al., 2003). Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen Spermadhäsinen, denn es wird nicht erst in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen gebildet, sondern bereits in den Tubuli recti und im Rete testis des Hodens (Ekhlasi-Hundrieser et al., 2002) Kapazitation Eine Reihe von endogenen Aktivierungsvorgängen im weiblichen Genital, die Voraussetzung für die Akrosomreaktion des Spermiums, die Penetration der Zona pellucida und Befruchtung der Eizelle sind, werden als Kapazitation bezeichnet. Dieses Phänomen ist seit den fünfziger Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt (Chang, 1951, Austin, 1951, Austin, 1952). Erste Schritte der Kapazitation, deren 28

29 Literatur molekulare Grundlagen weitestgehend noch unbekannt sind, beginnen vermutlich schon auf dem Weg der Spermien in den Eileiter, dem Hauptort der Kapazitation. Bei Schwein und Pferd werden die Spermien direkt in den Uterus abgesetzt, und im kaudalen Isthmus des Eileiters bis zur Befruchtung gespeichert (Miller and Hunter, 1986). Zu Beginn der Kapazitation wird die schützende Hülle aus Proteinen über der Spermienmembran entfernt. Hiermit werden die Spermadhäsine, die als Dekapazitationsfaktoren wirken, partiell entfernt. Hiernach entsteht eine Umstrukturierung der Membran durch Entfernung von Cholesterin (Breitbart, 2003). Bei intakten Spermien befinden sich Membranproteine über den gesamten Spermienkopf verteilt und sparen hierbei nur den rostralen Bereich aus. Hier besteht eine Diffusionsbarriere, die eine Proteinwanderung in diesem Bereich verhindert. Die Umorganisation der Spermienoberfläche bewirkt nun, dass diese Barriere aufgehoben wird und Proteine in diesen Bereich einwandern können. Sie bilden Aggregate in der periakromosomalen Region und bilden formen proteinfreie Regionen (Breitbart, 2003). Bei der Akrosomreaktion sind diese Bereiche durch ihre fluiden und fusiogenen Eigenschaften prädestiniert für die Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer akrosomaler Membran. Andere Transmembranproteine des Eberspermienkopfes zeigen ein ähnliches Verteilungsmuster (Aguas and da Silva, 1989). Anschließend an diese Neuverteilung der Membranproteine, folgt ein Lokalisationswechsel von Lipiden aus der apikalen Kopfregion in das Äquatorialsegment, wodurch eine Destabilisierung der apikalen Region eintritt (Revah et al., 2000) und einen zweiphasigen Influx von Kalziumionen bewirkt. Die erste Phase hierbei wird durch den Kapazitationsprozess selbst ausgelöst, während die zweite Phase über die Aktvierung eines spannungsabhängigen Kalziumkanals reguliert wird. Die hiermit verbundene Erhöhung der interzellulären Ca 2+- Konzentration löst die Exozytose des Akrosoms bei der Akrosomreaktion aus (Fraser, 1995). Der Kapazitationsprozess kann durch Heparin stimuliert werden, wobei dieser Effekt durch heparinbindende Proteine (FnII- Proteine) auf der Spermienoberfläche vermittelt wird (Miller and Hunter, 1986, Thomas et al., 1994). Aus den vielfältigen Veränderungen während des 29

30 Literatur Kapazitationsprozesses resultiert eine hyperaktive Bewegung der Spermien, die für die Loslösung der Spermien von den Oviduktepithelzellen und dem folgenden Transport zum Ort der Befruchtung notwendig ist (Lefebvre and Suarez, 1996, Raychoudhury and Suarez, 1991) Akrosomreaktion Die Akrosomreaktion wird durch die erste Bindung der Spermatozoen an die Oozyte induziert. Hierbei werden akrosomale Enzyme aktiviert und freigesetzt, welche im weiteren Verlauf für die Penetration der Zona pellucida essentiell sind. Im Laufe der Akrosomreaktion fusioniert die äußere akrosomale Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran. Hierdurch bilden sich Kanäle im Akrosom für die Freisetzung lytischer Enzyme, die eine partielle Hydrolyse der Zona pellucida bewirken und es den Spermatozoen ermöglichen, die extrazelluläre Membran zu penetrieren. Diese Penetration ist Voraussetzung für die Fusion mit der Vitellinmembran in der Oozyte. Als zentrales Ergebnis der Akrosomreaktion ist die Exozytose des Spermienakrosoms, die durch einen massiven Einstrom extrazellulärer Kalziumionen entsteht, zu sehen (Fraser, 1995). Untersuchungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass durch die Zugabe von Bikarbonat eine interzelluläre Kalziumaufnahme erleichtert werden kann (Roldan and Harrison, 1993). Bedingt durch den intrazellulären Kalziumspiegelanstieg erhöht sich der intrazelluläre ph-wert, wodurch die Ladung an der Spermienoberfläche vermindert wird und es zu einer Destabilisierung der Plasmamembran der Spermatozoen kommt. Die gesamte Akrosomreaktion versteht sich als ein exozytotischer Prozess, bei dem die außen vorliegende akrosomale Membran des Spermiums mit der darüber liegenden Plasmamebran fusioniert, wobei durch die Bildung unzähliger Pseudovesikel eine Durchlöcherung und somit eine Art Fenestrierung der Akrosommembran entsteht. Hierdurch können im weiteren Verlauf hydrolytische Enzyme freigesetzt werden (Breitbart, 2003). Dieser Prozess der Fusion wird durch den Kontakt des Spermiums mit dem ZP3-Glykoprotein der Zona pellucida ausgelöst. Die hierbei vorliegenden Rezeptoren sowie der Ablauf des molekularen Prozesses der Membranverschmelzung sind bis heute noch nicht komplett analysiert und verstanden (Gupta et al., 2007, Wassarman et al., 2004). Bekannt ist 30

31 Literatur bereits, dass die Akrosomreaktionen durch einen Einstrom von Kalzium ausgelöst wird. Untersuchungen der letzten Jahre gehen jedoch davon aus, dass diesem Einstrom von Kalzium ein Chloridausstrom voran geht, welcher die Membran des Spermiums depolarisiert und so den Kalziumeinstrom moduliert oder gar auslöst (Roldan et al., 1994, Shi and Roldan, 1995). Neueste Studien konnten jedoch partiell erkennen, dass die akrosomale Exozytose anscheinend eine spezielle Art der Kalzium-regulierten Exozytose ist, wobei diese durch mindestens drei vorliegende, zeitlich hinter einander geschaltete und aktivierte Arten von Kalzium-Kanälen ausgelöst wird (Florman et al., 2008, Darszon et al., 2005). Untersuchungen von Ackermann (Ackermann, 2008) sehen das Protein MUPPS als ein im frühen Prozess der akrosomalen Exozytose beteiligtes Protein an, welches in den Ablauf vor dem zweiten Ausstrom des Kalziums aus dem Akrosom involviert ist. Hierbei bildet es zusammen mit der Kalzium/Calmodulin Kinase II einen funktionellen Komplex, der die Phosphorylierung einer Signalkomponente der Signalkaskade ohne einen exogenen Reiz unterbindet. Erst eine Stimulation der Kaskade über das Zona pellucida Protein 3 (ZP3) oder ein schneller Kalziumeinstrom verschiebt die Kaskade vom MUPP1-Komplex und der Phosphorylierungspartner desphosphoryliert wodurch die Blockierung der Reaktion aufgehoben wird. Es entsteht eine akrosomale Exozytose und damit einher geht die Freisetzung der hydrolytisch wirksamen Enzyme aus dem Akrosom. Frühere Studien im humanen Bereich untersuchten des Weiteren eine durch Progesteron induzierbare Akrosomreaktion (De Jonge et al., 1993a, De Jonge et al., 1993b, Zaneveld et al., 1993, Brucker et al., 1994). Humanmedizinische Studien haben dabei festgestellt, dass die Zona pellucida eine rezeptorvermittelte Spermienbindung eingeht und somit die Akrosomreaktion auslöst (Liu et al., 1992). Als wichtigster physiologischer Vermittler der Akrosomreaktion in vivo wird auch hier das ZP3 gesehen, wobei eine zusätzliche Rolle in vivo dem Progesteron zuerkannt wird (van Duin et al., 1994, Buddhikot et al., 1999, Harrison et al., 2000). Progesteron wird im humanen weiblichen Genitaltrakt von Granulosazellen produziert und in der hierbei vorliegenden Follikelflüssigkeit mit einer Konzentration von ca. 10 μg/ml ausgewiesen (De Jonge et al., 1993a). Verschiedene Studien sehen hierbei Progesteron, nicht nur wie schon erwähnt als 31

32 Literatur Aktivator der Akrosomreaktion, sondern auch als aktive Komponente der Follikelflüssigkeit (Oehninger et al., 1994a, Oehninger et al., 1994b, Sueldo et al., 1993, Allgegeyer, 2005). 2.4 In dieser Arbeit näher betrachtete, immunologisch relevante, Gene Besonders für die Fragestellung dieser Arbeit interessante Gene sind schon im Vorfeld auf ihre modulierenden Aspekte hinsichtlich inflammatorischer Prozesse untersucht worden und werden im Anschluss gelistet CD163 Bei CD163 handelt es sich um ein 130k Da großes Transmembranprotein mit einem kda großen Anteil an N-glykosidisch gebundenen Mannose-reichen Zuckerresten. Es wurde erstmals 1993 unter dem Namen M130 beschrieben (Law et al., 1993). CD163 gehört zur Superfamilie der cysteinreichen Scavengerrezeptoren (SRCR, engl.: scavenger receptor cysteine rich), welche durch das Vorkommen einer oder auch mehrerer hochkonservierter zysteinreichen Proteindomänen charakterisiet wird. Diese Proteindomänen bestehen aus Aminosäureresten und wurden 1990 erstmals von Freemann beim Makrophagen Scavengerrezeptor Typ 1 beschrieben (Freeman et al., 1990, Resnick et al., 1994). In der extrazellulären Domäne von CD163 finden sich 9 SRCR-Domänen, die zwischen der sechsten und siebten Domäne eine 31 Aminosäurenlange Zwischensequenz beinhaltet. Die Transmembrandomäne umfasst eine Länge von 24 Aminosäuren. Die intrazelluläre Domäne liegt in einer Größe von 49 und 89 Aminosäuren vor, mit Hilfe der RT-PCR konnten hierbei vier alternativ gesplicede mrna-varianten nachgewiesen werden (Law et al., 1993). Kristiansen konnte 2001 zeigen, dass CD163 Hämoglobin/ Haptoglobin-Komplexe bindet und so deren Endozytose bewirkt (Kristiansen et al., 2001). Hierbei wird durch Hämolyse freigesetztes Hämoglobin nach Bindung an das Serumprotein Haptoglobin effektiv aus dem Blutkreislauf entfernt. Das durch Hämolyse freigesetzte Hämoglobin verfügt wegen der eisenhaltigen Häm-Gruppe über oxydative und toxische Eigenschaften. Die beschriebenen Eigenschaften von 32

33 Literatur CD163-positiven Makrophagen legen die Vermutung nahe, dass das Protein inflammatorische Vorgänge moduliert oder an ihnen beteiligt ist. Möglich ist, dass CD163 die Adhäsion von RM3/1-positiven, antiinflammatorischen Monozyten und die LPS- bzw. Zytokin-aktivierenden Endothelzellen verstärkt (Wenzel et al., 1996, Hauptmann et al., 1994). Beobachtungen, dass die Bindung monoklonaler Antikörper an CD163 auf entsprechenden Makrophagen zu einer Ca 2+ - und Inositoltriphosphatabhängigen Aktivierung der Makrophagen und der Sekretion der proinflammatorische wirkenden Zytokine IL-1ß, IL 6 und GM-CSF führt, sprechen gegen eine Beteiligung an antiinflammatorischen Prozessen (Droste et al., 1999, Van den Heuvel et al., 1999). Das freigesetzte und auch lösliche CD163 könnte als Mediator bei entzündlichen Prozessen eine Rolle spielen PPAR-alpha Bei den Peroxisomproliferator-aktivierenden Rezeptoren (PPAR s) handelt es sich um eine Familie intrazellulärer Liganden aktivierter Transkriptionsfaktoren. Zur Zeit sind 3 Subtypen PPAR-alpha, PPAR-beta (NUC-1 oder unter der Bezeichnung PPAR-delta geführt) und PPAR-gamma bekannt (Dreyer et al., 1992, Issemann and Green, 1990). Die PPAR s gehören zu der Überfamilie der Steroidhormon- Rezeptoren. Die ligandenaktivierenden PPARs bilden mit ihrem retinoid X receptor (RXR) einen heterodimeren Komplex aus (Abbildung 2) und somit einen breiteren Bindungspartner für unterschiedliche nukleäre Hormonrezeptoren wie unter anderem Schilddrüsenhormon- oder auch Vitamin D-Rezeptoren (Mangelsdorf et al., 1995). Diese sind in der Protorregion des Zielgenes lokalisiert. RXR ist in den Isoformen RXR-alpha, RXR-beta und gamma bekannt und wird durch die 9-cis-Retinionsäure aktiviert (Kliewer et al., 1992). 33

34 Literatur Abbildung 2: Der Mechanismus der Regulierung der Genexpression - Komplex PPAR / RXR (Kiec-W ilk et al, 2005.) (PPAR-Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren RXR - Retinoid X-Rezeptor-, 9-cis RA - 9-cis Retinsäure, PPRE - Peroxisom proliferator response element) Jeder der bekannten 3 Subtypen wird von einem eigenen Gen kodiert und lässt sich auch durch eine ganz unterschiedliche Gewebeverteilung charakterisieren (Auboeuf et al., 1997). PPAR-alpha wird dabei in Geweben wie Leber, Niere, Skelett- und Herzmuskulatur exprimiert (Wahli et al., 1995, Peters et al., 1997), wo es zentrale Prozesse im Lipidstoffwechsel generiert. Von PPAR-beta ist bekannt, dass es ubiquitär vorkommt, seine Funktion ist aber bislang noch nicht genau geklärt. Im Fettgewebe sowie im Interstitium lässt sich PPAR-gamma nachweisen (Mansen et al., 1996). Von PPAR-gamma ist bekannt, dass es eine wichtige Rolle in der Regulation der Adipogenese spielt. Weiterhin kontrolliert es in Adipozyten unter 34

35 Literatur anderem die Expression der Lipoproteinlipase. Die Aktivierung von PPAR-alpha in Monozyten/ Makrophagen führt zu einer Reduktion der prokoagulatorischen Aktivität. Aktiviertes PPAR-gamma inhibiert die Sekretion entzündungshemmender Zytokine und von PPAR-alpha ist bekannt, dass es bei knock-out Mäusen zu einer verlängerten Immunantwort auf Entzündungsreize führt (Devchand et al., 1999, Su et al., 1999). Bedingt durch die von den PPARs bekannten sehr zahlreichen Mechanismen kann von einer Schlüsselrolle in der Regulation von Entzündungsreaktionen ausgegangen werden. Hierbei sind heute schon eine Hemmung der Transkription von COX-2 sowie eine Hemmung und Stimulation von TNF-alpha bekannt (Kersten et al., 2000). 35

36 Material und Methoden 3 Material und Methoden Als Empfängertiere für die artifizielle Insemination wurden geschlechtsreife Jungsauen, Hybriden der Rasse Deutsches Landschwein und Pietrain, im Alter von 6 bis 9 Monaten und einem Gewicht 90 bis 130 kg ausgewählt, wie sie auch standardmäßig in der Ferkelproduktion eingesetzt werden. Um in vergleichenden Analysen Gruppengrößen von 3 empfängnisbereiten Sauen je Besamungsportion/ Untersuchungsgruppe zum selben Zeitpunkt künstlich befruchten zu können, wurde eine hormonelle Synchronisation durchgeführt. Die tierexperimentellen Arbeiten wurden in zwei Versuchsabschnitten in den Monaten September 2009 bis Januar 2010 im Institut für Nutztiergenetik des FriedrichLoeffler-Institut (FLI) in Mariensee und in den Monaten Januar bis Mai 2011 im Leibnitz Institut für Nutztierbiologie in Dummerstorf durchgeführt. In Versuchsabschnitt I wurden 49 präpuberale institutseigene Jungsauen, Hybriden der deutschen Landrasse und Pietrain, im Alter zwischen 5 und 6 Monaten hormonell stimuliert und mit sechs unterschiedlichen Besamungsdosen (Negativkontrolle ohne Besamung, PBS, Seminalplasma, PBS + Spermien, Nebenhodenschwanzsperma, Seminalplasma + Spermien ) inseminiert. Zwei Stunden später erfolgte die Schlachtung, wobei Gewebeproben für die anschließenden molekularbiologischen Untersuchungen gewonnen wurden. Die für den Versuchsabschnitt I verwendeten Tiere wurden im Institut für Nutztiergenetik, des FLI unter Standardbedingungen für diese Altersgruppe gehalten. Für die zweimalige Fütterung pro Tag stand eine institutseigene Futtermischung zur Verfügung. Wasser bekamen die Tiere ad libitum. Alle tierexperimentellen Arbeiten wurden durch den Tierschutzdienst des Niedersächsischen Landesamts für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt, überwacht und in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz 2002 durchgeführt. Für den Versuchsabschnitt II wurden 72 hormonell stimulierte zyklische Jungsauen, der deutschen Landrasse im Alter von 8 und 9 Monaten mit drei unterschiedlichen Inseminationsdosen (Negativkontrolle ohne Besamung, PBS, Seminalplasma + Spermien) besamt und zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten (15 Minuten, 2 36

37 Material und Methoden Stunden, 6 Stunden und zum Zeitpunkt der Ovulation) chirurgisch zur Probengewinnung, der Reproduktionstrakt entfernt. Diese Tiere verblieben im Anschluss an den Versuchstag im Institut in Dummerstorf. Die für diesen Versuchsabschnitt verwendeten Tiere wurden unter den dortigen Standardbedingungen gehalten. Alle tierexperimentellen Arbeiten für den Versuchsabschnitt II wurden durch den Tierschutzdienst des Landesamts für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V) genehmigt, überwacht und in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz 2002 durchgeführt. 3.1 Synchronisation der Versuchstiere Für die Superovulation in Versuchsabschnitt I erhielten die Sauen 1200 Internationale Einheiten (I.E.) PMSG (Firma Biomol GmbH, Hamburg Deutschland), intramuskulär (i.m.). 72 Stunden später wurde die Ovulation durch Gabe von 500 I.E. Ovogest (Firma Intervet, Unterschleißheim, Deutschland) i.m. ausgelöst. 24 Stunden danach wurden die Sauen einmalig durch künstliche Besamung belegt. Die in Versuchsabschnitt II benötigte Superovulation wurde erzielt, indem die Sauen 850 I.E: ecg (Pregmagon, Firma ReboPharm, Bocholt, Deutschland) i.m. erhielten. 80 Stunden später wurde durch 50 μg GnRH (Gonavet, Firma Vexy-Pharma GmbH, Schwarzenborn, Deutschland) die Ovulation ausgelöst und die Sauen einmalig, wiederum durch künstliche Besamung, belegt. Die Auslösung des Duldungseffektes erfolgte in beiden Versuchsabschnitten mittels Stütz- und Reitprobe vor der Besamung. 3.2 Gewinnung der verwendeten Ejakulate Gewinnung von Frischsperma Für die zwei Versuchsabschnitte wurden Ejakulate klinisch gesunder, institutseigener Eber mit geprüfter Fertilität verwendet. Alle Eber wurden während der gesamten Zeit der Versuchsabschnitte I und II regelmäßig abgesamt, wodurch eine weitgehend gleichbleibende Spermienqualität gewährleistet werden konnte. Die Tiere wurden jeweils am Morgen des Versuchstages mit Hilfe eines Phantoms durch die 37

38 Material und Methoden Handmethode abgesamt. Die spermienarme und spermienreiche Fraktion des Ejakulates wurde dabei getrennt in zwei Isoliergefäßen mit innenliegendem Plastikbeutel (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) aufgefangen. Durch olfaktorische Kontrolle wurde eine Urinkontamination des Ejakulates ausgeschlossen. Die spermienreiche Fraktion des Ejakulates wurde nach Gewinnung mit auf 36 C vorgewärmter 1 x PBS-Lösung (PBS-Gebrauchslösung) verdünnt. Im Anschluss an die Gewinnung des Ejakulates wurden die Isoliergefäße in einer Styroportransportkiste verpackt und zur weiteren Verwendung in das Labor transportiert Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma Zur Gewinnung von Nebenhodenschwanzsperma wurde ein institutseigener Eber getötet und die Hoden freipräpariert. Die Nebenhoden wurden abgesetzt und im Labor der Kanal des Nebenhodenschwanzes mit auf 37 C vorgewärmter 1 x PBS- Lösung gespült. Die ausgespülten Spermien wurden 10 Minuten bei 37 C zur Aktivierung des Stoffwechsels kultiviert. Ein Aliquot der Probe wurde hinsichtlich Motilität, Dichte und Anteil morphologischer Abweichungen bestimmt. 3.3 Spermauntersuchung- und Aufbereitung Jedes Ejakulat wurde hinsichtlich Volumen, Farbe, Konsistenz, Geruch, Motilität und Dichte der Spermien sowie Anteil der morphologisch abweichenden Spermatozoen untersucht. Eine erste Einschätzung der Motilität der Spermien wurde durch subjektive Schätzung im Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (+38 C) bei 160- facher Vergrößerung durchgeführt. Die Dichtebestimmung des Ejakulates wurde mit Hilfe der Zählkammer Thoma-neu im Doppelansatz durchgeführt Computerassistierte Spermaanalyse (CASA) Die Messung der Motilität wurde als Doppelmessung mit dem computerassistierten Sperma Analysesystem (CASA; IVOS Version 12; Hamilton Thorne Biosciences, Beverly, USA) durchgeführt. Es wurden 10 µl Probe in eine Makler-Kammer (SEFI Medical Instruments, Haifa, Israel) pipettiert. Auf insgesamt 10 Feldern wurden 38

