Universitätsfrauenklinik und Poliklinik Ulm. Prof. Dr. med. R. Kreienberg. Untersuchung des Her-2/neu und weiterer molekularer Marker als mögliche

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1 Universitätsfrauenklinik und Poliklinik Ulm Prof. Dr. med. R. Kreienberg Untersuchung des Her-2/neu und weiterer molekularer Marker als mögliche prädiktive Faktoren für das Ansprechen präoperativer Chemotherapie bei Patientinnen mit lokal fortgeschrittenem Mammakarzinom Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Rebecca Kelsey Kästle-Cavallo Colchester/England

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Rafael Schick 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Martin Bentz Tag der Promotion:

3 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Einleitung Material Untersuchungsmaterial von Patienten Patientenkollektiv Materialien für Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Materialien für Immunhistochemie (IHC) Computerprogramme Methoden Vorbereitung für FISH und IHC Nachweis von Her-2/neu mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung Nachweis von Her-2/neu mittels IHC Nachweis von Östrogen- und Progesteronrezeptoren mittels IHC Methode zum Nachweis von Mib-1 / p53 mittels IHC Bestimmung der klinischen Responsebeurteilungskriterien Statistische Auswertungsmethoden Ergebnisse Ergebnisse des Her-2/neu Nachweisverfahrens mittels FISH Ergebnisse des Her-2/neu Nachweisverfahrens mittels IHC Gegenüberstellung der Ergebnisse aus den Untersuchungsverfahren zum Her-2/neu Nachweis FISH/IHC Ergebnisse des Mib-1 Nachweisverfahrens mittels IHC Ergebnisse des p53 Nachweisverfahrens mittels IHC Ergebnisse der Hormonrezeptor Nachweisverfahren mittels IHC Gegenüberstellung der Ergebnisse aus dem Her-2/neu Nachweis mit weiteren molekularen Markern und Merkmalen Gegenüberstellung der Ergebnisse innerhalb der Responsegruppen Diskussion Methoden zur Her-2/neu Bestimmung Untersuchte molekularbiologische Marker und weitere Merkmalsfaktoren Prädiktiver Aussagegehalt der untersuchten molekularbiologischen Marker 73 6 Zusammenfassung

4 Abkürzungsverzeichnis A AC: Anthracyclin und Cyclophosphamid AT: Anthracyclin und Taxan C CDDP: Cis-Diaminodichloroplatin CR: "complete remission" / komplette Remission D DAB: 3, 3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride DAPI: 4',6-diamidino-phenylindole DNA: Desoxyribonukleinsäure E EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme ligand immuno assay ER: estrogen receptor / Östrogenrezeptor F FAC: 5-Fluorouracil-Anthracyclin-Cyclophosphamid FDA: federal drug admission (US) FEC: 5-Fluorouracil-Epirubicin-Cyclophosphamid FISH: Fluoreszenz in situ Hybidisierung FITC: Fluorescein-5-Isothiocyanate ( Fluoreszenz markiertes Anti-Digoxigenin) G GABG: german adjuvant breastcancer group H HCI: Hydroxidchlorid HE: Hämatoxilin Eosin HRP: horse radish peroxidase 4

5 I IHC: Immunhistochemie IRS: Imune Reactive Score M MF: Methotrexat und Fluorouracil MRT: Magnet-Resonanz-Tomographie N NaCI: Natriumchlorid P PBD: phosphate buffered detergent PBS: phosphate buffered saline PD: progressive disease / Progression PDE: protein digestion enzyme PgR: progesteron receptor / Progesteronrezeptor PJ: Propidium-Jodid PR: partial remission / partielle Remission R rhumab: recombinant humized anti-p185-her2 monoclonal antibody S SD: stable disease / Stabilisierung SSC: saline sodium citrate U UICC: United International Cancer Criteria W WHO: world health organisation 5

6 1 Einleitung In der medizinischen Krebsbekämpfung bei Mammakarzinompatientinnen gewinnt die primäre, neoadjuvante Chemotherapie nebst der adjuvanten Chemotherapie zunehmend an Bedeutung. Bei dieser primären Chemotherapie für Brustkrebspatientinnen handelt es sich um ein Therapieverfahren, welches im Gegensatz zur konventionellen adjuvanten Chemotherapie eine Behandlung vor der Tumoroperation mit unterschiedlichen Chemotherapie-Schemata vorsieht. Die primäre Chemotherapie bei Patientinnen mit Mammakarzinom ist damit eine Therapieform, die eine Visualisierung des Therapieeffektes erlaubt und grundsätzlich damit die Möglichkeit bereithält, einen individuellen Erfolg für die Patientinnen im Verlauf abzulesen. Als wichtiger Aspekt für die wissenschaftliche Krebsforschung können dabei die wiederholten stanzbioptischen Verlaufskontrollen mit angeschlossenen molekularbiologischen Untersuchungen gesehen werden. Diese ermöglichen einen besseren Einblick in den Mechanismus des Tumoransprechens auf die systemische Therapie und dienen der raschen Verfügbarkeit von Information über die Einstufung der Chemosensitivität des Primärtumors (Kreienberg 1999). Dabei scheinen Chemosensitivität des Tumors und Langzeiteffekte des Therapieerfolges kongruent zu sein. Einer der weiteren wesentlichen Vorteile der primären Chemotherapie liegt in der Möglichkeit der Reduktion der Mastektomien, vor allem bei der Therapie von lokal fortgeschrittenen Mammakarzinomen. Diese kann dadurch erzielt werden, daß die primäre Chemotherapie bei positivem Ansprechverhalten eine Verkleinerung des Tumorgewebes noch vor der Operation ermöglicht. Außerdem kann bei nichtoperablen Mammakarzinomen der Tumorgrößenzuordnung T3/T4 nach primärer Chemotherapie mit dem Effekt eines Downstaging ein Status erreicht werden, bei dem eine Operation durchführbar ist (Fisher et al. 1997, Chollet et al. 1997, von Minckwitz et al. 1999). Nachteilig wirkt sich bei der primären Chemotherapie aus, daß der in der Tumorbehandlung bis dato wichtige prognostische Faktor des Lymphknotenstatus, histologisch nur zum Zeitpunkt der Operation ermittelt werden kann. Somit steht dieser prognostische Faktor nicht zum Aufnahmezeitpunkt der Behandlung mittels primärer Chemotherapie zur Verfügung. Zudem ist der initiale Lymphknotenstatus nach erfolgter primärer Chemotherapie oft schwieriger oder nicht mehr feststellbar. Dies könnte zur Folge haben, daß Patientinnen mit initial positiven Lymphknotenstatus, welcher nach einer primären Chemotherapie nicht mehr festgestellt 6

