Mikroskopie: Michael Kempe. Text. Carl Zeiss AG Forschung und Technologie. Carl Zeiss AG, M. Kempe 2. Aalener Photoniktag 15. April

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1 Optische Mikroskopie: aktuelle Trends Michael Kempe Carl Zeiss AG Forschung und Technologie Text 15. April

2 Mikroskopie was ist eigentlich neu? Hooke Mikroskop Stativ1 (1857) L-Stativ (1936) Primo Star iled (2008) (17. Jahrhundert) 15. April 2010 Page 2

3 Trends der Mikroskopie für biomedizinische Anwendungen 1 Applikatives Umfeld 2 Sensitivität ein grundlegende Limit der Mikroskopie 3 Schnelle Bildgebung 4 Hochauflösende Bildgebung 5 Ausblick 15. April 2010 Page 3

4 Trends der Mikroskopie für biomedizinische Anwendungen 1 Applikatives Umfeld 2 Sensitivität ein grundlegende Limit der Mikroskopie 3 Schnelle Bildgebung 4 Hochauflösende Bildgebung 5 Ausblick 15. April 2010 Page 4

5 Grenzen der Beobachtung überwunden durch Mikroskopie k i Robert Koch erhält 1905 den Nobelpreis für seine Arbeiten zur Entdeckung des Tuberkelbazillus (1882) (Ölimmersionsobjektiv) i Matthias Schleiden und Theodor Schwann begründen Zellentheorie April 2010 Page 5

6 Analytische Methoden z.b. zum DNA Sequenzieren 2nm DNA Struktur DNA Sequenzierung 15. April 2010 Page 6

7 Analytische Methoden reichen nicht aus, um Funktion zu verstehen Verständnis der hochkomplexen biologischen Prozesse in komplexen Systemen - Dynamisches Netzwerk an interagierenden Molekülen Beispiel: Genexpression 15. April 2010 Page 7

8 Funktion ist der Schlüssel zum Verstehen und Heilen Beispiel: Immunsystem Relevant für die Diagnostik und Bekämpfung von Malaria, AIDS Krebs Allergien April 2010 Page 8

9 Funktion erfordert die Analyse von Dynamik NRK Zellen, EB3-eGFP (Spitzen der Microtubuli), Ellenberg, EMBL, Heidelberg Carl Zeiss Microcinematograph Göttingen, April 2010 Page 9

10 Dynamische Prozesse vollziehen sich im 3D-Raum 15. April 2010 Page 10

11 Von Langzeitbeobachtungen bis zu ultraschnellen ll Reaktionen Strukturgröße multi-cellular cellular sub-cellular 2. Signalketten / Ione potentiale 1. Entwicklungsbiologie Zellteilung Organentwicklung 3. Transport Processe von Proteinen / Vesikeln Blutfluß multi-molecularmolecular molecular 4.Wechselwirkung von Proteinen atomic Photosynthese fs ns µs ms s min h Zeitskale 15. April 2010 Page 11

12 und das so sanft als möglich Invasiv oder Nichtinvasiv? 15. April 2010 Page 12

13 Geht das? Technologisch: Kompromissdreieck Auflösung Kontrast Sensitivität Geschwindigkeit Eindringtiefe / Tiefendiskriminierung 15. Carl April Zeiss 2010 AG, M. Kempe 2. Aalener Photoniktag page 13 Page

14 Trends der Mikroskopie für biomedizinische Anwendungen 1 Applikatives Umfeld 2 Sensitivität ein grundlegende Limit der Mikroskopie 3 Schnelle Bildgebung 4 Hochauflösende Bildgebung 5 Ausblick 15. April 2010 Page 14

15 Photonen die physikalischen Grenzen der Mikroskopie Fluoreszenz ist der wichtigste Kontrast typische Konzentrationen Fluorophore pro cm 3 Emission von Photonen 10 8 s -1 Detektionseffizienz < 0.1 Detektionsvolumen (1 µm)³ detektierte Photonen < pro s Photonenrauschen: Signal-zu-Rausch-Verhältnis: N N/ N = N d.h. für ein SNR von 10 braucht man 100 Photonen schnellste Beobachtungszeit: > 100 /(10 10 s -1 ) = 10 ns 15. April 2010 Page 15

