Labor- und Messtechnik in der Biophysik (mit Übungen und Seminar)

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1 Labor- und Messtechnik in der Biophysik (mit Übungen und Seminar) (Prof. P. Jakob, Prof. B. Hecht, Prof. M. Sauer, Dr. K. Heinze) 4 St., Fr , SE 1, Physikalisches Institut, Am Hubland Die Veranstaltung umfasst 4 SWS Vorlesungen und Übungen/Seminar für Studierende ab dem 5. Fachsemester. Sie richtet sich an Studierende der Nanostrukturtechnik als Wahlpflichtveranstaltung (Bachelor/Master). Gegenstand der Vorlesung sind ausgewählte Grundlagen von Molekularbiologie bis Zellbiologie sowie physikalische Grundlagen biophysikalischer Verfahren zu Untersuchung und Manipulation von biologischen Systemen. Schwerpunkte bilden optische abbildende Verfahren und Sensorik, Einzelteilchendetektion, Rastermikroskopie, sowie konventionelle Röntgentechnik, Computertomographie, ausgewählte bildgebende Verfahren der Nuklearmedizin und MR-Tomographie. Leistungsüberprüfung: 1. Kurzvortrag & 1-seitige schriftliche Zusammenfassung (vor dem Vortrag zu verteilen Sekretariat EP5) & Anwesenheitspflicht & Dateien abgeben. 2. Klausur 1 Woche nach Semesterende. Die Klausur wird nach dem "multiplechoice" Prinzip durchgeführt. Beispielfragen werden nach jeder Vorlesungseinheit ins Netz gestellt. Diplomstudenten müssen Vortrag halten und Klausur bestehen. Benotung: Vortrag (50%) & Klausur (50%). Prozedur: Auswahl der Themen: Liste der Themen im Internet ab heute Abend, an mich mit 5 Wunschthemen. Themenvergabe nach Reihenfolge des Eingangs. Erste Vorträge ! in zwei Wochen. 1. Vortragsplanung (obligatorisch): 2 Wochen vor Vortrag: Vorbesprechung, 1 Woche vor Vortrag: Besprechung mit Folienvorlagen Zum Vortrag: 1-seitige Zusammenfassung 2. Vortragsdauer: 20 min. exakt! Diskussion und Fragen nach dem Vortrag 3. Am Ende: alle Vorträge und handouts auf CD (als pdf) Dateien im Sekretariat EP5 abgeben oder als pdf per an mich (Scheinvorausetzung!)

2 Termine: Hecht Hecht Hecht entfällt (nach Christi Himmelfahrt) Jakob Jakob entfällt (nach Fronleichnam) Heinze Heinze Sauer Sauer Sauer 10 Termine, bislang 29 Teilnehmer d.h. 2-4 Kurzvorträge pro Sitzung Überblick: Optische Einzelmoleküldetektion und -Spektroskopie: Grundlagen (Hecht) Einführung: Detektion einzelner Moleküle Theoretische Grundlagen Einzelmolekül-Observable Optische Einzelmoleküldetektion und -Spektroskopie: Anwendungen auf Biologische Systeme (Hecht) Einzelmoleküldiffusion o Zellmembran o Im Inneren der Zelle Einzelmolekülorientierung o Messung von Rotationen Einzelmolekül-ko-lokalisierung o Localization o FRET Chemische Reaktionen auf Einzelmolekülebene

3 1. Förster-Energie transfer: Grundlagen und Anwendungsbeispiel 2. Einzelne Viren in Zellen verfolgen 3. Funktion molekularer Motoren auf der Einzelmolekülebene 4. DNA-Sequenzierung mit Einzelmolekülmarkern: Einzelmoleküle unterscheiden mit wenigen Photonen Nano-optische Messmethoden in der Bio-Physik: Plasmonik (Hecht) Einführung in die Plasmonik Anwendungen plasmonischer Partikel in Sensorik, Bio-labeling, Photothermal imaging 1. Sensorik mit Oberflächenplasmonen 2. Hochauflösende Mikroskopie mit optischen Antennen 3. Zwei-Photonen Photolumineszenz von Goldnanopartikeln in der Biophysik 4. Photothermal imaging: Prinzip und particle-tracking in Zellen Struktur in atomarer Auflösung (Jakob) Röntgenstrukturanalyse Kristallbau Braggbedingung, reziprokes Gitter, Lauemethode, Debye-Scherer- Verfahren Einkristalldiffraktometrie Atomarer Formfaktor, Strukturfaktor, Phasenproblem Cryokristallographie Röntgenquellen 1. Neutronendiffraktometrie: Informationsgehalt, Vor- und Nachteile & Einsatzbereiche 2. Elektronendiffraktometrie: Informationsgehalt, Vor- und Nachteile & Einsatzbereiche 3. Synchrotonquellen für Strukturuntersuchungen D-NMR-Verfahren (Jakob)

