cytobox: Zelllinien-Herstellung im Rekord-Tempo
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- Berndt Esser
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1 Powered by Seiten-Adresse: cytobox: Zelllinien-Herstellung im Rekord-Tempo Bislang war die Produktion von Zelllinien mit einer Dauer von rund 14 Wochen sehr zeitintensiv und damit nicht selten auch kostspielig. Durch ein weltweit einmaliges Format des Konstanzer Unternehmens cytobox gehört dies ab sofort der Vergangenheit an. In der Rekordzeit von nur 30 Arbeitstagen erfreut die vor kurzem gegründete Biotechnologie-Firma Forscher und Entwickler mit fertigen, stabilen Zelllinien und das deutlich unter dem sonst üblichen Preisniveau für kundenspezifische Zelllinien. Möglich macht das die innovative ExoIn-Technologie mit einer ausgeklügelten Koppelung der Synthese von Target- Protein und Selektionsmarker. 1
2 Zur zuverlässigen Target-Expression wird bei cytobox durch dessen Koppelung an eine Antibiotikum-Resistenz beigetragen. cytobox Persönliche Daten eingeben, Proteinsequenz übermitteln und Parentalzelllinie auswählen das ist schon alles und in etwa fünf Minuten erledigt, beschreibt Dr. Konstantin Matentzoglu, Geschäftsführer von cytobox den einfachen und schnellen Weg, beim Konstanzer Unternehmen stabile Säuger- Zelllinien online in Auftrag zu geben, um diese bereits nach spätestens 30 Arbeitstagen in Empfang zu nehmen. Seit September 2009 bieten er und sein Team ein bis dahin noch nicht am Markt verfügbares Konzept der Zelllinien-Produktion, und das verbunden mit einer Erfolgsgarantie für den Kunden. Geweckt wurde die Idee, ein sehr standardisiertes und damit kundenfreundliches Format ins Leben zu rufen, durch den Erfolg der Zelllinienentwicklung bei der Mutterfirma Trenzyme GmbH auf Basis des dort lizenzierten ExoIN-Systems, das die Schnelligkeit und Qualität der Erzeugung liefert. Wir wollten ein Format, dass die breite Masse an Forschern anspricht, also auch in den Universitäten mit knappem Budget. Bedingung dafür waren ein günstiger Preis und ein bequemer Bestellprozess, erklärt Dr. Konstantin Matentzoglu. Hergestellt werden wahlweise CHO- oder HEK-basierte Zelllinien. Ist ein Auftrag eingegangen, wird dieser auf zunächst einmal auf Durchführbarkeit und rechtliche sowie ethische Aspekte in Bezug auf die Gensynthese geprüft. Nach erfolgreicher Verifizierung wird das Produkt der Gensynthese in unser ExoIN Vektorsystem kloniert und die vom Kunden ausgewählte Parentalzelllinie transfiziert, so der Zellbiologe. Im nächsten Schritt wird die stabile, rekombinante Zelllinie selektioniert, worauf eine Analyse der Expression der Targets über qpcr erfolgt und die Zelllinie anschließend versandfertig in mehreren Vials eingefroren wird. Bei der qpcr-kontrolle wird die Menge mrna des Targets pro Zelle quantifiziert, wobei hierbei nicht nur eine qualitative, sondern auch eine quantitative Aussage getroffen werden kann. Übertragen auf den Alltag ist das so, als wenn jemand auf die Frage nach der Außentemperatur nicht nur mit warm oder kalt antwortet, sondern präzise 23,5 C sagen kann, führt Dr. Matentzoglu die entscheidenden Vorteile auf. Vor dem Versand der fertigen Zelllinien werden anschließend eine Auftaukontrolle und ein Mykoplasmentest zur Qualitätssicherung durchgeführt. Danach geht die Zelllinie mit fertigem Medium und elektronischem Report an den Kunden. ExoIN-Technologie setzt neue Maßstäbe Einen wichtigen Faktor der rekordverdächtigen Zelllinien-Entwicklung markiert die ExoIN- Technologie. Wir koppeln hierbei die Expression, das heißt die Synthese des kundenspezifischen Target- Proteins an die Synthese eines Selektionsmarkers bzw. Antibiotika- Resistenz, konstatiert der Geschäftsführer von cytobox. Dadurch stellt das Unternehmen sicher, dass alle Zellen, die unter Selektionsbedingungen wachsen, das Target-Protein herstellen. Die Koppelung erfolgt anders als bei bisher verfügbaren Systemen auf Proteinebene. Dennoch können die Konstanzer durch ihre trickreiche Strategie sicherstellen, dass das Target durch die Koppelung in keinster Weise modifiziert wird. Da alle Zellen komplett das Gleiche machen nämlich das Target zu synthetisieren, können wir mit unserer Technologie den zeitaufwändigen und kostenintensiven Schritt des Single-Cell- Clonings einsparen, um eine quasi klonale Situation zu erzeugen das spart Zeit und vor 2