16 Photonen die physikalischen Grenzen der Mikroskopie um zu molekularer Auflösung zu kommen, muss das Detektionsvolumen reduziert werden auf mindestens V = (0.01 µm)³ ( µm) 3 (1 µm) 3 Moleküle in V: N = V C (10-8 m)³ 10-3 mol/m³ mol -1 = 10-3!! dh d.h. Einzelmoleküldetektion ist erforderlich höchstens10 7 photons/s für ein SNR von 10 braucht man mindestens 10 µs Mikroskop-Typ 2D Bild 3D Bild ( Pixel) (100 z-ebenen) Weitfeld 10 µs 1 ms Linienscanner 5 ms 0.5 s Punktscanner 2 s 25 s 15. April 2010 Page 16

17 Bleichen limitiert die maximale Zahl der pro Molekül emittierten Photonen YFP VENUS Point illumination Line illumination inten nsity point line inten nsity point line time 60 s time 60 s Sample: fixed CHO cells Objective: Plan-Neofluar 40x/1.3 oil / Excitation: 488 nm / Emission: > 505 nm / Aperture: 1 AU 15. April 2010 Page 17

18 Entwicklung der Sensitivität am Beispiel der Laser Scanning Mikroskopie in den letzten 25 Jahren Efficiency 5 0 MRC- 500 System A System B System C System D System E System F System G System H LSM 700 & 710 LSM April 2010 Page 18

19 LSM 710 and LSM 780 Innovative Beam Path and DetectorTechnology NEW: 32-Channel GaAsP array (instead of PMT array) Spectral Recycling Loop NEW: Red-optimized side PMT Grating NEW: Acive cooling (***) of 32-channel GaAsP array and red-optimized side PMT are actively cooled! NEW: Imaging in integration or photon counting mode with GaAsP array and redoptimized side PMT PMT ( *** ) PMT Spectral Beam Guides 32-Channel GaAsP Array (***) 15. April 2010 Page 19

20 Sensitivität ist kaum noch grundlegend g zu steigern Ideal System = % QE 18 detector and 0% 16 light losses Half way Normalised SNR MRC-500 System A System B System C System D System E System F System G System H LSM 700 & 710 LSM 78 tem Ideal syste 15. April 2010 Page 20

21 3D Mikroskopie Familie Focussed on Flexibility Focussed on Deep Imaging g Widefield Deconvolution Structured Illumination Single Point Laser Scanning Multiphoton Focussed on Fast Imaging Aperture Correlation Spinning Disk Line Scanning Total Internal Reflection Focussed on Superresolution Structured Illumination Photo Activated Localization 15. April

22 Trends der Mikroskopie für biomedizinische Anwendungen 1 Applikatives Umfeld 2 Sensitivität ein grundlegende Limit der Mikroskopie 3 Schnelle Bildgebung 4 Hochauflösende Bildgebung 5 Ausblick 15. April

23 Linienscanner LSM 5 LIVE ine detector 1 Slit 1 Li Filter 1 PO SBS Line detector 2 Slit 2 Filter 2 Achrogate CL Zoom Optics Scan Module Scanner XY X,Y Scan Lens Image plane Microscope AxioImager Eye Piece Tube Lens Epi illumination x 512 Collimators HBO Pupil plane UV Fiber VIS Fiber Piezo focus Objective Specimen Fiber Coupler AOTF Shutter HAL Condensor Diode 405 Diode 488 Diode 532 Diode 635 Laser Module 15. April 2010 Seite 23