7 werden kann, postoperativ mit einem Therapieschema abweichend zu jenem mit nachgewiesenem Lymphknotenbefall behandelt werden. Derartige nachteilige Konstellationen werden in neueren Studien relativiert. Diese zeigen auf, daß verwendete Prognosefaktoren wie Lymphknotenstatus und Grading nicht geeignet sind, um das Ansprechverhalten auf die adjuvante Therapie sowie den klinischen Krankheitsverlauf hinreichend genau vorherzusagen (van t Veer et al. 2002). Bei nicht Ansprechen der Chemotherapie gehen unterdessen wichtige Wochen vor der chirurgischen Intervention verloren, was zur Zeit einen weiteren Nachteil der primären Chemotherapie darstellt. Zusammenfassend lassen sich die wichtigsten Nachteile der primären Chemotherapie vor allem auf das Fehlen gesicherter und aussagekräftiger Prognosefaktoren sowie Verfahren zur Prädiktion vor allem in Bezug auf die Chemosensititvät des Tumors und somit zum Therapieverhalten zurückführen. Die Vorteile hingegen erwachsen primär aus einem möglichen positiven Ansprechverhalten, sowie der Möglichkeit durch geeignete Nachweisverfahren prädiktiver Faktoren einen Einblick in den Mechanismus des Ansprechverhaltens und somit eine Visualisierung des Therapieeffektes zu gewinnen. Wird nun aufgrund dieser Vorteile der primären Chemotherapie, welche durch mehrere Studien (Fisher et al. 1997, Chollet et al. 1997, von Minckwitz et al. 1999) belegt werden können, das Ziel verfolgt, die klinische Anwendbarkeit zu fördern, so bleibt eine Fokusierung auf aussagekräftige prädiktive und prognostische Faktoren in diesem Zusammenhang unerläßlich. Gerade in diesem Bezug gewinnen in der Krebsforschung und -bekämpfung vor allem molekularbiologische Grundlagen und Vorgänge an Bedeutung. Onkogene rücken zunehmend in das Zentrum des Interesses, sowohl im Hinblick auf die Unterstützung der Tumordiagnostik, als auch hinsichtlich der Tumortherapie. Ein wichtiges Onkogen für die Brustkrebsforschung ist das Onkogen Her-2/neu, auch bekannt unter den Begriffen Her-2 Protein, c-erb-2 oder ErbB-2. Hierbei handelt es sich um einen transmembranen Wachstumsfaktor- Rezeptor vom Tyrosinkinase-Typ. Dieser kodiert für ein transmembranäres Phosphoglykoprotein und entspricht einem 185 Kilodalton schweren Protein mit Tyrosinkinase Aktivität, welches auf dem Chromosom 17 q12 bis q22 lokalisiert ist (Popescu et al. 1989). Her-2/neu weist eine große Homologie mit den natürlich vorkommenden EGF (epidermal growth factor) Rezeptorproteinen auf und 7

8 vermittelt Wachstumssignale als auch Proliferationsreize im Zellkern (Coussens et al. 1985). Der Mechanismus des Proliferationsreizes ausgehend von Her-2/neu im Zellkern des menschlichen Gewebes kann wie folgt beschrieben werden. Die Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne triggert die Phosphorylierung der intrazellulären Domäne. Dies löst wiederum eine Signalkaskade aus, die letztlich im Zellkern endet und dort einen Proliferationsreiz vermittelt. Zugleich führt die Liganden-Bindung zur Dimerisierung der Rezeptoren (Coussens et al. 1985, Slamon et al. 1987). Diese Mechanismen der molekularbiologischen Bindungsreaktionen sind im weiteren für diese Arbeit von großer Relevanz, als daß sie die Grundlagen bilden für die Funktionsweise der zur Anwendung kommenden Nachweisverfahren. Ebenso spielen die vorliegende molekularbiologischen Vorgänge eine wichtige Rolle, wenn es als Thema um die Bedeutung des Her-2/neu als prädiktiven Faktor in der Therapie von Mammakarzinom geht. Her-2/neu ist ausserdem der molekularbiologische Marker, welcher als Zielobjekt für den im Herbst 1998 von der FDA erstmals zugelassener Antikörper Herceptin (Trastuzumab) zum Einsatz in der Therapie des Mammakarzinoms kam. Damit bildet Her-2/neu die Grundlage für eine neue gezielte Therapieform, bei welcher Antikörper im Krieg gegen das Wachstum der Krebszellen zur Anwendung kommen. Diese neue Therapieform zeichnet sich durch die reduzierten toxischen Nebenwirkungen im Vergleich zu konventionellen Chemotherapieverfahren sowie durch die belegbare Verlängerung der Überlebenszeit von Mammakarzinompatientinnen mit amplifiziertem Her-2/neu Status aus (Pegram et al. 1998). Die Behandlung mit Herceptin stellt zwar eine neue und zusätzliche Therapieform dar, jedoch ist sie nur bei den Patientinnen mit amplifiziertem Her-2/neu Status indiziert. Neben dem Onkogen Her-2/neu gelten Punktmutationen des Tumorsuppressorgens p53 sowie der Nachweis von p53-expressionen in der molekularbiologischen Krebsforschung als wichtige Faktoren. Dabei ist das sogenannte p53-tumorantigen ein auf dem p-arm des Chromosom 17 lokalisiertes nukleäres Protein mit 53 Kilodalton Molekulargewicht. Die p53-expression gilt als eine essentielle Komponente in der malignen Transformation von Zellen im Tumorgewebe. Im Unterschied zum sogenannten Wildtyp des p53 Proteins, welches im Zellkern aller gesunden Zellen an der Regulation der Zellproliferation beteiligt ist und dabei aufgrund einer Halbwertszeit von nur 30 Minuten schwierig über molekular- 8

9 biologische Methoden nachzuweisen ist, zeigt das punktmutierte p53, welches in malignen Zellen vorkommt, eine deutlich verlängerte Halbwertszeit und kann so anhand der erhöhten Konzentration mittels eines immunhistochemischen Verfahrens nachgewiesen werden (Vojtesek et al. 1992). Ebenfalls am Proliferationsmechanismus der Zellen involviert und damit im Blickfeld der molekularbiologischen Krebsuntersuchung sind die Zellproliferationsmarker Ki-67 und Mib-1. Bei Mib-1 handelt es sich um einen Klon des Ki-67 Proliferationsmarkers, welcher wiederum ein nukleäres Antigen darstellt, das im Prolifersationszellzyklus in der späten G1-, S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus, jedoch nicht in der G0-Phase exprimiert wird (Depowski et al. 1999). Unter anderem weisen Studien wie zum Beispiel die Studie von Querzoli et al auf eine hohe signifikante Korrelation zwischen der Mib-1 und Ki-67 Expression in untersuchten Zellpräparaten hin. Somit kann anstelle der direkten Analyse des Ki- 67, welche ausschließlich im eingefrorenen Zellpräparat durchgeführt werden muß, die Proliferationsaktivität im Tumorzellgewebe über das Mib-1 mittels einfacher zu handhabender immunhistochemischen Methoden untersucht werden. Der Zusammenhang zwischen stark erhöhten Mib-1 bzw. Ki-67 und aggressiven, schnell proliferierenden Tumoren, sowie eine mögliche Korrelation zur Chemosensitivität ist in der Krebsforschung Gegenstand mehrerer Studie so unter anderem bei Depowski et al. 1999, Rozan et al. 1998, Billgren et al und Makris et al Weitere molekularbiologische Faktoren mit grosser Bedeutung und breiter klinischer Anwendung in der Krebsdiagnostik und bekämpfung sind die Hormonrezeptoren für Östrogen und Progesteron. Diese gehören zur Familie der Steroidhormonrezeptoren und nehmen Einfluss auf regulierende Steuerungsmechanismen wie das Wachstum und die Differenzierung in bestimmten Zellgeweben zum Beispiel auch im Brustgewebe. In 60 80% aller Mammakarzinomfälle zeigen sie eine Überexpression und weisen wie in mehrerer Studien untersucht, einen Zusammenhang zum Ansprechverhalten der Tumortherapien wie auch bezüglich der Prognose auf (Clark et al. 1988, McGuire et al. 1990, Crowe et al. 1991, Fisher et al. 1988, Winstanley et al. 1991). Im Besonderen sind die Hormonrezeptoren für Östrogen und Progesteron für die endokrine Tumortherapie von bedeutendem prädiktiven Wert. 9