4 Magnetischer Dipol, Kernspin, Elektronenspin Zeemaneffekt Magnetisierung Larmorfrequenz Kernresonanz, chemische Verschiebung Relaxation, Spin-Spin-Wechselwirkung NMR-Spektrometer 1. Physikalische Grundlagen und Informationsgehalt der NMR- Relaxationszeiten T1 & T2 2. Messmethoden zur NMR-Relaxationszeitbestimmung 3. Grundlagen der Fourier-Transformation: Informationsgehalt eines 1D- NMR-Spektrums 4. Longitudinally-detected ESR (LODESR) 5. Proton-Electron Double Resonance Imaging (PEDRI) 6. Fourier-Transform ESR Fluoreszenzverfahren in der Biologie und der Biomedizin (Heinze) Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie: Weitfeld, Begriff der PSF, OTF, numerische Apertur, Auflösung, Bildanalyse Biomoleküle und ihre Umgebung in der Zelle: Struktur, Funktion, Dynamiken und Interaktionen Fluoreszenz-Farbstoffe für die Markierung von Biomolekülen: Grundlagen (Möglichkeiten und Stolperfallen) Wichtige Parameter und biophysikalische Messgrößen in der Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von FRAP, FRET, Anisotropie, FLIM etc. Beispiele beliebter Fluoreszenzverfahren: Zellpopulationen in Supension identifizieren, quantifizieren, sortieren: Durchflusszytometrie (FACS) Mikroskopie des Zellinneren: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Laser Scanning u. Spinning Disc), Weitfeld mit strukturierter Beleuchtung Mikroskopie von Oberflächen: Total Internal Reflexion Fluorescence Microscopy (TIRFM) Mikroskopische Aufnahmen makroskopischer Präparate: Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) und Ultramikroskopie Mikoskopische Einblicke ins Gehirn lebender Tiere: Zwei-Photonen intravital Mikroskopie

5 1. Entfaltung als Werkzeug der Bildanalyse in der Fluoreszenzmikroskopie (Prinzip, Anwendungen, Möglichkeiten und Grenzen) 2. Das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) und andere proteinbasierte Marker (Prinzip und biologische Anwendungen) 3. Fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie (Prinzip und Anwendungen in der Biologie) Von nano bis makro: Mikroskopie-Techniken komplementär oder korrelativ nutzen. Beispiele aus Licht- Elektronen- Raman- und Rasterkraftmikroskopie (Heinze) Struktur der Zelle Struktur aus Zellen: Abbildung von Zellen und Gewebe mit Elektronen- Rasterkraft- und Lichtmikroskopie im Vergleich Der kleine Unterschied: Aufbau, Auflösung, Kontrast und Probenpräparation von unterschiedlichen bildgebenden Verfahren im Vergleich Geschickt kombiniert: Welche Verfahren in Kombination sind üblich, möglich, notwendig. 1. Strukturanalyse von Proteinen durch Kryo-elektronen Mikroskopie 2. Strukturaufklärung biologischer Moleküle durch Rasterkraftmikroskopie 3. Raman und CARS Mikroskopie Prinzip, Setup, und Beispiele DNA-Analytik/Diagnostik (Sauer) DNA Struktur Interkalatoren, DNA Markierung UV-vis-Absorptions, CD-Spektroskopie PCR. Gelektrophores DNA Sequenzierung Fluorescent Probes DNA Microarrays, FISH

