Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie Teil-2

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1 Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie Teil-2 Grundvorlesung Mikrobiologie WS 2005/6 AG Mikrobiologie /AK Biotechnologie Angewandte Mikrobiologie Industrielle Mikrobiologie Medizinische Mikrobiologie Nahrungsmittel-Mikrobiologie Umwelt-Mikrobiologie 1

2 Industrielle Mikrobiologie oft synonym mit Biotechnologie Produktion von Protein, SCP Industrielle Mikrobiologie Organische Säuren incl. Aminosäuren Organische Lösungsmittel Polysaccharide, -alkanoate und Polyketide Antibiotika und andere Pharmaka Vitamine, Coenzyme 2

3 Woher kommen die Mikroorganismen, die in der Industriellen Mikrobiologie eingesetzt werden? Ursprünglich immer die natürliche Umgebung Anreicherung und Isolierung (Screening) Charakterisierung und Veränderung (Biochemisch/Molekular) Stammpflege und hinterlegen in Stammsammlungen Anreicherung und Isolierung Pour Plate Method Plattengussverfahren Spread Plate Method Ausspatelverfahren Plate count Verdünnungsserien Chemostat Kontinuierliche Kultur 3

4 Konstante Substratfütterungsrate F (ml/h) = konstante Entnahme an Zellsuspension Konstante Verdünnungsrate D = F/V (h -1 ) Mit: V = Kulturvolumen Anreicherung und Isolierung Chemostat Anreicherung und Isolierung Charakteristika einer Chemostatkultur 4

5 Welche Eigenschaften muss ein industrielleingesetzter Mikroorganismus haben? 1. Den gewünschten Umsatz zeigen 2. Als Reinkultur kultivierbar sein 3. Genetisch stabil sein 4. In Kulturen mit großen Volumina wachsen 5. Hohe Wachstumsrate haben 6. Gut konservierbar / hälterbar sein 7. Apathogen sein / keine oder inaktive Toxine produzieren Produkte der industriellen Mikrobiologie Zellen Bioconversion Zellprodukte Substrate Hefen Produkt z.b. Steroide Enzyme Antibiotika Nahrungsmittelzusätze Ethanol Zitronensäure Chemikalien 5

6 Primär und sekundär Metabolite Primäre Metabolite Zellen / Biomasse Primäre Metabolite Zellen / Biomasse Primäre Metabolite Zellen / Biomasse Wachstumssubstrat Wachstumssubstrat Wachstumssubstrat Sekundärmetabolite Sekundärmetabolite Primärstoffwechsel - Biomasse Nährstoffe / Substrat Zellen / Biomasse Produkte des Primärstoffwechsels Zellen / Biomasse und Metabolite werden simultan gebildet 6

7 Glucose Glucose-6-Phosphat ATP Primärstoffwechsel - Ethanol Fructose-6-Phosphat Fructose-1,6-bisphosphat ATP Substrat Biomasse Dihydroxyacetonphosphat Glycerinaldehyd-3- phosphat 1,3-Bisphosphoglycerat ATP Konzentration Produkt Ethanol ATP PEP Pyruvat Acetaldehyd Zeit Sekundärstoffwechsel Nährstoffe / Substrat Zellen / Biomasse Produkte des Primärstoffwechsels Sekundärmetabolit Zellen / Biomasse und Produkte des Primärstoffwechsels werden gebildet Produkte des Primärstoffwechsels werden in Sekundärmetabolite überführt 7

8 Sekundärstoffwechsel - Gluconsäurebildung Eine konsekutive Reaktion: Glucose wird zum Gluconolacton, das dann zu Gluconsäure umgesetzt wird. Organismus: Pseudomonas ovalis Biochemical Engineering Fundamentals, Bailey & Ollis, 1977 Sekundärstoffwechsel Nährstoffe / Substrat Zellen / Biomasse?? Intermediat des Primärstoffwechsels Sekundärmetabolit Zellen / Biomasse werden gebildet Überschüssiges Substrat wird in Sekundärmetabolite überführt 8

