Wachstum und Expression rekombinanter Proteine mit E. coli in verschiedenen Batch- Kultivierungsmedien

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1 1 Wachstum und Expression rekombinanter Proteine mit E. coli in verschiedenen Batch- Kultivierungsmedien 2. Seminar Biotechnologie ( ) Natalia Putkaradze Master Biotechnologie (3. Semester) Matrikel-Nr.:

2 2 Einleitung In der Arbeit von Hortsch et al. [1] wurden das Wachstum von E. coli und die Expression rekombinanter Proteine ADH (Alkohol-Dehydrogenase von Lactobacillus brevis) und FDH (Formiat-Dehydrogenase von Candida boidinii) mit E. coli in veschiedenen Kultivierungsmedien evaluiert. Zum diesen Zweck wurden einfache Batch-Experimente in parallelen Milliliter-Maßstab-Rührkesselbioreaktoren durchgeführt und der gelöste Sauerstoff (DO), der ph-wert, die optische Dichte (OD) und die Aktivität der Proteine gemessen. Material und Methoden Alle bis heute bekannten Parallelbioreaktoren sind in Abbildung 1 zusammengefasst und miteinander verglichen. Bei allen Reaktoren werden der ph-wert und der Sauerstoffpartialdruck po2 (oftmals auch die optische Dichte) online gemessen. Lediglich das in dieser Arbeit eingesetzte System (der Bioreaktorblock) ist in der Lage, Proben zur atline-messung zur Verfügung zu stellen. Abbildung 1. Vergleich paralleler Miniaturbioreaktoren [1]

3 3 Der zweite wichtige Vorteil des Bioreaktorblocks ist eine gute Versorgung der Mikroorganismen mit Sauerstoff, da der Sauerstoffeintrag im Drehzahlbereich zwischen 2000 und 2800 min -1 einen KLa-Wert von 0,1 bis 0,4 s -1 erreichen kann. Die Nutzbarkeit des Systems wurde bisher für die Kultivierung verschiedener Organismen nachgewiesen: Escherichia coli [3], [5], Saccharomyces cerevisiae [5], Bacillus subtilis [8], [9], Cupriavidus necator [10], Streptomyces tendae [7]. Der prinzipielle Aufbau des Systems ist in Abbildung 2 dargestellt. a b Abbildung 2: a) Aufbau eines parallelen Bioreaktorblocks: Sterilgasabdeckung (1), Kopfraumkühlung (2), Reaktoren (3), magnetisch-induktiven Antrieb (4), Rührerüberwachung (5), Sensorik (6); b) Verdrängungskörper (1), Gasauslass (2), Wärmekontaktring (3), Reaktor (4), Hohlachse (5), Rührorgan (6), magnetisch induktiver Antrieb (7), diagonale Bohrungen (8), Wärmekontaktring (9)[6]. Zum Vergleich des Wachstums von E. coli BL21 (DE3) T1r (pet24a-adhl. brevis fdhc. boidinii) (Julich Chiral Solutions, Jülich, Deutschland) und der Expression der Proteine ADH und FDH wurden folgende Medien eingesetzt: LB-Medium (10 g/l Pepton; 5 g/l