10 Hieraus resultieren die zentralen Kernthemen für die vorliegende Arbeit. Den Schwerpunkt bildet die Fragestellung, inwiefern Her-2/neu alleine oder in Kombination mit den molekularbiologischen Faktoren p53, Mib-1 sowie den Hormonrezeptoren ER, PgR einen prädiktiven Aussagegehalt beim Einsatz der primären Chemotherapie zur Verfügung stellen. Dies mit dem Ziel, die klinische Anwendbarkeit der primären Chemotherapie zu unterstützen, indem die Vorteile durch systematisch verbesserte, den Therapieeffekt visualisierende Verlaufskontrollen hervorgehoben werden. Gleichzeitig sollen damit aber auch durch aktualisierte und aussagekräftige prädiktive Faktoren die Nachteile der primären Chemotherpie diesbezüglich vermindert und ausgeglichen werden. Desweiteren soll auf der Grundlage einer prädiktiven Relevanz von Her-2/neu für konventionelle, adjuvante Therapieformen, primäre Chemotherapieschemata sowie Behandlungsmethoden mit Herceptin, der Fragestellung nach dem geeigneten Nachweisverfahren für die Her-2/neu Amplifizierung in der klinischen Praxis nachgegangen werden. Hierbei werden die gängigen Nachweisverfahren mittels FISH und IHC unter den Gesichtspunkten Protokollverlauf der Verfahren, Materialeinsatz und Kosten sowie Verläßlichkeit im klinischen Einsatz miteinander verglichen. 10

11 2 Material 2.1 Untersuchungsmaterial von Patienten Das Untersuchungsmaterial bestand aus 4µm formalinfixierten Paraffinschnitten aus histologisch gesichertem invasivem Mammakarzinomgewebe, welches aus Stanzbiopsien zum Diagnosezeitpunkt sowie aus Operationsmaterial nach erfolgter präoperativer Chemotherapie stammte. 2.2 Patientenkollektiv Für die vorliegende Arbeit wurden im Zeitraum zwischen 1995 und 2000 an der Universitätsfrauenklinik Ulm 50 Patientinnen im Alter zwischen 27 und 79 (Median: 52 Jahren) mit primär fortgeschrittenem Mammakarzinom, die mittels präoperativer Chemotherapie behandelt wurden, ausgewählt. Vor Studieneinschluss wurde bei den Patientinnen die Bestimmung der Tumorgrösse klinisch, mammographisch/sonographisch und in Einzelfällen magnetresonanztomographisch durchgeführt. Diese Untersuchung wurde nach Studienbeginn wiederholt im Patientinnenkollektiv durchgeführt und entsprechend zur Beurteilung der Responsebeurteilung herangezogen Einschlußkriterien Für die Aufnahme der Patientinnen in die zugrundeliegende Studie wurden folgende Auswahlkriterien als Einschlußkriterien zugrunde gelegt: Durch Stanzbiopsie histologisch nachgewiesenes Mammakarzinom Primärtumorgröße > 2 cm (apparativ zweidimensional gemessen) Keine metastasierte Erkrankung zum Diagnosezeitpunkt Keine vorherige Strahlentherapie, Chemotherapie, Hormontherapie, Immuntherapie oder Operation Karnofsky Index > 70% Unauffälliger Herzechobefund Adäquate hämatologische, renale und hepatische Funktion Uneingeschränkt geschäftsfähige Patientinnen mit schriftlicher Einverständniserklärung zum Therapieprotokoll nach Aufklärung. 11

12 2.2.2 Ausschlußkriterien Für die Aufnahme der Patientinnen in die zugrundeliegende Studie wurden folgende Auswahlkriterien als Ausschlußkriterien zugrunde gelegt: Sekundärer Tumor, ausgenommen kurativ behandeltes Basaliom der Haut oder Carcinoma in situ der Zervix Therapierefraktäre kardiale Vorerkrankungen, Koronare Herzkrankheiten, Herzrhythmusstörungen, Herzinsuffizienz Schwangerschaft und Stillzeit Patienten unter immunsuppressiver Therapie Diabetes mellitus mit renaler Insuffizienz Präexistierende motorische oder sensorische Neuropathie > Grad II WHO Angewandte Therapieformen Die 50 Patientinnen wurden mit folgenden primären Chemotherapieschemata behandelt: 30% mit AC-Schema: Chemotherapie mit Anthracyclin und Cyclophosphamid 70% mit AT-Schema: Chemotherapie mit Anthracyclin und Taxan Wichtige klinische Kennzahlen und Merkmale Die 50 in die Studie aufgenommene Mammakarzinompatientinnen wiesen nach eingehenden Untersuchungen und Anamnese die in der folgenden Tabelle 1 dargestellten Merkmale auf. 12

13 Kennzahlen und Merkmale zur Beschreibung des Patientenkollektiv Kategorie Parameter Verteilung / Kennzahlen (Gesamtzahl n=50) Demographische Alter bei Diagnose von-bis Parameter bei Diagnose Median Menopausenstatus prämenopausal postmenopausal Histologische Parameter Tumortyp duktal lobulär andere Anzahl befallener Lymphknoten > = Klinische oder pathologische Parameter Tumorgrösse in mm Median Tumor-Staging T 1 T 2 T 3 T Tumor-Grading entfällt Tab. 1: Kennzahlen und Merkmale zur Beschreibung des Patientenkollektiv im Überblick 13

14 2.3 Materialien für Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Reagenzien für FISH Her-2/neu Alle Reagenzien wurden bezogen in Analysequalität. Antifade glycerolbasiert (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Aqua Spüllösung (Delta Pharm, Boehringer Ingelheim, Pfullingen) Ethanol 99,8% (Riedel de Häen, Seelze) DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) 1 M Natronlauge (Riedel de Häen, Seelze) Phosphate Buffered Detergent (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Propidiumjodid (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Pretreatment Powder (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Saline Sodium Citrate (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) 1 M Salzsäure (Riedel de Häen, Seelze) Xylol (Riedel de Häen, Seelze) Antikörper für FISH Her-2/neu Fluorescein-konjugiertes Anti-Digoxigenin (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Fluorescein-konjugiertes Anti-Kaninchen (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Kaninchen Anti-Schaf Antikörper (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Enzyme für FISH Her-2/neu Protein Digestion Enzyme (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) 14

