GENEXPRESSION DER GH- IGF-1 KASKADE IN ENDOKRIN AKTIVEN UND ENDOKRIN INAKTIVEN HYPOPHYSENADENOMEN

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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Abteilung Innere Medizin II der Albert-Ludwig-Universität Freiburg im Breisgau GENEXPRESSION DER GH- IGF-1 KASKADE IN ENDOKRIN AKTIVEN UND ENDOKRIN INAKTIVEN HYPOPHYSENADENOMEN INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vorgelegt 2002 von Katharina Hancke geboren in Wiesbaden

2 2 Dekan Prof. Dr. re. nat. M. Schumacher 1. Gutachter Prof. Dr. M. Reincke 2. Gutachter PD Dr. J. Honegger Jahr der Promotion 2003

3 3 DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich mich bei allen ganz herzlich bedanken, die mir beim Gelingen dieser Arbeit tatkräftig zur Seite standen. Herrn Prof. Dr. med. Reincke danke ich herzlich für die Überlassung dieses Dissertationsthemas und die Korrektur meiner Arbeit. Weiterhin danke ich Herrn PD Dr. med. Honegger für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens. Besonderen Anteil an meiner experimentellen Arbeit hat ohne Zweifel das Laborteam B9, das mich bei meiner Arbeit immer unterstützt hat. Besonders bedanken möchte ich mich bei Maik Stahl und Patrizia Mora, die mich oft psychologisch unterstützt haben und bei Oliver Zwermann, der geduldig den Material und Methodenteil korrigiert hat. Vielen Dank auch Kai Schmenger, der mir vor allem mit Computerfragen und dem Umgang mit Geräten geholfen hat. Bei meinem Freund Michael Denkinger möchte ich mich besonders bedanken. Er hat nicht nur den einen oder anderen Tippfehler trotz Zeitdrucks ausfindig gemacht und immer wieder die Arbeit geduldig gelesen. Sondern er hat mich, wenn es mal nicht so gut lief, immer wieder aufgebaut und unterstützt. Besonders möchte ich mich auch bei meiner Familie bedanken. Sie haben mich immer unterstützt, waren immer an meiner Arbeit interessiert und haben mir öfters hilfreiche Tipps gegeben. Vor allem meine Mutter, die den einen oder anderen Artikel für mich noch ausfindig gemacht hat. Auch meinen lieben Großeltern vielen Dank, vor allem für die seelische Unterstützung, das Interesse und den Antrieb, mich zu beeilen und schnell fertig zu werden.

4 4 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG Die Hypophyse Die Hormone des Hypophysenvorderlappens und die Regulation Wachstumshormon (GH=Growth-Hormon) und Regulation Prolaktin und Regulation Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) und Regulation Thyroidea-stimulierendes Hormon (TSH) und Regulation Die Gonadotropine LH und FSH und ihre Regulation Tumoröse Veränderungen der Hypophyse Klassifikation und Epidemiologie von Hypophysenadenomen Pathophysiologie und molekulare Aspekte der Tumorgenese allgemeine Therapieansätze von Hypophysenadenomen Somatotrope Hypophysenadenome Gonadotropin-produzierende Hypophysenadenome Endokrin inaktive Hypophysenadenome Fragestellung PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN Patienten

5 5 2.2 Arbeitsschritte im Überblick Material Arbeiten mit RNA RNA-Extraktion Prinzip Durchführung Das Polymerase Chain Reaktion (PCR) - Verfahren Das Prinzip Durchführung Analyse der PCR-Produkte Gelelution das Southern Blot Verfahren Prinzip Durchführung Gelelektrophorese Kapillartransfer auf Nylonmembran ( Blotten) Radioaktive Markierung der Blots Das Prinzip Herstellung der cdna-sonde Markieren der cdna-sonde ( Labelling ) Hybridisierung und Waschschritte Detektion der spezifischen RNA-Sequenzen (Autoradiographie)

6 Blot stripping und Rehybridisierung Semiquantitative Auswertung ERGEBNISSE Nachweis der mrna Expression von GH, GH-Rezeptor, IGF-1, IGF-1-Rezeptor und β- Aktin in den Adenomen Genexpression der mrna in normalem Hypophysengewebe Genexpression in endokrin inaktiven Hypophysenadenomen Genexpression in somatotropen Hypophysenadenomen Mittelwerte der relativen mrna Expression von GH, GH-Rezeptor, IGF-1 und IGF-1- Rezeptor und Zusammenfassung der Ergebnisse DISKUSSION Diskussion der Ergebnisse Expression von Growth Hormone (GH) Expression von Growth Hormone Rezeptor (GH-R) Expression von Insulin-like-Growth-Factor-1 (IGF-1) Expression von Insulin-like-growth-factor-1-Rezeptor (IGF-1-R) Wirkung von IGF-1 und IGF-1-Rezeptor auf die Entstehung von Adenomen Therapiemöglichkeiten ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS

