Master Biotechnologie 1. Seminar

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1 Master Biotechnologie 1. Seminar Patrick Pilak Biosynthesis of Sandalwood Oil Santalum album CYP76F Cytochromes P450 Produce Santalols and Bergamotol Bohlmann et al Zielsetzung Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin Sandelholzöl biotechnologisch durch Metabolic Engineering in S. cerevisae herzustellen. 2 Einleitung 2.1 Sandelholzöl Sandelholzöl wird aus den Wurzeln und Holz des Sandelholzbaumes santalus album gewonnen. Es wird von der Duft- und Perfumindustrie benötigt und hat daher eine große wirtschaftliche Bedeutung für die entsprechenden Produktionsländer. Der Sandelholzbaum wächst in den tropischen und gemäßigten Zonen Indiens, Indonesiens und Australiens. Diese Baumart weist ein langsames Wachstum auf und ist für seine kleinen roten Blüten bekannt. 2.2 Gründe für eine biotechnologische Produktion von Sandelholzöl Durch Krankheiten, Abholzung und Ausbeutung sind die natürlichen Populationen dieser Baumart stark dezimiert worden. Gleichzeitig steigt die Nachfrage von der verarbeitenden Industrie. Alternativmöglichkeiten sind Plantagen und chemische Produktionsanlagen. Da ein Baum 30 Jahre benötigt bis er verarbeitet werden kann sind Plantagen aber unrentabel. Im Falle von chemischen Herangehensweisen sind diverse Aufarbeitungsschritte mit umweltschädlichen Chemikalien notwendig. Aus diesen ökologischen und ökonomischen Gesichtspunkten ist eine alternative biotechnologische Produktionsmethode von Interesse. 1

2 2.3 Cytochrome P450 Cytochrome P450 bilden eine Superfamilie von Hämproteinen und kommen in allen bekannten Lebensformen vor. Sie zeichnen sich durch ihr spezifisches Absorptionsspektrum und ihre Vielfalt an katalytischen Reaktionen aus. Um die große Anzahl der heute bekannten Cytochrome P450 einordnen zu können werden diese nicht nach ihrer Funktion, sondern anhand der Sequenzähnlichkeit ihrer Gene klassifiziert. Enzyme deren Gene eine 40 %ige Übereinstimmung aufweisen werden in eine Familie eingeordnet; bei Sequenzähnlichkeiten von 55 % in eine Subfamilie. Dementsprechend gehört das Cytochrom 76F39 in die Familie 11 und die Subfamilie A. Die letzte Zahl steht für das individuelle Gen dieses Enzyms (Abb. 1). CYP76F39 Cytochrom P450 Familie Subfamilie Individuelles Gen Abbildung 1: Nomenklatur CYP76F39 Das aktive Zentrum dieser Enzyme besteht aus einem Protoporphyrin IX, dessen Zentrum ein Eisen 3+- Ion bildet. Dieses Ion ist äquatorial an die 4 Stickstoffatome des Protoporphyrinringes gebunden. Im Gegensatz zu den meisten Hämproteinen handelt es sich beim fünften Liganden nicht um ein Histidin, sondern um ein Thiolat-Anion eines Cysteins (Abb.2). Diese charakteristische Eigenschaft führt dazu, dass Cytochrome P450 ein spezifisches Absorptionssmaximum bei 450 nm im reduzierten COgebundenen Zustand aufweisen. Die Abkürzung P450 resultiert aus dieser Eigenschaft und steht für Pigment 450. Abbildung 2: Prosthetische Gruppe von Cytochromen P450. Ein zentral angeordnetes Eisen 3+- Ion ist an vier Stickstoffatome des Protoporphyrinringes gebunden. Proximal als fünfter Ligand ist ein Thiolat-Rest eines Cystein an das Eisenion gebunden. 2