15 2.3.4 Sonden für FISH Her-2/neu Her-2/neu DNA Probe (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Die Her-2/neu DNA Probe bestand aus Digoxigenin markierter Probe, die für den Her-2/neu Genlokus spezifisch ist, sowie aus DNA in Hybrisol ( 50% Formamid, 2xSSC) Geräte und Zubehör für FISH Her-2/neu OV 11 Hybridisierungsofen (Biometra Analytik GmbH, Göttingen) Deckgläser 24x32 mm Eppendorf Pipetten 10, 100, 1000 µl (Eppendorf AG, Hamburg) Eppendorf Standardtips 10, 100, 1000 µl (Eppendorf AG, Hamburg) Präzisionswaage Mettler Toledo P 1200 (Giessen, Schweiz) Glasküvetten (Merck Eurolab GmbH, Darmstadt) Zeiss Axioskop Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochern) Bildanalysesystem (Intas, Göttingen) PH-Meter Digi 520 (Witegro Laborbedarf, Altenhain) PH Fühler (Ingold Mettler-Toledo, Giessen, Schweiz) Tischzentrifuge 5415 C (Merck Eurolab, Darmstadt) Objektträger 24x60 mm silanisierte (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Plastic coverslips (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Conical tube 50 ml (Falcon, Frankreich) Eppendorf safe-lock 0,5 ml (Eppendorf GmbH, Hamburg) Hybridisierungsbad Hyb-Bad Oncor cat.# S2470 (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Inkubator Typ B6760 (Haereus Instruments, Hanau) Elite Ectachrome 400 ISO 400/27 Kodak Select Series Film (Kodak, Stuttgart) Messzylinder (Schott Brand, Wertheim) Gefrierschrank Liebherr Comfort (Liebherr, Ulm) Feuchte Kammer (selbst gebaut aus Kunststoffschalen, Zellstoffpapier, Holzstäbchen) Pinzette 15

16 Thermometer (Merck Eurolab, Darmstadt) Magnetrührer Heidolph MR 1 (Heidolph Instruments, Schwabach) LC-100 C Kamera (Zeiss, Oberkochern) Sony colour video printer (Sony, Köln) Sony colour printing paper (Sony, Köln) 2.4 Materialien für Immunhistochemie (IHC) Reagenzien für IHC Her-2/neu Alle nicht weiter aufgeführten Reagenzien wurden von der Firma Merck, Darmstadt in Analysequalität bezogen. Aqua dest (Destillieranlage) 15 M Ammoniumhydroxid-Stammlösung, verdünnt auf 37 mm DAB gepuffertes Substrat: Substratpuffer ph 7.5, enthält Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Verstärker und antimikrobiellen Zusatz (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) DAB Chromogen: 3,3 Diaminobenzidin Chromogenlösung (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Detektionsreagenz: Dextranpolymer konjugiert mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Ziege Anti-Kaninchen Immunglobulinen in Tris/HCI-Puffer, sowie Stabilisierungsprotein und antimikrobiellem Zusatz (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Epitop-Retrieval-Lösung 10x: Citratpufferkonzentrat mit antimikrobiellem Zusatz (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Ethanol 70%, 90% (Riedle de Häen, Seelze) Eukitt Eindeckmedium (Kindler, Freiburg) Mayer s Hämatoxylin Waschpuffer (PBS) 10x: Tris/HCI-Pufferkonzentrat mit Detergenz und antimikrobiellem Zusatz (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Saugfähige Labortücher (Kimberly & Clark, Düsseldorf) Xylol (Riedel de Häen, Seelze) 16

17 2.4.2 Antikörper für IHC Her-2/neu Kaninchen Anti-Human HER-2 Protein: gebrauchsfertiger affinitätsisolierter Antikörper, gelöst in 50 mm Tris/HCI, 0.1 NaCI, 15mM Natriumazid, ph 7.2, mit Stabilisatorprotein (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Immunogen: synthetisches C-terminales Peptid (intrazytoplasmatischer Anteil) des HER-2 Proteins (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Spezifität: HER-2 Protein (keine Kreuzreaktion mit HER-1,HER-3, HER-4) (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Reinigungsmethode: Der Antikörper wurde über immobilisierte HER-2 Peptide affinitätschromatographisch gereinigt (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Negativ-Kontroll-Reagenz: Immunglobulinfraktion aus Kaninchen-Normalserum in einer äquivalenten Proteinkonzentration wie der HER-2 Primärantikörper. Gelöst in 50 mm Tris/HCl, 0.1 M NaCl, 15mM Natriumazid, ph 7.2, mit Stabilisatorprotein (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Enzyme für IHC Her-2/neu Peroxidase-Blockierungsreagenz: 3% Wasserstoffperoxid mit 15mM Natriumazid (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Kontrollobjektträger für IHC Her-2/neu Kontrollobjektträger: jeder Objektträger enthielt Schnittpräparate von 3 formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebs-Zellinien, die unterschiedliche Expressionsniveaus des HER-2/neu Proteins repräsentierten. MDA-231 (0) MDA-175 (1+) SKBR3 (3+) (DAKO, HercepTest, Diagnostik GmbH Hamburg) Reagenzien für IHC - Mib-1, p53, ER, PgR Alle nicht weiter aufgeführten Reagenzien wurden von der Firma Merck, Darmstadt in Analysequalität bezogen. Elite ABC Kit - ABC Reagenz (Vectastain/Camon, Californien, USA) Aqua dest (Destillieranlage) DAB (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) 17

18 Dikaliumhydrogenphosphattrihydrat Ethanol(Riedel de Häen, Seelze) Eukitt Eindeckmedium (Kindler, Freiburg) Mayer s Hämatoxylin Natriumchlorid (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz) Natronlauge 2 mol/l (Riedel de Häen, Seelze) Normalserum (Vectastain/Camon, Californien, USA) Kaliumzitrat Kaliumdihydrogenphosphat Trinatriumzitratdihydrat Wasserstoffperoxid 3% Zitronensäuremonohydrat (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz) Xylol (Riedel de Häen, Seelze) Antikörper für IHC - Mib-1, p53, ER, PgR Primär Antikörper (Vectastain/Camon, Californien USA) Brücken Antikörper (Vectastain/Camon, Californien USA) Geräte und Zubehör für IHC Wasserbad (temperierbar ca C) ( Julabo Exatherm P5 electronic, Labortechnik, Seelbach über Lahr Schwarzwald) Stopuhr (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Wasch-/ Spritzflaschen (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Pipetten (Gilson, Villers le bel, Frankreich über Abimed, Langenfeld) Pipettenspitzen (Abimed, Langenfelden) Messzylinder (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Mikrowelle M611 (Whirlpool, USA) Färbeküvetten / Pufferbäder (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Feuchte Kammer (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Glasküvetten (Gesellschaft für Labortechnik, Burgwelden) Kühlschrank (Gilson, Villers le bel, Frankreich) Beschichtete Objektträger Superfrost (ResoLab, Bad Oeynhausen) Brutschrank, max 60 C (Dinkelberg, Neu-Ulm) Deckgläser 24x32 mm 18