39 Material und Methoden zwischen 400 und 800 Zellen pro Messung ausgewertet, wobei pro Feld innerhalb einer Sekunde 60 Bilder erzeugt wurden. Proben mit einer zu hohen Spermiendichte wurden unmittelbar vor der Messung mit 1 x PBS Lösung auf maximal 10 x 10 6 Spermien/ml eingestellt. Um keine Beeinträchtigungen der Spermienqualität durch Temperaturschwankungen hervorzurufen, wurde die 1 x PBS-Lösung zuvor auf 37 C angewärmt. Die Temperatur des beheizbaren Probentisches wurde für die Messungen auf 37 C eingestellt. Folgende Parameter wurden zur Beurteilung der Spermienbewegungen ausgewertet: Gesamtmotilität (Motility): Prozentuales Verhältnis der beweglichen Spermien zur Gesamtzahl aller erkannten Spermien Vorwärtsbeweglichleit (Progessive Motility): Prozentuales Verhältnis der vorwärtsbeweglichen Spermien zur Gesamtzahl aller erkannten Spermien Abstandsgeschwindigkeit (VSL): Geschwindigkeit bezogen auf die kürzeste Distanz zwischen dem Anfangs- und dem Endpunkt der gemessenen Wegstrecke (µm/sek.) Kurvolineare Geschwindigkeit (VCL): Geschwindigkeit bezogen auf die wirklich zurückgelegte Wegstrecke zwischen dem Anfangs- und dem Endpunkt der beobachteten Bewegung (µm/sek.) Durchschnittsgeschwindigkeit (VAP), mittlere Geschwindigkeit bezogen auf die wirklich zurückgelegte Wegstrecke zwischen dem Anfangs- und dem Endpunkt der beobachteten Bewegung (µm/sek.) Seitliche Auslenkung der Spermienköpfe (ALH in µm) Frequenz der Pendelbewegung des erfassten Spermiums (BCF, Hz) Gradlinigkeit (STR%) Durchschnittsgeschwindigkeit bezogen auf die kürzeste Abstandsbahn (STR=VSL/VAP x 100 in %) Linearität (LIN%) Durchschnittsgeschwindigkeit bezogen auf die wirklich zurückgelegte Strecke (LIN=VSL/VCL x 100 in %). (Mönch-Tegeder, 2011) 39

40 Material und Methoden Morphologische, spermatologische Untersuchung der Besamungsportion Die Ermittlung des jeweiligen Anteils an Samenzellen die abweichende Formen aufwiesen, erfolgte durch die Auszählung von 100 Spermien bei 1000-facher Vergrößerung und Ölimmersions unter dem Phasenkontrastmikroskop. Von einem Aliquot der zu verwendenden Besamungsportion wurden jeweils 3 Tropfen auf einen Objektträger gegeben, mit Deckgläsern (18 x 18 mm) eingedeckelt und im Anschluss nach den von Krause beschriebenen und für Ebersperma angepassten Bewertungsschemata untersucht (Krause, 1965) Erstellung der Besamungsportionen Im Anschluss an die Bestimmung der Dichte und Motilität der Spermien wurden diese jeweils mit 1 x PBS-Lösung gewaschen. Für den Waschvorgang wurde das Ejakulat in 50 ml Röhrchen überführt, für 10 Minuten bei x g zentrifugiert und anschließend der gewonnene Überstand abgenommen. Danach wurden die Spermien in 1 x PBS-Lösung resuspendiert und mit 1 x PBS-Lösung wiederum auf 50 ml aufgefüllt. Die Waschung mit anschließender Zentrifugation wurde zwei Mal wiederholt. Für die Versuche wurden unterschiedliche Besamungsportionen mit einem Gesamtvolumen von 80 ml hergestellt (Tabelle 2 und 3). Tabelle 2: Besamungsportionen für den Versuchsabschnitt I Besamungsportion Spermienanzahl Gesamtvolumen in PBS 0 80 ml PBS Seminalplasma / SP 0 80 ml Seminalplasma Spermien in PBS / PBSSP 3 x 10 9 Spermien Ad 80 ml PBS Nebenhodenschwanzsperma 3 x 10 9 Spermien Ad 80 ml PBS / NHS Spermien in Seminalplasma 3 x 10 9 Spermien Ad 80 ml Seminalplasma / SPSp Negativkontrolle / NC 0 Keine Besamung 40

41 Material und Methoden Tabelle 3: Besamungsportionen für den Versuchsabschnitt II Besamungsportion Spermienanzahl Gesamtvolumen in PBS 0 80 ml PBS Spermien in Seminalplasma 3 x 10 9 Spermien Ad 80 ml Seminalplasma / SPSp Negativkontrolle / NC 0 Keine Besamung 3.4 Probengewinnung Zur Gewinnung der Gewebeproben wurden die Tiere in Versuchsabschnitt I 2 Stunden nach der Besamung im institutseigenen Schlachthaus betäubt und geschlachtet. Der Genitaltrakt wurde sofort entnommen und die Ovarien auf ihre Funktionskörper überprüft (Follikel, Gelbkörper und eventuelle Zysten). Eines der Uterushörner wurde mit 20 ml 1 x PBS-Lösung befüllt, mehrfach geschwenkt und die Spüllösung für weitere Untersuchungen aufgefangen. Das Uterushorn wurde dann in 4 gleich große Abschnitte eingeteilt. Von jedem dieser Abschnitte wurde eine Gewebeprobe des noch ringförmig verschlossenen Uterus gewonnen und für in Anschluss anzufertigenden Gewebeschnitte mit Tissue Tek (Firma Hartenstein Laborbedarf, Würzburg) konserviert. Die 4 Uterusabschnitte wurden zur Gewinnung der Gewebeproben sagittal geöffnet und das Epithelgewebe mit einer Schere sorgfältig entfernt. Hierbei wurde darauf geachtet, keine tieferen Gewebeschichten mit zu entfernen. Zur Kontrolle wurde in Vorversuchen diese Art der Präparation mittels mikroskopischer Darstellung überprüft. Die gewonnenen Proben wurden in 1 ml Kryoröhrchen erst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und später bei -80 C gelagert. Für den Versuchsabschnitt II wurden im Abstand von 15 Minuten, 2 Stunden, 6 Stunden nach Besamung und zum Zeitpunkt der Ovulation die entsprechenden Tiere narkotisiert und der Genitaltrakt operativ entfernt. Der weitere Versuchsablauf entsprach dem Versuchsabschnitt I. 41

42 Material und Methoden a) b) c) d) e) f) Abbildung 3: Uteruspräparation: a) Uterushorn links, beginnend unten mit Cervixbereich A; b) Uterusabschnitt; c) Öffnung des Uterusabschnittes; d) Uterusabschnitt geöffnet; e) Entnahme uterines Epithelzellgewebe aus dem Uterusabschnitt für die RNA - Präparation; f) Uterusabschnitte A (Cervixbereich) D (Nähe utero-tubale Verbindung) für histologische Schnittpräparate 42

43 Material und Methoden Die präparierten Schichtbereiche des Uterusgewebes sind in Abbildung 4 dargestellt. Endometrium: Frühe Proliferationsphase 1. Endometrium mit Stratum functionale endometrii 2. Myometrium mit Stratum basale endometrii Abbildung 4: Schematische Darstellung des Endometriums (Quelle: SID=1b20a44233dd119f7455d3e946ca6638#), farblich markiert wurde hierbei die für die Versuchsabschnitte entnommene Gewebeschicht. 3.5 RNA-Präparation Die Isolierung der Gesamt-RNA aus uterinem Epithelzellgewebe wurde mit dem Standard- TRI Reagent - Solution für RNA/DNA/Protein Isolation Reagent von Applied Biosystems (Darmstadt) nach Herstellerangaben durchgeführt Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren (Nanodrop) Die Basen in den Nukleinsäuren absorbieren durch ihre Spektralcharakteristika bei einer Wellenlänge von 260 nm Licht einer entsprechenden Wellenlänge zwischen nm. Hieraus lässt sich mittels einer photometrischen Messung bei 280 nm der Gehalt an Tyrosin- und Tryptophanresten bestimmen, wodurch Informationen über die Verunreinigung der RNA durch Proteine erhoben werden können. Eine optische Dichte (OD) bei 260 nm entspricht hierbei einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die Reinheit der Nukleinsäurelösung ergibt sich nachfolgend aus dem 43

44 Material und Methoden Quotienten der gemessenen Absorptionskoeffizienten bei 260 nm und 280 nm. Eine sehr reine RNA-Lösung liegt bei einem Quotienten von 1,9 und 2, RNA Bioanalyser Untersuchung Die Qualität der gewonnen RNA-Proben wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) entsprechend der Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Hierbei wurde das Verhältnis der ribosomalen Untereinheiten der 28S und 18S-rRNA, sowie evtl. auch enthaltener degradierter Abbauprodukte der RNA in ein Verhältnis gesetzt und mittels der Agilent 2100 Expert-Software in einem RIN-Wert auf der Skala von 1 bis 10 ermittelt. Ein Wert von 1 entspricht dabei einer vollständig degradierten RNA und ein Wert von 10 einer völlig intakten RNA (Abbildung 5). Die Darstellung der einzelnen RIN-Werte erfolgte mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer elektronisch entsprechend einem Gelelektrophoresebild. Für die weitere Mikroarray-Chip-Analyse wurden nur Proben verwendet, die einen RIN-Wert von mindestens 7 oder besser hatten. Marker 28S-rRNA 18S-rRNA RNA-Proben Abbildung 5: Darstellung einzelner RNA-Proben aus dem Versuchsabschnitt I auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer 44

45 Material und Methoden 3.6 Reverse Transkription Bei der reversen Transkription (RT) handelt es sich um eine Umschreibung der mrna in einen komplementären DNA-Strang (copydna oder cdna). Um hierbei Verunreinigungen mit genomischer DNA zu vermeiden, die die Ergebnisse weiterführender Analysen verfälschen, wurde ein DNAse-Verdau der DNA vor der RT-Reaktion durchgeführt. Für diesen DNAse-Verdau wurden 2 μg Gesamt-RNA, 2 µl DNAse (1 unit/µl von Biozym,) und H 2 0 bidest in 0,2 ml Zentrifugenröhrchen (Biozym, PCR Softtubes, Oldendorf) auf ein Gesamtvolumen von 20 µl gebracht. Der DNAse-Verdau wurde im PCR-Cycler (PTC-200 Thermocycler MJ Research, Watertown, USA) für 30 Minuten bei 37 C durchgeführt. Nach Inaktivierung der DNAse bei 80 C für 10 min wurde die gereinigte RNA entweder direkt weiter verwendet oder bei -80 C gelagert. Die RT erfolgte in einem Volumen von 20 µl bei 25 C für 10 Minuten, gefolgt von einer Stunde bei 42 C und einer nachgeschalteten Denaturierung bei 95 C für 5 Minuten. Hieran schloss sich eine Kühlung der Proben auf 4 C an und bis zur weiteren Verarbeitung in der Real-Time-PCR eine Lagerung auf Eis. Tabelle 4: Mengenkomponenten der einzelnen Reaktionslösungen für die Reverse Transkriptase PCR Komponente Probe Negative-Kontrolle MgCl 2 (50mM) 2,0 µl 2,0 µl 10xPCR-Puffer 2,0 µl 2,0 µl ddntp s (10mM) 2,0 µl 2,0 µl Hexamer/Oligo d(t) (50µM) 1,0 µl 1,0 µl RNAse-Inhibitor (20 Units/µl) 1,0 µl - Reverse Transkriptase (50 units/µl) 1,0 µl - RNA 2 µg 2 µg H2O ad 20,0 µl ad 20,0 µl 45

46 Material und Methoden 3.7 Semiquantitative Real-Time-PCR Bei der semiquantitativen Real-Time-PCR wird das PCR-Produkt in Echtzeit verfolgt. Die Sichtbarmachung der PCR-Produkte erfolgt dabei nicht am Ende der Reaktion durch eine Gelelektrophorese, sondern am Ende der Zyklen mittels gemessener Fluoreszenzintensität eines interkalierenden Farbstoffes, der in die doppelsträngige DNA eingebaut wird. Der Einbau des verwendeten Farbstoffes SYBR Green (Firma Ivitrogen, Life Technologies GmbH, Darmstad, Deutschland) ist unspezifisch und die Detektionsmethode beruht auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des gemessenen Amplifikationsproduktes ist. Gemessen wird in einem Temperaturbereich direkt unterhalb der Schmelztemperatur der Amplifikate, wodurch erreicht wird, dass nur das angestrebte Produkt doppelsträngig vorliegt und Fluoreszenzsignale abgibt. Mit der gemessenen Schmelzkurve kann die Messtemperatur der PCR optimiert werden. Treten evtl. Nebenpeaks auf, welche durch Primerdimer auftreten können, so muss die Messtemperatur der qpcr höher gewählt werden. SYBR Green, als interkalierender Farbstoff, fluoresziert nach Anregung durch Licht einer Wellenlänge von 497 nm im Bereich von 520 nm. Bei einem nicht eingebundenen Farbstoff ist die Emission sehr gering. Erst wenn sich der Farbstoff in die Windungen der doppelsträngigen DNA einlagert, wird die Emission des Lichtes verstärkt. Bei einer hohen Ausgangsmenge an Matrizen-DNA, sind weniger PCR-Zyklen notwendig, um das Fluoreszenzsignal höher als den Fluoreszenzhintergrund entstehen zu lassen. Der Punkt, an dem das Signal höher als der Hintergrund erscheint, wird Threshold-Cycle (C t -Wert) genannt. Er befindet sich immer in der exponentiellen Phase der Amplifikation. Eine Standard-Kurve ermöglicht es, mit Hilfe des C t -Wertes der gemessenen Probe die Konzentration der darin befindlichen, spezifischen mrna zu bestimmen. 46

47 Material und Methoden Tabelle 5: Mastermix für Real-Time-PCR Ansatz Zu untersuchende Probe cdna-probe 2 μl Primer forward 100 ng/µl 0,6 µl Primer reverse 100 ng/µl 0,6 µl 2 x Power Sybr Green Applied Biosystems 10 µl Master Mix enthält: Hot Start Taq Polymerase dntp s Sybr Green Farbstoff Rox Farbstoff RNAse DNAse freies H 2 O ad 20 μl Der Mastermix für die Real-Time-PCR wurde angesetzt und 20 µl pro Well auf einer 96 Well Platte aufgetragen. Die Proben wurden im Doppelansatz untersucht. 2 µl der zu untersuchenden cdna wurde pro Well in den Mastermix zugegeben, wodurch sich ein Endvolumen von 20 µl je Well ergab. Die Real-Time-PCR wurde auf dem ABI 7500 fast Gerät (Applied Biosystems; Darmstadt, Deutschland) im Standardprogramm mit adaptierter Primertemperatur durchgeführt: Aktivierung der Taq-Polymerase bei 95 C für 10 Minuten, 40 Zyklen bei 95 C für 15 Sekunden zur Denaturierung der Proben und 60 Sekunden mit der für den gewählten Primer spezifischen Temperatur zur Anlagerung und Verlängerung der Primer mit Messung des Fluoreszenzsignales. 3.8 Primerdesign Das Design, der für die Real-Time-PCR verwendeten Primer, erfolgte mittels NCBI Datenbank und dem hierbei verfügbaren Tool Pick Primer. Hierbei wurde eine durchschnittliche Länge der Primer von bei bp, eine Schmelztemperatur (T M ) im optimalen Bereich zwischen 52 und 58 C und ein G/C-Gehalt von 50-60% angestrebt. Die Hybridisierung der Primer untereinander (cross dimer und self dimer) 47

48 Material und Methoden war möglichst gering zu halten. Die verwendeten Primer wurden bei der Firma Eurofins (Münster, Deutschland) bezogen und sind in Tabelle 6 aufgeführt. Tabelle 6: Verwendete Real-Time-PCR Primer für die einzelnen Real-Time-PCR Validierungen Gen Primersequenz PPAR-alpha COX-2 BSP NMSR2 CD163 TGF-Beta2 CXCL14 GPNMB For: GGA GAA CCA TTC GGC TAA Rev: TTC AGA CCT TGG CAT GCG C For: ACC CGC CTC ACA CTC CTG AAC A Rev: TCC CGC AGC CAG ATT GTG GC For. TCA AGG GAA GAA AAC CGA GAC Rev: AGG AGA TGC AGG GAA AGG AC For: ATC CAG GTC ACC TCC TTC CT Rev: CTG CCT CAA GGT GTT GGT CT For. GGC TGG TGA ATG GAG GAA ACC G Rev: TCA CAC ACT GTT CCC CAC CGT C For: TGC GCA AGA GGA TCG AGG CGA Rev: TCC TCG GGT TCG GGG TAG TCT For: TCA TCA CCA CCA GGA GCA TGT C Rev: GCT TCT CAT TCC AGG CGT TGT For: CTG ATG ACT CCC TGG TGG AT Rev: CAT GCC GAT AGG TCC TGT T 3.9 Gelelektrophorese Zur Kontrolle der sich bildenden Produkte aus der Real-Time-PCR wurden im Anschluss an die ersten Durchläufe die als positiv detektierten Proben in der Gelelektrophorese hinsichtlich ihrer Produktgröße kontrolliert. Nukleinsäuren enthalten genau wie z. B. Proteine und weitere molekularbiologisch interessante Moleküle geladene oder ionisierbare Gruppen. Diese Ladung ermöglicht 48

49 Material und Methoden es, diese Moleküle in einem elektrischen Feld gerichtet zu bewegen. Die Wahl der gebildeten Substanzen und ihre physikalische Eigenschaften bilden hierbei ein Gitter, wodurch sich die einzelnen Moleküle ihrer Größe entsprechend bei gleicher Ladung unterschiedlich schnell in diesem elektrischen Feld bewegen. Nukleinsäuren sind durch ihr Zucker-Phosphat-Rückgrat bei allen ph-werten negativ geladen. Dies bildet die Grundlage der verschiedenen Methoden der Gelelektrophorese. RNA- und DNA-Fragmente wandern in einem angelegten elektrischen Feld stets von der Kathode zur Anode. Hierbei wandern sie umso langsamer, je länger bzw. größer sie sind. Die im Gel aufgetrennten Nukleinsäuren lassen sich durch Ethidiumbromidfärbungen visualisieren. Ethidiumbromid (EtBr) interkaliert mit doppelsträngigen Nukleinsäure-Molekülen und fluoresziert rot-orange nach Anregung mit UV-Licht im Wellenbereich zwischen 254 und 300 nm. Mit Hilfe der horizontalen Agarose-Gelelektrophorese ist es möglich, verschiedene Ergebnisse von RNA- und DNA-Modifikationen zu überprüfen. Die elektrophoretische Auftrennung zur Kontrolle der ermittelten Real-Time-PCR Produkte erfolgte in 2,0%igen horizontalen Agarosegelen versetzt mit Ethidiumbromid (0,3 µg/ml) nach der Standardmethode (Sambrook et al., 1989). Die Agarose wurde hierbei durch Aufkochen in der Mikrowelle in 1 x TBE gelöst und nach Abkühlen auf ca. 60 C mit EtBr (Endkonzentration von 0,3 µg /ml) versetzt. Die Agaroseflüssigkeit wurde in einem abgedichteten Gelschlitten mit eingesetztem Probenkamm gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wurde der Kamm entfernt und die Gelkammer soweit mit 1 x TBE-Puffer gefüllt, bis das Gel bedeckt war. Die zu analysierenden Proben wurden mit 10 x Ladepuffer (Endkonzentration 1 x) versetzt und 25 µl in jede einzelne Geltasche pipettiert. Eine Auftrennung der Proben erfolgte mit einer konstanten Spannung von 80 V für etwa 45 Minuten. Die Agarose-Gele wurden mit einem gekühlten 16-Bit-CCD-Kamera-System der Firma Vilber-Lourmat (Eberhardzell, Deutschland) fotografiert und im tif-format gespeichert. Um die Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente abschätzen zu können, wurde bei der Elektrophorese ein DNA-Größenstandard (100 bp, High Molecular Weight, HMW-Marker, Firma Invitrogen) mit aufgetragen. 49