3 Cytochrome P450 gehören zu den Oxidoreduktasen bzw. in der weiteren Einteilung zu den externen Monooxygenasen. Bei dieser Reaktion wird ein externer Elektronendonor in Form von NAD(P)H genutzt um zwei Sauerstoffatome zu spalten. Dabei wird ein Sauerstoffmolekül auf das entsprechende Substrat übertragen und das andere zur Bildung eines Wassermoleküls genutzt. Vereinfacht dargestellt wird die folgende Reaktion katalysiert: R-H + O 2 + NAD(P)H + H + R-OH + H 2 O + NAD(P) + Um diesen Reaktionsschritt durchführen zu können, wird neben NAD(P)H als Elektronendonor auch eine Elektronentransportkette benötigt. Abhängig von der genauen Zusammensetzung der Komponenten und dem Organismus werden 10 verschiedene Klassen unterschieden. Im Falle des mikrosomalen Systems besteht die Transportkette aus einer Cytochrom-P-Reduktase (CPR). Abbildung 3: Mikrosomales Elektronentransportsystem. Durch die Oxidation von NADPH+H + werden 2 Elektronen auf die Cytochrom P Redukase (CPR) übertragen. Durch das Eisen-Schwefel-Protein CPR werden diese dann auf das entsprechende Cytochrom P450 übertragen, um die Übertragung eines Sauerstoffatoms auf das enzymspezifische Substrat unter Wasserfreisetzung zu ermöglichen. Durch die Oxidation von NAD(P)H zu NADP + werden 2 Elektronen auf die CPR übertragen. Die Aufgabe des CPR besteht im Anschluss darin die Elektronen auf das Cytochrom P450 zu übertragen. Das breite Spektrum an katalysierten Reaktionen dieser Enzyme umfasst unter anderem die Biosynthese von Steroiden, die Biotransformation von Xenobiotika und die Aktivierung von Karzinogenen. Aber auch eine weitreichende, nicht weniger wichtige, Fülle an chemischen Reaktionen, wie beispielsweise Hydroxylierungen, Deaminierungen und N-, O-, S-Dealkylierungen. Einer der größten Vorteile besteht allerdings darin, dass CYP450 in der Lage sind inaktiven Sauerstoff zu nutzen um Substrate stereo- und regioselektiv umzusetzen, was durch chemische Verfahren nur sehr schwierig und unter Bildung von racemischen Gemischen durchzuführen ist. Allein durch diese Fähigkeit und der Vielfalt an möglichen Reaktionen und Substraten bergen Cytochrome P450 ein immenses biotechnologisches Potential. 3

4 2.4 Synthese von Sandelholzöl Die Synthese von Sandelholzöl in s. album beginnt mit der Synthese von Farnesylpyrophosphat (FPP) aus Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) und Isopentylpyrophosphat (IPP) durch die Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS). Im Anschluss wird FPP durch ein Enzym (Santalensynthase SSy) zu den vier Ausgangssubstraten von Sandelholzöl umgesetzt. Diese Substanzen sind die Sesquiterpene a-santalen, a-exo-bergamoten, epi-ß-santalen und ß-santalen. Ausgehend davon entstehen die Grundsubstanzen von Sandelholzöl: a-santalol, a-exo-bergamotol, epi-ß-santalol und ß- santalol durch eine Hydroxylierung. Diese können als Z oder E Isomere vorliegen. Abbildung 4: Biosynthese von Sandelholzöl in s. album 4

5 3 Ergebnisse 3.1 Identifizierung der Gene Es wurde eine cdna Bibliothek des Genoms von s. album durch eine Transkriptionsassemblierung erstellt. Zunächst wurden CPR s aus Arabidopsis thaliana als Suchsequenzen eingesetzt und dadurch 2 SaCPR s mit 70%- und 82%iger Identität identifziert. Des Weiteren wurden diverse pflanzliche Cytochrome P450, die an der Terpen Biosynthese beteiligt sind, als Suchsequenzen eingesetzt. Als Suchmotive wurde die Hämbindestelle und Sauerstoffbindestelle verwendet. Dadurch wurden 10 Cytochrome der Familie 76 identifiziert (Abb. 5). Abbildung 5: Phylogenetische Analyse der entdeckten Cytochrome. 3.2 In vitro Synthese von Sandelholzöl Neun der identifizierten Cytochrome wurden in Plasmide integriert und mit einem Plasmid, dass die SaCPR enthält in S. cerevisae kotransformiert. Im Anschluss wurden die Mikrosome isoliert und in in vitro Experimenten eingesetzt. Als Substrate wurden die Substanzen sind die Sesquiterpene a- Santalen, a-exo-bergamoten, epi-ß-santalen und ß-santalen verwendet. In einer GC-MS Analyse wurden das natürliche Sandelholzöl und die Proben der neun transformierten Cytochrome (Abb.6) vermessen. Dabei wies das Cytochrom CYP76F39v1 die größte Übereinstimmung mit dem natürlichen Sandelholzöl auf, da die Substanzen a-santalol, a-exobergamotol, epi-ß-santalol und ß-santalol synthetisiert werden konnten. Allerdings stimmen die Verhältnisse der E/Z-Stereoisomere nicht überein. Im natürlichen Sandelholzöl überwiegen die Z- Stereoisomere, wohingegen im biotechnologisch hergestellten Sandelholzöl die E-Stereoisomere überwiegen. Die übrigen acht Cytochrome synthetisierten nicht alle acht Substanzen und sind daher von weniger Interesse. 5