19 Rührer Ika-Vibrax-VxR electronic (Jauke/Kunkel Labortechnik, Staufen) Lichtmikroskop 3,5x-40x Objektivvergrößerung (Zeiss, Oberkochern) LC-100 C Kamera (Zeiss, Oberkochern) Fujichrome 64 T Type II Tungsten Professional ISO 64/19 (Fuji Photo Film Europe, Düsseldorf) 2.5 Computerprogramme FRIDS (Frauenklinik Ulm, internes Dokumentationssystem) Auswertungen, Statistik: Excel 97, SPSS Methoden 3.1 Vorbereitung für FISH und IHC Das Mammakarzinomgewebe wurde in Formalin fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Am Schlittenmikrotom wurden 4 µm dicke Gewebeschnitte erzeugt, die auf silanisierten Objektträgern aufgezogen wurden. Diese mußten getrocknet über Nacht bei 65 C gebacken werden, um das Wachs zu schmelzen und eine bessere Haftung zu garantieren. Zur Sicherstellung, das es sich bei dem zu untersuchenden Gewebe um Krebszellen handelt, wurden im Zweifelsfall für die FISH Färbung die IHC Färbung sowie die HE Färbung zum Vergleich hinzugezogen, da diese Schnitte von den gleichen Paraffinblöcken stammten. Die HE Färbung wurde von jedem Patientengewebe routinemäßig im Frauenklinik Labor Ulm durchgeführt. Für die Auswertungen sowohl für FISH als auch für IHC wurden die Paraffinschnitte jeweils von denselben Paraffinblöcken erstellt. 3.2 Nachweis von Her-2/neu mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung Grundlagen zum Nachweisverfahren Das Oncor Her-2/neu (ERBB2) Gen Amplifikations System besteht aus einer DNA Probe und weiterer Detektionsreagenzien, die das Her-2/neu Gen gelb/grün auf einem rot fluoreszierenden Zellhintergrund erscheinen lassen. Das Hybridisierungsverfahren besteht aus fünf Grundelementen: Fixierung Vorbehandlung Denaturierung Hybridisierung Detektion 19

20 Die 4 µm dünnen formalinfixierten in Paraffin eingebetteten und auf silanisierte Objektträger aufgebrachten Gewebeschnitte des Brustkrebsgewebes werden mit Pretreatment Solution behandelt, um die Peptid Brücken aufzubrechen. Die Proteinase dient der enzymatischen Proteinverdauung, die mit der nachfolgenden 2xSSC Inkubation vor dem Hybridisierungsschritt heraus gewaschen werden. Diese Vorbehandlung ist notwendig, da die relativ starke Gewebefixierung mit Formalin zu einer Verschlechterung der Zugänglichkeit der zellulären DNA führt. Während der Denaturierung wird die Doppelstrang-Gewebe-DNA durch das Formamid zu einer Einzelstrang-DNA aufgebrochen, somit kann die Digoxigeninmarkierte DNA Sonde an der Her-2/neu Gensequenz anlagern. Die DNA Sonde besteht aus DNA Sequenzen mit jeweils vier Digoxigenin-markierten überlappenden DNA Klonen, die jeweils mit einer Her-2/neu Gensequenz hybridisieren. Dabei wird diese Hybridisierungsreaktion durch die in Abbildung 1 dargestellten Faktoren beeinflußt. Die nicht angelagerte Sonde wird in weiteren Waschschritten ausgewaschen. Die Digoxigenin-markierte Her-2/neu Probe wird mittels FITC (Fluoreszenz-markiertem Anti-Digoxigenin) dargestellt. Die Bindung des FITC an der Digoxigenin-markierten DNA Probe ist fest, so daß das Fluorescein am Ort der Her-2/neu Gensequenz immobilisiert ist. Die Gegenfärbung erfolgt mit Propidiumjodid (PJ)-Antifade Lösung, das die nukleäre und chromosomale DNA anfärbt, indem es zwischen den Basen der Doppelhelix hängen bleibt. Die Antifade Komponente dient der Verzögerung des Ausbleichens der fluoreszierenden Signale. 20

21 Temperatur: - Maximale Hybridisierungsrate im Temperaturbereich von C unter Tm Kationenkonzentration: - Monovalante Kationen vermindern die elektrostatische Abstoßung der Einzelstränge Formamid: - Senkt Schmelzpunkt der DNA linear um 0.72 C pro % Formamid durch Unterbrechung der Wasserstoffbrückenbindungen Konzentration DNA-Sonde DIG DIG DIG DNA- Sonde zelluläre DNA Dextran-Sulfat: - Erhöht die effektive DNA- Sondenkonzentration durch Senkung des freien Wasseranteils Länge DNA-Sonde: - Die Diffusionsfähigkeit von DNA-Sonden in Zellpräparationen nimmt ab einer Größe von ca bp stark ab Abb. 1 Einflußfaktoren der Hybridisierungsreaktion bei Fluoreszenz in situ Hybridisierung ( Abk. DIG=Digoxigenin, bp=basenpaare, Tm=Temperatur, bei welcher DNA=Desoxyribonukleinsäure in Einzelstrangform vorliegt) Versuchsprotokoll FISH Entparaffinierung (Fixierung) Objektträger zweimal für jeweils 5 Minuten in Xylol einlegen. Objektträger zweimal für jeweils 5 Minuten in 100% Ethanol-Lösung einlegen. Objektträger aus 100% Ethanol-Lösung herausnehmen und lufttrocknen lassen Versuchsprotokoll FISH - Vorbehandlung Pretreatment Solution 30% (12g/40ml 2x SSC) in conical tube vorbereiten, in Glasküvette füllen und im Wasserbad auf 45 C erwärmen. Glasküvette mit maximal 4 Objektträger beladen und in Pretreatment Solution 15 Minuten inkubieren. Objektträger in 2x SSC ph 7.0 legen und 2 Minuten waschen Versuchsprotokoll FISH - Denaturierung Protein Digestion Solution 0.25 mg/ml (400 µl PDE, enthält Formamid, plus 40 ml 2x SSC) in der Glasküvette im Wasserbad auf 45 C erwärmen. 21