4 4 Hefeextrakt; 5 g/l NaCl; 1,9 g/l KH2PO4; 2 g/l K2HPO4); TB-Medium (12 g/l Pepton; 24 g/l Hefeextrakt; 4 ml/l Glycerol; 2,3 g/l KH2PO4; 12,5 g/l K2HPO4); Komplex-Medium nach [5] (20 g/l Pepton; 20 g/l Hefeextrakt; 30 g/l Glucose; 13 g/l, KH2PO4; 10 g/l K2HPO4; 5 g/l NaCl; 2 g/l (NH4)2SO4; 1 g/l MgSO4*7H2O; 0,2 g/l NH4Cl); EnBase Flo Medium nach [13] (BioSilta, Finnland.1,5-12 U/L Glucoamylase). EnBase (Enzyme-Based-Substrate-Delivery) ist eine moderne Methode, die für einen enzymatischen Abbau von Stärke zu Glucose die Glucoamylase von Aspergillus niger verwendet. Das Zellwachstum wird durch Zugabe von Glucose gezielt gesteuert. Dafür wird ein Zweiphasen-System erzeugt, das aus einem Gel als Stärkequelle und aus einem Kultivierungsmedium besteht. Es gibt eine zusätzliche Schicht aus Agarose zwischen Stärkequelle und Kulturmedium, welche die Freisetzung von unlöslichen Stärke- Teilchen am flüssigen Medium verhindert und für eine bessere Steuerung der Freisetzung-Geschwindigkeit von löslicher Stärke sorgt. Mit dieser Methode wurden hohe Zelldichten und hohe Ausbeuten an rekombinanten Proteinen erzielt. Ergebnisse und Diskussion Die Ergebnisse der EnBase-Methode mit verschiedenen Glucoamylase-Konzentrationen sind in Abbildung 3 gezeigt. Das schnellste Wachstum wurde bei Kultivierungen mit einer Glucoamylase-Konzentration von 12 U/L beobachtet. Hierbei wurde eine Trockengewichtskonzentration von 8 g/l erreicht (Abb. 3c). Bei Reaktionen mit niedrigen Enzym-Konzentrationen wurde ein langsameres Wachstum beobachtet, da in diesen Fällen weniger Glukose freigesetzt wurde (Abb. 3a, 3b).

5 5 Abbildung 3. Wachstum von E. coli im EnBase-Medium. Glucoamylase-Konzentration: 1,5 (a); 6 (b) und 12 (c) U/L. Induktion mit IPTG (Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosid) bei einer Trockengewichtskonzentration von ca. 3,5 g/l. Vertikale gestrichelte Linien zeigen die Zeitpunkte für die Induktion. Bei allen Kulturen hat der Sauerstoff-Verbrauch am Ende der exponentiellen Phase sein Maximum erreicht. Der ph-wert bei allen EnBase-Kultivierungen ist nahezu konstant geblieben. Nur die Kultivierungen mit einer Glucoamylase-Konzentration von 12 U/L zeigten eine leichte Abnahme von ph 7,0 auf 6,8 (Abb. 3c). Während dieser Phase werden komplexe Zusatzstoffe und freigegebene Glukose durch die Zellen verstoffwechselt, was zu einem leichten metabolischen Überschuss bei Kultivierungen mit großen Mengen an Glucoamylase führt. In Abbildung 4 sind die Ergebnisse für Kultivierungen im Komplex-Medium nach [5] dargestellt. Die Zellen wurden bei ca. 2,5 g/l; 5 g/l und 7,5 g/l Trockengewichtskonzentrationen induziert. Das exponentielle Wachstum der Zellen wurde nach der Induktion bei einer Trockengewichtskonzentration von ca. 2,5 g/l

6 6 gestoppt und es wurde ein lineares Wachstum beobachtet. Die übrig gebliebene Glucose wurde bei der zweiten Wachstumsphase vollständig metabolisiert. Bei diesen Kultivierungen wurde eine Trockengewichtskonzentration von 14 g/l erzielt. Dieses Ergebnis stimmt mit Ergebnissen von Kusterer überein [5]. Der ph-wert ist während der Wachstumsphase konstant geblieben und danach bis auf 7,2 angestiegen. Hier wurde eine minimale Konzentration des gelösten Sauerstoffs von 30% der Luftsättigung gemessen. Abbildung 4. Wachstum von E. coli im Komplex-Medium nach [5]. Induktion mit IPTG bei der Trockengewichtskonzentration von 2,5 (a); 5 (b); 7,5 g/l (c). Vertikale gestrichelte Linien zeigen die Zeitpunkte für die Induktion[1]. Bei den Kultivierungen, bei denen die Induktion bei einer Trockengewichtskonzentration von 5 g/l erfolgte, wurde nach der Induktion die exponentielle Wachstumsphase gestoppt und nachfolgend wurde ein lineares Wachstum bis zu einer Trockengewichtskonzentration von 12 g/l beobachtet. Nach 6 Stunden sank die Sauerstoffkonzentration unter 10% der Luftsättigung. Deshalb wurde die Rührergeschwindigkeit automatisch von 2800 rpm auf 2900 rpm erhöht, um eine