50 Material und Methoden 3.10 Mikroarray und Chipdesign Eine Modulation der Immunantwort des Uterusgewebes durch biochemisch unterschiedlich zusammengesetzte Besamungsportionen sollte durch Veränderungen der Transkription von pro- und antiinflammatorischen Genen gekennzeichnet sein. Daher wurden RNA-Mikroarrays durchgeführt, um regulierte Gene nach künstlicher Befruchtung zu identifizieren, die als potenzielle Modulatoren die Immunantwort des Uterus beeinflussen. Der verwendete Mikroarray wurde in Kooperation mit der Firma febit GmbH in Heidelberg durchgeführt. Hierbei wurden genspezifische Sonden für Sus scrofa aus Gensequenzen der USDA und NCBI Datenbank erstellt. Die Auswahl der zu untersuchenden Gene erfolgte hierbei durch die Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Es wurden hierbei bis zu 6 unterschiedliche, spezifische Sonden je Gen erstellt. Der für den Array verwendete Biochip wurde von der Firma febit GmbH in Eigenproduktion erstellt. Die verwendeten RNA Proben wurden zur Kontrolle der Qualität und Quantität mittels Agilent 2100 Bioanalyzer und mit dem hierfür entwickelten RNA 6000 Nano Kit der Firma Agilent (Waldbronn, Deutschland) kontrolliert. Die statistische Auswertung der Mikroarraydaten erfolgte sowohl mittels firmeneigener Datenanalyse der Firma febit GmbH, Heidelberg, als auch im Institut für Nutztiergenetik durch die Software R ( Gewinnung von Uterusspülflüssigkeit Zur Messung des durch die unterschiedlichen Besamungsportionen induzierten Einwanderung von zellulären Immunzellen und der Zählung von im freien Lumen verbliebenden Spermien wurde der Uterus vor der Gewinnung der Gewebeproben mit 20 ml 1 x PBS-Lösung gespült und die in der Spülflüssigkeit enthaltenen Zellen und Spermien gezählt. Nach Entfernung des gesamten Reproduktionstraktes ex vivo wurde dieser in Höhe der Cervix und jeweils an der utero-tubalen Verbindungen mit einer Klemme verschlossen. Es folgte das Reinigen des Uterus von außen mit 1 x PBS bis kein anhaftendes Blut mehr erkennbar war. Anschließend wurden 20 ml 1 x PBS-Lösung mit einer Spritze und aufgesetzter Knopfkanüle in eines der zwei 50

51 Material und Methoden Uterushörner eingebracht. Hiernach wurde das Uterushorn an der Cervix abgesetzt und der Uterus für ca. 1 Minute geschwenkt, eine der Klemmen geöffnet und die eingebrachte PBS-Menge in einem steriles Becherglas aufgefangen. Das Volumen der Spülflüssigkeit wurde gemessen und sofort auf 0 C abgekühlt, um die Vermehrung evtl. vorhandener Bakterien zu minimieren Bestimmung der Anzahl von Spermien und Immunzellen in der Uterusspülflüssigkeit Die Uterusspüllösungen wurden im ersten Screening auf Leukozyten und Spermien untersucht. Die Anzahl dieser Zellen in der Spüllösung wurde mittels Thoma Zählkammer (Firma Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) unter dem Phasenkontrastmikroskop im Hellfeld bei einer Vergrößerung von 50 ausgezählt (Mikroskop Zeiss, Auszählung von 4 Gruppenquadraten, Objektiv 5, Okular 10) und die Konzentration der Zellen pro Milliliter Spülflüssigkeit ermittelt. Im weiteren Differenzierungsprozess wurden polymorphkernige Granulozyten (PMN) und mononukleäre Zellen (MNC) differenziert. Dies geschah mit Hilfe der Pappenheimfärbung. Luftgetrocknete Ausstrichpräparate der Spüllösungen wurden hierbei 10 Minuten in eiskaltem Methanol fixiert. Im Anschluss erfolgte die alkoholische Färbung der Präparate mit May-Grünwaldlösung (Firma Merck, Darmstadt, Deutschland). An das Abtropfen der überschüssigen Lösung schloss sich das Auftragen von Giemsa Gebrauchslösung (Firma Merck, Darmstadt, Deutschland) für weitere 20 Minuten zur wässrigen Färbung an. Hiernach erfolgte das Abspülen und Abstoppen / Differenzieren der Färbung mit Aqua bidest. Die so angefärbten Präparate der Spüllösungen wurden nach Lufttrocknung unter dem Phasenkontrastmikroskop mittels ihrer unterschiedlichen Granula differenziert. (Zeiss Mikroskop, Hellfeld, 1000 Vergrößerung mit Immersionsöl). Hierbei wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und die dabei vorliegende Verteilung der einzelnen Populationen wurden prozentual angegeben. 51

52 Material und Methoden 3.13 Probenentnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur Färbung Das für die Entnahme der Uterusepithelzellproben ausgewählte Uterushorn wurde im Anschluss in vier annähernd gleich große Abschnitte unterteilt. Hierbei wurde der Abschnitt nahe der Cervix mit A und der im Bereich der utero-tubalen Verbindung mit D bezeichnet. Aus jedem dieser Abschnitte wurde eine Probe mit der Stärke von 1cm entnommen und mit Tissue-Tek (Firma Hartenstein, Würzburg, Deutschland) eingebettet. Hierzu wurden die Proben in einem mit Aluminiumfolie ausgekleidetem Ring aus Kunststoff mit der Höhe von 1,3 cm auf Trockeneis durchgefroren. Im Anschluss wurde die Aluminiumfolie entfernt und das Probenstück in eine Form aus Aluminiumfolie mit dem Durchmesser von 1,2cm auf Trockeneis gesetzt. Das bei Raumtemperatur flüssige Tissue-Tek wurde nun vollständig um das Probenstück aufgetragen, so dass ein Austrocknen und Schädigen der Gewebeprobe verhindert wurde. Die Aufbewahrung der so eingebetteten Gewebeprobe erfolgte bei -20 C. Die Proben wurden mit einer Schnittdicke von 10 µm auf Super-Frost Objektträger (Firma Mercateo, Köthen, Deutschland) gezogen und im Anschluss 2 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet Immunhistologische Nachweise an Kryostatschnitten Mit dem ZytoChem-Plus HRP Polymer Kit der Firma ZYTOMED (Berlin, Deutschland) wurden die verschiedenen Gewebeproben qualitativ auf die Antigene von CD163 und PPAR-alpha hin untersucht. Endogene Peroxidasen im Gewebe können zu unerwünschten Hintergrundfärbungen führen. Um diese zu inaktivieren, wurden die Gewebeproben mit 3 %iger H 2 O 2 -Lösung 10 Minuten inkubiert (Peroxid- Block). Die H 2 O 2 -Lösung wurde durch einmaliges Waschen mit Waschpuffer für 2 Minuten neutralisiert und von den Proben abgenommen. Unspezifische Bindungen des eingesetzten Primär- oder Sekundärantikörpers im HRP-Polymer des verwendeten ZytoChem-Plus HRP Polymer Kit wurden durch die Inkubation mit einer Blocking-Solution des HRP Polymer Kits für abweichende 10 Minuten weitestgehend minimiert. Das weitere Vorgehen der Färbung erfolgte laut Protokoll der Firma ZYTOMED. 52

53 Material und Methoden Die für die immunhistologische Färbung verwendeten Antikörper wurden bei der Firma Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH (Eching, Deutschland) bezogen Histologische Färbungen und bakteriologische Untersuchungen der Uteri Um eine Modulation der Immunantwort durch eine eventuell vorhandene Infektion ausschließen zu können, wurde durch eine Abklatschprobe des nicht zur RNA- Gewinnung verwendeten Uterushorns eine Gram-Färbung zur Einfärbung von Zellwänden von Bakterien durchgeführt. Gram-positive Bakterien erscheinen nach dem Anfärben blau, da sie eine der Zellmembran aufgelagerte dicke, mehrschichtige Mureinhülle besitzen, in der sich der Farbstoff einlagert. Für die Färbung wurden die Abklatschpräparate auf den Objektträgern hitzefixiert, in dem sie 3 x kurz durch die Flamme eines Bunsenbrenners gezogen wurden. Anschließend erfolgte die Färbung mit Kristallviolettlösung für 1 Minute, Spülen der Objektträger mit Aqua bidest und Einbringen der Objektträger für 1 Minute in Lugolscher Lösung (Firma Carl Roth, Darmstadt, Deutschland). Hieran schloss sich ein erneutes Abspülen mit Aqua bidest sowie ein schnelles tropfenweises Auswaschen mit 96 % Ethanol an. Das aufgebrachte Ethanol wurde in einem letzten Waschgang mit Aqua bidest wiederum entfernt, und es erfolgte die Gegenfärbung für 20 Sekunden in Safarinlösung. Nach Abspülen der Safarinlösung mit Aqua bidest und Trocknung erfolgte die Hellfeldmikroskopie der Präparate (Zeiss Mikroskop, Vergrößerung 50-fach, Hellfeld) Western-Blotting-Analyse Bei der Western-Blotting-Analyse handelt es sich um ein Verfahren zum Proteinnachweis mit Hilfe von markierten Antikörpern. Nach Auftrennung der aufgebrachten Proteine durch eine Elektrophorese werden sie durch Blotten auf eine Nitrozellulosefolie übertragen und im Anschluss mit dem jeweiligen Antikörper detektiert. Zur Gewinnung der Proteine wurden Gewebeproben aus dem Uterusepithel, der Uterusmuskulatur und der Leber frisch geschlachteter Sauen im 53

54 Material und Methoden Institut gewonnen. Dieses Gewebe wurde im Anschluss in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Für Proteinextraktion wurden die Proben im Verhältnis 1:10 mit Lysis- Ripa-Puffer homogenisiert. Das so gewonnene Gewebelysat wurde 20 Minuten auf Eis inkubiert, der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und 15 Minuten bei 6 C und 1400 rpm zentrifugiert. Der hierdurch gewonnene Überstand wurde in kleine Aliquots für die weitere Verwendung im Western-Blot für 5 Minuten bei 95 C denaturiert. Die Messung der Proteinkonzentration im Lysat erfolgte mittels Bradford- Assay am Nanodrop. Für die Elektrophorese (SDS-Page) wurde ein 12,5%-iges Polyacrylamid-Trenngel gegossen und mit Butanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde das zur Überschichtung genutzte Butanol abgegossen und ein Sammelgel über das Trenngel gegossen. Je 30 μg Protein der zu untersuchenden Probe wurden zusammen mit dem Ladepuffer auf ein Volumen von 20 μl aufgefüllt und auf das Polyacrylamidgel aufgetragen. Das in dem Puffer enthaltene SDS denaturierte und entfaltete die dreidimensionalen Proteinstrukturen zu ungefalteten Aminosäureketten, so dass eine Auftrennung nach Molekulargewicht möglich war. Die SDS-Page Auftrennung der Proteine erfolgte bei 200 Volt in SDS-Laufpuffer. Die Elektrophorese wurde nach ca. 45 Minuten beendet, wenn die Lauffront am Gelende angekommen war. Die durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden in einer Semidry-Blot-Apparatur auf eine Nylonmembran (Nylon Membrane, positively charged, Nr , Firma Roche, Mannheim, Deutschland) transferiert. Der Proteintransfer wurde mit Transferpuffer bei Raumtemperatur bei 30 Volt und 300 ma in 25-30min durchgeführt. Anschließend wurde die Membran einmalig für 2 Minuten in Waschpuffer (1 x PBS + 0,05% Tween) gewaschen und danach für 60 Minuten in Blocking-Solution bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (offener Tisch-Plattformschüttler, Firma Eppendorf, Hamburg) inkubiert, um die Membran zu blockieren. Es folgte die Inkubation mit dem monoklonalen Primärantikörper in Blocking Solution im Verhältnis 1:400 bei 4 C über Nacht auf dem Schüttler. Nach dieser Inkubation wurde die Membran dreimal in Waschpuffer gewaschen, um nicht gebundene Primärantikörper zu entfernen und anschließend mit dem sekundären Mouse-anti-Rabbit-HRP-Antikörper (Firma ZYTOMED, Berlin, Deutschland) im Verhältnis 1:1000 in Blocking-Solution 1 54

55 Material und Methoden Stunde bei Raumtemperatur wiederum auf dem Schüttler inkubiert. Es folgten 3 Waschschritte mit dem Waschpuffer für jeweils 10 Minuten. Die Detektion des Sekundärantikörpers erfolgte mittels Detektionslösung gemäß den Angaben des Herstellers (Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus, Perkin Elmer, Waltham, USA). Die Dauer wurde in Abhängigkeit von der Signalstärke variiert. Zur Dokumentation wurden die Gele fotografiert (16-Bit-CCD-Kamera-System der Firma Vilber-Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) und im tif-format gespeichert Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung Die im Polyacrylamidgel durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden im Anschluss an das Western-Blotting mit dem Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue dargestellt. Die Nachweisgrenze dieses Verfahrens liegt bei 0,1 2 µg pro Proteinbande. Die geladenen Proteinmengen ließen sich auf diese Weise optisch quantifizieren, sodass ein Coomassie-gefärbtes Gel als Beladungskontrolle für den Western-Blot und weitere Nachweisverfahren diente. Es wurde eine fertige kolloidale Coomassie-Suspension der Firma Roth (Karlsruhe, Deutschland) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Mikroarray-Daten erfolgte bei der Firma febit in Heidelberg, unter Berücksichtigung der Normalisierung unterschiedlicher Komponenten. Nach der Synthese der RNA-Proben, Hybridisieren, Färben und Scannes des Microchips wurden die produzierten Roh-Daten mit Hilfe der chipspezifischen Software der Firma febit ähnlich dem Affymetrix Programm Mikroarray Suite, Version 4,0 ausgewertet (Firma febit Heidelberg, jetzt Comprehesive Biomarker Center, Heidelberg). Der Fold Change-Wert gibt hierbei die Intention der Regulation des entsprechenden Genes gegenüber seiner jeweiligen Kontrollgruppe an und liefert somit eine Aussage über die absoluten Unterschiede in der Expression der regulierten Gene. Der Fold Change gibt weiterhin die Differenz 55

56 Material und Methoden der mittleren logarithmierten Expression / Intensität der Expression der zu vergleichenden Gruppen an (Lenz, 2009). Um von einer Regulierung sprechen zu können, müssen die entsprechenden Gene folgende Kriterien erfüllen: 1. Der Expressionsunterschied sollte im Vergleich zu der angesetzten Kontrollgruppe erhöht oder verringert sein. 2. Die Expression sollte in einem Fold Change Bereich von unter 0,5 oder über 2 liegen. Mit Fold-Change wird hierbei der Verhältnis der Genexpression im Bezug auf das Grundniveau bezeichnet. Das Grundniveau entspricht hierbei der Expression in der Vergleichsgruppe. Liegt der angegebene Fold-Change in der Expression unter 1, wurde das entsprechende Gen negativ reguliert und der zur Berechnung des entsprechenden Fold-Change greift die Formel 1/qmedian. 3. Der vorliegende limma adjp- Wert durfte den Wert von 0,05 nicht überschreiten Die so erhobenen Roh-Daten wurden für die weitere Auswertung im Institut für Nutztiergenetik des FLI nochmals kontrolliert und in Form von Boxplot-Grafiken dargestellt. Hierbei erfolgte die statistische Auswertung der Daten mit dem Programmpaketen R ( und JMP ( Die statistische Auswertung der weiteren Versuchsdaten erfolgte mit Hilfe des Computerprogramme Sigma Stat for Windows (Jandel Scientific Cooperation, San Rafel, USA) und Prizm 5.0a für Apple (Apple Software, USA). Zur Auswertung der Ergebnisse wurden Mittelwerte und Standardabweichungen (±SD) bestimmt. Die Werte wurden auf Normalverteilung / Gauß-Verteilung geprüft und bei vorhandener Normalverteilung mittels Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Bei nicht vorhandener Normalverteilung wurden die Werte mittels Wilcoxon-Test analysiert und mit dem Chi-Quadrat-Test auf Signifikanz überprüft. Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen gelten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p 0,05 als signifikant. 56

57 Material und Methoden 3.19 Verbrauchsmaterialien und Reaktionskits Agarose NEEO Ultra Quality Roti garose, ROTH, Karlsruhe, Deutschland Agilent RNA 6000 Nano Kit für RNA Qualitätskontrolle, Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. Life Sciences & Chemical Analysis, Waldbronn, Deutschland Giemsa Gebrauchslösung, Merck, Darmstadt, Deutschland HRP Polymer und Waschpuffer für Immunhistologische Färbungen, Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland May Grünwald Lösung, Merck, Darmstadt, Deutschland Pipetten: 1-10 μl; μl, μl, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen mit und ohne Filter: 10, 100 und 1000 μl, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA Reaktionsgefäße: 0,65 und 1500 μl, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Tissue Tek, Gewebeeinbettung, Hartenstein Laborbedarf, Würzburg, Deutschland TRI Reagent für RNA-Aufarbeitung, Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA Vectashield, Einbettungsmedium für histologische Schnitte, Axxora GmbH, Lörrach, Deutschland, 57

58 Material und Methoden Puffer und Lösungen NaCl: NaCl: SIGMA S 5886; 1,08M; 9,0 g Aqua bidest. Barnstead E-pure 1 L Penicillin: Appli Chem GmbH 0,06 g Streptomycin: Appli Chem GmbH 0,1g PBS: Stocklösung Na-Pyruvat: SIGMA P3662 3,6 g Streptomycinsulfat: Appli Chem GmbH 5,0 g D-Glucose: Appli Chem GmbH 100,0 g CaCl 2 xh 2 O: SIGMA C7902; 0,178 M 13,3 g Penicillin G: Appli Chem GmbH 6,0 g Aqua bidest: Barnstead E-pure 1 L PBS-Gebrauchslösung / 1 x PBS-Lösung: Aqua bidest: Barnstead E-pure 1 L Stocklösung: 10 ml PBS-Pulver: SIGMA D ,65 g = Dulbecco s phosphate buffered saline Polymeraseketten Reaktion (PCR) und reverse Transkriptase PCR: 50 mm MgCl 2 Invitrogen, Y02016, Karlsruhe, Deutschland 10 x PCR Puffer ohne Mg Invitrogen, Y02028, Karlsruhe, Deutschland Der 10 x PCR Puffer bestand aus 200 mm Tris ph 8,4 und 500 mm KCl. 58

59 Material und Methoden dntp s Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland 100 mm Stocklösung der dntp s wurden in autoklaviertem Wasser verdünnt (1:10) und dann als 10 mm Stocklösung für den Gebrauch in der Reversen Transkription und der PCR eingesetzt. Hochreines Wasser wurde mit dem Ionenaustauscher von Millipore (Milli Q Synthesis A 10) hergestellt (bei > 18 MΩ). Random Hexamers GeneAmp RNA PCR Kit components, N , Applied Biosystem, USA 50 μm bereitgestellt in 10 mm Tris-HCl, ph 8,3. RNAse-Inhibitor GeneAmp RNA PCR Kit components, N , Applied Biosystem, USA: 20 U/μl Reversetranskriptase: GeneAmp RNA PCR Kit components, N , Applied Biosystem, USA: 80 U/μl Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen, , Karlsruhe, Deutschland Spezifische Primer Eurofins MWG GmbH, Ebersberg, Deutschland Lösungen und Reagenzien für die Agarose Gelelektrophorese: 1x Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) 90 mm Tris 90 mm Borsäure 2 mm EDTA ph 8,3 Western Blotting Analyse: Waschpuffer Doppelt destilliertes Wasser 400 ml 1M Tris 50 ml, ph 7,4 1,5M NaCl Tween 20 (Roth, Deutschland) 0,5 ml 59

60 Material und Methoden Ladepuffer 6 x Puffer 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylenblau 15% Ficoll (Type 400) 20 x SSC Für 1 Liter 175,3 g NaCl 88,2 g Tri-Natriumcitrat Dihydrat Mit 1M HCl auf ph 7,0 einstellen Whatman Papier Whatman Papier Chromatographie Paper 3 mm (Whatman LTD, ) Blot-Membran Nylon Membranen, positively charged (Roche, ) 10 % Blockinglösung 10 g Pulver (Blocking Reagent, Roche) in 100 ml Maleinsäurepuffer bei 60 C lösen. Maleinsäurepuffer Für 1 Liter 11,61 g Maleinsäure 8,77 g NaCl Auf ph 7,5 mil NaOH einstellen 60

61 Material und Methoden Trenngel 12,5% 5000 μl 30 % Acrylamid / 0,8 % Bisacrylamid μl H2O + 1,5M Tris/HCl, ph 8, μl 10 % SDS + 70 μl 10% APS + 45 μl TEMED Sammelgel 5% 759 μl 30 % Acrylamid / 0,8 % Bisacrylamid μl H2O μl Tris / HCl, ph 6, μl 10 % SDS + 40 μl APS + 40 μl TEMED Antikörper PPARA Rabbit anti-human Polyclonal (aa22-36) Antibody 50 µg, LS-B , WB, IHC-P, Biozol Diagnostica Vertrieb GmBH, München, Deutschland CD163, MOUSE ANTI PIG, monoclonal Antibody,IgG1, MCA2311F, AbD serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland Detektionspuffer Für 1 Liter 100 ml TrisHCl ph 9,5 33,3 ml 3M NaCl 61

62 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Reproduktionsbiologische Manipulationen Empfängertiere Während im ersten Versuchsabschnitt 93,9 % der präpuberalen Versuchstiere (46 von 49 Jungsauen) erfolgreich stimuliert werden konnten, waren im zweiten Versuchsabschnitt 95,8% der Jungsauen (69 von 72 Tieren) empfängnisbereit. Eine eventuell symptomlose, bakterielle Infektion wurde durch Gramfärbung von Abklatschproben des Uterushorns in beiden Versuchsabschnitten ausgeschlossen (Abbildung 6). Keiner der verwendeten Uteri war in dieser Hinsicht auffällig. Abbildung 6: Gramfärbung von Abklatschprobe des Uterushorns, 40 0-fache Vergrößerung, der abgebildete Messbalken gibt den Maßstab für 100 μm an 62