7 7 1. EINLEITUNG 1.1 Die Hypophyse Die Hypophyse (Glandula pituitaria) liegt als kleines, walzenförmiges, 0,6 g schweres Organ in der Sella turcica über der Keilbeinhöhle, hinter oder unter dem Chiasma opticum sowie unter dem Boden des Zwischenhirns. Sie ist mit dem Zwischenhirn durch das Infundibulum (=Hypophysenstiel) verbunden, das durch ein Loch im Diaphragma sellae tritt. Seitlich liegt sie zwischen den Sinus cavernosi und den in ihnen verlaufenden Aa. carotides internae. An der Hypophyse unterscheidet man den Hypophysenhinterlappen (=Neurohypophyse) und den Hypophysenvorderlappen (=Adenohypophyse) [64]. Der Hypophysenhinterlappen (HHL) entwickelt sich aus einer Ausstülpung des Zwischenhirns, dem Infundibulum. Dies erklärt, weshalb HHL und Hypothalamus, über das Infundibulum verbunden, eine strukturelle und funktionelle Einheit bilden. In dem HHL werden die Hormone Vasopressin und Ocytocin, die im Hypothalamus gebildet werden, ausgeschüttet [43]. Der Hypophysenvorderlappen (HVL) entwickelt sich aus einer Epitheltasche (Rathke-Tasche) der ektodermalen Mundbucht, die durch ein Loch in der Sella turcica auf das vom Dienzephalon kommende Infundibulum zuwächst. Im weiteren Verlauf obliteriert die epitheliale Verbindung zur Mundbucht. Der Teil der Rathke-Tasche, der zum Hypophysenhinterlappen Kontakt aufnimmt, bildet den sog. Mittellappen, der aber nur im Embryonalzustand beim Menschen nachweisbar ist [59]. Der HVL ist einer hypothalamischen Kontrolle unterstellt, reagiert aber auch auf Signale anderer endokriner Systeme. Er bildet hgh (human Growth Hormone), Prolaktin, TSH (Thyreotropin), ACTH (Corticotropin) und die Gonadotropine LH (luteinisierende Hormon) und FSH (follikelstimulierendes Hormon). Die fetale Hypophysenanlage ist beim Menschen zwischen der 4. und 5. Woche der Schwangerschaft erkennbar. Es erfolgt schnell eine zytologische Differenzierung, wobei die spezifischen sekretorischen Granula, die die Translationsprodukte der Hormongentranskripte enthalten, nach dem 1. Trimester der Schwangerschaft nachweisbar sind.

8 8 1.2 Die Hormone des Hypophysenvorderlappens und die Regulation Der Hypothalamus ist die letzte neurale Schaltstelle zwischen dem Zentralnervensystem (ZNS) und den endokrinen Zellen des HVL. Er steht unter der Kontrolle seiner hypophysiotropen Zentren, deren Neurohormone über das Portalsystem den HVL erreichen, um an den jeweiligen Zielzellen Synthese und Sekretion der einzelnen Hormone zu steuern. Diese hypophysialen Neurone, die im Bereich der Eminentia mediana Kontakt zu dem Protalsystem finden, können als neuroendokrine Transducer bezeichnet werden, da sie neurale in hormonale Information verwandeln. Die Freisetzung der HVL-Hormone wird nicht nur vertikal durch inhibierende und stimulierende hypophysiotrope Neurohormone gesteuert, sondern unterliegt auch einer parakrinen Steuerung durch die von den jeweiligen Nachbarzellen gebildeten und in den Interzellulärspalt abgegebenen Zytokine und Wachstumsfaktoren. Außerdem unterliegt die HVL-Hormonfreisetzung einer negativen Feedback-Kontrolle (s. Abbildung 1) über die in der Peripherie freigesetzten Hormone oder Wachstumsfaktoren. Das Prinzip der Feedback-Kontrolle entspricht einem Regelkreissystem. Die Regulation der Regelgröße erfolgt im allgemeinen über eine negative Rückkopplung (negativer Feedback) durch das freie, zirkulierende Hormon auf hypophysärer und auch auf hypothalamischer Ebene. Darüber hinaus besteht ein Regelkreis zwischen HVL-Hormonen und hypophysiotropen Hormonen, der als short Feedback bezeichnet wird. Unter ultra short Feedback versteht man die Rückkoppelung zwischen postsynaptischen peptidergen Neuronen, die die hypophysiotropen Neurohormone freisetzen und den präsynapitischen, in der Regel monoaminergen Neuronen höherer Nervenzentren [78].

