Untersuchungen zum Einsatz technischer und mikrobiell hergestellter Enzymsysteme zur Hydrolyse der Lignocellulose in Maissilage

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1 Untersuchungen zum Einsatz technischer und mikrobiell hergestellter Enzymsysteme zur ydrolyse der Lignocellulose in Maissilage Vortrag Dipl.-Ing. Christina Schober Dipl.-Ing. Wolfgang Claassen Prof. Dr. Lutz Fischer Universität ohenheim Institut für Lebensmittelwissenschaften und Biotechnologie Lehrstuhl Biotechnologie

2 Übersicht Theoretische Grundlagen Ergebnisse Untersuchungen von verschiedenen Enzymsystemen mit Modellsubstraten Untersuchungen ausgewählter Enzymsysteme zur Freisetzung vergärbarer Zucker aus Maissilage Ausgewählte technische Enzympräparate Enzymsystem von Penicillium brasilianum Batista IBT Zusammenfassung

3 Schema Bioethanolprozess Rohstoff Chemische / physikalische Vorbehandlung Enzymatische ydrolyse Enzym - Produktion Vergärung Ethanol - Aufreinigung Schlempe- Verarbeitung Ethanol

4 Gebräuchliche Ausgangsstoffe für die Bioethanolherstellung Ausgangsstoffe Trockensubstanz (%) Zucker (z.b. Zucker, Stärke, Cellulose und emicellulose (g/100g TS) Lignin (g/100g TS) Theoretische Ethanol- Ausbeute (L/kg TS) Maissilage n.d. 2 0,41 3 Körnermais ,6 0,46 Weizen k.a. 0,40 afer ,41 Gerste ,41 Maisstroh ,29 aferstroh ,26 Gerstenstroh ,31 Zuckerrohr k.a. 0,50 Bagasse ,28 Quelle: Kim, I.S., Dale, B.E Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues. Biom. Bioe. 26(4): : Zusammensetzung der in dieser Arbeit eingesetzten Maissilage. 2 : mit angewandter Analysemethode nicht messbar. 3 : theoretische Ethanol-Ausbeute berechnet aus der Zusammensetzung der in dieser Arbeit eingesetzten Maissilage (Anteil von vergärbaren C 6 -Zuckern in Form von Stärke und Cellulose).

5 Zucker der Maissilage Stärke: Cellulose: α-d-1,4-glucose-polymer Anteil 1 in Maissilage: 38% β-d-1,4-glucose-polymer Anteil 1 in Maissilage: 19% emicellulose: 2 C 4 2 C C C 1 2 C 4 2 C Zucker-Polymer aus Xylose, Arabinose, Galactose, Mannose, Glucose, Rhamnose und Fucose Anteil 1 in Maissilage: 17% 1 : % = g / 100 g Trockensubstanz Maissilage (Zusammensetzung der in dieser Arbeit eingesetzten Maissilage).

6 Enzyme der Cellulose-ydrolyse β-endoglucanase (EC ) β-exoglucosidase (EC ) Cellulose 1,4-β- Cellobiosidase (EC ) β-endoglucanase (EC ) β-glucosidase (EC ) Cellulose-Kette (β-d-1,4-glucose- Polymer) Cellobiose (β-d-1,4- Glucose-Dimer)

7 verwendete Enzymsysteme Eingesetzte Enzympräparate und Enzymsysteme Technische Enzympräparate aus der Alkohol-, Brau- und Stärkeindustrie, Waschmittel- und Textilindustrie, Umwelttechnologie und Futtermittelindustrie. Extrazelluläre Enzymsystem von Penicillium brasilianum Batista IBT Extrazelluläre Enzymsystem von Bakterienstämmen aus Termitendarm (Cellulosimicrobium sp., Cellulomonas sp.)

8 Testsystem: Bioethanolausbeute Zymomonas mobilis CP 4 sehr hohe spezifische Produktivität Saccharomyces cerevisiae in Form von Trockenhefe sehr einfach handhabbar im Vergleich zu Z. mobilis vergleichbarer Ausbeutekoeffizient Y P/S

9 Experimentelle Vorgehensweise Untersuchung der Enzymaktivitäten mit Modellsubstraten Untersuchungen ausgewählter Enzymsysteme mit Maissilage Enzym-Substrat-Verhältnis Mischpräparate Einfluss der Vorbehandlungsmethode der Maissilage Temperatur-Einfluss p-einfluss ydrolyse von Maissilage mit dem Mischpräparat GC 880 / Novozym 188 bzw. dem Enzymsystem von P. brasilianum Batista und anschließende Ethanolherstellung mit Zymomonas mobilis

10 Aktivitäten mit Modellsubstraten Enzympräparat bzw. extrazelluläres Enzymsystem eines Mikroorganismus GC 880 Genencor Penicillium brasilianum Batista IBT Bakterienisolat MX5 (Cellulosimicrobium variabile sp. nov.) Bakterienisolat KMaC5 (Cellulomonas cellulans) Bakterienisolat NA2 (Cellulomonas cellulans) Bakterienisolat C.sp (Cellulomonas sp.) relative β-endoglucanase- Aktivität 1 max. (ku CMC /gprotein) 692 ± 14 (66 C, p 4,3) 27,6 ± 0,6 (49 C, p 5,1) 0,3 ± 0,01 (40 C, p 7,1) 0,3 ± 0,01 (40 C, p 7,1) 0,2 ± 0,01 (40 C, p 7,1) 2,7 ± 0,08 (56 C, p 6,4) relative β-glucosidase- Aktivität 2 max. (ku pnpg /gprotein) 0,1 ± 0,01 (67 C, p 6,4) 1,4 ± 0,04 (69 C, p 6,6) : Enzymassay: Somogyi-Nelson-Assay, Substrat Carboxymethylcellulose, C, p 3-8, 10 min, 1 ml. 2 : Enzymassay: β-glucosidase-assay, Substrat pnpg, C, p 3-8, 1 min, 1 ml.