7 7 Sauerstofflimitierung zu vermeiden. Der ph-wert sank während der Wachstumsphase auf 6,7 und erhöhte sich danach auf 7,3. Die Kultivierungen, bei denen die Zellen bei einer Trockengewichtskonzentration von 7,5 g/l induziert wurden, zeigten ein exponentielles Wachstum bis zu einer maximalen Trockengewichtskonzentration von 14 g/l. Aufgrund des starken exponentiellen Wachstums und anschließender Acetatbildung (overflow-metabolismus) sank der ph-wert unter 6,5 und erhöhte sich danach auf 7,1. Die Ergebnisse für das Wachstum von E. coli in LB- und TB-Medien sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Kulturen wurden bei einer Trockengewichtskonzentration zwischen 0,35 0,45 g/l induziert. Eine maximale Trockengewichtskonzentration von 1 g/l wurde in Kultivierungen mit LB-Medium beobachtet und der Sauerstoffverbrauch war entsprechend gering. Abbildung 5. Wachstum von E. coli im LB-Medium (a), TB-Medium (b). Vertikale gestrichelte Linien zeigen die Zeitpunkte für die Induktion[1]. Das Wachstum im TB-Medium wurde durch die Induktion am Anfang kurz gestoppt und hat anschließend in der zweiten Wachstumsphase eine Trockengewichtskonzentration von 5 g/l erreicht.

8 8 Die Ergebnisse der Analyse der ADH- und FDH-Aktivität im Komplex-Medium sind in Abbildung 6 (a, b) dargestellt. Die Zellen wurden bei einer Trockengewichtskonzentrationen von 2,5; 5 und 7,5 g/l induziert. Die Proben wurden jeweils 6 beziehungsweise 24 Stunden nach der Induktion gezogen und die Aktivität der Enzyme gemessen. a c b d Abbildung 6. 1) Spezifische Aktivität von ADH (a) und FDH (b), 6 Stunden (in schwarz) und 24 Stunden(in grau) nach Induktion mit IPTG; 2) Spezifische Aktivität von ADH (c) und FDH (d) in verschiedenen Medien, 6 Stunden (in schwarz) und 24 Stunden(in grau) nach Induktion mit IPTG(jeweils n=6 parallele Bioreaktoren) [1]. Die höchsten spezifischen ADH- und FDH-Aktivitäten wurden bei den 6-Stunden-Proben von den Kulturen gemessen, bei denen die Trockengewichtskonzentration bei der Induktion 5 g/l betragen hat. Alle nach 24 Stunden gemessenen Proben zeigten im Vergleich zu den nach 6 Stunden gemessenen Proben niedrigere spezifische Aktivitäten der ADH und FDH. Nur die 24-Stunden-Proben von den Kultivierugen, die bei der Induktion eine Trockengewichtskonzentration von 7,5 g/l hatten, wiesen eine höhere spezifische FDH-Aktivität als die 6-Stunden-Proben auf.