22 Glasküvette mit maximal 4 Objektträger beladen und in Protein Digestion Solution 60 Minuten inkubieren Versuchsprotokoll FISH - Dehydratation Drei Ethanol Lösungen (70, 80, 95%) vorbereiten und jeweils in zwei Glasküvetten füllen. Die 70% Ethanol-Lösung auf 20 C abkühlen. Die Objektträger in aufsteigender Alkoholreihe jeweils für 2 Minuten dehydrieren. Objektträger aus 95% Ethanol-Lösung herausnehmen und lufttrocknen lassen Versuchsprotokoll FISH - Denaturierung und in situ-hybridisierung Backofen auf 72 C vorheizen. Objektträger und DNA-Sonde 5 Minuten auf 37 C erwärmen. DNA-Sonde kurz zentrifugieren, um das Pipettieren der Sonde zu erleichtern. 10 µl vorbereitete DNA-Sonde auf den Gewebeschnitt pipettieren (bei größeren Gewebeschnitten 15µl Sonde) und mit einem auf die Größe des Gewebeschnittes zurecht geschnittenen Kunststoffdeckglas abdecken, dabei keine Luftbläschen mit eindecken. 10 Minuten bei 72 C im Backofen simultan denaturieren. Die Objektträger in vorgewärmte feuchte Kammern legen und über Nacht bei 37 C hybridisieren Versuchsprotokoll FISH - Hybridisierungswaschgänge Eine Glasküvette mit 0.5x SSC ph 7.0 Hybridisierungswaschlösung im Hybridisierungswasserbad auf 72 C erwärmen. Kunststoffdeckglas vorsichtig mit Pinzette entfernen. Objektträger 5 Minuten in der 0.5x SSC-Lösung bei 72 C inkubieren. Maximal 4 Objektträger gleichzeitig verarbeiten. Objektträger 2 Minuten in 1x PBD bei 37 C einstellen Versuchsprotokoll FISH - Detektion Die Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt und auf 37 C erwärmt werden. 22

23 Objektträger aus dem Waschpuffer entnehmen und Flüssigkeit kurz ablaufen lassen. Es darf jedoch niemals die Oberfläche des Objektträgers antrocknen. 60 µl FITC/Anti-Digoxigenin pro Objektträger aufgeben. Mit Kunststoffdeckglas überdecken und 10 Minuten bei 37 C in feuchter Kammer inkubieren. Kunststoffdeckglas vorsichtig mit Pinzette entfernen. Objektträger dreimal in 1x PBD bei 37 C für jeweils 2 Minuten waschen. Zur Signalverstärkung können folgende Reagenzien zusätzlich verwendet werden: - Fluorescein-konjugiertes Anti-Kaninchen (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) - Kaninchen Anti-Schaf Antikörper (Oncor, Gaithersburg, USA, bezogen über Ventana Deutschland GmbH, Frankfurt a.m.) Versuchsprotokoll FISH Gegenfärbung 15 µl Propidiumjodid/Antifade-Lösung 0.6 mg/ml pro Objektträger aufgeben und mit 24x32 mm Deckglas eindecken Auswertung mittels Fluoreszenzmikroskopie Unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberlampe von 100 Watt, werden 2x 20 nicht übereinander liegender Zellkerne unter einem 100x Ölimmersions-Objektiv ausgezählt und der Mittelwert errechnet. Diese Auswertung wird so vorgenommen, nachdem in einer Studie (Press et al. 1997) gezeigt werden konnte, daß diese Anzahl an ausgewerteten Nuklei eine korrekte Klassifizierung zu den einzelnen Score Gruppen zuläßt. Lediglich im Falle jener Stanzen, bei denen nur geringe Mengen an Tumormaterial zur Verfügung stehen, werden bei der Auswertung eine Anzahl von nur 20 Nuklei ausgezählt, welches eine Sicherheit der korrekten Klassifizierung (Press et al. 1997) von 84% bedeutet. Um die Signale visualisieren zu können, müssen Filter bestimmter Wellenlänge vorgesetzt werden. Um den Objektträger auf Zellen abzusuchen wird der Filter zur Sichtbarmachung der Gegenfarbe (bei Propidiumjodid: 520/610 nm) eingesetzt, zur Auswertung der Signale wird dann der Filter des Detektionsreagenz und der Gegenfarbe eingesetzt (bei FITC/PJ: 490/525 nm). Dieser Kurzwellen Filter erlaubt das Sichtbarmachen des FITC, während PJ gleichzeitig durchscheint. Um für diese Arbeit die Ergebnisse zu dokumentieren, wurde eine Zeiss 23

24 LC-100 C Kamera (400 ASA Einstellung, Belichtungseinstellung -2) an einen Sony colour video printer angeschlossen und mittels einem Kodak Ektachrom 400 Farbfilm die Bilder auf Sony colour printing paper gedruckt. Zur Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop liefert Oncor repräsentative Referenz-Abbildungen in Farbe. Kontrollobjektträger mit drei formalinfixierten, paraffineingebetteten, humanen Mammakarzinomzellinien mit den Scoreergebnissen I, II, III. Diese werden mitgeliefert, um die Färbeergebnisse zu validieren. Die Scoreergebnisse korrelieren mit der Her-2 Rezeptorzahl pro Zelle, die wie folgt eingeteilt werden: - Score I: Mittelwert der ausgezählten Zellen < 3 Signale pro Zellkern. - Score II: Mittelwert der ausgezählten Zellen > 3 und < 10 Signale pro Zellkern. - Score III: Mittelwert der ausgezählten Zellen > 10 Signale pro Zellkern. Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der Her-2/neu Überexpression erfolgte für diese Arbeit von zwei Personen, unabhängig voneinander. Alle Ergebnisse der FISH Methode wurden fotographisch dokumentiert Lagerung Lagerung der Präparate im Dunkeln bei 4 C. Die angefärbten Präparate sind einige Wochen auswertbar, das fluoreszierende Signal verblaßt jedoch mit der Zeit. 3.3 Nachweis von Her-2/neu mittels IHC Grundlagen zum Nachweisverfahren Der DAKO HercepTest, welcher in dieser Studie zur Anwendung kommt, ist ein semi-quantitativer, immunhistochemischer Test, zum Nachweis der Überexpression des Her-2/neu Protein in Mammakarzinomgewebe für den in vitro diagnostischen Gebrauch. Das Immunhistochemische Nachweisverfahren besteht aus fünf Grundelementen: Fixierung Vorbehandlung Primärantikörperinkubation Antikörperexpressionsverstärkung Detektion Routinemäßig fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeproben werden mit einem gebrauchsfertigen Kaninchen-Primärantikörper gegen das humane Her-2/neu 24