11 Untersuchungen des Enzym-Substrat- Verhältnisses mit Maissilage Monosaccharid-Ausbeute (%) in Bezug auf nicht gelöste Zuckerfraktion in Maissilage 2 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0,1 mg / g 1 mg / g 10 mg / g 0,1 mg / g 1 mg / g 10 mg / g 0,1 mg / g 1 mg / g 10 mg / g Genencor GC 880 Genencor Laminex BG Biopract MethaPlus L 100 Enzym-Substrat-Verhältnis (mg/g) 1 1 : mg Protein / g TS durch Dampfexplosion vorbehandelte Maissilage 2 : spezifische Monosaccharid-Ausbeute = g Monosaccharid / 100 g nicht gelöste Zuckerfraktion in Maissilage Bedingungen: durch Dampfexplosion vorbehandelte Maissilage (1,5 % TS), 55 C, p 4,3, 400 ml AV im 1-L Schüttelkolben, Inkubationsdauer 110 h

12 Mischpräparate Monosaccharid-Ausbeute (%) in Bezug auf nicht gelöste Zuckerfraktion in Maissilage 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0,1 mg / g 1 mg / g 10 mg / g 1 mg / g 10 mg / g 20 mg / g Genencor GC Novozym 188 Genencor Laminex BG + Novozym 188 Enzym-Substrat-Verhältnis (mg/g)

13 Einfluss der Vorbehandlungsmethode der Maissilage Monosaccharid-Konzentration (g/l) in der Maissilage- Suspension 30,0 27,5 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 95 % / 5 % 85 % / 15 % 66 % / 33 % 95 % / 5 % 85 % / 15 % 66 % / 33 % durch Dampfexplosion vorbehandelte gemörserte Maissilage (10% TS) Maissilage (1,5% TS) Genencor GC 880 / Novozymes Novozym 188 (% Anteil im Gemisch (g/g)) 1 1 : g Protein / g Protein

14 Enzymsystems von P. brasilianum Batista: Temperatur-Einfluss 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Temperatur ( C) Monosaccharid-Ausbeute (%) in Bezug auf nicht gelöste Zuckerfaktion in Maissilage

15 Enzymsystems von P. brasilianum Batista: p-einfluss 100% Monosaccharid-Ausbeute (%) in Bezug auf nicht gelöste Zuckerfaktion in Maissilage 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 p 1 : spezifische Monosaccharid-Ausbeute = g Monosaccharid / 100 g nicht gelöste Zuckerfraktion in Maissilage Bedingungen: Enzym-Substrat-Verhältnis 1 mg Protein / g TS gemörserte Maissilage, p 5, 100 ml AV im 500-mL Schüttelkolben, Inkubationsdauer 24 h

16 Bioethanolausbeute mit Zymomonas mobilis Mischpräparat GC 880 / Novozym 188 durch Dampfexplosion vorbehandelt (2% TS) gemörsert (15% TS) Enzymsystem von P. brasilianum Batista IBT durch Dampfexplosion vorbehandelt (2% TS) gemörsert (15% TS) Spezifische Monosaccharid- Ausbeute max. (%) 67 ± 4,7 58 ± 3,0 62 ± 5,0 55 ± 4,9 Volumetrische Monosaccharid- Ausbeute (g/l) 13 ± 1,1 64 ± 3,3 12 ± 0,9 63 ± 5,6 Volumetrische Ethanol-Ausbeute (g/l) 5,7 ± 0,4 26,3 ± 2,3 6,3 ± 0,7 24,3 ± 2,6 Produktausbeutekoeffizient Y 1 P/S von Z. mobilis CP 4 0,50 0,48 0,57 0,46 1 : Ethanol-Produktausbeutekoeffizienten Y P/S : g Ethanol / g freigesetzte Monosaccharide. Bedingungen bei der enzymatischen ydrolyse: 50 C (GC 880 / Novozym 188) bzw. 45 C (P. brasilianum), p 4, 350 ml AV im 2-L Schüttelkolben, Enzym-Substrat- Verhältnis 1 mg Protein / g TS vorbehandelte Maissilage, Inkubationsdauer 48 h. Bedingungen bei der anschließenden Vergärung mit Z. mobilis CP4: 30 C, p 5, g BTM / L Maissilage-Suspension, Inkubationsdauer 24 h.

17 Zusammenfassung Die beste Monosaccharid-Ausbeute wurde mit dem technischen Mischpräparat GC 880 / Novozym 188 und Enzymsystem von Penicillium brasilianum Batista IBT erreicht. Die Bioethanol-Ausbeute nach Einsatz des Mischpräparates GC 880 / Novozym 188 betrug 0,20 g Ethanol / g Trockensubstanz gemörserte Maissilage (~50% des theoretischen Wertes). Gemörserte Maissilage ist aus praktischen Gesichtspunkten effektiver.

18 Vielen Dank dem Ministerium für Ernährung und ländlichem Raum und der Landesstiftung Baden- Württemberg für die finanzielle Förderung Projektnr.: IV/59-10