63 Ergebnisse Quantitative und qualitative Bestimmung der Ejakulate Die zur Besamung gewonnenen Ejakulate im ersten und zweiten Versuchsabschnitt enthielten durchschnittlich 250 ml der spermienarmen Phase und 100 ml der spermienreichen Phase und im Mittel 80 ± 4,5% bzw. 77 ± 8% motile Spermien mit einem Anteil von durchschnittlich 3,0 ± 1,0% bzw. 2,5 ± 0,7% morphologisch abweichender Spermatozoen. 4.2 Uterusspülung Zur Evaluierung der Immunreaktion des Uterus und gegebenenfalls der Spermienretention nach Übertragung der unterschiedlichen Inseminatvariationen, wurde die Anzahl der ins Uteruslumen migrierten Leukozyten und der zurückgewonnenen Spermien nach Spülung der Uterushörner mit 20 ml PBS bestimmt. Zwischen den durchschnittlich 21,7 ± 4,0 ml Spülsuspension, die im 1. Versuchsabschnitt zwei Stunden nach der Besamung durch Spülung des Uterushorns gewonnen wurden, und den im Mittel 20,0 ± 5,2 ml Spülsuspension nach 15 Minuten, 2 Stunden, 6 Stunden und zum Zeitpunkt der Ovulation im 2. Versuchsanschnitt traten keine signifikanten Volumenunterschiede auf Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Besamungsportion Im 1. Versuchsabschnitt wurden 2 Stunden nach Instillation von PBS oder Seminalplasma (SP) in das Uteruslumen bzw. nach Insemination mit Spermien in Seminalplasma (SPSp), Spermien in PBS (PBSSp) und Nebenhodenschwanzsperma (NHS) ein Uterushorn mit PBS gespült und die Leukozyten- und Spermienzahlen bestimmt. Zusätzlich gab es eine unbesamte Kontrollgruppe (NC) Anzahl ins Uteruslumen migrierter Leukozyten In Uteri unbehandelter Sauen wurden mit 10 x 10 6 Leukozyten die geringste Anzahl an Zellen in der Spülsuspension gezählt. Während die Applikation von PBS bereits zu einem Anstieg der Leukozytenzahl auf 36,23 x 10 6 führte, traten nach Instillation 63

64 Leukozyten in mio. pro Uterushorn Ergebnisse von Seminalplasma mit 71,52 x 10 6 Leukozyten annähernd doppelt so viele Immunzellen auf. Die Besamung mit Spermien in PBS und mit Nebenhodenschwanzsperma war mit einer Erhöhung der Leukozytenzahl um fast 110 % auf 98,95 bzw. 95,47 x 10 6 im Vergleich zur PBS-Applikation assoziiert. Nach Insemination mit Spermien in Seminalplasma allerdings konnte mit 26,66 x 10 6 Zellen eine geringere Infiltration von Leukozyten in das Uterusepithel gegenüber PBS nachgewiesen werden, welche aber eine Verdoppelung der Leukozytenzahl gegenüber den unbehandelten Tieren darstellte. Signifikante Unterschiede hinsichtlich des Leukozyteninflux fanden sich ausschließlich in dem Vergleich der unbesamten Kontrollgruppe mit der Untersuchungsgruppe Spermien in PBS (Abbildung 7) NC PBS SP PBSSp NHS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 7: Anzahl der gezählten Leukozyten in der Spülsuspension im 1. Versuchsabschnitt innerhalb der Untersuchungsgruppen; Mittelwert+SD;N=49; NC= Negativkontrolle; PBS= PBS- Medium; Sp= Seminalplasma; PBSSp= PBS+Spermien; NHS= Nebenhodenschwanzsperma; SPSp= Seminalplasma+Spermien, rot gekennzeichnete Datenpunkte sind innerhalb des jeweiligen Messzeitpunktes gegenüber grün gekennzeichneten Datenpunten signifikant (p 0,05) unterschiedlich 64

65 % Verteilung der charakterisierten Leukozytenpopulation Ergebnisse Bestimmung polymorphkerniger Granulozyten und mononukleärer Leukozyten Die in der Spülsuspension enthaltenen Leukozyten wurden im Anschluss an die zahlenmäßige Bestimmung histologisch-morphologisch in polymorphkernige Granulozyten und mononukleäre Leukozyten differenziert. In den Gruppen NC und PBS sowie nach Applikation von Seminalplasma und Nebenhodenschwanzsperma stehen 28-31% mononukleäre Leukozyten einem Anteil von 69-72% polymorphkerniger Granulozyten gegenüber. Nur nach Insemination mit PBS + Spermien wurde eine annähernd gleiche Verteilung der Leukozyten nachgewiesen, während SPSp zu einer Verschiebung der Leukozytenverteilung zu 86% polymorphkerniger Granulozyten bei einer reduzierten Menge von 14% mononukleärer Zellen führte (Abbildung 8). Signifikante Unterschiede fanden sich innerhalb der Untersuchungsgruppen nicht polymorphkernige Granulozyten mononukleäre Leukozyten 20 0 NC PBS SP PBSSp NHS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 8: Verteilung der histologisch-morphologisch differenzierten Leukozyten in der Spülsuspension im 1. Versuchsabschnitt innerhalb der Untersuchungsgruppen; Mittelwert+SD; NC= Negativkontrolle; PBS= PBS-Medium; Sp= Seminalplasma; PBSSp= PBS+Spermien; NHS= Nebenhodenschwanzsperma; SPSp= Seminalplasma+Spermien 65

66 Ergebnisse Anzahl freier Spermien im Uteruslumen In den Untersuchungsgruppen NC, PBS sowie SP des ersten Versuchsabschnittes wurden keine Spermien übertragen, sodass daher keine zurückgespülten Spermatozoen in der Spülsuspension nachweisbar waren. In der Untersuchungsgruppe NHS traten mit 4,74 x 10 6 Spermatozoen die geringste Anzahl an zurückgespülten Spermien auf. Nach Applikation von PBSSp waren mit 56,79 x 10 6 Spermatozoen deutlich weniger zurückgespülte Spermien zu finden, als nach SPSp-Besamung mit 86,18 x 10 6 Spermien in der Spüllösung. Signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen fanden sich jedoch nicht. Die in den Spülsuspensionen gezählten Spermienzahlen sollten im Anschluss in ein Verhältnis zu Spermienpopulationen innerhalb der histologischen Schnittpräparate gebracht werden. Hierzu wurden Präparate angefertigt, welche auf Lokalisation und Menge der darin enthaltenen Spermienmenge hin untersucht wurden. Jedoch konnte keine Spermienpopulation im Bereich des Uteruslumen, der uterine Epithelzellen oder auch tieferer Endometrium- und Myometriumschichten nachgewiesen werden (Abbildung 9). Abbildung 9: Schnittpräparat Uterus, ohne Spermien, 400-fache Vergrößerung, der abgebildete Massbalken gibt den Maßstab für 200 μm an 66

67 Ergebnisse Leukozyten- und Spermienzahl im Uterus nach künstlicher Besamung in Abhängigkeit von der Zeit Im 2. Versuchsabschnitt wurden 15 min, 2 Stunden, 6 Stunden oder zum Zeitpunkt der Ovulation nach Applikation von PBS in das Uteruslumen oder nach Insemination mit SPSp ein Uterushorn mit PBS gespült und die Leukozyten- und Spermienzahlen bestimmt. Zusätzlich wurden zu denselben Zeitpunkten Untersuchungen an unbesamten Kontrolltieren durchgeführt Anzahl ins Uteruslumen migrierter Leukozyten In der unbehandelten Kontrollgruppe variierte die Leukozytenzahl in der Spüllösung zwischen 2,15 x 10 6 zum Zeitpunkt der Ovulation und einem Maximalwert von 46,33 x 10 6 zum Zeitpunkt 2 Stunden nach der Behandlung. Nach PBS-Applikation wurde dagegen in den ersten 6 Stunden mit 19,98 29,26 x 10 6 eine sehr viel höhere Anzahl von Immunzellen ermittelt, wobei auch in der PBS-Gruppe zum Zeitpunkt der Ovulation eine Reduktion der Leukozytenkonzentration auf 2,15 x 10 6 auftrat. Im Hinblick auf die Insemination mit SPSp wurde nach 15 Minuten die absolut geringste Zahl von Leukozyten mit 1,63 x 10 6 gemessen, die über einen Wert von 2,56 x 10 6 nach 2 Stunden bis auf 5,4 x 10 6 nach 6 Stunden anstieg, um anschließend zur Ovulation ihren Maximalwert von 16,48 x 10 6 zu erreichen (Abbildung 10). Zum Zeitpunkt 2 Stunden nach Behandlung wurde in der NC-Gruppe eine signifikant höhere Leukozytenzahl als in der SPSp-Gruppe gemessen. Zum Zeitpunkt der Ovulation fand sich eine signifikant geringere Anzahl an Leukozyten in den Untersuchungsgruppen NC und PBS gegenüber der Besamungsportion mit SPSp. Der Vergleich innerhalb der Behandlungsgruppen in Abhängigkeit von der Zeit ergab keine signifikanten Ergebnisse. 67

68 Leukozyten in Mio. pro Uterushorn Leukozyten in Mio. pro Uterushorn Leukozyten in Mio. pro Uterushorn Leukozyten in Mio. pro Uterushorn Ergebnisse 15 Minuten 2 Stunden NC PBS SPSp NC PBS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Stunden NC PBS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Zum Zeitpunkt der Ovulation NC PBS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 10: Anzahl der gezählten Leukozyten in mio. pro Uterushorn in der Spülsuspension im 2. Versuchsabschnitt nach Messzeitpunkten unterschieden; Mittelwert+SD; NC = Negativkontrolle, PBS = PBS-Medium, SPSp = Seminalplasma + Spermien. Rot gekennzeichnete Datenpunkte sind innerhalb des jeweiligen Messzeitpunktes gegenüber grün gekennzeichneter Datenpunkte signifikant (p 0,05) unterschiedlich 68

69 % Verteilung der charakterisierten Leukozytenpopulation Ergebnisse Bestimmung polymorphkerniger Granulozyten und mononukleärer Leukozyten Die histologisch-morphologisch differenzierten Leukozytenpopulaltionen zeigten wie im 1. Versuchsabschnitt weder eine Abhängigkeit von der Zeit nach Manipulation noch von der applizierten Besamungsportion (Abbildung 11) polymorphkernige Granulozyten mononukleäre Leukozyten 20 0 Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 11: Verteilung der histologisch-morphologisch differenzierten Leukozyten in der Spülsuspension innerhalb der einzelnen Untersuchungsgruppen, dargestellt im 2. Versuchsabschnitt; Mittelwert±SD; NC = Negativkontrolle, PBS = PBS-Medium, SPSp = Seminalplasma + Spermien Anzahl freier Spermien im Uteruslumen Die Spülung des Uterus ergab 15 Minuten post inseminationem mit 57,14 x 10 6 die höchste Anzahl freier Spermien, die bis zum Zeitpunkt 2 Stunden nach Besamung um 25 % auf 49,44 x 10 6 Spermien zurückging. In den zum Zeitpunkt 6 Stunden nach der Besamung und der Ovulation gewonnenen Spüllösungen waren in keinem der besamten Tiere noch Spermien zu finden. Wie bereits im ersten 69

70 Ergebnisse Untersuchungsabschnitt festgestellt, konnten in den histologischen Schnitten zu keinem Zeitpunkt Spermien gefunden werden. 4.3 Transkriptom-Analysen Die Unterschiede in der Anzahl der infiltrierten Immunzellen nach Uterusspülung belegen die differenziellen, immunstimulatorischen Eigenschaften der verschiedenen Komponenten der Besamungsportionen. Zur weiteren Charakterisierung der Immunantwort des Uterus nach künstlicher Besamung wurden daher Mikroarray- und Realtime-PCR-Analysen sowie immunhistologische Färbungen durchgeführt, um die Expression pro- und antiinflammatorischer Gene auf RNA- und Proteinniveau zu bestimmen RNA-Mikroarray-Analysen Vergleich der regulierten Gene innerhalb der Gruppenvergleiche, 1. Mikroarray PBSv SPSp, 2 Gene 7% NHSv SP, 6 Gene 21% SPSpvs SP, 1 Gen 3% NCv NHS, 5 Gene 17% NCv SPSp, 15 Gene 52% Vergleich der regulierten Gene innerhalb der Gruppenvergleiche, 2. Mikroarray 15NCv 15PBS, 1 Gen 6% 6NCv 6SpSP, 17Gene 94% Abbildung 12: Prozentuale Verteilung der regulierten Gene innerhalb der Gruppenvergleiche, 1. und 2. Mikroarray; NC=negative Kontrolle, NHS=Nebenhodenschwanzsperma, SP=Seminalplasma, Sp=Spermien 70

71 Ergebnisse Mikroarray-Analyse, 1. Versuchsabschnitt Im 1. Versuchsabschnitt wurden in unterschiedlichen Gruppenvergleichen 29 Gene als reguliert identifiziert, was einem Anteil von 8% entspricht. In Tabelle 7 sind die Fold Change-Werte der differentiell regulierten Gene aufgelistet. Die Höhe der Regulationen in den Gruppenvergleichen bewegten sich zwischen 2,21 und 18,57- fach. Die höchste Anzahl regulierter Gene findet sich, wie aus Abbildung 12 ersichtlich, beim Vergleich Negativkontrolle gegenüber der Insemination mit Spermien in Seminalplasma. Hierbei waren die Gene CD163 und CXCL14 mit Werten von 7,24 und 18,57 am stärksten reguliert. Vierzehn von 15 Genen waren dabei nach Besamung mit Spermien und Seminalplamsa verglichen mit unbesamten Tieren herunterreguliert. Nur PPAR-alpha war in diesem Gruppenvergleich signifikant höher reguliert. Statistisch belastbare Regulationen gegenüber den unbesamten Kontrollen wurden nach Besamung mit Nebenhodenschwanzsperma festgestellt. Auch hier war die Mehrzahl der differentiell regulierten Gene (4 von 5) herabreguliert. Im Vergleich der behandelten Gruppen miteinander fiel der Gruppenvergleich Nebenhodenschwanzsperma gegen Seminalplasma auf, in dem 6 Gene als unterschiedlich reguliert identifiziert wurden. 71

72 Ergebnisse Tabelle 7: Regulierte Gene im 1. Versuchsabschnitt; Gene, die in dem jeweiligen Gruppenvergleich gegenüber der zuerst genannten Vergleichsgruppe höher reguliert wurden, sind grün markiert Gruppenvergleich Gen Fold Change NC versus SPSp AIF1 3,71 NC versus SPSp CD163 7,24 NC versus SPSp CTSH 3,15 NC versus SPSp CTSK 3,29 NC versus SPSp CTSL2 2,22 NC versus SPSp CXCL14 18,57 NC versus SPSp F3 2,21 NC versus SPSp HDAC2 3,40 NC versus SPSp LYZ 2,22 NC versus SPSp PPAR-alpha 5,59 NC versus SPSp S100A12 2,88 NC versus SPSp SCYE1 oder AIMP17 5,06 NC versus SPSp SLA-DQB1 (Y) 2,65 NC versus SPSp SMAD1 2,36 NC versus SPSp TGF beta2 / L08375_1 2,24 TNF alpha induzierendes NHS versus SP Protein 2,21 NHS versus SP JAK2 2,75 NHS versus SP MALT1 4,21 NHS versus SP PLAT 4,18 NHS versus SP PRDX5 5,10 NHS versus SP STAT5B 2,76 PBS versus SPSp STAT3 2,35 SPSp verus ssp CXCL10 2,99 PBS versus SPSp IL13RA1 7,55 NC versus NHS ANXA1 2,79 NC versus NHS CCL2 2,97 NC versus NHS CTSS 2,49 NC versus NHS GPNMB 3,05 NC versus NHS IL7 2,28 72

73 Ergebnisse Mikroarray-Analyse, 2. Versuchsabschnitt Die Analyse der Transkriptionsvarianten im 2. Versuchsabschnitt belegte eine Regulation von 18 und damit 5,2 % der untersuchten Gene, wobei mit 17 Genen der überwiegende Teil davon aus dem Vergleich Negativkontrolle versus Besamung mit Spermien in Seminalplasma 6 Stunden nach Insemination stammt (Abbildung 12). In Tabelle 8 und 9 ist dargestellt, wie sich diese Gene im Verlauf der Zeit relativ gegenüber der Negativkontrolle veränderten. Abbildung 13 und 14 zeigen den Verlauf der Regulierung basierend auf den absoluten Expressionsdaten. Dabei wurden 10 Gene herauf und 7 Gene herabreguliert. Nach 15 min war lediglich ein Gen nach Applikation von PBS im Vergleich mit den unbesamten Kontrolltieren differentiell reguliert. Dabei handelt es sich um das Gen CEBPB was im Vergleich zur Kontrollgruppe 2,3-fach herauf reguliert wurde. Nach 2h und zum Zeitpunkt der Ovulation konnten keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen detektiert werden. Eine Listung der im ersten Mikroarray in dem Gruppenvergleich NC versus SPSp regulierten Gene und die im zweiten Mikroarray zum Untersuchungszeitpunkt 6 Stunden nach der Besamung regulierten Gene zeigte eine Regulierung überwiegend inflammatorisch wirksamer Gene (Tabelle 10). 73

74 Ergebnisse Tabelle 8: Fold-Change-W erte im Gruppenvergleich 6NC versus 6SPSp; gegenüber der Kontrollgruppe herunter regulierte Gene; *p 0,05 "Fold-Change"-Wert Zeitpunkt x nach Besamung 15min 2std 6std* ovulatorisch MIF 1,11 1,11 2,17 1,51 IL7 1,07 1,45 2,51 1,89 JAK2 1,27 1,28 2,6 1,03 F3 1,51 1,61 2,91 2,39 CXCL17 1,56 1,45 3,62 6,99 SLA3 2,42 1,03 6,29 1,80 Tabelle 9: Fold-Change-W erte im Gruppenvergleich 6NC versus 6SPSp; gegenüber der Kontrollgruppe hoch regulierte Gene; *p 0,05 "Fold-Change"-Wert Zeitpunkt x nach Besamung 15min 2std 6std* ovulatorisch ACE2 1,40 1,27 2,15 2,49 AHSG 1,04 0,91 2,18 1,70 NMUR2 1,08 1,26 2,23 1,03 MNDA 1,14 0,98 2,24 1,39 MSTR1 1,12 1,04 3,57 1,02 NOX1 1,06 1,22 2,53 1,15 FLT3 1,70 1,27 2,68 1,21 NALP6 1,60 1,26 2,71 1,09 ORM1 1,07 1,19 2,76 1,00 IL31 1,17 1,54 3,93 2,24 AOAH 1,26 1,51 4,90 1,38 74

75 log q median Wert log q median Wert Ergebnisse 1 0,5 0-0,5-1 -1,5 15min 2Std 6Std Zeitpunkt der Ovulation MIF IL7 JAK2 F3 ANXA1 CXCL17 SLA3-2 Abbildung 13: Verlauf der Expression der zum Zeitpunkt 6h nach Besamung signifikant herunter regulierten Gene im Gruppenvergleich NC versus SPSp über alle Untersuchungszeitpunkte hinweg, basierend auf den absoluten Expressionsdaten (log q median) 2 1,5 1 0,5 0-0,5-1 15min 2Std 6Std Zeitpunkt der Ovulation ACE AHSG NMUR2 MNDA NOX1 FLT3 NALP6 ORM1 IL31 AOAH Abbildung 14: Verlauf der Expression der zum Zeitpunkt 6h nach Besamung signifikant höher regulierten Gene im Gruppenvergleich NC versus SPSp über alle Untersuchungszeitpunkte hinweg, basierend auf den absolute n Expressionsdaten (log q median) 75

76 Ergebnisse Tabelle 8: Listung der regulierten Gene im 1.- und 2.- Mikrorarry, aus den Gruppenvergleichen NC versus SPSp und 6NC versus 6SPSp Gruppenvergleich NC versus SPSp Regulierte Gene 1. Mikroarray Zuordnung CXCL14 SCYE1 oder AIMP17 TGFbeta2 PPAR-alpha AIF1 CD163 CTSH CTSK CTSL2 F3 HDAC2 LYZ S100A12 SLA-DQB1 (Y) SMAD1 Chemokin Cytokin Cytokin Anti-inflammatorische Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Gruppenvergleich 6NC versus 6SPSp Regulierte Gene 2. Mikroarray Zuordnung CXCL17 FLT3 IL31 IL7 ACE2 AHSG AOAH F3 MIF MNDA MSTR1 NALP6 NMUR2 NOX1 ORM1 SLA3 JAK2 Chemokin Cytokin Cytokin Cytokin Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung Inflammatorische Wirkung TH1 76

77 Ergebnisse Semiquantitative Real-Time-PCR Die Verifizierung der Mikroarray-Ergebnisse der Gene CD163, PPAR-alpha, COX2, TGF2beta, BSP1, NMSR2, CXCL14 und GPNMB aus dem 1. Versuchsabschnitt wurde mittels Real-Time-PCR mit GAPDH als endogener Kontrolle durchgeführt. Dabei konnte die Regulationen dieser Gene bestätigt werden Immunhistochemische Untersuchungen Die immunhistochemischen Untersuchungen hatten zum Ziel, exemplarisch zu überprüfen, in wie weit sich die Transkriptom-Analysen auf die eigentliche Synthese vom Proteinen übertragen lassen. Dafür wurde mit CD163 eines der am stärksten regulierten Gene und mit PPAR-alpha eines der funktionell wichtigsten Gene ausgesucht CD163 positive Makrophagen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Besamungsportion In der Gruppe SPSp trat die geringste Anzahl der in dem Gewebe vorliegenden Makrophagen mit durchschnittlich 31 Zellen / 500 µm 2 auf. Mit 34 bzw. 38 Zellen / 500 µm 2 war die uterine Makrophagendichte in der unbesamten Kontrollgruppe und nach Instillation von PBS nur etwas höher. In den Untersuchungsgruppen NHS, PBSSp sowie SP wurden dagegen erhöhte Makrophagendichten von 40, 45 und 54 Zellen / 500 µm 2, detektiert (Abbildung 15). Eine Unterscheidung der Infiltrationsrate mit Makrophagen innerhalb der Uterusabschnitte A bis D konnte nicht gefunden werden. Die Reduktion der Anzahl CD163 positiver Makrophagen im Uterusgewebe nach Insemination mit Seminalplasma in Kombination mit Spermien im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur Gruppe mit PBS-Applikation demonstriert eine immunsupprimierende Tendenz von Seminalplasma mit Spermien und spiegelt auch die gemessene mrna Expression wieder. Signifikante Influxunterschiede fanden sich jedoch in keiner der Untersuchungsgruppen. 77