3 Dr. Konstantin Matentzoglu, Geschäftsführer von cytobox. cytobox allem Geld, erklärt Dr. Matentzoglu. Der sehr hohe marktübliche Preis zwischen und Euro für eine stabile, klonale Zelllinie führte dazu, dass solche Projekte eher vorsichtig angegangen werden und viel Planungsaufwand betrieben wird, egal ob es der Forscher selbst durchführt oder ob er einen Dienstleister damit beauftragt, bemerkt der Zellbiologe. Mit dem neuen Konzept unterbietet cytobox Markt-Preise sehr deutlich und wird so auch für den akademischen Bereich interessant. Hinter der raschen Zelllinien-Herstellung steckt neben einer optimierten De-novo-Synthese von cdna auch eine einhergehende Standardisierung des Prozessablaufs bis zur finalen Zelllinie. Durch die im Paket beinhaltete Gensynthese sind wir nicht auf natürliche cdna-quellen wie Kundenproben, Klone aus Bibliotheken mit all ihren Problemen, wie zum Beispiel fehlerhaften Sequenzen, angewiesen, so der Geschäftsführer von cytobox. Damit wird es für das Konstanzer Unternehmen aber auch möglich, unkompliziert ein designtes Protein mit beispielsweise Aminosäure-Austauschen oder beliebigen Tags zu synthetisieren. Schnell, aber auch zuverlässig Die Entwicklung von Zelllinien ist nicht selten mit einem ungewissen Ausgang verbunden. Mit der optimierten Verbindung zwischen Target- Expression und Selektion hat cytobox einen Weg gefunden, Klone mit fehlender Target- Expression weitestgehend auszuschließen. Üblicherweise hat man zwar resistente Klone, die das Target- Gen tragen, doch ist häufig unklar, ob diese dann auch das Protein produzieren, so dass man erst in ein sehr aufwändiges Screening von vielen, zum Teil Tausenden Einzelklonen investieren muss, stellt Dr. Konstantin 3
4 Mit innovativen Methoden und einem weltweit einmaligen Vertriebskonzept entwickelt cytobox Zelllinien im Schnellverfahren. cytobox Matentzoglu fest. Hier beugt das Konstanzer Unternehmen vor: Auch mit unserem System kann es passieren, dass man mal zum Beispiel bei zytotoxischen Proteinen keinen Klon findet, der das Target synthetisiert. Nur wissen wir es schon zwei bis drei Wochen nach Projektstart und nicht erst nach drei Monaten Screening, wie es beim sonst üblichen Prozess der Fall ist, bemerkt der Zellbiologe. Das festzustellen ist sehr einfach: Wachsen die Zellen unter Selektionsbedingungen, dann synthetisieren sie das Target alle negativen Zellen sterben einfach ab erklärt er weiter. Zur Zuverlässigkeit der Expression des kundenspezifischen Targets bei cytobox trägt somit dessen Koppelung an eine Antibiotikum-Resistenz bei. Antibiotika-Konzentrationen im Wachstumsmedium sind für gewöhnlich sehr kritisch. Schwankungen in der Antibiotikum- Aktivität durch z.b. unterschiedlich alte Chargen oder gar unterschiedliche Antibiotikum- Hersteller wirken sich dramatisch aus, betont Dr. Konstantin Matentzoglu. Daher validieren er und sein Team für jede Mediumscharge das verwendete Antibiotikum. Das Medium enthält dabei alle Komponenten, die die Zellen zum Wachstum brauchen, so dass nichts mehr 4
5 zugesetzt werden muss, auch kein Serum, berichtet der cytobox-geschäftsführer. Ist trotz der sehr sicheren Kopplung der Expression an das Wachstum der Zellen mal keine Expression zu sehen, entstehen für die Auftraggeber keinerlei Kosten. Wir verfolgen eine strikte Erfolgsgarantie, so dass es überhaupt kein Risiko für den Kunden gibt, stellt der Konstanzer Entwickler klar. Ausweitung der Gensynthese geplant Eine weitere deutliche Reduzierung der Herstellungsdauer sieht Dr. Matentzoglu zur Zeit als nicht realisierbar, da durch das Wachstum und die Teilung von Zellen ein bestimmtes natürliches Limit gesetzt wird. Beschleunigen könnte man den Prozess nur durch eine schnellere Gensynthese. Die stellt jedoch eine bereits sehr etablierte und optimierte Technologie dar, so der Zellbiologe. Im Prinzip ist die Zeit für die Gensynthese der Flaschenhals, so dass das Unternehmen die Größe der Targets im Standardpaket auf Basenpaare limitiert hat. Wir überlegen jedoch gerade, ob in einer zukünftigen, noch stärker modularen Ausbaustufe dieses Limit fallen kann, verweist Dr. Matentzoglu auf mögliche Weiterentwicklungen. Fachbeitrag mst BioLAGO BIOPRO Baden-Württemberg GmbH Weitere Informationen cytobox UG Dr. Konstantin Matentzoglu Geschäftsführer Byk-Gulden-Str. 2 D Konstanz Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) info(at)cytobox.com 5
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