9 9 Die Induktion bei einer Trockengewichtskonzentration von 5 g/l wurde zur Expression von ADH und FDH als optimal identifiziert. Die spezifischen Enzymaktivitäten beider Proteine in verschiedenen Medien sind in Abbildung 6 (c,d) dargestellt. Die höchste spezifische ADH-Aktivität wurde im Komplex-Medium gemessen. Die Messungen ergaben völlig unterschiedliche Ergebnisse für die Aktivität von FDH. Die höchste spezifische Aktivität des Enzyms zeigte die 24-Stunden-Probe des EnBase- Mediums mit einer Glucoamylase Konzentration von 1,5 U/L. Spezifische Aktivitäten der Enzyme in LB- und TB-Medien sind dabei auch niedriger als in anderen Medien. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass für ein unlimitiertes Wachstum ein Bioreaktor verwendet werden muss, mit dem hohe Sauerstoff-Transfer-Koeffizienten erreicht werden. Ein gutes Beispiel dafür sind Milliliter-Maßstab Rührkesselbioreaktoren, die eine gute Sauerstoffversorgung der Proben ermöglichen (KLa>0,4 s -1 ). Für eine effiziente Proteinexpression müssen abhängig von dem rekombinanten Protein verschiedene Prozessparameter und Medien evaluiert werden. Die einfachen parallelen Batch- Experimente in 48 Milliliter-Maßstab Rührkesselbioreaktoren ermöglichen die Identifizierung optimaler Prozessbedingungen in kurzer Zeit. Wenn in den Miniaturbioreaktoren die Bedingungen mit denen im Labor- und Pilotmaßstab vergleichbar sind kann die Entwicklungszeit erheblich reduziert werden. Die Kombination von dem EnBase-Medium und den Milliliter-Maßstab Rührkesselbioreaktoren hat ein großes Potenzial, die Kultivierungen mit hohen Zelldichten in einem quasi fed batch -Modus zu erzielen.

10 10 Literatur [1] Hortsch R, Weuster-Botz D Growth and recombinant protein expression with Escherichia coli in different batch cultivation media. Appl Microbiol Biotechnol 90: [2] Puskeiler R, Kaufmann K, Weuster-Botz D. 2005a. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng 89: [3] Puskeiler R, Kusterer A,John GT, Weuster-Botz D. 2005b. Miniature bioreactors for automated high-throughput bioprocess design (HTBD): reproducibility of parallel fedbatch cultivations with Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem 42: [4] Bareither R, Pollard D A review of advanced small scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: current state and future need. Biotechnol. Prog 27:2-14. [5] Kusterer A, Krause C, Kaufmann K, Arnold M, Weuster-Botz D Fully automated single-use stirred-tank bioreactors for parallel microbial cultivations. Bioprocess Biosyst Eng 31: [6] Kusterer A, Reaktionstechnische Optimierung von Parallelreaktoren für kontrollierte Bioprozesse. Dissertation. Fakultät für Maschinenwesen,Technischen Universität München. [7] Hortsch R, Krispin H, Weuster-Botz D (2010b) Process performance of parallel bioreactors for batch cultivation of Streptomyces tendae. Bioprocess Biosyst Eng. doi: /s

11 11 [8] Knorr B, Schlieker H, Hohmann H.P, Weuster-Botz D Scale-down and parallel operation of the riboflavin production process with Bacillus subtilis. Biochem Eng J 33: [9] Vester A, Hans M, Hohmann HP, Weuster-Botz D Discrimination of riboflavin producing Bacillus subtilis strains based on their fed-batch process performances on a millilitre-scale. Appl Microbiol Biotechnol 84: [10] Höfel T, Wittmann E, Reinecke L, Weuster-Botz D Reaction engineering studies for the production of 2-hydroxyisobutyric acid with recombinant Cupriavidus necator H 16. Appl Microbiol Biotechnol 88: [11] Chmiel H Bioprozesstechnik. Elsevier GmbH, München. [12] Phue JN, Noronha SB, Hattacharyya R, Wolfe AJ, Shiloach J (2005) Glucose metabolism at high density growth of E. coli B and E.coli K: differences in metabolic pathways are responsible for efficient glucose utilization in E. coli B as determined by microarrays and northern blot analyses. Biotechnol Bioeng 90: [13] Panula-Perälä J, Siurkus J, Vasala A, Wilmanowski R, Casteleijn MG, Neubauer P (2008) Enzyme controlled glucose auto-delivery for high cell density cultivations in microplates and shake flasks. Microb Cell Fact 7:31.