6 Abbildung 6: GC-MS Analyse der in vitro Umsätze der identifizierten CYP76F. (E)- α -santalol (7) and (Z)- α -santalol (5), (E)-ß-santalol (12),(Z)-ß-santalol (10), (E)-α-exo-bergamotol (8), (Z)-α-exo-bergamotol (6), (E)- epi-ß-santanol (11), (Z)-epi-ß-santanol (9) 3.3 In vivo Synthese von Sandelholzöl Neun der identifizierten Cytochrome wurden in Plasmide integriert und mit einem Plasmid, dass die SaCPR und SaSSy enthält in S. cerevisae kotransformiert. Die FPPS in s. cerevisae ist ausreichend um genug FPP herzustellen. Somit mussten keine Substrate zugegeben werden. Im Anschluss erfolgte eine GC-MS Analyse wie in 3.2. Abbildung 7: GC-MS Analyse der in vitro Umsätze der identifizierten CYP76F. (E)- α -santalol (7) and (Z)- α -santalol (5), (E)-ß-santalol (12),(Z)-ß-santalol (10), (E)-α-exo-bergamotol (8), (Z)-α-exo-bergamotol (6), (E)- epi-ß-santanol (11), (Z)-epi-ß-santanol (9) 6

7 Abbildung 7 verdeutlicht, dass wie in Abbildung 6 alle Santalole und Bergamotole synthetisiert wurden, aber wiederum in einer Mischung der Stereoisomere, die nicht dem natürlichen Sandelholzöl entspricht. Zudem wurden Farnesol und andere unbekannte Nebenprodukte synthetisiert. Diese könnten bei einer späteren Aufarbeitung des Öles behindern. 4 Diskussion 4.1 Kritikpunkte Die in dieser Arbeit beschriebene Methode zur Herstellung von Sandelholzöl ist in zwei Punkten zu kritisieren. Erstens, wurden in vivo Nebenprodukte identifiziert, die die Aufarbeitung des Öles behindern könnten. Zweitens, konnten nicht die natürlichen Verhältnisse der E- und Z-Stereoisomere gebildet werden. Im natürlichen Öl überwiegen die Z-Stereoisomere, wohingegen in dem in dieser Arbeit hergestellte Öl die E-Stereoisomere überwiegen. Daher ist das derzeitige Öl als nicht verkaufsfähig einzustufen. 4.2 Erklärungen Für die in 4.1 angesprochenen Probleme gibt es verschiedene mögliche Erklärungen. Zum Einen wäre es denkbar, dass eine Isomerase in a. album existiert die die E-Stereoisomere zu Z-Isomeren umsetzt. Da im Sandelholzbaum das Öl über Jahre verbleibt und in dieser Arbeit das Öl in Minuten oder Stunden synthetisiert worden ist, wäre diese Erklärung plausibel. Außerdem unterscheiden sich die physiologischen Bedingungen in Hefe und Pflanzen, sodass es zu leichten Veränderungen im aktiven Zentrum der Cytochrome kommen könnte, wodurch nur Z-Isomere gebildet werden würden. 4.3 Lösungen Zum Einen wäre es möglich die in 4.2 beschriebene Isomerase zu identifizieren und zusätzlich in Hefe heterolog zu exprimieren. Zum Anderen wäre es denkbar dass noch andere Cytochrome existieren die nur Z-Stereoisomere bilden können. Auch diese gilt es zu finden. 7

8 5 Zusammenfassung Die in dieser Arbeit postulierte Methode beschreibt den ersten biotechnologischen Prozess zur Herstellung von Sandelholzöl. Dies würde eine Alternative zur bisherigen Gewinnung von Sandelholöl aus dem Sandelholzbaum s. album darstellen. Aufgrund von wirtschaftlichen Interessen ist dies ein Forschungsfeld, das es weiter zu untersuchen gilt. Zwar konnten die Grundsubstanzen des Sandelholzöls hergestellt werden, aber diese stimmen nicht mit dem nativen Öl überein, weshalb dieses Öl noch nicht verkaufsfähig ist. Zudem konnten neue Informationen über die Cytochrome der Familie F76 gewonnen werden. 8

9 6 Literatur Biosynthesis of Sandalwood Oil: Santalum album CYP76F Cytochromes P450 Produce Santalols and Bergamotol (Bohlmann et al. 2013) Cytochromes P450 as versatile biocatalysts (Rita Bernhardt 2006) 9