78 Ergebnisse 60 Anzahl der Makrophagen/500µm NC PBS SP PBSSp NHS SPSp Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 15: Anzahl der Makrophagen in der immunhistologischen Färbung für das Gen CD163, Mittelwert+SD; 1. Mikroarray CD163 positive Makrophagen in Abhängigkeit von der Zeit nach Besamung Bei der Auswertung der immunhistologischen Färbung für das Gen CD163 im zweiten Versuchsabschnitt fand sich in der Untersuchungsgruppe NC im zeitlichen Verlauf einen Anstieg der durchschnittlichen Makrophagenanzahl von 43 Zellen / 500µm 2 bzw. 45 Zellen / 500 µm 2 nach 15 Minuten und 2 Stunden auf einen maximalen Wert von 81 Zellen / 500 µm 2 nach 6 Stunden und einer folgenden Reduktion auf 66 Zellen / 500 µm 2 zum Ovulationszeitpunkt. In der Untersuchungsgruppe PBS fiel die Makrophagenanzahl vom Zeitpunkt 15 Minuten nach Besamung mit 47 Zellen / 500 µm 2 auf einen Wert von 43 Zellen / 500 µm 2 nach 2 Stunden ab und fand ihren Maximalwert 6 Stunden nach der Besamung mit 56 gezählten Makrophagen. Hiernach fiel der Wert bis zum Zeitpunkt der Ovulation auf den Minimalwert von 41 Zellen / 500 µm 2 CD163 positiven Makrophagen ähnlich der NC-Gruppe. In der Gruppe SPSp fand sich zu Beginn der Untersuchungsreihe 15 78

79 Ergebnisse Minuten nach der Besamung der absolut geringste Wert mit 36 Zellen / 500 µm 2 gezählter Makrophagen, der 2 Stunden nach der Besamung auf 51 Zellen / 500 µm 2 ansteigt und zum Zeitpunkt 6 Stunden nach der Besamung auf wiederum 44 Zellen / 500 µm 2 abfiel. Zum Zeitpunkt der Ovulation fand sich in dieser Untersuchungsgruppe der Maximalwert von 59 Zellen / 500 µm 2 gezählten CD163 positiven Makrophagen (Abbildung 15). Der in der unbehandelten Kontrollgruppe und nach Applikation von PBS beobachtete Anstieg der Makrophagenzahl von 15 min bis zu 6 Stunden mit anschließender Reduktion trat bei den Tieren der Gruppe SPSp nicht auf. Allerdings konnten auch hier keine signifkanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen bzw. den unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten festgestellt werden. Exemplarisch für die durchgeführten Färbungen der CD163 positiven Makrophagen in den Versuchsabschnitten 1 und 2 sind in Abbildung 17 Fotos in 50- und 400-facher Vergrößerung aufgeführt. Alle durchgeführten Färbungen ergaben ein gleich gutes positives Signal. 120 Anzahl der Makrophagen/500µm Untersuchungsgruppe / Besamungsportion Abbildung 16: Mittelwert der gezählten Makrophagen in der immunhistologischen Färbung für das Gen CD163, Mittelwert+SD; 2. Mikroarray 79

80 Ergebnisse a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) Abbildung 17: Immunhistologische Färbungen des uterinen Epithelzellgewebes mit einem für das Schwein spezifischen CD163-Antikörper. a-c) in 100-facher Vergrößerung, a) Kontrollfärbung der immunhistologischen Färbung, b + c histologische Uterusschnittpräparate der Untersuchungsgruppe SPSp, Versuchsabschnitt I. d-f) in 200-facher Vergrößerung, g-i) in 400-facher Vergrößerung und j-l) in 1000-facher Vergrößerung, d-l Schnittpräparate der Untersuchungsgruppe SPSp aus den Uterusabschnitten A-D, Versuchsabschnitt I 80

81 Ergebnisse PPAR-alpha Translation im Uterus Der in dieser Arbeit verwendete, für Schweine spezifische PPAR-alpha Antikörper ergab in den durchgeführten immunhistologischen Färbungen im Uterusepithelgewebe keine positiven Signale. Auch Veränderungen hinsichtlich der Inkubationszeiten, Konzentrationen des Antikörpers und Temperaturen führten zu keinerlei Signalgebung. Um die Aktivität des verwendeten PPAR-alpha-Antikörpers zu testen, wurde zur Kontrolle ein Western Blot durchgeführt. Hierbei ergab sich in Lebergewebsproben und in Proben der Tunica muscularis uteri eine positive Reaktion des Antikörpers. Um eine Aussage über die Effizienz des Blots treffen zu können, wurde darüber hinaus eine Coomassie Brillant Blau Färbung der Membran mit ebenfalls positiven Signalgebungen durchgeführt. Coomassie Gel Western Blot kda kda : Leberparenchym 2: Uterines Epithelzellgewebe Präparation entsprechend dem Mikroarray 3: Uterines Epithelzellgewebe, Präparation unter dem Mikroskop 4: Tunica muscularis (Uterus) Abbildung 18: Coomassie-Brilliant-Blau Färbung und PPAR-alpha Western Blot Als Bestätigung der Aktivität des PPAR-alpha Antikörpers auch unter immunhistochemischen Bedingungen, wurden aus dem für den Western Blot verwendeten Lebergewebe histologische Schnitte als positive Kontrolle angefertigt. Hierbei konnten schon in der 100-fachen Vergrößerung Signale ausgemacht werden. Dadurch konnte abgesichert werden, dass der verwendete Antikörper in seiner Aktivität für die verwendeten Schnitte und Färbungen bei einer Proteinexpression 81

82 Ergebnisse innerhalb der Nachweisgrenze Signale prinzipiell ermöglicht. Im Uterusepithel des Schweins konnte jedoch trotz nachweislich funtionierendem Antikörper weder durch immunhistochemische Färbung noch durch Western Blotting PPAR-alpha detektiert werden (Abbildung 19). 82

83 Ergebnisse a) b) c) d) e) f) g) h) i) Abbildung 19: Immunhistologische Färbungen mit einem für das Schwein spezifischen PPAR-Alpha-Antikörper a-c) uterines Epithelzellgewebe, Untersuchungsgruppe SPSp, Versuchsabschnitt I, ohne Signalgebung, Vergrößerungen a) 5-fach, b) 20-fach, c) 40-fach. d-i) immunhistologische Leberparenchymfärbungen, Versuchsabschnitt I, mit Signalgebung, Vergrößerung d) 50-fach, e) 100-fach, f) 400-fach, g-i) 1000-fach 83

84 Diskussion 5 Diskussion In der Europäischen Union wurden im Jahr 2003 rund 102,3 Mill. Hausschweine (Sus scofa domestica) als Lieferanten von hochwertigem Fleisch gehalten ( urostat&collection=02-statistics%20in%20focus&product=ks-nn n-de. ( )), die eine wichtige Säule der Ernährung der Bevölkerung darstellen. In der modernen Ferkelproduktion wird aus züchterischen, ökonomischen, aber auch gesundheitlichen Gründen fast ausschließlich die instrumentelle Samenübertragung genutzt. Diese effizient und kostengünstig zu gestalten, hat eine große Bedeutung für Landwirtschaft und Ernährung. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, durch ein vertieftes Verständnis der involvierten Prozesse diese Technik noch weiter zu optimieren. Die Applikation körperfremder Zellen induziert üblicherweise eine Abwehrreaktion des Immunsystems. Dies gilt auch für die natürliche oder künstliche Befruchtung, in der Spermien in Kontakt mit dem Gewebe des weiblichen Genitaltrakts treten (Woelders and Matthijs, 2001, Dalin et al., 2004). Um trotzdem sexuelle Fortpflanzung zu ermöglichen, bedarf es daher einer Kontrolle des Immunsystems, was zum einen durch den weiblichen Organismus selbst passiert, aber auch durch Ejakulatbestandteile beeinflusst wird (Georgiou et al., 2011). Welche Mechanismen dabei im Einzelnen zusammenspielen, ist noch nicht völlig bekannt. Bei Schweinen enthält das Ejakulat neben einer großen Anzahl von Spermien (zwischen 20 und 60 Milliarden) einen besonders hohen Seminalplasmaanteil (zwischen 100 und 400 ml). In den für die künstliche Besamung beim Schwein eingesetzten Besamungsportionen wird der Seminalplasmaanteil in hohem Maße ausverdünnt. Der hierbei erreichte Verdünnungsgrad des konservierten Spermas wird dabei auf der Grundlage der im gewonnenen Ejakulat vorliegenden Spermienanzahl und der später pro Besamungsportion gewünschten Anzahl an Spermien berechnet. Im Durchschnitt wird heute in den Besamungsportionen mit einer Größenordnung von 1,5 bis 3 Milliarden Spermien pro eingesetzter Portion 84

85 Diskussion gearbeitet (Georgiou et al., 2011). Das reduziert den Anteil des Seminalplasmas in einem erheblichen Umfang und begrenzt die im Seminalplasma enthaltenden aktiven Substanzen in ihrer Wirkung (Waberski et al., 1995). Dabei wird die Bedeutung des Seminalplasmas für die Befruchtung zunehmend apparenter. Einige Autoren vermuten, dass nicht nur die reduzierte Spermienanzahl in den Besamungsportionen selbst, sondern auch der in hohem Maße verringerte Seminalplasmaanteil einer der limitierenden Faktoren für eine erfolgreiche Besamung sind (Waberski et al., 1994, Ottensmeier, 1998). Die Effekte von Seminalplasma und seiner unterschiedlichen Inhaltsstoffe auf Ovulation und Spermienmotilität im weiblichen Genitaltrakt sind bereits untersucht worden (Waberski et al., 1994, Claus et al., 1987). Diese Studien zeigten einen Einfluss von Seminalplasma auf die Vorverlegung der Ovulation nach Applikation (Waberski et al., 1999). Entsprechende Untersuchungen hinsichtlich der Wirkungen der im Ejakulat vorliegenden Spermadhaesine und ihrer lektinartigen Moleküle beschreiben Effekte auf die erfolgreiche Befruchtung (Evans et al., 2003, Calvete et al., 1993, Calvete et al., 1994, Topfer-Petersen et al., 1985). Daneben spielen Faktoren aus dem Seminalplasma ebenfalls eine Rolle bei der Regulierung der Immunantwort des weiblichen Genitals auf Insemination (O'Leary et al., 2004, Robertson, 2007). Spermien wurde bis vor kurzem keine Bedeutung in diesem Prozess zugemessen. Dabei konnten Lovell und Getty bereits 1968 (Lovell and Getty, 1968) den innigen Kontakt zwischen Spermien und Uterusepithel zeigen. Die zugrundeliegenden Bindungsmechanismen und -strukturen sind bisher kaum untersucht worden. Untersuchungen von Taylor et al (Taylor et al., 2008) zeigten, dass bei Schweinen die Anwesenheit von Spermien im Inseminat zu einer Suppression proinflammatorischer Gene im Uterusgewebe führt. Eine zentrale Frage für die Schweinebesamung ist, warum im Tierart-übergreifenden Vergleich für eine erfolgreiche Befruchtung besonders viele Spermien benötigt werden. Interessanterweise haben Untersuchungen mittels tief-intrauteriner Besamung nahe der utero-tubalen Verbindung gezeigt, dass die Dosierung bei Jungsauen auf 5 x 10 6 und bei Altsauen bis zu 1 x 10 7 unter Umgehung des Spermientransportes durch den Uterus reduziert werden kann, ohne dass eine erkennbare Reduzierung der Fruchtbarkeit zu erkennen war (Krueger et al., 1999). 85

86 Diskussion Die tief-intrauterine Besamung ist allerdings für den praktischen Einsatz nicht unumstritten, da bei falscher Handhabung eine Perforation der Uteruswand nicht vollkommen ausgeschlossen werden kann. Die positiven Ergebnisse der Besamung vor die utero-tubale Verbindung zeigen, dass es im Uterus zu massiven Spermienverlusten kommt. Ex-vivo Versuche lieferten Hinweise darauf, dass ein Teil dieser Verluste auf die Retention von Spermien im Uterus zurückzuführen ist (Taylor et al. 2007). Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit folgende Hypothesen untersucht werden: 1. Eine Retention von Spermien im Uterus ist durch die Bindung von Spermien an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. 2. Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. 3. Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und somit eventuell auch spätere Prozesse wie Implantation und Embryonalentwicklung. Zur Überprüfung der Hypothesen wurden zwei Besamungsversuche mit unterschiedlich zusammengestellten Besamungsportionen (Versuch I) und zu unterschiedlichen Besamungszeitpunkten (Versuch II) durchgeführt. Es sollte hierbei auf der einen Seite ermittelt werden, ob der Verbleib von Spermien im Uterus auch unter in-vivo-bedingungen nachweisbar ist und, im positiven Fall, ob Membranoberflächenmoleküle dieses Phänomen beeinflussen können. Dafür wurde die Anzahl von Spermien in Uterusspülsuspensionen und histologischen Schnittbildern bestimmt. Darüber hinaus dienten die Versuche dazu, die Regulation des Leukozyteneinwanderung durch einzelne Bestandteile der Besamungsportion nachvollziehen zu können. Um die Regulation auf molekularer Ebene zu analysieren und damit das Zusammenspiel der einzelnen Komponenten besser zu verstehen, wurde ein Microarray durchgeführt. Hierzu wurde ein individuell für die Fragestellung des Projektes gestalteter Microarray-Chip verwendet, mittels dessen die Expression von 349 immunrelevanten Genen im Uterusepithel untersucht wurde. 86

87 Diskussion Im ersten Versuchabschnitt wurde der Effekt sechs unterschiedlicher Besamungsvariationen zu einem fixen Zeitpunkt (2 h) untersucht. Dabei repräsentierte die Insemination mit Spermien und Seminalplasma den physiologischen Zustand. Als Kontrolle wurden Tiere nur mit Seminalplasma bzw. mit gewaschenen Spermien in PBS inseminiert, um die beiden physiologischen Komponenten separat zu testen. Darüber hinaus wurde eine Gruppe mit Nebenhodenschwanzsperma besamt, um Effekte eventuell auf der Spermienmembran verbliebener, nicht abwaschbarer Seminalplasmakomponenten sichtbar zu machen. Zur Testung des reinen Volumeneffekts wurde einer Gruppe ausschließlich PBS appliziert. Schließlich gab es eine völlig unbehandelte Kontrollgruppe. Im zweiten Versuchsabschnitt sollte die Zeitkinetik im Vordergrund stehen. Dabei wurden drei Behandlungsgruppen (Besamung mit Spermien und Seminalplasma: physiologischer Zustand ; Besamung mit PBS: Volumeneffekt ; unbesamte Kontrollgruppe) zu 4 unterschiedlichen Zeitpunkten nach Besamung untersucht (15 min, 2 h, 6 h, Ovulation) 5.1 Diskussion zu Hypothese 1 Eine Retention von Spermien im Uterus ist durch die Bindung von Spermien an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. Zur Klärung, ob die Interaktion von uterinen Epithelzellen mit Spermien ein Grund für die erheblichen Mengenverlust vom Ort der Insemination bis zur uterotubalen Verbindung und dem Eileiter ist, wurde jedes Uterushorn zunächst mit 20 ml PBS gespült, um die sich im Uteruslumen befindenden noch freien Spermien zu zählen. Nach der Spülung wurden jeweils von vier Abschnitten des Uterushorns histologische Schnitte angefertigt und auf darin enthaltenen Spermien untersucht. Bereits die Spülungen nach 15 und 120 min enthielten je nach Zusammensetzung des Inseminats nur noch 3,8 bzw. 3,2% der ursprünglich applizierten Spermienmenge von 3 Milliarden. Sechs Stunden nach Besamung waren gar keine 87

88 Diskussion Spermien mehr nachweisbar. Darüber hinaus konnten im ersten sowie auch im zweiten Versuchsabschnitt zu keinem Zeitpunkt Spermien in den histologischen Schnitten lokalisiert werden. Im Hinblick auf den 2. Punkt könnte man zunächst argumentieren, dass die Methode der Gewebskonservierung und die Aufarbeitung der Schnitte eventuell nicht optimal gewesen ist. Die Einbettung der Schnittpräparate erfolgte allerdings mittels Tissue Tek, welches ein erheblich geringeres invasives Handling im Vergleich zu Paraffinschnitten benötig. Somit ist es unwahrscheinlich, dass es zu einem Verlust evtl. vorhandener Spermien in den histologischen Schnitten durch die in dieser Arbeit verwendete Präparationsmethode kam. So verbleiben zwei Erklärungsoptionen. Entweder binden die Spermien nicht an das Uterusepithel oder sie binden nur sehr punktuell, so dass die Menge an angefertigten Schnitten nicht ausreichte um die Spermienbindungsfoki zu finden. Für die zweite Option sprechen umfangreiche rasterelektronische Untersuchungen am porcinen Endometrium nach Besamung (Michelmann et al., persönliche Mitteilung), die Spermien lediglich um bestimmte Drüsenareale herum nachweisen konnten. Aber auch in-vitro-untersuchungen mit primären porcinen Endometriumzellkulturen zeigten, dass Spermien an bestimmte Zellen in großen Mengen binden, während andere Endometriumzellen scheinbar keine Bindungsstrukturen aufweisen (Bergmann, 2012). Anhand der vorliegenden Daten ist es also nicht möglich, Hypothese 1 dieser Arbeit zu bestätigen oder zu entkräften. Es kann aber festgestellt werden, dass die gewählte Methode nicht geeignet ist, um diese Fragestellung zu beantworten. In zukünftigen Arbeiten sollten Verfahren gewählt werden, die es erlauben, größere Abschnitte des Uterusepithels im Hinblick auf Spermienbindung zu scannen, wie zum Beispiel die Verwendung von fluoreszenz-markierten Spermien in Verbindung mit Phasenkontrastmikroskopie. Die Hypothese, dass ein gewisser Anteil an Spermien zumindest fokal ans Uterusepithel binden und damit nicht frei im Uteruslumen verfügbar ist, wird allerdings durch die Beobachtung gestützt, dass bereits 15 Minuten nach transzervikaler Besamung mit 114 Millionen (auf beide Uterushörner hochgerechnet) noch nicht einmal 10% der versamten Spermien aus dem Uteruslumen wieder erspülbar waren. In anderen Arbeiten wurden ähnliche Daten erhoben. In einer 88

89 Diskussion Studie aus dem Jahr 1968 konnte 15 Minuten nach der Insemination nur noch etwa die Hälfte der eingebrachten Spermien aus dem Uterus wiedergewonnen werden (First et al., 1968). Andere Autoren fanden zwei Stunden nach der Besamung nur noch einen Bruchtteil der inseminierten Spermien frei im Lumen (Rigby, 1966, F. Du Mesnil Du Buisson 1955, Kvasnitsky, 1959). Matthijs et al. (2003) proklamierten, dass innerhalb der ersten 4 Stunden nach Besamung ein Großteil der eingebrachten Spermien, bis zu 99%, über Phagozytose und Rückfluss reduziert werden, wobei letzterem ca. 50% der Verluste zugeschrieben wurden. Dieser Erklärungsansatz lässt sich allerdings nur bedingt auf die vorliegende Arbeit übertragen. Verluste durch den natürlicherweise stattfindenden Spermienreflux nach Besamung finden definitiv statt. Viring und Einarsson (Viring and Einarsson, 1980) berichtete von einem Verlust von einem Drittel der Spermien nach 2 Stunden. Steverink (Steverink et al., 1998) registrierten nach 30 Minuten bereits 8% der versamten Spermien im Rückfluss, ansteigend auf 31% nach 2,5 Stunden. Doch selbst wenn man annimmt, dass bereits 15 Minuten nach Besamung 10% der ursprünglich 3 Milliarden Spermien mittels Rückfluss entfernt worden sind, stellt sich die Frage, wo die übrigen ca. 2,6 Milliarden Spermien verblieben sind. Phagozytose, wie von Matthijs et al. (2003) vorgeschlagen, kann dabei als Erklärungsansatz nicht dienen. Fünfzehn Minuten nach Besamung mit Spermien in Seminalplasma wurden pro Uterushorn im Mittel 1,63 Millionen Leukozyten gezählt. Es ist höchst unwahrscheinlich, dass diese innerhalb einer solch kurzen Zeitspanne 1,3 Milliarden Spermien phagozytieren können. Darüber hinaus wurde bei der mikroskopischen Evaluierung der erspülten Leukozyten auch keine Hinweise auf einen gerade stattfinden Phagozytosevorgang gefunden. Insofern ist es weiterhin plausibel anzunehmen, dass zumindest ein Teil der Spermien nicht frei verfügbar und damit erspülbar ist, weil sie an das Uterusepithel gebunden haben. Als alternativer bzw. ergänzender Erklärungsansatz kann die Vermutung von Viring und Einarsson (1980) gelten, dass ein Teil der Spermien durch den Ovidukt hindurch in die Bauchhöhle übertritt. Diese erklärt allerdings nicht, warum bei der tief-intrauterinen Besamung mit einer um ca. 90% reduzierten Spermienmenge gute Trächtigkeitsergebnisse erreicht werden, die denen der üblichen Besamung entsprechen (Krüger, 2000), wenn im Vergleich die 89