9 9 Abbildung 1. Allgemeiner Feedback-Mechanismus Hypothalamus hypothalamische Hormone oder Transmitter Hypophysenvorderlappen neg. Rückkopplung der Gewebshormone auf hypothalamischer Ebene und auf hypophysärer Ebene Hormone des Hypophysenvorderlappen Nebenniere/ Schilddrüse/ Leber/Ovar & Hoden Negative Wirkung Positive Wirkung Es wird in der Regel unterschieden zwischen den direkt in der Peripherie wirkenden Hormonen: Wachstumshormon (GH) und Prolaktin (PRL) und den über Stimulation peripherer endokriner Drüsen ihre biologische Aktivität entfaltenden glandotropen Hormonen: ACTH, TSH und die Gonadotropine LH und FSH Wachstumshormon (GH=Growth-Hormon) und Regulation Das Wachstumshormon (GH) ist ein einkettiges Peptidhormon mit 191 Aminosäuren, 2 Disulfidbrücken und einer relativen Molekülmasse von Das Gen für humanes Wachstumshormon befindet sich auf dem langen Arm des Chromosomen 17. Die Transkription des GH-Gens erfolgt ausschließlich in den somatotropen Zellen des HVL. Im Gegensatz zu dem GH-verwandten Prolaktin wird Wachstumshormon in großen Mengen intragranulär in den somatotropen Zellen des HVL gespeichert. So enthält die menschliche Hypophyse 4-6 mg GH, was etwa 3-4% des Drüsentrockengewichtes entspricht. Die tägliche

10 10 GH-Produktionsrate beim Erwachsenen beträgt nur einen kleinen Teil dieser Menge, etwa 400 µg pro Tag. Einen starken Reiz für die Stimulation der GH-Sekretion stellt eine Verringerung der Glucose- Konzentration im Blut dar. Im Gegensatz dazu führt ein Anstieg des Blutzuckers zu einer Hemmung der GH-Sekretion. Freie Fettsäuren wirken ähnlich wie die Glucose auf die GH- Sekretion, während Glukokortikoide diese hemmen. Außerdem steht die GH-Sekretion unter dualer hypothalamischer Kontrolle durch das stimulierende GHRH und das inhibierende Somatostatin (vgl. Abb. 2). Diese Sekretion erfolgt pulsatil und wird durch die zeitversetzte, intermittierende Freisetzung von GHRH und Somatostatin in das hypothalamisch-hypophysäre Portalblut hervorgerufen [76]. Das Growth-Hormon-Releasinghormon (GHRH) ist ein langkettiges Neuropeptid mit 44 Aminosäuren, das nach Bindung an den Rezeptor der somatotropen Zelle zu einer Aktivierung der Adenylatzyklase führt. Der Anstieg des zyklischen Adenosinmonophosphats (camp) führt über Aktivierung von Kinasen zu einer Stimulation der GH-Genexpression und -Sekretion [77].

11 11 Abbildung 2. Feedback-Mechanismus der somatotropen Hormone freie Fettsäuren Glukokortikoide Stress Somatostatin Blutglucose Hypothalamus Blutglucose GHRH neg. Rückkopplung Hypophysenvorderlappen auf hypothalamischer Ebene durch GH GH auf hypophysärer Ebene durch IGF-1 Leber: IGF-1 IGF-1 Negative Wirkung Positive Wirkung Das Growth Hormon ist ein Protein-anaboles Hormon, das zu einer vermehrten Aufnahme von Aminosäuren in die Zelle und zu einer verminderten Stickstoffausscheidung führt. Zusätzlich stimuliert GH die Proteinsynthese und wirkt bezüglich des Aminosäurestoffwechsels zum Insulin synergistisch. Im Gegensatz dazu wirkt GH im Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel als Inulinantagonist. Diese biologische Wirkung ist an den klinischen Bildern Akromegalie, hypophysärer Riesenwuchs und Minderwuchs abzulesen. Die meisten Stoffwechselwirkungen werden nicht direkt durch GH, sondern durch den in der Leber gebildeten Insulin-like-growth-faktor-I (IGF-I, früher Somatomedin C genannt) vermittelt. IGF-I wirkt über einen negativen Feedbackmechanismus auf die GH-Sekretion. Es hemmt die auf hypophysärer Ebene die GH-Expression und auf hypothalamischer Ebene die Freisetzung von GHRH (vgl. Abb.2).