9 Sekundärstoffwechsel Penicillin Produktion erfolgt, wenn das C : N : P-Verhältnis für das Zellwachstum ungünstig ist (unbalanced growth) Sekundärmetabolite - Charakteristika der Produktion 1. Sekundärmetabolite werden spezifisch jeweils nur von wenigen Spezies / Stämmen produziert. 2. Sie scheinen ohne Bedeutung für Wachstum und Reproduktion 3. Die Bildung von Sekundärmetaboliten hängt stark von den Wachstumsbedingungen insbesondere von der Medienzusammensetzung ab. Häufig hat das C : N. P-Verhältnis großen Einfluss. 4. Sekundärmetabolite werden häufig als eine Gruppe eng verwandter Strukturen gebildet. Z.B.: Streptomyces sp.produziert 32 eng verwandte jedoch nicht identische Anthracyclinantibiotika. 5. In vielen Produktionsstämmen kann der Stoffwechsel zur Überproduktion des Sekundärmetaboliten angeregt werden. Das geht bei Primärstoffwechselprodukten nicht. 9

10 Bioreaktoren im Labor und Pilotmaßstab Photos: Hulsch, 2003 Industriell interessante Speicherstoffe von Bakterien Das Homopolymer Polyhydroxybutyrat (PHB) 10

11 Intrazelluläre Polymere Die meisten Prokaryoten sind in der Lage intrazellulär eine oder mehrere Arten von Reservestoffen zu bilden / lagern. Diese bestehen aus wasserunlöslichem Material/ Granula sog. inclusion bodies Reservematerial wird gebildet, wenn das Verhältnis von verfügbarer Energie zu verfügbaren Baustoffen nicht ausgeglichen ist. Die makromolekularen Reservestoffe können zur Aufrechterhaltung des Metabolismus in Hungerphasen verwendet werden. Es gibt verschiedene polymere (Speicher-) Stoffe Einige Beispiele: Polyglucose Polypeptide Schwefel Polyphosphate Polyketide Polyhydroxyalkanoate Wachse, Wachsester 11

12 Polyhydroxyalkanoate (PHAs) 1920 Erstbeschreibung von Polyhydroxybuttersäure (PHB) durch Lemoigne* Organismus: Bacillus megaterium 1974 Erstbeschreibung von Heteropolymeren aus 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat Seit ca Einsatz von PHAs als Verpackungsmaterial Lemoigne, M Bull Soc Chim Biol, 8: 770 Wallen, L.L., Rohwedder W.K Environ Sci Technol, 8: 576 De Smet et al J Bacteriol, 154:870 ß-Hydroxybuttersäure (Isomere) H 3 C CH 2 CH OH O C H 3 C OH CH CH 2 C O OH OH a b O HO CH 2 CH 2 CH 2 C OH c Valeriansäure H 3 C-(CH 2 ) 3 -COOH 12

13 Einige Funktionen von PHA in Zellen Speicherung von großen Mengen an Kohlenstoff ohne osmotische Probleme In Bacillus kann PHA als Kohlenstoff- und Energie-Quelle für die Sporenbildung dienen Azotobacter, die Sauerstoffstress haben, nutzen PHA als C-Quelle zur Kapselbildung PHB spielt eine Rolle in der Regulierung der Ca 2+ Konzentration in Zellen Biosynthesis Balanced medium Glucose Excess carbon, NADH N-,P-or O 2 -limitation Pyruvate Oxalac. 1 Acetyl-CoA 2* CoA-SH TCC Citrate NADH O 2 Respiration chain N,P Growth Acetoacetyl-CoA NAD(P)H 3 NAD(P) Hydroxybutyryl-CoA Acetoacetyl-CoA 4 Polyhydroxybutyrate 1 = Citrat synthase, 2* = ß-Ketothiolase, 3 = Acetyl-CoA reductase, 4 = PHB-synthase 13

14 PHA-Synthese aus Kohlehydraten Die meisten Organismen synthetisieren PHA aus Acetyl-CoA durch eine Sequenz von drei aufeinanderfolgenden Reaktionen 1. acetyl-coa + acetyl-coa acetoacetyl-coa 2. acetoacetyl-coa + acetyl-coa 2 3-hydroxybutyryl-CoA hydroxybutyryl-CoA + PHB CoASH 3-hydroxybutyrat 1 = 3-ketothiolase, acetyl-coa acetlytransferase, 2 = acetoacetyl-coa-reductase, 3 = poly(3-hydroxybutyrate)synthase, PHB-synthase Regulation des PHA-Stoffwechsels Azotobacter beijerincki akkumuliert PHB nur unter Sauerstoffmangel Der Kontrollpunkt ist das Schicksal von Acetyl-CoA Haben Zellen ein hohes Verhältnis von NADH/NAD, dann wird PHB synthetisiert Hohe NADH/NAD-Verhältnisse inhibieren die TCA-Enzyme Citratsynthase and Isocitratdehydrogenase Haben Zellen ein niedriges NADH/NAD Verhältnis, ist der bevorzugte Stoffwechselweg der TCA, weil: Das Enzym des ersten PHB-Syntheseschrittes durch CoA inhibiert wird, das bei niedrigen NADH/NAD Verhältnissen akkumuliert Das Verhältnis von NADH/NAD und die Konzentration von Acetyl CoA hängt ab von der Konzentration an: Sauerstoff, Stickstoff oder Phosphat 14