90 Diskussion erniedrigte Spermienkonzentration bei normaler Applikation nicht zur Trächtigkeit führt. 5.2 Diskussion zu Hypothese 2 Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. Die Bedeutung von Seminalplasmakomponenten für die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen kann im Rahmen dieser Arbeit nur mittels indirekter Hinweise diskutiert werden, da wie im vorhergehenden Abschnitt besprochen, der direkte Nachweis dieser Bindung nicht erbracht werden konnte. Interessant sind in dieser Hinsicht insbesondere die Ergebnisse der Uterusspülung nach Insemination. So wurde im Versuch 1 der vorliegenden Arbeit nach Besamung mit Seminalplasma und Spermien, in der Spülflüssigkeit die geringste Anzahl an eingewanderten Leukozyten auf der einen Seite und zugleich die höchste Anzahl an zurückgewonnenen Spermien auf der anderen Seite nachgewiesen. Die Besamung mit Nebenhodenschwanzspermien, also Spermien ohne jeglichen Kontakt zu Seminalplasmabestandteilen, führte zu genau dem gegenteiligen Ergebnis, nämlich einer gegen Null tendierenden Retention von Spermien, bei vergleichsweise hohem Leukozytenanteil. Zum Einen könnte die beobachtete seminalplasma-bedingte Förderung des Spermienverbleibs im Uterus Zeichen einer durch Seminalplasmakomponenten vermittelten transienten Bindung von Spermien an das Uterusepithel sein. Ähnliches wird für die Bindung von Spermien an das Eileiterepithel beschrieben. Dieses Spermienreservoir ist bei fast allen Haustierarten mittlerweile beoachtetet worden (Dobrinski et al., 1996, Topfer-Petersen et al., 2002, Suarez, 1987). Zumindest beim Rind gilt es als nachgewiesen, dass die dafür erforderlichen Bindungsstrukturen auf der Spermienoberfläche dem Seminalplasma entstammen (Gwathmey et al., 2003, Ignotz et al., 2001). Zum anderen geben diese Ergebnisse erste Hinweise darauf, dass Spermien und Seminalplasma bei der Regulation der uterinen Immunantwort kooperieren, was ein weiterer Anhaltspunkt 90

91 Diskussion dafür ist, dass Spermien über Seminalplasmabestandteile mit dem Uterusepithel Kontakt aufnehmen. Diese Hypothese wird weiterhin dadurch unterstützt, dass die Übertragung von gewaschenen Spermien in PBS den signifikant höchsten Einstrom von Leukozyten verursachte, während sich der Influx nach Besamung mit Spermien in Seminalplasma nicht von der Negativkontrolle unterschied. Das entspricht auch Versuchen von Rozeboom (Rozeboom et al., 1999), die den höchsten Influx neutrophiler Granulozyten nach Applikation von Spermien in PBS verglichen mit Spermien in Seminalplasma, Seminalplasma allein bzw. PBS allein hatten. Auch die Daten bezüglich des Leukozyteninflux aus dem 2. Versuchsabschnitt bestätigen den Einfluss von Spermien und Seminalplasma auf die endometriale Immunregugation. So liegt die Zahl erspülter Leukozyten 15 min nach Besamung mit Seminalplasma und Spermien signifikant niedriger, als nach Applikation von PBS und ist nach 2 Stunden signifikant niedriger als bei der Negativkontrolle. Zum Zeitpunkt der Ovulation, also ca. 18 Stunden nach Besamung, stieg der Leukozyteneinstrom bei der Behandlungsgruppe signifikant über das Niveau der Negativkontrolle, was auf einen Langzeiteffekt der Spermien-Seminalplasma- Suspension hindeutet. Bisher wurden solche Ergebnisse vor allem dahingehend gedeutet, dass es der Seminalplasma-Anteil allein ist, der zu der Herunterregulation des uterinen Immunsystems führt. Auch die in diesen Versuchen erhobenen Daten bezüglich des Leukozyten-Einstroms geben einen deutlichen Hinweis darauf, dass es auch der Anwesenheit von Spermien bedarf, wie die erhobenen Genexpressionsdaten zeigen. Im ersten Versuchsabschnitt mit sechs gegeneinander getesteten Besamungsvariationen, wurde die größte Anzahl an differentiell regulierten Genen festgestellt, wenn sowohl Spermien als auch Seminalplasma anwesend waren. Weder Seminalplasma allein, noch gewaschene Spermien allein führten zu einer sich von der Negativkontrolle unterscheidenden Genexpression. Dieses konnte im zweiten Versuchsabschnitt wiederholt werden und bestätigt außerdem zuvor durchgeführte Experimente von Taylor (Taylor et al., 2009), bei denen eine Beteiligung von Spermien an der Regulation der uterinen Genexpression beim Schwein zu ersten Mal festgestellt wurde. Es ist natürlich nicht zwingend, dass die 91

92 Diskussion beobachtete, durch Kombination von Spermien und Seminalplasma verursachte Modifikation des Transkriptoms aufgrund einer durch Seminalplasma vermittelten Bindung von Spermien an das uterine Epithel stattfindet. Es ist jedoch ein nahe liegender Erklärungsansatz. Alternativ kämen auch von Spermien nach Kontakt mit Seminalplasma sezernierte Substanzen in Frage. Das erscheint aber unwahrscheinlich, da Spermien ein weitgehend inaktiviertes Chromatin besitzen und kaum mrna produzieren. Hypothese 2 dieser Arbeit kann somit als teilweise bestätigt gelten, wenn der direkte Beweis auch noch aussteht. Derzeit laufende in-vitro-studien an Zellkulturen sollen zur weiteren Abklärung beitragen. 5.3 Diskussion zu Hypothese 3 Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und somit eventuell auch spätere Prozesse wie Implantation und Embryonalentwicklung. Die immunologische Reaktion im Uterus nach dem natürlichen Deckakt oder auch der künstlichen Besamung wurde in der Vergangenheit schon wiederholt von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht (Waberski et al., 1999, Döhring, 2004, Lechner, 2008). Insbesondere beim Schwein und auch dem Pferd, den sogenannten Uterusbesamern, wurden hierzu mehrere Studien durchgeführt, um die beobachteten Abwehrmechanismen des Uterus besser verstehen und eventuell auch regulieren zu können (Döhring, 2004, Schuberth et al., 2008, Matthijs et al., 2003). Was als Auslöser bzw. Regulator dieser lokalen Immunreaktionen fungiert, wurde dabei durchaus kontrovers diskutiert. Während Matthijs (Matthijs et al., 2003) die uterine Reaktion hauptsächlich dem Volumeneffekt zuschreiben favorisierte O Leary (O'Leary et al., 2004) Seminalplasma als vorrangigen Regulator. Rozeboom et al. (1999) konnten den Einfluss von Spermien zeigen. Darüber hinaus konnte auch eine 92

93 Diskussion Wirkung von Verdünnerbestandteilen nachgewiesen werden. So wurde nach Verwendung von Androhep als Verdünner statt Seminalplasma 3 Stunden nach der Besamung eine erhebliche Aktivierung des uterinen Immunsystems beobachtet, was sich in einer massiven Einwanderung von Leukozyten in den Uterus äußerte (Taylor, 2007). Die meisten dieser Studien beurteilten die Immunantwort allerdings allein aufgrund der zellulären Reaktion. Bisher gibt es nur wenige Studien, die das Geschehen beim Schwein auch auf molekularbiologischer Ebene untersuchten. So konnten O Leary et al. (2004) zeigen, dass Seminalplasma bei einigen immunrelevanten Genen Einfluss auf die Expression bis in die frühe Trächtigkeit hinein hat. Taylor et al. (2009) analysierten die Effekte von Verdünner und Seminalplasma mit und ohne Spermien auf die Expression beispielhaft gewählter Gene und stellten fest, dass die Anwesenheit von Spermien bei 5 von 8 Genen zu einer Herabregulation führte. Jiwakanon et al. (2011) beschrieb im Vergleich zu unbesamten Tieren eine differentielle Regulation von TGF-ß1 und Interleukin 6 und 10 nach Besamung mit Spermien bzw. Verdünner. Gemeinsam ist diesen Arbeiten, dass die Untersuchung nur die Expression einiger weniger, maximal 8 Gene umfasste. In der vorliegenden Arbeit wurde die besamungs-induzierte Expression von 349 immunrelevanten Genen auf Transkriptomebene untersucht. Diese wurde zum einen 2 h nach Besamung mit 6 unterschiedlichen Inseminatvarianten erfasst und zum anderen zu vier verschiedenen Zeitpunkten bis zur Ovulation mit drei Inseminatvarianten. Aus den Expressionsdaten wurden zwei Hauptbefunde ermittelt: I. Der bei weitem größte Einfluss des Inseminates auf die Genregulation erfolgt nach Besamung von Spermien in Kombination mit Seminalplasma. Dieses Phenomen wurde sowohl im ersten wie auch im zweiten Versuchsabschnitt beobachtet. II: Die immunologische Reaktion des Uterus wird in relativ kurzer Zeit (2-6 h) nach Besamung evident, ist aber bereits zum Zeitpunkt der Ovulation auf Transkriptomebene schon nicht mehr nachweisbar. Vor allem die erste Feststellung kann dabei als deutliche Unterstützung des ersten Teils von Hypothese 3 angesehen werden. Allerdings muss die Bedeutung von Seminalplasma als Vermittler der Bindung von Spermien an das Uterusepithel 93

94 Diskussion ergänzt werden. Darüber, welche Seminalplasmafaktoren dabei eine Rolle spielen, lässt sich zum heutigen Zeitpunkt noch keine Aussagen treffen. Anhaltspunkte geben jedoch Untersuchungen, die gezeigt haben, dass die Bindung porciner Spermien an das Oviduktepithel durch Lektin-Kohlenhydrat-Bindungen vermittelt wird. Beim Schwein werden diese Lektine durch Seminalplasmaproteine wie unter anderem dem AQN-1 repräsentiert. Diese binden an die Plasmamembran der Spermien und werden während des Kapazitationsvorganges entfernt (Töpfer-Petersen et al., 2002, Jansen and Bajpai, 1982, Kaeoket et al., 2002a). Um zu überprüfen, ob die Spermien-Uterus-Bindung ebenfall lektinvermittelt ist, sind weitergehende Studien erforderlich. Der zweite Teil der dritten Hypothese bezüglich der Langfristigkeit der ausgelösten Änderungen in der Genexpression, wird von den erhobenen Daten nicht gestützt. Im Gegensatz zu O Leary et al. (2004), die Auswirkungen bis in die Trächtigkeit hinein proklamierten, wurden in dieser Arbeit bereits bei Eintritt der Ovulation ca. 18 h nach Besamung, keine unterschiedliche Genregulation zwischen der Behandlung- und den Kontrollgruppen mehr festgestellt. Das deutet daraufhin, dass die Immunantwort zu diesem Zeitpunkt im Wesentlichen bereits abgeschlossen ist. Diese Sichtweise erscheint plausibel, da eine entzündliche Reaktion im Uterus die Aufnahme des Konzeptus erschweren würde. Interessanterweise konnten differentiell regulierte Gene im ersten Versuchsabschnitt schon nach 2 h beobachtet werden, während sie im zweiten Versuchsabschnitt erst nach 6 h auftraten. Jedoch können diese zeitlichen Unterschieden anhand unterschiedlicher Versuchsorte und genetischer Hintergründe der Versuchstiere erklärt werden. Im Rahmen der Genexpressionsanalysen wurden ebenfalls immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt. Ziel war es zu eruieren, inwieweit es die Analyse des Transkiptoms ermöglicht auf das eigentliche Proteom zu schließen. Dabei wurde festgestellt, dass dieses nur sehr bedingt möglich ist. Von den beiden stichprobenartig getesteten Genen, konnte nur CD163 immunhistochemisch nachgewiesen werden, wobei der Verlauf der Expression des Proteins CD163 in beiden Versuchsabschnitten nicht der Expression des Gens CD163 folgte. Das Produkt des zweiten Gens, der Transkriptionsfaktor PPAR-alpha, wurde als Protein 94

95 Diskussion in den Gewebeproben nicht festgestellt. Weitere Studien sind daher notwendig, um die Wirkung von Inseminatbestandteilen auch auf der Proteinebene besser zu verstehen. 5.4 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick In der vorliegenden Arbeit wurden Besamungsversuche an Sauen durchgeführt, mit besonderer Blickrichtung auf die Interaktionen von Spermien mit dem Uterusepithel. Der endgültige Nachweis, dass Spermien in der Tat direkt an das Endometrium binden, konnte nicht erbracht werden. Allerdings gibt es eine Vielzahl von indirekten Hinweisen darauf. Die Ergebnisse implizieren darüber hinaus die wichtige Rolle von noch nicht näher bestimmten Seminalplasmakomponenten bei dieser Interaktion. Bindungen von Spermien an das Uterusepithel sind also ein valider Erklärungsansatz für Spermienverluste nach Besamung. Weitere Studien müssen durchgeführt werden, um den Mechanismus der Spermienbindung zu verstehen. Ein genaues Verständnis der Bindung würde erlauben, die uterinen Bindungsstellen mit Agonisten zu sättigen, so dass mehr freie Spermien zur Befruchtung zur Verfügung stehen und daher die Besamungsportionen effizienter genutzt werden könnten. 95

96 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Sonja Junge-Krämer: Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mituterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer erfolgreichen Insemination Die künstliche Besamung des Schweines hat in den letzten 20 Jahren weltweit zunehmend an Bedeutung gewonnen. Durch Optimierung des Besamungsmanagements gelingt eine hohe Fertilitätsrate von nahezu 90%. Allerdings werden hierfür Besamungsportionen mit mindestens 1 x 10 9 Spermien benötigt, wodurch der effiziente Einsatz von Besamungsebern eingeschränkt wird. Dieser Umstand limitiert auch die Etablierung neuer biotechnischer Verfahren in der Schweinereproduktion, hervorzuheben ist die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien anhand der Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie. Um die benötigte Spermienzahl pro Besamungsportion senken zu können, muss auf aufwendige Techniken wie tief intrauterine Besamung und laparoskopische Eileiterbesamung zurückgegriffen werden, da bei diesen Verfahren die durch die Uteruspassage bedingte Verluste vermieden werden können. Damit die künstliche Besamung mit einer reduzierten Spermienkonzentration innerhalb der konventionellen Besamungstechniken erfolgreich durchgeführt werden kann, müssen daher grundlegende uterine Mechanismen der Spermienselektion aufgezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, anhand eines besseren Verständnisses sowohl der uterinen Spermienretentionsmechanismen als auch der immunologischen Reaktionen im porcinen Uterus neue Möglichkeiten für die Optimierung des Besamungsmanagements beim Schwein aufzuzeigen. Demzufolge wurden die nachstehend genannten Hypothesen aufgestellt: 96

97 Zusammenfassung 1. Die Retention von Spermien im Uterus wird durch die Bindung von Spermien an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. 2. Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. 3. Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und hat dadurch Auswirkungen auf spätere Ereignisse wie Implantation und Embryonalentwicklung. In einem ersten in-vivo-versuch wurden präovulatorischen Jungsauen eine von 5 verschiedene Inseminatvarianten intrauterin appliziert: PBS allein (PBS); Seminalplasma allein (SP); Nebenhodenschwanzsperma in PBS (NHS); Spermien in PBS (PBSSp); Spermien in Seminalplasma (SPSp). Das Inseminat hatte dabei jeweils ein Volumen von 80 ml und enthielt gegebenenfalls 3 x10 9 Spermien. Eine unbesamte Negativkontrolle (NC) vervollständigte die Untersuchungsgruppen. Zwei Stunden nach Behandlung wurden die Tiere geschlachtet und der Reproduktionstrakt entfernt. Auf die Spülung eines der beiden Uterushörner mit 20 ml einer PBS-Lösung folgte die Aufbereitung von Gewebeproben zur Herstellung histologischer Schnitte und einer anschließenden Präparation des uterinen Epithelzellgewebes zur Gewinnung von RNA für Genexpressionsstudien. Das zweite Uterushorn diente einer Gramfärbung zum Ausschluss symptomloser Infektionen. Die aus dem Uterus gewonnene Spülfüssigkeit wurde hinsichtlich der Quantität rückgespülter Spermien und Leukozyten untersucht. Die geringsten Mengen der in das Uteruslumen eingewanderter Leukozyten sowie die größte Anzahl an rückgespülten Spermien konnten in der Untersuchungsgruppen SPSp gezählt werden. Die RNA-Proben wurden mittels eines speziell gefertigten Mikroarray-Chips auf die Expression von 349 immunrelevanten Genen untersucht. Der Gruppenvergleich NC versus SPSp ergaben mit 15 die meisten der differentiell regulierten Gene. Die in dieser Gruppe regulierten Gene CD163 und PPAR-alpha wurden nachfolgend mittels immunhistologischen Untersuchungen näher untersucht. Der Nachweis von CD163- Protein gelang, jedoch wurden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der detektierten Menge an CD163 im uterinen Epithelzellgewebe festgestellt. Für PPARalpha konnte keine Expression im uterinen Epithelzellgewebe ermittelt werden. Die 97

98 Zusammenfassung Validierung der Mikroarray Ergebnisse mittels Real-time PCR zeigte weitgehende Übereinstimmungen. In einem zweiten Besamungsversuch wurde die Zeitkinetik der uterinen Immunantwort untersucht. Nach Instillation von entweder PBS allein oder Spermien in Seminalplasma in präpuberale Jungsauen wurde der Reproduktionstrakt zu verschiedenen Zeitpunkten (15 min, 2h und 6h nach Besamung, sowie zum Zeitpunkt der Ovulation) chirurgisch entfernt. Die weiteren Untersuchungen wurden gemäß dem ersten In-vivo-Versuch durchgeführt. Wie im ersten Versuchsabschnitt fanden sich hierbei im Gruppenvergleich NC versus SPSp mit 17 die meisten differentiell regulierten Gene, allerdings zeitverschoben zu 6 Stunden nach der Besamung. Ausserdem zeigte es sich, dass zum Zeitpunkt der Ovulation jegliche immunologische Reaktion des Uterus abgeschlossen war. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit schließen: Die Besamungsportionen, welche sowohl Spermien als auch Seminalplasma enthielten, also den Komponenten des Eberejakulates im Natursprung entsprachen, wiesen den geringsten Anteil ins Uteruslumen eingewanderter Leukozyten auf, bei gleichzeitig vergleichsweise hoher Rate rückgespülter Spermien. Darüber hinaus konnte in beiden Versuchsabschnitten gezeigt werden, dass es bei Kontakt des Uterusepithels mit Spermien und Seminalplasma in Kombination zu einer signifikanten Änderung im Genexpressionsmusters im Vergleich mit der Negativkontrolle kommt. Dieses verdeutlicht und unterstreicht die These, dass die Kombination aus Spermien und Seminalplasma einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Modulation der porcinen, uterinen Immunantwort hat. Es ist zu vermuten, dass die Einflussnahme auf die uterine Genexpression durch Seminalplasma-vermittelte Bindung der Spermien an das Uterusepithel erfolgt, auch wenn der eigentliche Beweis für diese Bindung noch austeht. Diese Bindung könnte auch einen Teil der Verantwortung für die hohen uterinen Spermienverluste tragen. 98

99 Zusammenfassung Ein weiterer interessanter Befund dieser Studie ist, dass jegliche Änderungen in der Genexpression zum Zeitpunkt der Ovulation nicht mehr nachweisbar sind. Derzeit laufende in-vitro Untersuchungen haben zum Ziel die Spermien-Epithelzellbindung direkt nachzuweisen und den Bindungsmechanismus zu entschlüsseln. 99

100 Summary 7 Summary Sonja Junge-Krämer: Characterization of the interaction of porcine spermatozoa with uterine epithelial cells and the coinciding gene expression with regard to modulations of a successful artificial insemination procedure. During the past two decades artificial insemination in pigs has become more a more important worldwide. Optimized insemination management has led to high fertilisation rates of up to 90 %. However, at least 1 x 10 9 spermatozoa per AI portion are needed to succeed. This limits the efficient use of boars and ejaculates. Furthermore the application of innovative biotechnological methods in pig reproduction such as sex differentiation of spermatozoa by flow-cytometry, are margined. In order to reduce the number of spermatozoa for successful insemination, complex techniques are needed such as deep intra-uterine and laparoscopicoviductal insemination, as bypassing the uterus avoids sperm selection. To enable conventional artificial insemination but with reduced numbers of spermatozoa, a better understanding of essential uterine mechanisms of sperm selection is needed. The aim of this thesis is to identify, by an improved understanding of sperm retention mechanisms as well as the immunological reaction of the porcine uterus, new methods to optimize artificial insemination management in the pig. Thus the following hypotheses were aligned: 1. The retention of porcine spermatozoa in the uterus is mediated by binding of the spermatozoa to the uterine epithelial cell tissue. 2. The interactions between spermatozoa and the epithelium are mediated by seminal plasma components. 3. The binding of spermatozoa to uterine epithelial cells influences the gene expression in the uterus and has effects on later events such as nidation and embryonic development. In the first of two in vivo trials, pre-ovulatory gilts were artificially inseminated intrauterine with one of five different inseminate treatments: PBS only (PBS); seminal 100