12 12 IGF-I ist ein einkettiges Polypeptid mit 67 Aminosäuren, das in der Leber gebildet wird und in das Plasma sezerniert wird. Klinisch wird die Regulation von Wachstumshormonen auf IGF-I insofern sichtbar, dass es bei Akromegalie erhöht und bei Hypophysenunterfunktion erniedrigt ist [76] Prolaktin und Regulation Das humane Prolaktin (PRL) ist ein einkettiges Peptidhormon mit 199 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von Prolaktin und GH haben eine ausgeprägte Interspezieshomologie. Der Hauptproduktionsort des Prolaktin sind die laktotrophen Zellen des HVL. Sie sind im Gegensatz zu den somatotropen Zellen, die dichtgepackt sind mit Sektretionsgranula, in der Regel nur spärlich granuliert. Dies erklärt auch, dass die Speicherfähigkeit und somit die PRL- Konzentration in der Hypophyse viel geringer ist als die des Wachstumshormons, nämlich nicht mehr als 150 µg pro Drüse. Bei der Frau ist Prolaktin ein wichtiges Reproduktionshormon, das die Laktogenese und die Laktation post partum induziert und aufrechterhält. Gleichzeitig führt es zu einer Suppression der Ovarialfunktion. Während der Schwangerschaft, bei Brustwarzenstimulation, bei körperlicher Anstrengung, Nahrungsaufnahme und bei unspezifischem Stress kommt es physiologischerweise zu einem kontinuierlichen Anstieg der PRL-Spiegel. Eine Hypoglykämie (Insulin), Östrogene, TRH, einige Neurotransmitter (z.b. Dopamin) und viele Medikamente (Dopamin-Antagonisten, Serotoninpräkursoren, GABA-Agonisten, Opiate, u.a.) senken den PRL-Spiegel [76]. Beim Mann hat Prolaktin dagegen kaum eine physiologische Bedeutung. Die Gonadotropine werden bei einem erhöhten Prolaktinspiegel allerdings supprimiert. Die PRL-Sekretion steht unter einem überwiegend inhibitorisch hypothalamischen Einfluss, ein Prolaktin-Releasing-Hormone ist aber noch nicht identifiziert.

13 13 Abbildung 3: Feedbackmechanismus der Prolaktinsekretion Neurotransmitter Körperliche Anstrengung Schwangerschaft Hypothalamus Dopamin Stillen Stress TRH Hypophysenvorderlappen Glukokortikoide Medikamente Östrogene Nahrungsaufnahme Prolaktin Brustdrüse Negative Wirkung Positive Wirkung Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) und Regulation ACTH ist ein einkettiges Peptidhormon mit 39 Aminosäuren, dessen C-terminaler Anteil Speziesspezifität aufweist. Das Gen kodiert ein höhermolekulares Prohormon, das POMC mit 266 Aminosäuren. Die Genexpression von POMC (Proopiomelanocortin) wird durch Corticotropin-Releasinghormon (CRH) über den CRH-Rezeptor und durch Vasopressin über den Subtyp des V1-Rezeptors synergistisch stimuliert. Bei CRH handelt es sich um ein Neurohormon mit 41 Aminosäuren. Es ist ebenfalls artspezifisch. CRH wird in den parvozelluläre Neuronen des Nucleus paraventricularis des Hypothalamus gebildet.

14 14 Abbildung 4: Feedbackmechanismus der corticotropen Hypophysenadenome Stress Zytokine Hypothalamus CRH Cortisol Hypophysenvorderlappen ACTH Cortisol Nebenniere: Cortisol Negative Wirkung Positive Wirkung Die menschliche Hypophyse enthält etwa 250 ìg ACTH, von denen täglich etwa 10 bis 20 % sezerniert werden. Der gesunde Mensch hat jeden Tag etwa 7-10 kurz andauernde Perioden, in denen es zu einer vermehrten ACTH-Sekretion kommt.. Der Großteil dieser Sekretionsperiodik tritt in den frühen Morgenstunden auf und ist für den morgendlichen Plasma-Cortisolanstieg verantwortlich. Der kurzandauernde Anstieg der ACTH-Sekretion ist seinerseits durch kurzfristige Anstiege der CRH-Konzentration im hypophysären Portalsystem (2-3 Pulse pro Stunde) bedingt. Es ist allerdings noch nicht bekannt, durch welchen Mechanismus diese pulsatile CRH-Sekretion ausgelöst wird. Die biologische Wirkung des ACTH besteht in einer Steigerung der Synthese und Sekretion aller Nebennierenrindenhormone. Dabei ist der entscheidende Schritt in der Steroidogenese die Umwandlung von Cholesterin in Pregnenolon. Die Abspaltung der Seitenkette wird durch Cytochrom P 450 katalysiert. Langfristig führt die ACTH-Exposition der NNR zu einer Stimulation der Transkription sämtlicher Gene der Enzyme für die Steroidbiosynthese.