24 Aperture Correlation Microscopy New Technology for Fast Optical Sectioning Excitation light passes a patterned disc placed in a conjugated plane to the focal plane resulting in patterned excitation ti In-focus and 50% of out-of-focus light are detected on the left part of the camera Remaining 50% of the out-of-focus light is reflected at the back of the disc This part is detected simultaneously on the right part of the camera 15. April 2010 Page 24

25 Aperture Correlation Microscopy New Technology for Fast Optical Sectioning Camera captures both images side-by-side Images are extracted, registered and mirrored Addition results in widefield image Scaled subtraction results in an optical section 15. April 2010 Page 25

26 VivaTome A New Class in Fast Optical Sectioning Conventional image and optical sectioning No loss of information All information captured in one shot No motion artifacts Offers high frame rates (up to 30 f/s) Suitable for fast live cell imaging Efficient white light illumination Spectral flexibility Two different grid patterns on one disc High quality optical sections with all magnifications Compatible with versatile platforms Ease of use 15. April 2010 Page 26

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28 Kontrast- und Auflösungssteigerung Optimierung der Frequenzübertragung innerhalb der OTF = Kontraststeigerung Ausdehnung der Grenzfrequenz = Auflösungssteigerung während Bild- nach Bildauf- klassische neue aufnahme nahme Optimierung Verfahren SIM Phasenmasken Deconvolution kürzere Wellenlänge höherer Aperturwinkel höhere Brechzahl (Immersionsflüssigkeit, SIL) lineare Proben- wechselwirkung nichtlineare Proben- wechselwirkung STED GSD ESA PALM RESOLFT SPEM 15. April 2010 Page 28

29 Verfahren zur Auflösungssteigerung Nonlinear Sample Interactions Linear Sample Interaction De-Excitation Depletion Transformation Stimulated Emission Excited State Absorption Energy Transfer Triplet Occupation Saturation Switching Photoactivation Structured Illumination STED STimulated Emission Depletion ESA Excited State Absorption GSD Ground State Depletion SI-SPEM Structured Illumination Saturated Pattern Excitation Microscopy RESOLFT REversible Saturable OpticaL Fluorecence Transitions microscopy PALM* Photo-Activation Localization Microscopy dstorm Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy SI (linear) Structured Illumination 15. April 2010 Page 29

30 SIM Prinzip OTF (Grenzfrequenz) Bereich der Auflösungssteigerung (erweiterte OTF) verschobenes Frequenzband strukturierte Beleuchtung Rekonstruktion (Verschieben der Bänder) Page No. 30

31 Structured Illumination Microscopy: SR-SIM Multi-colour 3D superresolution microscopy Sample: SR-SIM Myoblast C2C12 (mouse) in late S-phase; staining: DNA (BrdU), Dnmt1 Dr. Schermelleh, h LMU Munich (Germany) Wide Field 15. April 2010 Page 31

32 Structured Illumination Microscopy: SR-SIM Multi-colour 3D superresolution microscopy Sample: SR-SIM Myoblast C2C12 (mouse) in late S-phase; staining: DNA (BrdU), Dnmt1 Dr. Schermelleh, h LMU Munich (Germany) 15. April 2010 Page 32

33 Structured Illumination Microscopy: SR-SIM Multi-colour superresolution microscopy SR-SIM Wide Field Wide Field 0.2 µm SR-SIM SIM 02µm 0.2 M. Bastmeyer, Univeristy of Karlsruhe (Germany) 15. April 2010 Page 33

34 Structured Illumination Microscopy: SR-SIM Multi-colour superresolution microscopy SR-SIM Wide Field 0.2 µm SR-SIM SIM 02µm 0.2 M. Bastmeyer, Univeristy of Karlsruhe (Germany) 15. April 2010 Page 34