25 Protein inkubiert. Es folgt die Detektion mit einem peroxidasekonjugierten Detektionsreagenz aus Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper und Meerrettichperoxidase (HRP), die an ein Dextranpolymer gebunden sind. Die enzymatische Umwandlung des nachfolgend zugeführten Chromogens (DAB) führt zur Bildung eines sichtbaren Reaktionsproduktes an der Stelle des Antigens. Das Gewebe wird abschließend gegengefärbt und eingedeckt. Die Ergebnisse werden Lichtmikroskopisch ausgewertet Vorbereitung der Gewebeschnitte Zur Vorbehandlung der Gewebeschnitte muß eine Epitopendemaskierung mit 10 mm Citratpuffer ph 6,1 erfolgen. Dazu werden die Gewebeschnitte in einem kalibrierten Wasserbad von 95 C hitzevorbehandelt. Der Citratpuffer besteht aus: Stammlösung A: 21,01g Zitronensäuremonohydrat plus 1000ml destilliertes Wasser; Stammlösung B: 29,41g Natriumcitrat plus 1000ml destilliertes Wasser; Gebrauchslösung: 18ml Stammlösung A plus 82ml Stammlösung B plus 1000ml destilliertes Wasser. Im Anschluß wird sofort die Färbung durchgeführt. Alle Reagenzien werden vor der Färbung auf Raumtemperatur gebracht (20-25 C). Es wird darauf geachtet, daß die Gewebeschnitte während der gesamten Färbung nicht austrocknen Versuchsprotokoll IHC - Entparaffinierung (Fixierung) Objektträger 2x5 Minuten in ein Xylolbad tauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x 5 Minuten in 95% Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x5 Minuten in 70 % Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in destilliertes Wasser tauchen Versuchsprotokoll IHC - Vorbehandlung Objektträger 2x5 Minuten in Waschpuffer auf der Basis von Tris/HCI- Pufferkonzentrat eintauchen. Färbeküvetten in ein Wasserbad stellen und mit verdünnter Epitop-Retrieval- Lösung füllen, die auf 95 C erhitzt werden. 25

26 Die bei Raumtemperatur entparaffinierten Objektträger in die Epitop-Retrieval- Lösung eintauchen und bei 95 C 40 Minuten inkubieren. Die gesamte Küvette aus dem Wasserbad nehmen und in der Epitop-Retrieval- Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Pufferlösung abschütten und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer spülen. Überschüssigen Puffer abklopfen und mit einem fusselfreien Zellstofftuch um die Schnitte herum abwischen, um die Reagenzien innerhalb des Schnittareals zu halten. Die Schnitte vollständig mit dem Peroxidase Blockierungsreagenz überdecken. Für 5 Minuten inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser spülen (den Wasserstrahl nicht direkt auf den Gewebeschnitt richten) und die Schnitte 2x5 Minuten in ein frisches Pufferbad stellen. Überschüssigen Puffer abklopfen und wie zuvor beschrieben kurz um die Schnitte herum abwischen Versuchsprotokoll IHC - Primärantikörperinkubation Gewebe mit 100 µl des Her-2/neu Primärantikörpers bzw. des negativen Kontrollreagenzes überschichten. Für 30 Minuten inkubieren. Vorsichtig mit Waschpuffer 2x5 Minuten spülen. Überschüssigen Puffer abklopfen und wie zuvor beschrieben kurz um die Schnitte herum abwischen Versuchsprotokoll IHC - Antikörperexpressionsverstärkung Gewebe mit 100 µl des Dextran-Polymers überschichten. Für 30 Minuten inkubieren. Die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer spülen. Überschüssigen Puffer abklopfen und wie zuvor beschrieben kurz um die Schnitte herum abwischen. Gewebe mit 100 µl der Substrat-Chromogen-Gebrauchslösung überschichten. Gewebeschnitte sogleich 10 Minuten inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser spülen. 26

27 3.3.7 Versuchsprotokoll IHC - Gegenfärbung Die Schnitte in wäßriger 10% Hämatoxylinlösung für 60 Sekunden inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser 5 Minuten spülen, dabei wie oben beschrieben den Wasserstrahl nicht direkt auf die Gewebeschnitte richten Versuchsprotokoll IHC - Eindecken Gewebeproben entwässern und mit Eukitt eindecken Auswertung mittels Lichtmikroskopie Zur Auswertung unter dem Lichtmikroskop (Objektivvergrößerung: 10- und 40- fache Vergrößerung) werden die Kriterien Zellmembranfärbungsmuster und intensität unter Ausschluß sonstiger zytoplasmatischer Färbungen berücksichtigt. Zur Einteilung in die Skalenstufen sind im DAKO-Kit repräsentative Referenz- Abbildungen in Farbe enthalten. Kontrollobjektträger mit drei formalinfixierten, paraffineingebetteten, humanen Mammakarzinomzellinien mit Färbeintensitäten von 0, 1+, 2+ und 3+ werden mitgeliefert um die Färbeergebnisse zu validieren. Die Färbeintensität dieser Zellinien korreliert mit ihrer Her-2 Rezeptorzahl pro Zelle Lagerung Reagenzien werden bei 2-8 C in einem lichtundurchlässigen Behälter aufbewahrt. Die Präparate können in einem Objektträgerkasten einige Monate aufbewahrt werden. 3.4 Nachweis von Östrogen- und Progesteronrezeptoren mittels IHC Grundlagen zum Nachweisverfahren Die Grundlagen entsprechen prinzipiell dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Her-2/neu mittels IHC. Unterschiede bestehen in der Verwendung eines Primär-Anitkörpers und anschließender Inkubation mit einem Brücken- Antikörper sowie dem mitgelieferten ABC-Reagenz Vorbereitung: Das Mammakarzinomgewebe wurde in Formalin fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Am Schlittenmikrotom wurden 4 µm dicke Gewebeschnitte erzeugt, die auf Superfrost Objektträger aufgezogen wurden. Diese mußten 27

28 getrocknet über Nacht bei 65 C gebacken werden, um das Wachs zu schmelzen und eine bessere Haftung zu garantieren Protokoll: Objektträger 2x5 Minuten in ein Xylolbad tauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x5 Minuten in 95% Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x5 Minuten in 70 % Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in destilliertes Wasser tauchen. Objektträger 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) eintauchen. Überführung der Objektträger in eine mikrowellengeeignete Objektträgerkunststoffkammer, die mit 10mM Citratpuffer gefüllt ist. Gewebeschnitte 30 Minuten in Citratpuffer auf 95 C erhitzen. Damit Objektträger in keinem Falle austrocknen wird während dieses Vorganges in regelmäßigen Abständen destilliertes Wasser nachgefüllt, um die verdampfte Flüssigkeit zu ersetzen. Objektträger 30 Minuten im Citratpuffer abkühlen lassen. Die Pufferlösung abschütten und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Überschüssigen Puffer abklopfen und vorsichtig mit einem fusselfreien Zellstofftuch um die Schnitte herum abwischen, um die Reagenzien innerhalb des Schnittareals zu halten. Gewebeschnitte 15 Minuten in 3% Wasserstoffperoxid bei 37 C inkubieren. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Wie oben beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl Normalserum jenes Tieres, welches den entsprechenden Antikörper für die Nachweismethode liefert, auf Objektträgern aufbringen und 15 Minuten inkubieren, damit unspezifische Bindungsstellen des Antikörpers gesättigt werden, anschließend überschüssige Flüssigkeit vorsichtig abklopfen. 100µl ER-/PgR-Primär-Antikörper auf die Objektträger pipettieren und Reagenzien über Nacht bei +10 C in einer feuchten Kammer inkubieren. 28