15 15 Cortisol, als der wichtigste Mediator des ACTH, spielt eine große Rolle als Regulator des Intermediärstoffwechsels und als Modulator des Immunsystems. Es stimuliert unter anderem die Glukoneogenese als Gegenspieler des Insulins und es wirkt antiinflammtorisch. Die ubiquitäre Präsenz von Cortisolrezeptoren in praktisch allen Zellen des Organismus erklärt die Wirkungsvielfalt dieses Hormons, dessen biologische Auswirkung zum Beispiel bei Mehrsekretion an dem klinischen Bild des Cushing Syndroms sichtbar wird [50; 76] Thyroidea-stimulierendes Hormon (TSH) und Regulation TSH ist ein Glykoproteidhormon, das aus 2 Aminosäureketten besteht: eine á-kette, die mit der á-kette der HVL-Hormone FSH (Follikel stimulierendes Hormon), LH (luteinisierendes Hormon) und Choriongonadotropin identisch ist und die aus 92 Aminosäuren und 2 Kohlenhydrateinheiten besteht sowie eine spezifische â-kette, die aus 112 Aminosäuren und 1 Kohlenhydrateinheit besteht. Das spezifische Molekulargewicht des menschlichen TSH-Moleküls beträgt Dalton. Die normalen Serumspiegel von TSH liegen zwischen 0,3 und4,4 me/l. Die TSH-Sekretion wird durch das TSH-Releasing-Hormon (TRH) stimuliert, das zusätzlich für die Synthese eines biologisch voll aktiven TSH-Moleküls erforderlich ist. Als wichtigster und dominierender Faktor der TSH-Sekretion auf hypophysärer Ebene gilt die negative Feedback- Wirkung durch das freie, nicht an eiweißgebundenen peripheren Schilddrüsenhormone T3, aber auch durch das freie T4. Ein Anstieg von freiem T3 über den normalen Bereich hinaus blockiert die TSH-Sekretion. Somatostatin und Dopamin sind zwar keine echten TSH-Inhibitoren, hemmen aber wie Glukokortikoide die TSH-Sekretion auf hypophysärer Ebene [77].

16 16 Abbildung 5: Feedbackmechanismus der Schilddrüsenhormone Hypothalamus Östrogene TRH Hypophysenvorderlappen T3 und T4 Somatostatin Dopamin Glukokortikoide TSH T3 und T4 Schilddrüse: T3 und T4 Negative Wirkung Positive Wirkung Zu den biologischen Wirkungen von TSH gehört die Steigerung der Schilddrüsendurchblutung, die Stimulation der Organifikation von intrathyreoidalem Jodid und einer bevorzugten Stimulation der T3- gegenüber der T4-Ausschüttung in der Schilddrüse. Außerdem wird die Thyreoglobulinfreisetzung stimuliert. Die biologische Wirkung der Schilddrüsenhormone beruht im wesentlichen auf einer Steigerung des Grundumsatzes, einem fördernden Einfluss auf Wachstum und Entwicklung, einer fördernden Wirkung auf den Calcium- und Phosphatumsatz, einer hemmenden Wirkung auf die Glykogen- und Proteinsynthese und einer Erhöhung der Katecholaminempfindlichkeit des Herzens. Klinisch tritt eine Hypothyreose an dem Nervensystem mit einer Apathie und am Muskel mit verlangsamten Sehnenreflexen in Erscheinung, eine Hyperthyreose tritt am Nervensystem mit einer Übererregbarkeit in Erscheinung und führt am Muskel zu einer Myopathie [24].

17 Die Gonadotropine LH und FSH und ihre Regulation Die Gonadotropine sind, wie unter erwähnt, auch Glykoproteine, die aus einer α- Untereinheit, die sie mit TSH gemeinsam haben, und einer für jedes Hormon spezifischen β- Untereinheit bestehen. Die β-untereinheit besteht bei FSH aus 115 Aminosäuren und bei LH aus 118 Aminosäuren. Die Bildung und Sekretion der Gonadotropine werden durch Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH), einem Dekapeptid aus dem Hypothalamus, stimuliert. Beim Mann führt Testosteron, das in den Sertoli-Zellen des Hodens gebildet wird, zu einer Reduktion der GnRH-Sekretion aus dem Hypothalamus und hemmt so die LH- und FSH-Sekretion. Bei der Frau regulieren die in den Ovarien gebildeten Östrogene und Progesterone die LH- und FSH-Freisetzung über den Hypothalamus. Die FSH-Sekretion wird nicht nur über die Sexualhormone, sondern auch durch Inhibin, einem Produkt sowohl der Sertoli-Zellen als auch der Follikel, auf hypophysärer Ebene gehemmt. FSH steuert das Follikelwachstum im Ovar bei der Frau und die Spermatogenese in den Sertolizellen beim Mann. LH ist bei der Frau für die Ovulation und die Aufrechterhaltung des Corpus Luteum verantwortlich. Beim Mann steuert dieses Hormon die Androgenproduktion in den Leydig-Zwischenzellen, die ebenfalls für die Spermatogenese erforderlich ist [76].