101 Summary plasma only (SP); epididymal sperm in PBS (NHS); spermatozoa in PBS (PBSSp); spermatozoa in seminal plasma (SPSp). Volumes of 80 ml were used containing 3 x 10 9 spermatozoa respectively. A not inseminated negative control (NC) completed the treatment groups. Two hours after treatment animals were slaughtered and the reproductive tract was extracted. One uterine horn was flushed with 20 ml PBS and then used to gain samples for histological slices as well as salvaging uterine epithelium tissue for RNA extraction for later gene expression studies. The other horn served for a gram stain to detect possible latent infections. In the gathered fluid from the uterine flush the number of spermatozoa and leukocytes was quantified. The lowest number of luminal leukocytes and coinciding with it, the highest number of retrieved spermatozoa were found in the treatment group SPSp. The RNA samples were analysed for the expression of 349 immunorelevant genes with a custom made micro-array chip. The groups NC versus SPSp showed 15 differentially regulated genes, which was the highest number in all groups compared. The expression of two genes, CD136 and PPAR-alpha, were additionally analysed on protein level using immunohistological methods. CD136 could be detected, but no significant change in the amount of CD163 protein was detected in the uterine tissue. PPAR-alpha could not be shown to be expressed in the epithelial tissue. The micro-array results were validated by quantitative PCR. In the second insemination trial the time associated kinetics of the uterine immune response were examined. After instillation of either PBS only or spermatozoa in seminal plasma to pre-puberal gilts, the reproductive tract was extracted surgically at different times post AI (15min, 2h, and 6h post insemination as well as time of ovulation). The succeeding investigations were undertaken in the same ways as for the first trial. Repeating the results from the first trial, the NC and the treatment group SPSp showed 17 differentially regulated genes, but shifted in time, namely after 6 hours post insemination. Also, it was observed that at time of ovulation all immunological responses in the uterus were completed. 101

102 Summary From the findings in these studies it can be summarized that: Insemination portions that contained spermatozoa as well as seminal plasma, which therefore correspond to compounds in boar ejaculates in natural service, showed the lowest number of leukocytes migrated into the uterine lumen and at the same time high numbers of retained spermatozoa. Moreover, in both trials it could be shown that contact of the uterine epithelium with spermatozoa in presence of seminal plasma lead to a significant regulation of the gene expression of the endometrium compared to the negative control. This emphasises the hypothesis that the combination of spermatozoa and seminal plasma has an significant effect on the modulation of the porcine maternal immune response after insemination. We propose that this effect on the uterine gene expression is caused by seminal plasma mediated binding of spermatozoa to the uterine epithelium even though this binding is still to be substantiated. This binding may also account for the high sperm losses. A further interesting finding of this study is that by the time of ovulation no changes in gene expression could be detected comparing inseminated and not inseminated animals. Currently on going experiments are aimed at verifying and identifying this spermepithelial cell binding. 102

103 Anhang 8 Anhang 8.1 Verzeichnis der im Mikroarray geprüften Gene Gen / Abkürzung NCBI-Nr. / Datenbank-Nr. Vermerke / Genbezeichung ZFP36 NM_ Sus scrofa zinc finger protein 36, C3H type, homolog (mouse) (ZFP36), mrna. XCL1 NM_ Sus scrofa chemokine (C motif) ligand 1 (XCL1), mrna. XCL2 AY Sus scrofa CXCL2 mrna, complete cds TYK2 NM_ Sus scrofa tyrosine kinase 2 (TYK2), mrna. TXK AY Sus scrofa tyrosine-protein kinase TXK mrna, partial cds. ALOX15 NM_ Sus scrofa arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15), mrna. ALOX5 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Arachidonate 5-lipoxygenase CCL1 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 1 (CCL1), mrna. CCL11 AY Sus scrofa chemokine ligand 11-like mrna, partial sequence CCL14 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CCL16 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 103

104 Anhang CCL17 DQ Sus scrofa chemokine ligand 17-like protein mrna, partial cds. CCL19 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 19 (CCL19), mrna CCL2 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), mrna. CCL20 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 20 (CCL20), mrna CCL21 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 21 (CCL21), mrna CCL22 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CCL23 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CCL24 NM_ Sus scrofa chemokine ligand 24-like protein (LOC780407), mrna. CCL25 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 25 (CCL25), mrna CCL26 NM_ Sus scrofa chemokine ligand 26-like protein (LOC780409), mrna. CCL27 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 27 (CCL27), mrna CCL28 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 28 (CCL28), mrna CCL3L1 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1 (CCL3L1), mrna. CCL4 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 4 (CCL4), mrna 104

105 Anhang CCL5 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5), mrna. CCL8 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) ligand 8 (CCL8), mrna PIK3CA GenBank Acc: CV PDUts1112B03 Porcine testis cdna library I Sus scrofa cdna clone PDUts1112B03 5- similar to homologue to ref NM_ Homo sapiens phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide (PIK3CA), mrna, mrna sequence PIK3CG NM_ Sus scrofa phosphoinositide-3-kinase, catalytic, gamma polypeptide, (PIK3CG), mrna. PIK3R3 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PIK3R5 IL10 NM_ NM_ Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5 oder P101, Sus scrofa p101 protein (P101), mrna. Sus scrofa interleukin 12A (natural killer cell stimulatory factor, IL12A NM_ maturation factor 1, p35) (IL12A), mrna. IL12B NM_ IL13 EU IL15 DQ Sus scrofa interleukin 15 (IL15) mrna, complete cds. IL16 NM_ IL17A NM_ , cytotoxic lymphocyte 105

106 Anhang IL17B XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Interleukin-17 receptor B precursor (IL-17 receptor B) (IL- 17RB) (Interleukin-17B receptor)(il-17b receptor) (IL-17 receptor homolog 1) (IL-17Rh1) (IL17Rh1) (Cytokine receptor CRL4) (LOC ), mrna IL17D TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index IL17F XM_ PREDICTED: Sus scrofa interleukin 17F (LOC ), mrna. IL18 NM_ Sus scrofa interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor) IL18BP TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index IL19 DQ Sus scrofa interleukin 19 (IL19) mrna, partial cds IL1A NM_ Sus scrofa interleukin 1, alpha (IL1A), mrna. IL1B NM_ Sus scrofa interleukin-1 beta (IL-1beta), mrna. IL1F5 GenBank: EW rcsk02_e5.y1 csk Sus scrofa cdna 5-, mrna sequence IL1F6 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index IL1RL1 EU Sus scrofa interleukin 1 receptor-like 1 (IL1RL1) mrna, partial IL1RN NM_ Sus scrofa interleukin 1 receptor antagonist (IL1RN), mrna IL2 EU Sus scrofa interleukin-2 mrna, complete cds. IL20 DQ Sus scrofa interleukin 20 mrna, partial cds. IL21 NM_ Sus scrofa interleukin 21 (IL21), mrna. IL22 AY Sus scrofa interleukin 22 mrna, partial cds. IL23A NM_ Sus scrofa interleukin 23, alpha subunit p19 (IL23A), mrna. 106

107 Anhang IL24 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index IL25 dbest Id: , GenBank: BU IL26 DQ Sus scrofa interleukin 26 mrna, partial cds. IL27 NM_ Sus scrofa interleukin 27 (IL27), mrna. IL28B NM_ Sus scrofa interleukin 28B (IL28B), mrna. PS72U47 Pig Skin Subtraction Library- Sulfur Mustard Regulated Transcripts Sus scrofa cdna similar to Mus musculus interleukin 25 (Il25), mrna, mrna sequence IL29 NM_ Sus scrofa interleukin 29 (interferon, lambda 1) (IL29), mrna IL3 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Nuclear factor, interleukin 3, regulated (LOC ), mrna. IL31 EF Sus scrofa interleukin 31 receptor A mrna, partial cds IL33 GenBank: BX BX Sus Scrofa library (scan) Sus scrofa cdna clone scan0023.c.23 5prim, mrna sequence IL34 EU Sus scrofa putative interleukin-34 (IL34) mrna, complete cds. IL5 NM_ Sus scrofa Interleukin 5 (IL-5), mrna. IL6 PIGIL6A Sus scrofa interleukin 6 (IL-6) mrna, complete cds. IL6ST NM_ Sus scrofa interleukin 6 signal transducer (gp130, oncostatin M receptor) (IL6ST), mrna. IL8 NM_ Sus scrofa interleukin 8 (IL8), mrna. IL8RA AF Also known as CXCR1; IL8RA, Sus scrofa interleukin 8 receptor 1 (IL8R1) gene, partial cds. 107

108 Anhang IL8RB XM_ IL9 NM_ Sus scrofa interleukin 9 (IL9), mrna. chemokine (C-X-C motif) receptor 2, interleukin 8 receptor, beta,predicted: Sus scrofa interleukin 8 receptor, beta (IL8RB), mrna. IL9R AK Sus scrofa mrna, clone:pbl010087g05, expressed in periphral blood mononuclear cell INDO TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index INHA DQ Sus scrofa inhibin alpha subunit (INHA) gene, complete cds. INHBA NM_ Sus scrofa inhibin, beta A (INHBA), mrna. INHBB NM_ Sus scrofa inhibin, beta B (INHBB), mrna. CSF1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to colony stimulating factor 1, (LOC ), mrna. CSF2 NM_ Sus scrofa colony stimulating factor 2 (granulocyte-macrophage) CSF3 NM_ Sus scrofa colony stimulating factor 3 (granulocyte) (CSF3), mrna CCRL1 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) receptor-like 1 (CCRL1), mrna CCRL2 NM_ Sus scrofa chemokine (C-C motif) receptor-like 2 (CCRL2), mrna CD14 EF Sus scrofa CD14 gene, complete cds. CD163 EU Sus scrofa CD163 mrna, complete cds. CD46 NM_ Sus scrofa CD46 molecule, complement regulatory protein (CD46), mrna 108

109 Anhang CEBPA AF CCAAT/enhancer binding protein alpha, Sus scrofa CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP alpha) mrna CEBPB AF Sus scrofa CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBP beta) mrna, partial CEBPD CEBPE XM_ XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to CCAAT/enhancer-binding delta protein (LOC ), mrna PREDICTED: Sus scrofa similar to CCAAT/enhancer binding protein, epsilon (LOC ), mrna. CLEC7A DQ Sus scrofa C-type lectin domain family 7, member A (CLEC7A) mrna partial CMA1 BV CMA1-1 Porcine genomic DNA PCR Sus scrofa STS genomic, sequence tagged site. CX3CL1 DQ Sus scrofa chemokine (C-X3-C motif) ligand 1 (CX3CL1) mrna, partial CXCL10 DQ Sus scrofa CXCL10 mrna, complete cds. CXCL11 NM_ Sus scrofa chemokine (C-X-C motif) ligand 11 (CXCL11), mrna. CXCL12 NM_ Sus scrofa chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1) (CXCL12), mrna. CXCL13 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CXCL14 AY Sus scrofa chemokine (CXCL14) mrna, partial cds. CXCL16/ SR-PSOX NM_ Sus scrofa scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized low density lipoprotein (SR-PSOX), mrna, scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized low density lipoprotein 109

110 Anhang CXCL17 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CXCL2 / CXCL2; GRO2; GROB; MIP2; MIP2A; SCYB2 NM_ Sus scrofa chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (CXCL2), mrna. CXCL5 NM_ oder Alveolar macrophage chemotactic factor-2 (AMCF-2, Sus scrofa alveolar macrophagederived chemotactic factor-ii CXCL9 /MIG NM_ Sus scrofa chemokine (C-X-C motif) ligand 9 (CXCL9), mrna. IFNA1 NM_ Sus scrofa interferon alpha-1 (IFNA1), mrna. IFNA10 NM_ Sus scrofa interferon-alpha-10 (IFN-ALPHA-10), mrna. IFNA14 NM_ Sus scrofa interferon-alpha-14 (IFN-ALPHA-14), mrna. IFNA2 NM_ Sus scrofa interferon alpha-2 (LOC ), mrna. IFNA4 NM_ Sus scrofa interferon-alpha-4 (IFN-ALPHA-4), mrna. IFNA5 NM_ Sus scrofa interferon, alpha 5 (IFN-ALPHA-5), mrna. IFNA8 NM_ Sus scrofa interferon-alpha-8 (IFN-ALPHA-8), mrna. IFNB1 NM_ Sus scrofa interferon beta (IFNB1), mrna. IFNE1 GQ Sus scrofa interferon-epsilon (IFN-epsilon) mrna, complete cds. IFNG NM_ Sus scrofa interferon-gamma (IFNG), mrna. ITGAD TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index ITGB2 NM_ ITGB6 NM_ Sus scrofa integrin, beta 6 (ITGB6), mrna. Sus scrofa integrin, beta 2 (complement component 3 receptor 3 and 4 subunit) (ITGB2), mrna. LTB EU Sus scrofa lymphotoxin beta (LTB) mrna, complete cds. LTA NM_ Sus scrofa lymphotoxin alpha (LTA), mrna. LGALS3BP TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 110

111 Anhang LGALS4 NM_ Sus scrofa lectin, galactoside-binding, soluble, 4 (LGALS4), mrna. LGALS9 NM_ Sus scrofa lectin, galactoside-binding, soluble, 9 (LGALS9), mrna TOLLIP/Toll-interacting protein TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index TLR1 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 1 (TLR1), mrna. TLR10 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 10 (TLR10), mrna. TLR2 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 2 (TLR2), mrna TLR3 DQ Sus scrofa Toll-like receptor 3 mrna, complete cds. TLR4 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 4 (TLR4), mrna. TLR5 FJ Sus scrofa toll-like receptor 5 (TLR5) mrna, complete cds. TLR6 AB Sus scrofa TLR6 mrna for Toll-like receptor 6, complete cds. TLR7 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 7 (TLR7), mrna. TLR8 NM_ Sus scrofa toll-like receptor 8 (TLR8), mrna. TLR9 NM_ Sus scrofa Toll-like receptor 9 (TLR9), mrna. TNF NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) (TNF), mrna PREDICTED: Sus scrofa similar to tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2 TNFAIP2 XM_ (LOC ), mrna. MAP2K3/ Mitogen-activated protein kinase kinase 3 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index MAP2K6/Mitogen-activated protein kinase kinase 6 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index MAP3K3/Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 111

112 Anhang MAP3K4/Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4 GenBank: CV MAP3K5/Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 XM_ PDUts1002E09 Porcine testis cdna library I Sus scrofa cdna clone PDUts1002E09 5- similar to homologue to ref NM_ Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4 (MAP3K4), transcript variant 1, mrna, mrna sequence PREDICTED: Sus scrofa similar to mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 (LOC ), mrna MAP3K7 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7- interacting protein 1 (TGF-beta-activated kinase TNFSF10 NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 (TNFSF10), mrna. TNFSF12A NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor receptor superfamily, member 12A TNFSF13B NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13b TNFSF18 DQ Sus scrofa tumor necrosis factor superfamily member 18 mrna, partial TNFSF4 NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 TNFSF7 NM_ heißt auch: Sus scrofa CD70 molecule (CD70), mrna TNFSF8 NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor receptor superfamily, member 8 TNFSF9 XM_ REDICTED: Sus scrofa similar to C1q and tumor necrosis factor related protein 9 (LOC ), mrna. CD58 AF Sus scrofa CD58 antigen (CD58) mrna, complete cds. 112

113 Anhang CD69 AF Sus scrofa type II membrane protein CD69 mrna, complete cds. CEACAM1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Protein LYRIC (Lysine-rich CEACAM1 co-isolated protein) (3D3/LYRIC) (Metastasis (LOC ), mrna.(metadherin) (Astrocyte elevated gene-1 protein) (AEG-1)adhesion protein) FABP4 NM_ Sus scrofa fatty acid binding protein 4, adipocyte (FABP4), mrna C3 NM_ Sus scrofa complement component 3 (C3), mrna. C5 NM_ Sus scrofa complement component 5 (C5), mrna. IRAK1 AJ Sus scrofa partial mrna for interleukin receptor associated kinase 1 IRAK2 XM_ REDICTED: Sus scrofa similar to interleukin-1 receptor-associated kinase 2 (LOC ), mrna. IRAK4 NM_ Sus scrofa interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4) IRF1 NM_ Sus scrofa interferon regulatory factor 1 (IRF1), mrna. IRF3 NM_ Sus scrofa interferon regulatory factor 3 (IRF3), mrna. IRF4 EF Sus scrofa interferon regulatory factor 4 mrna, partial cds IRAF7 / neu NM_ Sus scrofa interferon regulatory factor 7 (IRF7), mrna. JAK1 NM_ Sus scrofa Janus kinase 1 (JAK1), mrna JAK2 NM_ Sus scrofa Janus kinase 2 (JAK2), mrna. JAK3 AY Sus scrofa Janus kinase 3 (JAK3) gene, partial cds JAM3 TC Junctional adhesion molecule 3; CD323; JAM-3; JAM-C; Jcam3 113

114 Anhang Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CCBP2 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to chemokine binding protein 2 NFKB1 NM_ Sus scrofa nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (NFKB1), mrna. TGFB1 NM_ Sus scrofa transforming growth factor, beta 1 (TGFB1), mrna TGFB2 L08375 Sus scrofa transforming growth factor beta 2 mrna, 3' end. TGFB3 NM_ Sus scrofa transforming growth factor, beta 3 (TGFB3), mrna PF4 TC Platelet factor 4 (chemokine (C-X-C motif) ligand 4) (PF4); Oncostatin A; Iroplact; CXCL4 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PLA2G2A TC Phospholipase A2, group IIA (platelets, synovial fluid); Phosphatidylcholine 2-acylhydrolase; Group IIA phospholipase Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene IndexA2; GIIC spla2; Non-pancreatic secretory phospholipase A2 (NPS-PLA2); MOM1; PLA2; PLA2B; PLA2L; PLA2S; PLAS1; spla2 PLA2G7 NM_ Phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma) Sus scrofa phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma) (PLA2G7), mrna. TREM1 NM_ Sus scrofa triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1), mrna 114

115 Anhang TREM2 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (LOC ), mrna. TREML2 TC Triggering receptor expressed on myeloid cells-like 2; TREM-like transcript 2 (TLT2) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index SOD1 AF Sus scrofa superoxide dismutase 1 (SOD1) mrna, partial cds. S100A10 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to S100 calcium binding protein A10, transcript variant 3 (LOC ), mrna. S100A12 NM_ Sus scrofa S100 calcium binding protein A12 (S100A12), mrna S100A7 EF S100 calcium binding protein A7, psoriasin 1, Sus scrofa psoriasin 1 mrna, partial cds S100A8 NM_ S100 calcium binding protein A8, calprotectin Sus scrofa S100 calcium binding protein A8 (S100A8), mrna. S100A9 EU Sus scrofa calcium-binding protein S100A9 gene, complete cds. SOCS1 GQ Sus scrofa suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) mrna, partial SOCS2 NM_ Sus scrofa suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2), mrna SOCS5 NM_ Sus scrofa suppressor of cytokine signaling 5 (SOCS5), mrna PTX3 AK Sus scrofa mrna, clone:ovrm10148c10, expressed in ovary PTGES NM_ Sus scrofa prostaglandin E synthase (PTGES), mrna 115

116 Anhang PTGS1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa prostaglandin-endoperoxide synthase 1 (PTGS1) PTGS2/ PGHS-2, COX2 NM_ Sus scrofa prostaglandin G/H synthase-2 (PGHS-2), mrna SERPINA3-2 NM_ alpha-1-antichymotrypsin 2, Sus scrofa alpha-1-antichymotrypsin 2 (SERPINA3-2), mrna SERPINA3-3 AJ Sus scrofa partial mrna for alpha-1-antichymotrypsin 3 SERPINB9 NM_ Sus scrofa serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 9 (SERPINB9), mrna. STAT1 NM_ Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), mrna STAT2 NM_ Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 2 (STAT2), mrna. STAT3 NM_ Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), mrna. STAT4 XM_ PREDICTED: Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4), partial mrna. STAT5A NM_ Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 5a (STAT5A), mrna STAT5B NM_ Sus scrofa signal transducer and activator of transcription 5b (STAT5B);mRNA ST3GAL4 NM_ Sus scrofa ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 4(ST3GAL4), mrna SELE NM_ Sus scrofa selectin E (SELE), mrna SLPI NM_ Sus scrofa secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), mrna SMAD1 NM_ Sus scrofa SMAD family member 1 (SMAD1), mrna 116

117 Anhang SMAD6 XM_ SELPLG NM_ Sus scrofa selectin P ligand (SELPLG), mrna PREDICTED: Sus scrofa similar to Mothers against decapentaplegic homolog 6 (SMAD 6) (Mothers against DPP homolog 6) (Smad6) (hsmad6) SIGLEC1 NM_ Sus scrofa sialoadhesin (SIGLEC-1), mrna. Sialic acid binding Ig-like lectin 5; CD33 antigen-like 2 (CD33L2); OB binding protein-2 (OB- SIGLEC5 TC BP2, OBBP2); CD170 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index SIRPA NM_ Sus scrofa signal-regulatory protein alpha (SIRPA), mrna TGM2 XM_ Transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyltransferase); C polypeptide; TGase C; TGase- TGH2 (LOC ), mrnah;predicted: Sus scrofa similar to tissue transglutaminase homologue; protein-glutamine-gammaglutamyltransferase; tissue transglutaminase; transglutaminase 2; transglutaminase C; cytosolic transglutaminase THBS1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa thrombospondin 1 (THBS1), mrna THPO TC Thrombopoietin (myeloproliferative leukemia virus oncogene ligand, megakaryocyte growth and development factor) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index IFNK NM_ Sus scrofa interferon-kappa (IFN-KAPPA), mrna IFNW1 NM_ Sus scrofa interferon omega 1 (LOC ), mrna. 117