29 Anikörper-Lösung auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Gewebeschnitte mit 100µl Brückenantikörper-Lösung überdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Brückenantikörper-Lösung auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Wie zuvor beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl ABC-Reagenz auf Gewebeschnitte pipettieren und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. ABC-Reagenz auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Wie zuvor beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl DAB auf Gewebeschnitte pipettieren und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser spülen (den Wasserstrahl nicht direkt auf den Gewebeschnitt richten). Die Schnitte in wäßriger 10% Hämatoxylinlösung für 60 Sekunden inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser 5 Minuten spülen, dabei wie oben beschrieben den Wasserstrahl nicht direkt auf die Gewebeschnitte richten. Gewebeproben entwässern und mit Eukitt eindecken Lichtmikroskopie Zur Auswertung unter dem Lichtmikroskop (10x und 40x Vergrößerung) werden die Kriterien Prozentsatz der positiv angefärbten Zellen (PP) und Färbeintensität (SI) berücksichtigt. Aus diesen zwei Parametern errechnet sich wie folgt die Immune Reactive Score (IRS): SI x PP. Die Färbeintensität SI wird unterteilt von 0-3 d.h. von negativ bis stark positiv. Der Prozentsatz der positiven Zellen PP wird unterteilt in 0-4 d.h. negativ =0, < 10% PP=1, 10-50% PP=2, 51-80% PP=3, >80% PP=4. Der errechnete IRS ergibt dann folgende Auswertung: 0=negativ, 1,2=schwach positiv, 3,4=mäßig positiv, 6,8=positiv, 9,12=stark positiv Lagerung Reagenzien werden bei 2-8 C in einem lichtundurchlässigen Behälter aufbewahrt. 29

30 Die Präparate können in einem Objektträgerkasten aufbewahrt werden. 3.5 Methode zum Nachweis von Mib-1 / p53 mittels IHC Grundlagen zum Nachweisverfahren Die Grundlagen entsprechen prinzipiell dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Her-2/neu mittels IHC. Unterschiede bestehen in der Verwendung eines Primär-Anitkörpers und anschließender Inkubation mit einem Brücken- Antikörper sowie dem mitgelieferten ABC-Reagenz Vorbereitung Das Mammakarzinomgewebe wurde in Formalin fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Am Schlittenmikrotom wurden 4 µm dicke Gewebeschnitte erzeugt, die auf Superfrost Objektträger aufgezogen wurden. Diese mußten getrocknet über Nacht bei 65 C gebacken werden um das Wachs zu schmelzen und eine bessere Haftung zu garantieren Protokoll: Objektträger 2x5 Minuten in ein Xylolbad tauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x5 Minuten in 95% Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger 2x5 Minuten in 70 % Ethanol eintauchen. Überschüssige Feuchtigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in destilliertes Wasser tauchen. Objektträger 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) eintauchen. Überführung der Objektträger in eine mikrowellengeeignete Objektträgerkunststoffkammer, die mit 10mM Citratpuffer gefüllt ist. Gewebeschnitte 15 Minuten in Citratpuffer auf 95 C erhitzen. Damit Objektträger in keinem Falle austrocknen wird während dieses Vorganges in regelmäßigen Abständen destilliertes Wasser nachgefüllt, um die verdampfte Flüssigkeit zu ersetzen. Objektträger 30 Minuten im Citratpuffer abkühlen lassen. 30

31 Die Pufferlösung abschütten und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Überschüssigen Puffer abklopfen und vorsichtig mit einem fusselfreien Zellstofftuch um die Schnitte herum abwischen, um die Reagenzien innerhalb des Schnittareals zu halten. Gewebeschnitte 15 Minuten in 3% Wasserstoffperoxid bei 37 C inkubieren. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Wie oben beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl Normalserum jenes Tieres, welches den entsprechenden Antikörper für die Nachweismethode liefert, auf Objektträgern aufbringen und 15 Minuten inkubieren, damit unspezifische Bindungsstellen des Antikörpers gesättigt werden, anschließend überschüssige Flüssigkeit vorsichtig abklopfen. 100µl Mib-1 (1:50) bzw. 100µl p53 (1:1500) Primär-Antikörper-Lösung auf die Objektträger pipettieren und Reagienzien über Nacht bei +10 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Anikörper-Lösung auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Gewebeschnitte mit 100µl Brückenantikörper-Lösung überdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Brückenantikörper-Lösung auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) spülen. Wie zuvor beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl ABC-Reagenz auf Gewebeschnitte pipettieren und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. ABC-Reagenz auf einem fusselfreiem Zellstofftuch ablaufen lassen und die Schnitte 2x5 Minuten in Waschpuffer (PBS) mit einem Tropfen Detergenz (Spülmittel) spülen. Wie zuvor beschrieben mit fusselfreiem Zellstofftuch um Schnitte herum abwischen. 100µl DAB auf Gewebeschnitte pipettieren und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. 31

32 Vorsichtig mit destilliertem Wasser spülen (den Wasserstrahl nicht direkt auf den Gewebeschnitt richten). Die Schnitte in wäßriger 10% Hämatoxylinlösung für 60 Sekunden inkubieren. Vorsichtig mit destilliertem Wasser 5 Minuten spülen, dabei wie oben beschrieben den Wasserstrahl nicht direkt auf die Gewebeschnitte richten. Gewebeproben entwässern und mit Eukitt eindecken Lichtmikroskopie Zur Auswertung unter dem Lichtmikroskop (10x und 40x Vergrößerung) werden die Kriterien der Zellkernfärbungsmuster und -intensität berücksichtigt. Für Mib-1 wird die Unterteilung negativ =< 10%, positiv = 10-20%, stark positiv => 20% der angefärbten Tumorzellen vorgenommen. Für p53 gilt die Unterteilung in negativ =< 10% und in positiv => 10% der angefärbten Tumorzellen Lagerung Reagenzien werden bei 2-8 C in einem lichtundurchlässigen Behälter aufbewahrt. Die Präparate können in einem Objektträgerkasten aufbewahrt werden. 3.6 Bestimmung der klinischen Responsebeurteilungskriterien Als objektive Kriterien in der Ergebnisfindung des Responseverhaltens im Patientinnenkollektiv wurden die UICC Kriterien (United International Cancer Criteria) herangezogen. Diese werden im folgenden kurz dargestellt: Komplette Remission (CR) (Skalenwert 2 in Auswertungen): völliges Verschwinden aller bekannter Läsionen. Bei osteolytischen Metastasen erfolgt eine radiologische Beurteilung. Partielle Remission (PR) (Skalenwert 1 in Auswertungen) : Reduktion der meßbaren Läsionen um 50% und mehr. Verbesserung der bewertbaren Läsionen, keine Progression und/oder kein auftreten neuer Läsionen. Stabilisierung (SD) (Skalenwert 0 in Auswertungen): Reduktion der meßbaren Läsionen um weniger als 50% oder Zunahme um weniger als 25% und kein Auftreten neuer Läsionen. Progression (PD) (Skalenwert 0 in Auswertungen): Wachstum um mehr als 25% bei einer oder mehreren Läsionen und/oder Auftreten neuer Läsionen. 32