18 18 Abbildung 6: Feedbackmechanismus der Gonadotropine Hypothalamus GnRH Inhibin Testosteron Hypophysenvorderlappen Östrogene Progesterone LH/FSH LH/FSH Ovar: Östrogene und Progesterone Hoden: Testosteron Negative Wirkung Positive Wirkung 1.3 Tumoröse Veränderungen der Hypophyse Klassifikation und Epidemiologie von Hypophysenadenomen Meist findet sich als Ursache der HVL-Hormonmehrsekretion ein endokrin aktives Hypophysenadenom, das neben seiner Hormonaktivität auch durch die Folgen der intra- und suprasellären Raumforderung klinisch in Erscheinung treten kann. Tumoren der Hypophyse machen etwa 10 % aller intrazerebralen Neoplasien aus. Sie werden nach ihrer sekretorischen Aktivität und ihrer Größe in endokrin aktive oder inaktive Mikro- oder Makroadenome unterteilt. Zufällig, also nicht durch eine gezielte Diagnostik festgestellte Hypophysenadenome, werden Hypophyseninzidentalome genannt. Hypophysenkarzinome mit intra- und extrazerebralen Metastasen sind ausgesprochen selten. In der Literatur sind etwa 50 Fälle

19 19 beschrieben worden. Am häufigsten sind hier die endokrin inaktiven und PRL-sezernierenden Karzinome, gefolgt von ACTH- und GH-sezernierenden Hypophysenkarzinomen [76]. Tabelle 1. Verteilung der verschiedenen Hypophysenadenome [23] Adenomtyp Gesamtanteil Endokrin inaktives Hypophysenadenom 45 % Somatotropes Hypophysenadenom % Corticotropes Hypophysenadenom 10 % Prolaktinom % Gonadotropin-sezernierende Adenome 1% Thyreotropin-sezernierende Adenome 1% Der häufigste HVL-Hormonexzeß ist die Hyperprolaktinämie. Nur das endokrin inaktive Hypophysenadenom kommt häufiger vor als das Prolaktinom. Letzteres ist viel häufiger als das GH-sezernierende Adenom bzw. das ACTH-sezernierende Adenom. Glykoproteid-Hormonproduzierende Hypophysenadenome (Thyreotropin- und Gonadotropin-sezerniernde Adenome) sind Raritäten (vgl.tabelle 1). In folgenden Unterkapiteln wird auf die in der Arbeit verwendeten endokrin inaktiven Hypophysenadenome und die somatotropen Hypophysenadenome näher eingegangen. Zusätzlich werden die Gonadotropin-produzierenden Hypophysenadenome erläutert.

20 Pathophysiologie und molekulare Aspekte der Tumorgenese Hypophysenadenome sind in der Regel sporadische Tumoren. Nur im Fall der multiplen endokrinen Neoplasie Typ I (MEN-I) treten sie hereditär in Erscheinung. Die Tumorpathogenese der sporadischen, soliden Hypophysenadenome ist ein Mehrschrittprozess, bei dem initialen Ereignissen (Mutation, Transformation) eine Serie von weiteren Veränderungen nachfolgt, die als Tumorprogression (klonale Expansion, Neovaskularisation, Invasion) zusammengefasst werden [55]. Es handelt sich um monoklonale Tumoren, bei denen durch eine oder mehrere Mutationen eine initiale Zelltransformation stattgefunden haben muss, die wiederum eine klonale Expansion zur Folge hat. Dieser primär hypophysären Tumorhypothese steht die hypothalamische gegenüber. Hier kommt es durch vermehrte Freisetzung hypothalamischer stimulierender Faktoren zu einer Hyperplasie der Hypophysenzellen. Letztere begünstigt auch Zellmutationen mit daraus resultierender monoklonaler Transformation [55]. Die Proliferation der verschiedenen hypophysären Zellen wird physiologischerweise durch stimulierende Faktoren (Proliferationsfaktoren) angeregt und durch Inhibitoren gehemmt. Im folgenden werden einige dieser Wachstumsfaktoren und Inhibitoren näher erläutert. Der Wachstumsfaktor für die somatotropen Zellen ist GHRH (Growth Hormone Releasing Hormone). Ein Verlust der GHRH vermittelten Wirkung (z.b. durch Rezeptordefekt) führt beispielsweise zur Entwicklung der GH-defizienten lit/lit-zwergmaus [20; 39]. In GHRH überexprimierenden transgenen Mäusen wurde dagegen eine somatotrope Hyperplasie und die Entwicklung von somatotropen Hypophysentumoren beobachtet [4; 42]. Beim Menschen ist eine GHRH Überexpression nur sehr selten und führt meist zu einer Hyperplasie der somatotropen Zellen, nicht aber zur Bildung echter Tumoren [15]. CRH, TRH und GnRH sind Wachstumsfaktoren für cortikotrope, thyreotrope bzw. gonadotrope Zellen. Bei Überexpression dieser kommt es allerdings nur in extrem seltenen Fällen zu einer Neoplasie [3]. Ein wichtiger Wachstumsfaktor ist GH, das über seinen Mediator IGF-1 eine prolifertationssteigernde und somit wachstumsfördernde Wirkung auf Zellen hat. GH fördert rezeptorvermittelt die zelluläre Produktion und Sekretion von IGF-1. Von IGF-1 wiederum ist bekannt, dass es als Wachstumsfaktor generell die Gewebeproliferation anregt [29]. Die höchsten