35 PALM - Prinzip Lokalisierungsgenauigkeit gg g viel höher als Auflösung: FWHM x n Schrotrauschbegrenzt: mit n=500 Photonen <15 nm Lokalisierungsgenauigkeit möglich Grundverfahren Statistische Aktivierung der Farbstoffmolekül im Abstand größer als das klass. Auflösungslimit Fluoreszenzanregung der aktivierten Moleküle und Messung des Schwerpunktes der PSF Deaktivieren der Moleküle (durch Bleichen oder Ausschalten) Eintragen der Lokalisierungspunkte in das hochaufgelöste Bild Wiederholen der Schritte 1 bis 3 in Praxis ca mal bis alle Moleküllagen vermessen sind Animation 15. April 2010 Page 35

36 How Superresolution Light Microscopy Works Principle of PAL-M PAL-M relies on fluorochomes that can be either photoactivated, photoconverted or reversibly ersibl photoswitched (e.g. fluorescent proteins). Table: Fluorescent proteins compatible with PAL-M 15. April 2010 Page 36

37 PALM Bildgebung Conventional TIRF Free description: Latest project progress? What has been achieved? Image not required but possible PALM 15. April 2010 Page 37

38 Superresolution Light Microscopy Principle of dstorm In dstorm, illumination at high laser power shifts fluorochromes into dark states. dstorm relies on reversible photoswitching of fluorochomes between bright (fluorescent) and dark (non- fluorescent) states. S 1 ex T 2 em T 1 dark state Irreversible photobleaching is prevented by using a redox system. S 0 bright state 15. April 2010 Page 38

39 Superresolution Light Microscopy: dstorm Dual-colour visualization of mitochondria and actin TIRF dstorm 2 µm M. Heilemann and M. Sauer, University of Würzburg (Germany) 15. April 2010 Page 39

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41 Neue 3D Bildgebung Single Plane Illumination Microscopy SPIM Beleuchtung mittels Zylinderlinse in dünner Schicht und kleiner NA Detektion mit hoher h NAi in rechtem Winkel dazu vergleichbar mit konfokaler Bildgebung aber parallele Detektion und optimierte Bleichreduktion neuartige Probenpräparation erforderlich I psf ( x, y, z) h ( x, y, z) h ( x, y, z) ill 2 det 2 E. Stelzer et al. EMBL Heidelberg 15. April 2010 Page 41

42 SPIM Bildgebung von Modellorganismen in-vivoi Medaka GFP muscle label, excitation at = 488 nm, detection nm, air lens CZ Fluar 5x/0.25 E. Stelzer e et al., EMBL Heidelberg 15. April 2010 Page 42

43 Ausblick Zeit Kontrast transversale Auflösung 2D axiale Auflösung 3D Zeitliche Auflösung System Bildgebung 1873 Hellfeld Visuell / Abbe 270nm Rayleigh, 800nm Auge / stationär Klassisches Syst. Polarisation 1880 Immersion, 170nm 500 nm (Schärfent.) Fluoreszenz UV, 100nm 1925 Dunkelfeld 1932 Phasenkontrast 1948 Röntgenmikr. (50nm) 1952 DIC SHG Konfokal/Scan 500nm 1979 Deconvolution TIRF, 100nm (Oberfl) 1984 Nahfeld,SNOM, 80nm 1987 FRET, 5-10nm (ind.) Photonen Fluo Raman Mikr., 80nm (2-seit) 1994 STED, 60nm 1997 SIM, 350nm CARS SIM 100 /SPEM 50nm 2004 SPIM, 200nm (seitl) 2006 PALM, 20nm Foto, fix Film, 10s Kamera / digital 10-1 s FCS, 10-6 s FLIM, s Stereoskopisch Lebendzellmikrosk. automat. Reader 15. April 2010 Page 43

44 Entwicklungstrends der Mikroskopie alte Techniken sterben nicht aus, sondern werden durch neue Verfahren komplementiert die Mikroskopie arbeitet in vielerlei Hinsicht dicht an fundamentalen Grenzen der raum-zeitlichen ili Beobachtung mit Licht neuere Entwicklungen loten den Kompromiss aus Geschwindigkeit und 3D - Auflösung (neu) aus technologische und applikative Weiterentwicklung (u.a. Proben- präparation) gehen dabei Hand in Hand Page