15 Produktion bakterieller Cellulose Bakterielle Cellulose ist ein hochwertiger Rohstoff Verwendung z.b. als Verbandsmaterial Bakterielle Cellulose ist ein extracelluläres Polymer von Acetobacter xylinum In nicht gerührten Batch Kulturen air werden Celluloseschichten von bis zu 20 cm produziert cellulose Bacteria in suspension Bakterielle Cellulose hat die selbe Zusammensetzung wie Pflanzencellulose, jedoch ohne den Hemicelluloseanteil Sie ist extrem rein und hoch kristallin Bakteriencellulose wird produziert, wenn die Zellen ein nicht ausgewogenes Nährstoffangebot haben Unterschiedliche Zucker können als C-Quelle fungieren 15

16 Produktion von Cellulose durch Acetobacter xylinum Produktion bakterieller Cellulose Glucose Cellulose Microrofibrillen Gluco- Kinase ATP ADP Pore Pore Pore Cellulose-Synthase CS CS Glucose-6-p Gluc-1-P UDP-Gluc Weiterer Metabolismus Glylcolyse, TCA etc. UTP PPi UDP-Glc-Pyrophosphorylase Hygiene, Prävention, Konservierung Mikroorganismen und Futter/Nahrungsmittel Produktion (z.b. Yoghurt, Essig, Tofu) Melioration (z.b. Silage, Sauerkraut) Zusatzstoffe und Konfektion (z.b. Zucker) Functional Food and Novel Food 16

17 Anwendungsbereiche einiger Mikroorganismen als Starterkulturen Mikroorgansimus Saccharomyces cerevisiae Lactobacillus Streptococcus lactis Penicillium roquefortii Streptomyces sp. Lactobacillus plantarum Leuconostoc, Pediococcus Acetobacter aceti Anwendungsbereich Brauwesen, Backindustrie Joghurt, Salami Sauermilchprodukte Roquefort Käse Aromaverbesserung in Rohwurst Silage Sauerkraut Essig Essigherstellung Essig ist eine wässrige Lösung von Essigsäure Essig wird durch bakterielle Oxidation von Ethanol produziert Essig kann aus allen ethanolhaltigen Substanzen produziert werden Meist wird Essig aus Wein oder Apfelmost hergestellt Die jährliche Produktion beträgt 1 x 10 9 Liter 17

18 Spezies und Stoffwechselweg der Essigsäurebildung Acetobacter sp. und Glauconobacter sp., zwei eng verwandte Spezies werden zur industriellen Produktion eingesetzt Essigsäurebildung erfolgt in diesen Organismen über eine unvollständige Oxidation Sauerstoff ist der Elektronenakzeptor Das Medium wird durch das Produkt Essigsäure stark angesäuert Welche Produktionsprozesse werden eingesetzt? 1. Orlean-Methode; ist die älteste Methode Wein wird in offenen Schalen der Luft ausgesetzt. Essigsäurebakterien wachsen als schleimige Schicht an der Oberfläche (Biofilm). 2. Trickling Filter oder Oberflächenreaktor Hier wird Ethanol über Holzspäne verrieselt. Auf den Spänen siedeln die Mikroorganismen. Luft wird von unten eingeblasen, um aerobe Verhältnisse zu gewährleisten. Konversionsrate bei 30 o C ist 90%. 3. Frings-Essigsäurereaktor häufig eingesetzter industriellerprozess Submerser Rührtank mit intensiver Begasung. Er wird batch, semikontinuierlich oder kontinuierlich betrieben. 18

19 Essigsäureproduktion Oxidation von Ethanol zu Essigsäure Organismus: Acetobacter aceti NAD NADH 2 H 2 O NAD NADH 2 CH 3 CH 2 OH CH 3 CHO CH 3 CH(OH) 2 CH 3 COOH Ethanol 1 Acetaldehyd Acetaldehydhydrat 2 Essigsäure 1 = Alkoholdehydrogenase 2 = Acetaldehyddehydrogenase Nachhaltige Biotechnologie Nutzung erneuerbarer Rohstoffe Einsparung: Ressourcen, Energie Zukünftiges Entwicklungspotential Neue nachhaltige Produkte 19