21 21 Expressionsraten erreicht IGF-1 in fetalem Gewebe. IGF-1 wird auch als wichtiger neoplastisch agierender Faktor diskutiert. In Tumoren des zentralen Nervensystems (Glioblastomen, Meningeomen und Astrozytomen), aber auch in Tumorgewebe des Gastrointestinaltraktes (Kolorektales Karzinom), der Lunge (Bronchialkarzinom) und der Leber (Hepatozelluläres Karzinom) wurden im Vergleich zu normalem Gewebe wesentlich höhere Expressionsraten von IGF-1 mrna gemessen [32]. Auch der IGF-1-Rezeptor spielt eine wesentliche Rolle in der Tumorgenese. Zum Beispiel wurde bei Ratten, die Gliomzellen mit einem funktionstüchtigen IGF-1-Rezeptor injiziert bekamen, ein ausgeprägtes Tumorwachstum beobachtet. Solche, die Gliomzellen mit defekten Rezeptoren injiziert bekamen, entwickelten dagegen keinen Tumor [56; 58]. Auch besteht ein Zusammenhang zwischen endogener IGF-1 Expression und histopathologischem Grading eines Tumors [25]. Ein wichtiger Inhibitor der somatotropen Zellproliferation ist Somatostatin, das neben seiner Wirkung als Gegenspieler des GHRH durch Hemmung der GH-Sekretion auch das Wachstum der somatotropen Zellen über spezifische Somatostatinrezeptoren hemmt. Somatostatin spielt dabei weniger eine Rolle bei der Entstehung von somatotropen Adenomen, sondern viel eher bei der Tumorprogression. Dies ist zurückzuführen auf einen Verlust der inhibitorischen Kontrolle von Somatostatin, deren Ursache in einer Veränderung der Expression von Somatostatinrezeptoren liegt [37; 45] allgemeine Therapieansätze von Hypophysenadenomen Da die Adenomentstehung meist mit einer Raumforderung im Bereich des Chiasma opticum einhergeht, ist das primäre Therapieziel die Beseitigung dieser Raumforderung mit Normalisierung von Visus und Gesichtsfeld. Außerdem wird dadurch eine Normalisierung der Hormonmehrsekretion und der Erhalt oder die Wiederherstellung der HVL-Funktion erwartet. Die Indikation zum operativen Vorgehen kann erst nach Abschluss der radiologischen und endokrinologischen Diagnostik gestellt werden, wobei es sich in der Regel um einen mikrochirurgischen transsphenoidalen Eingriff handelt. Die Therapiestrategie von allen Hypophysenadenomen richtet sich nach der Hormonaktivität der Tumoren, der klinischen Symptomatik und der Hormonachsenausfälle. Die postoperative Strahlenbehandlung ist besonders dann indiziert, wenn ein Tumor rezidiviert, ein invasives Adenom nur partiell exstirpiert werden kann oder ein residualer Tumor progredient wird und angrenzende Hirnstrukturen in Mitleidenschaft gezogen werden [55].