118 Anhang SCYE1 oder AIMP1 NM_ Sus scrofa aminoacyl trna synthetase complex-interacting multifunctional protein 1 (AIMP1), mrna. PRKCA AY Sus scrofa protein kinase C alpha mrna, partial cds ADORA1 NM_ Sus scrofa A1 adenosine receptor (LOC606743), mrna. ADORA2A XM_ PREDICTED: Sus scrofa adenosine A2a receptor (ADORA2A), mrna ADORA3 XM_ PREDICTED: Sus scrofa A3 adenosine receptor (LOC606753), mrna. PROCR NM_ Sus scrofa protein C receptor, endothelial (EPCR) (PROCR), mrna. ACE2 NM_ Sus scrofa angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A)3 ACE3 mrna ADA TC Adenosine deaminase; Adenosine aminohydrolase AGER/SBAB-649D6.10 NM_ advanced glycosylation end product-specific receptor Sus scrofa advanced glycosylation end product-specific receptor AGT XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to angiotensinogen (LOC ) NOX1 AJ Sus scrofa partial NOX1 gene for NADPH oxidase 1, exons 3-5 NOX4 NOX5 TC XM_ NADPH oxidase 4; Kidney superoxide-producing NADPH oxidase (KOX), KOX-1, RENOX Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PREDICTED: Sus scrofa similar to NADPH oxidase, EF-hand calcium binding domain 5 (LOC ), mrna CRP NM_ Sus scrofa C-reactive protein (CRP), mrna CTSG XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Cathepsin G precursor (CG) (LOC ), mrna. 118

119 Anhang CTSS XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Cathepsin S (LOC ), mrna PREDICTED: Sus scrofa attractin (ATRN), partial mrna Sus scrofa annexin A1 (ANXA1), ATRN XM_ mrna ANXA1 AHSG NM_ X56021 Alpha-2-HS-glycoprotein; Alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotein; fetuin A (FETUA); 63-kDa phosphoprotein (pp63); S.scrofa mrna for fetuinalpha-2-z-globulin; AHS; A2HS; HSGA AIF1 NM_ Sus scrofa allograft inflammatory factor 1 (AIF1), mrna. ALCAM AJ Sus scrofa partial mrna for activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM gene) AOAH AOC3 TC TC Acyloxyacyl hydrolase (neutrophil) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index Amine oxidase, copper containing 3 (vascular adhesion protein 1); VAP-1 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene IndexGene Index DPP4 NM_ Sus scrofa dipeptidyl-peptidase 4 (DPP4), mrna. F3 NM_ Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor); CD142; TF, Sus scrofa tissue factor (LOC396677), mrna. FADD NM_ Sus scrofa Fas (TNFRSF6)-associated via death domain (FADD), mrna FASLG NM_ Sus scrofa Fas ligand (TNF superfamily, member 6) (FASLG), mrna 119

120 Anhang FLT3 FLT3LG TC GU Fms-related tyrosine kinase 3; Fetal liver kinase 2 (Flk-2); STK-1; CD135 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index Sus scrofa fms-related tyrosine kinase 3 ligand transcript variant 3 (FLT3LG) mrna, partial cds. FOXP3 AM Sus scrofa mrna for forkhead box P3 (FOXP3 gene) FST NM_ Sus scrofa follistatin (FST), mrna FUT7 TC Fucosyltransferase 7 (alpha (1,3) fucosyltransferase); FucT-VII; Selectin-ligand synthase; Alpha(1,3)-fucosyltransferase Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene IndexVII GADD45B TC Growth arrest and DNA-damage-inducible, beta; MyD118 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index GADD45G TC Growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma; cytokine responsive protein 6 (CR6); Gadd45-related protein Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index(GRP17); oncostatin M-inducible protein OIG37 GDF11 XM_ PREDICTED: Sus scrofa growth differentiation factor 11 (GDF11) GDF15 TC Growth differentiation factor 15; Prostate differentiation factor beta (PTGFB); Macrophage inhibitory cytokine 1 (MIC-1, MIC1) NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drug)-activated protein 1 (NAG-1); PDF; Placental bone morphogenic Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index protein beta (PLAB) 120

121 Anhang GDF5 EU Sus scrofa scrofa GDF5 protein gene, partial cds GDF8 AY MSTN; GDF8, Sus scrofa myostatin (MSTN) mrna, complete cds GPI NM_ Sus scrofa glucose phosphate isomerase (GPI), mrna. GPNMB NM_ Sus scrofa glycoprotein (transmembrane) nmb (GPNMB), mrna GPX1 NM_ Sus scrofa glutathione peroxidase 1 (GPX1), mrna GPX2 DQ Sus scrofa glutathione peroxidase 2 (GPX2) mrna, complete cds. GPX4 NM_ Sus scrofa glutathione peroxidase 4 (GPX4), mrna HDAC4 TC Histone deacetylase 4 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index HIF1A NM_ Sus scrofa hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor) (HIF1A), mrna SLA-1** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 1 (SLA-1), mrna SLA-10** Z97400 Sus scrofa SLA-10 gene, exons 3 and 4 (partial). SLA-2** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 2 (SLA-2), mrna. 121

122 Anhang SLA-3** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 3 (SLA-3), mrna SLA-5** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 5 (SLA-5), mrna SLA-6** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 6 (SLA-6), mrna SLA-7** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 7 (SLA-7), mrna SLA-8** NM_ Sus scrofa MHC class I antigen 8 (SLA-8), mrna. SLA-9** Z97396 Sus scrofa SLA-9 gene, exon/intron 1 (partial). SLA-DMA (X) NM_ Sus scrofa SLA-DM alpha chain (SLA-DMA), mrna. SLA-DMB (Y) NM_ Sus scrofa MHC class II, DM beta (SLA-DMB), mrna SLA-DOA (Y) NM_ Sus scrofa major histocompatibility complex, class II, DO alpha (SLA-DOA), mrna SLA-DOB (Y) NM_ Sus scrofa MHC class II, DO beta (SLA-DOB), mrna SLA-DQA1 (X) NM_ Sus scrofa MHC class II histocompatibility antigen SLA-DQA1 SLA-DQB1 (Y) NM_ Sus scrofa SLA-DQ beta1 domain (SLA-DQB1), mrna SLA-DRA (X) NM_ Sus scrofa MHC class II DR-alpha (SLA-DRA), mrna SLA-DRB1 NM_ Sus scrofa MHC class II histocompatibility antigen SLA-DRB1 (SLA-DRB1), mrna BTNL2 XM_ Butyrophilin-like 2 (MHC class II associated); BTL-II; HSBLMHC1; Btl2; Gm315; NG9, PREDICTED: Sus scrofa similar to butyrophilin-like 2 (LOC ), mrna. CD200R1L TC CD200 receptor 1-like 1; CD200 cell surface glycoprotein receptor isoform 2 (CD200R2) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index CD300LF (X) TC CD300 antigen like family member F; CMRF-35-like molecule 1 (CLIM1, CLM-1, CLM1); DCderived Ig-like receptor 2 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index(Digr2); polymeric immunoglobulin receptor 3 (Pigr3); Immune receptor expressed on myeloid cells 1 (IREM1); Immunoglobulin superfamily; member 13 (IgSF13); NK inhibitory receptor precursor (NKIR) CD36 NM_ Sus scrofa CD36 molecule (thrombospondin receptor) (CD36), mrna. 122

123 Anhang HMMR (CD168) TC Hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM); Intracellular hyaluronic acid binding protein (IHABP); CD168 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index HMGB1 NM_ Sus scrofa high-mobility group box 1 (HMGB1), mrna HSPD1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin), transcript variant 1 (HSPD1), mrna INPP5D TC Inositol polyphosphate-5-phosphatase; 145kD (INPP5D); SHIP1; SH2 containing inositol phosphatase; SH2 containing Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Indexinositol phosphatase, isoform b; p150ship; signaling inositol polyphosphate 5 phosphatase SIP-145 LAMP1 NM_ Sus scrofa lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP-1), LBP NM_ Sus scrofa lipopolysaccharide binding protein (LBP), mrna MMP2 FJ Sus scrofa matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) mrna, complete cds MMP7 NM_ Sus scrofa matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine) (MMP7) 123

124 Anhang MMP9 NM_ Sus scrofa matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase) (MMP9), mrna MPO AF Sus scrofa myeloperoxidase (MPO) gene, exons 9 and 10 and partial MYD88 AB Sus scrofa MyD88 mrna for myeloid differentiation primary response gene 88, complete cds MADCAM1 NM_ Sus scrofa mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1 (MADCAM1), mrna. NPY2R NM_ Sus scrofa neuropeptide Y receptor Y2 (NPY2R), mrna NLRP12 TC NLR family, pyrin domain containing 12; NACHT, leucine rich repeat and PYD containing 12 (NALP12); monarch 1; PYRIN-containing APAF1-like protein 7 (Pypaf7); RNO; RNO2 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index NLRP3 TC NLR family, pyrin domain containing 3; Cold autoinflammatory syndrome 1 (CIAS1); AII/AVP receptor-like; Muckle-Wells syndrome (MWS); NACHT, LRR and PYD containing protein 3 (NALP3); PYRIN-containing APAF1-like protein 1 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index(PYPAF1); angiotensin/vasopressin receptor AII/AVP-like; chromosome 1 open reading frame 7 (C1orf7); cryopyrin ORM1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa orosomucoid 1 (ORM1), mrna. LITAF TC Lipopolysaccharide-induced TNF factor; p53 induced gene 7 (PIG7); small integral membrane protein of lysosome/late endosome (SIMPLE); tumor protein p53 inducible protein 7 (TP53I7); TBX1 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 124

125 Anhang LTA4H AB Sus scrofa LTA4H mrna for leukotriene A4 hydrolase, complete cds. PAEP NM_ Sus scrofa beta-lactoglobulin (LOC396596), mrna. Progestagen-associated endometrial protein (placental protein 14; pregnancy-associated endometrial alpha-2-globulin; alpha uterine protein); Glycodelin; beta lactoglobulin (BLG, LGB); beta lactoglobulin D; LACB LYZ NM_ Sus scrofa lysozyme (renal amyloidosis) (LYZ), mrna. PREDICTED: Sus scrofa similar to Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1 (MALT lymphoma-associated translocation) (Paracaspase) MALT1 XM_ (LOC ), mrna. MIF MNDA NM_ TC Sus scrofa macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) (MIF), mrna. Myeloid cell nuclear differentiation antigen; PYHIN3 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 125

126 Anhang MRC1 AY Sus scrofa mannose receptor C1 mrna, partial cds MST1 TC Macrophage stimulating 1 (hepatocyte growth factor-like); Macrophage-stimulating protein (MSP) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index NALP6 NM_ Sus scrofa NLR family, pyrin domain containing 5 (NLRP5), mrna NMUR2 FJ Sus scrofa neuromedin s receptor 2 protein (NMSR2) mrna, partial NRG1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to neuregulin 1 (LOC ), mrna PHF11 TC PHD finger protein 11; APY, BCAP, IGEL, IGER, IGHER; IgE responsiveness (atopic) Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PLAT NM_ Sus scrofa plasminogen activator, tissue (PLAT), mrna. PLAU NM_ Sus scrofa plasminogen activator (PLAU), mrna PLXNC1 PML TC XM_ Plexin C1; PLXN-C1; Virally-encoded semaphorin receptor (VESPR); CD232 Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PREDICTED: Sus scrofa similar to promyelocytic leukemia protein (LOC ), mrna. POU2F1 NM_ Sus scrofa POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), mrna PRDX5 NM_ Sus scrofa peroxiredoxin 5 (PRDX5), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mrna 126

127 Anhang PRG1 XM_ PREDICTED: Sus scrofa proteoglycan 1 precursor-like, transcript variant 1 (LOC ), mrna. RARRES2 NM_ Sus scrofa retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2 (RARRES2), mrna RETN NM_ Sus scrofa resistin (RETN), mrna ROCK1 D89493 Sus scrofa mrna for Rho-kinase beta, partial cds RSAD2 NM_ Sus scrofa inflammatory response protein 6 (IRG6), mrna IRG6; CIG6; RSAD2 SCG2 NM_ Sus scrofa secretogranin II (SCG2), mrna SCGB1A1 DQ Sus scrofa secretoglobin family 1A member 1 (SCGB1A1) gene, exons 2, 3 and partial cds IL31RA1 NM_ Sus scrofa interleukin 13 receptor, alpha 1 (IL13RA1), mrna TNFAIP6 NM_ Sus scrofa tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), mrna. CLEC4G NM_ Sus scrofa C-type lectin domain family 4, member G (CLEC4G), mrna. CLEC5A NM_ Sus scrofa C-type lectin domain family 5, member A (CLEC5A), mrna SAA1-1 BV SAA1-1 Porcine genomic DNA Sus scrofa STS genomic, sequence tagged site SAA1-2 BV SAA1-2 Porcine genomic DNA Sus scrofa STS genomic, sequence tagged site CTSL2 NM_ Sus scrofa cathepsin L (CTSL2), mrna. CTSH NM_ Sus scrofa cathepsin H (CTSH), mrna. 127

128 Anhang CTSK NM_ Sus scrofa cathepsin K (CTSK), mrna GADD45A NM_ Sus scrofa growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha (GADD45A) HDAC2 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to histone deacetylase 2 (LOC ), mrna PREDICTED: Sus scrofa similar to histone deacetylase 8 (HD8) (LOC ), HDAC8 XM_ mrna HD8 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to Histone deacetylase 8 (HD8) partial mrna (LOC ), SLA-8 zusätzlich AK Sus scrofa mrna, clone:ovrm10066d05, expressed in ovary SLA-DOB AK Sus scrofa mrna, clone:pbl010060a11, expressed in periphral blood mononuclear cell INPP5F XM_ PREDICTED: Sus scrofa inositol polyphosphate-5-phosphatase F (INPP5F), mrna NMUR1 FJ Sus scrofa neuromedin S receptor 1 (NMS1R) mrna, partial cds. RIPK3 XM_ PREDICTED: Sus scrofa similar to receptor-interacting serine-threonine kinase 3 (LOC ), mrna. VEGF AF Sus scrofa vascular endothelial growth factor mrna, complete cds. VEGF AF Sus scrofa vascular endothelial growth factor 189 (VEGF) mrna, partiel!! ALOX12 GenBank: M , PIGLOX12A Pig arachidonate 12-lipoxygenase mrna, complete cds. ALOX12 D10621 Sus scrofa gene for arachidonate 12-lipoxygenase, complete cds 128

129 Anhang IL4 PIGIL4A Pig interleukin 4 mrna, complete cds. IL4 NM_ Sus scrofa interleukin 4 (IL4), mrna. IL7 NM_ Sus scrofa interleukin 7 (IL7), mrna. IL7 EU Interleukin 7 IRF2 DQ Sus scrofa IRF2 binding protein 2 (IRF2BP2) gene, partial cds. IRF2 DQ Sus scrofa IRF2 binding protein 1 gene, partial cds HDAC5 AY Sus scrofa histone deacetylase 5 (HDAC5) gene, partial cds HDAC5 AY Sus scrofa histone deacetylase 5 (HDAC5) gene, partial cds MST1R TC Macrophage stimulating 1 receptor (c-met-related tyrosine kinase); CDW136; CD136; Recepteur dªorigine nantais (RON); Stem cell-derived tyrosine kinase Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index MST1R TC Macrophage stimulating 1 receptor (c-met-related tyrosine kinase); CDW136; CD136; Recepteur dªorigine nantais (RON); Stem cell-derived tyrosine kinase Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PIAS4 TC Protein inhibitor of activated STAT, 4; PIASY; PIASgamma Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index PIAS4 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index RUNX1 TC Runt-related transcription factor 1 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene); Corebinding factor subunit alpha-2 (CBF-alpha-2); Acute myeloid leukemia 1 protein (Oncogene AML-1; Polyomavirus enhancer-binding protein 2 alpha B subunit (PEBP2-alpha B, PEA2-alpha B); SL3-3 enhancer factor 1 alpha B subunit; SL3/AKV corebinding factor alpha B subunit Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index 129

130 Anhang RUNX1 TC Achtung andere Datenbank: DFCI Sus scrofa Gene Index Runt-related transcription factor 1 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene); Core-binding factor subunit alpha-2 (CBF-alpha-2); Acute myeloid leukemia 1 protein(oncogene AML-1; Polyomavirus enhancer-binding protein 2 alpha B subunit (PEBP2-alpha B, PEA2-alpha B); SL3-3 enhancer factor 1 alpha B subunit; SL3/AKV core-binding factor alpha B subunit PPAR-alpha NM_ Sus scrofa peroxisome proliferator-activated receptor alpha PPAR-gamma NM_ Sus scrofa peroxisome proliferator-activated receptor gamma PPAR-beta/delta NM_ Sus scrofa peroxisome proliferator-activated receptor delta LIF NM_ Sus scrofa leukemia inhibitory factor (LIF), mrna. LIFR-beta SSU97364 Sus scrofa LIF receptor beta mrna, partial cds GAPDH AF Sus scrofa glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mrna 130

131 Anhang ß-Actin AY Sus scrofa cytoskeletal beta actin mrna, partial cds. BSP1 NM_ Sus scrofa binder of sperm 1 Chemokine ligand 2 AY_ Sus scrofa chemokine ligand 2 mrna, partial cds 131

132 Anhang 8.2 Abkürzungen der untersuchten Besamungsportionen in den Mikroarrayuntersuchungen / Boxplotgrafiken NC PBS SP PBSSp NHS SPSp X15 X2 X6 XOvu Negativkontrolle PBS Seminalplasma Ejakulierte Spermien in PBS versamt Nebenhodenschwanzsperma in PBS versamt Seminalplasma + ejakulierte Spermien Untersuchungsgruppe 15 Minuten nach Besamung Untersuchungsgruppe 2 Stunden nach Besamung Untersuchungsgruppe 6 Stunden nach Besamung Untersuchungsgruppe zum Zeitpunkt der Ovulation 132

133 Anhang 8.3 Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 1. Mikroarray CXCL14, NC versus SPSp, p=0,02 133

134 Anhang CXCL10, SPSp versus Sp, p=0,03 134

135 Anhang CD163, NC versus SPSp, p=0,01 135

136 Anhang IL7, NC versus NHS, p=0,01 136

137 Anhang F3, NC versus SPSp, p=0,04 137

138 Anhang ANXA1, NC versus NHS, p=0,01 138

139 Anhang HDAC2, NC versus SPSp, p=0,04 139

140 Anhang IL31RA1, PBS versus SPSp, p=0,00 140

141 Anhang STAT3, PBS versus SPSp, p=0,02 141

142 Anhang PPAR-alpha, NC versus SPSp, p=0,04 142

143 Anhang PRDX5, NHS versus Sp, p=0,02 143

144 Anhang PLAT, NHS versus SP, p=0,03 144

145 Anhang STAT5B, NHS versus SP, p=0,04 145

146 Anhang CTSK, NC versus SPSp, p=0,04 146

147 Anhang CTSL2, NC versus NHS, p=0,02 147

148 Anhang CTSH, NC versus SPSp, p=0,01 148

149 Anhang SMAD1, NC versus SPSp, p=0,02 149

150 Anhang CCL2, NC versus NHS, p=0,02 150

151 Anhang LYZ, NC versus SPSp, p=0,01 151

152 Anhang GPNMB, NC versus NHS, p=0,00 152

153 Anhang SCYE1 oder AIMP17, NC versus SPSp, p=0,02 153

154 Anhang AIF1, NC versus SPSp, p=0,02 154

155 Anhang SLA-DQB1, NC versus SPSp, p=0,01 155

156 Anhang S100A12, NC versus SPSp, p=0,01 156

157 Anhang CTSS, NC versus NHS, p=0,01 157

158 Anhang TNF alpha induzierendes Protein, NHS versus SP, p=0,03 158

159 Anhang MALT1, NHS versus SP, p=0,03 159

160 Anhang TGFbeta2, NC versus SPSp, p=0,02 160

161 Anhang JAK2, NHS versus SP, p=0,03 161

162 Anhang 8.4 Regulierte Gene als Boxplotgrafik, 2. Mikroarray ACE2, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 162

163 Anhang AHSG, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 163

164 Anhang AOAH, 6PBS versus 6SPSp, p=0,05 164

165 Anhang CEMPB, 15NC versus 15PBS, p=0,02 165

166 Anhang CXCL17, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 166

167 Anhang F3, 6NC versus 6SPSp, p=0,03 167

168 Anhang FLT3, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 168

169 Anhang IL31, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 169

170 Anhang IL7, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 170

171 Anhang JAK2, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 171

172 Anhang MIF, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 172

173 Anhang MNDA, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 173

174 Anhang MSTR1, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 174

175 Anhang NOX1, 6NC versus 6SPSp, p=0,03 175

176 Anhang ORM1, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 176

177 Anhang NMUR2, 6NC versus 6SPSp, p=0,03 177

178 Anhang NALP6, 6NC versus 6SPSp, p=0,02 178

179 Anhang SLA3, 6NC versus 6SPSp, p=0,03 179