6 1. Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung 2. Molecular Beacons/Smart Probes 3. FISH/DNA-Chips Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie (Sauer) Fluoreszenzimaging STED Mikroskopie Zweiphotonenmikroskopie Light-Sheet Mikroskopie Lokalisationsmikroskopie Fluoreszierende Proteine, PALM Photoschalter STORM/dSTORM 1. STED 2. PALM 3. dstorm Dielektrische Einzelzellspektroskopie (Dr. Vladimir Sukhorukov) Dielektrischer Aufbau der Zelle: das Einschalenmodell Polarisation der Zelle im elektrischen Feld Dielektrophorese; Elektrokinetische Effekte im Wechselfeld Anwendungen in der Mikrofluidik; digitale Mikrofluidik Elektrischer Durchbruch der Zellmembran Elektromanipulation von Zellen Biomedizinische Anwendungen der Elektroporation/-fusion von Zellen 1. AC-elektrokinetische Techniken zur Analyse von Zellen 2. Elektrorotation von Zellen 3. Mikrofluidische Systeme zur Zellanalyse

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8 Themen von Greg Harms aus dem Jahr 2010: Molekularbiologie bis Zellbiologie, Proteomics, Massenspektrometrie, Elektronmikroskopie, Durchlichtmikroskopie (Harms) Prozessierung zellulärer Signale durch Proteomics mit Massenspektrometrie Proteomics mit Massenspektrometrie Organisation der Zelle (Abbildung von Organellen, Zellen, und Gewebe mit Elektronen- und Durchlicht-Mikroskopie) Elektronen- und einführung zu Durchlicht-mikroskopische Techniken (Optik, Aufbau, Auflösung, Kontrast und Probenpräparation) 1. Neural Networks and Learning The Model 2. Elektronmikroskopie: Einzel-protein-strukturanalyse durch Cryoelectron Microscopy 3. Elektronmikroskopie: Improved Resolution and Contrast Through Abberation Correction 4. Massenspektrometrie: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) und Quadrupolemassenspektrometrie in Proteomics Fluoreszenztechniken, Fluoreszenzmikroskopie: Wide-field und Konfokal (Harms) Durchlichtmikroskopie Kontrast und verbesserungen in Imaging Zellular Bewegungen und Migration in Gewebe und Organismen Fluoreszenzbestimmungen in der Biologie (Farbstoffe und deren Anwendung für Normalgebrauch in der Biologie, Labelling, FRET, Photophysik und Chemie) Spektroskopie und Durchflusszytometrie Optische Fluroeszenzmikroskopie o a. Konfokal Fokussieren von Licht Konzept der Point-spread function Konfokal o Wide field Detektion von zellulärer Signale durch Fluoresenzmikroskopie (FRET, Polarisation, FLIM, FRAP) mit klassische Assays als Nachweis

9 4. Cell Tracking (für Eukaroten und Prokaryoten) mit Durchlicht und Fluoreszenz- mikroskopie: Konzept, Aufbau, Beispiele, und Analyse 5. Deconvolution of optical images 6. Grüne Fluoreszierende Proteine (GFP) und Anwendungen in biologischen Bestimmungen 7. Durchflusszytommetrie und Anwendungen in der Biologie 8. Anwendungen von FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in Biologie 9. Dynamic Light Scattering in Biology, Biomedicine and Biophysics Histologie und Medizin- Tief ins Gewebe: Multiphoton Mikroskopie und andere Techniken (Harms) Intravital Microscopy Sheet Illumination Microscopy / Selective Plane Illumination Microscopy Nicht-Lineare Optik Multiphoton Mikroskopie (Aufbau und Verwendung: Optische Messungen in Gewebe) Laser Dissection Ultrasound Imaging Optische Tomographie 1. Zwei-Photon Fluoreszenz Mikroskopie Prinzip, Setup, und Beispiele (Vor- und Nachteile im Vergleich zu Ein-Photon konfokal Mikroskopie) 2. Sheet Illumination Microscopy / Selective Plane Illumination Microscopy Prinzip, Setup, und Beispiele 3. CARS Mikroskopie Prinzip, Setup, und Beispiele 4. THz-Mikroskopie - Prinzip, Setup, und Beispiele