22 22 Hormoninaktive Hypophysenadenome werden grundsächlich der operativen Therapie zugeführt, da sie häufig erst durch ein Chiasmasyndrom in Erscheinung treten und zum Zeitpunkt ihrer Präsentation typischerweise groß sind. Ein medikamentöser Therapieversuch ist selten sinnvoll. Nur gelegentlich sprechen sie auf Dopamin- oder Somatostatinanaloga an. Die GH-produzierenden Tumoren sind nicht nur ein kosmetisches und psychisches Problem (z.b. Depression) der Patienten, sondern gehen mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität einher. Methode der Wahl stellt hier die chirurgische Behandlung dar. Die Erfolgsrate liegt bei den selten infiltrativ wachsenden Mikroadenomen bei 90% und bei Makroadenomen mit häufiger auftretendem infiltrativem Wachstum zwischen 30 und 60% [55]. Die medikamentöse Therapie hat in der Behandlung der nicht operablen oder nicht durch die Operation geheilten Patienten ihren festen Platz. Bei Patienten mit Akromegalie und Restaktivität des Hormonsexzesses stehen Dopaminagonisten und langwirkende Somatostatinanaloga zur Verfügung. 1.4 Somatotrope Hypophysenadenome Das somatotrope Hypophysenadenom bedingt eine pathologisch gesteigerte Mehrsekretion von Growth-Hormon (GH), die in 99% der Patienten von einem monoklonalen Makroadenom ausgeht. Auf Grund seiner Größe führt es zu einer Veränderung der knöchernen Struktur der Sella turcica und ist deshalb bei praktisch allen Patienten in der seitlichen Schädelaufnahme zu erkennen. Die erhöhten GH-Spiegel führen zu einer vermehrten Bildung und Freisetzung von IGF-1 nicht nur in der Leber, sondern auch in sämtlichen GH-Zielgeweben, wo IGF-1 die biologische GH- Wirkung vermittelt. Der negative IGF-1-Feedback auf die GH-Sekretion aus dem Adenom ist entweder überhaupt nicht oder in einer erheblich erhöhten Schwellenkonzentration wirksam. Das mittlere Alter bei der Diagnosestellung liegt etwa bei 40 Jahren, wobei sich die Symptome meist etwa 8 Jahre zurückverfolgen lassen. In der Literatur gibt es keine eindeutige Geschlechtsspezifität, allerdings scheint die Diagnose bei Frauen etwas häufiger gestellt zu werden [72].

23 23 Die langanhaltende Mehrsektion von GH führt zu dem Krankheitsbild der Akromegalie bzw. dem Riesenwuchs (Gigantismus). Die Klinik der Akromegalie resultiert aus der gesteigerten Stimulation des enchondralen und appositionellen Knochenwachstums, aus der Stimulation des Wachstums der Haut und der Hautanhangsorgane sowie der allgemeinen Organomegalie. Dies führt zu der Vergrößerung der Akren: die Hände werden größer, es kommt zur Ausbildung supraorbitaler Wülste, zum Wachstum der Nase, zur Zunahme der Kieferknochen, etc. Diese Veränderungen treten in der Regel erst allmählich auf, so dass die Diagnose erst viel später gestellt wird. Außerdem kommt es zu exzessivem Schwitzen, zu Karpaltunnelsyndrom, zu Arthralgien, zur Vergrößerung innerer Organe z.b. Kardiomegalie, zu Zyklusunregelmäßigkeiten, zur Hypertonie, Hypertrichose, pathologischen Glucosetroleranz oder Diabetes mellitus und Struma. Zusätzlich kommen die Zeichen der lokalen Raumforderung: Kopfschmerzen und Gesichtsfeldausfällen [75]. Die Therapie der Wahl besteht in der transphenoidalen Resektion des Hypophysenadenoms. Bei Makroadenomen ist meist zur Normalisierung der GH-Spiegel ergänzend eine Strahlentherapie und/oder eine medikamentöse Therapie mit Dopaminagonisten oder Somatostatinanaloga, z.b. Octreotid oder GH-Rezeptorantagonisten erforderlich (s. a ). 1.5 Gonadotropin-produzierende Hypophysenadenome Die Gonadotropin sezernierenden Hypophysenadenome sind sehr selten und werden unterschieden in FSH-produzierende, FSH- und LH-produzierende und LH-produzierende Adenome. Die Häufigkeit nimmt nach der genannten Reihenfolge ab, wobei das LHproduzierende Hypophysenadenom ausgesprochen selten vorkommt und nur Einzelfälle in der Literatur beschrieben sind. Bei den FSH-produzierenden Adenom handelt es sich meist um männliche Patienten mit dem klinischen Zeichen des Hypogonadismus. Bei weiblichen Patienten manifestiert sich neben der sellaren Raumforderung eine Amenorrhö. FSH- und LH-produzierende Adenome kommen auch vor allem bei männlichen Patienten vor und manifestieren sich wiederum durch eine Raumforderung und einen Hypogonadismus. Die LH-produzierenden Adenome sind mit einer isolierten LH-Erhöhung bei gleichzeitig vorliegendem Hypophysenadenom beschrieben. Um welche Art von Adenom es sich handelt, wir durch den immunologischen Nachweis von FSH und/oder LH bestimmt [73].

24 24 Die Therapie der Wahl ist eine operative Entfernung des Tumorgewebes mit einer anschließenden Nachbestrahlung. 1.6 Endokrin inaktive Hypophysenadenome Endokrin inaktive Hypophysenadenome sind Adenome, bei denen im Serum keine erhöhten Werte von Prolaktin, ACTH oder GH messbar sind und die deshalb auch Nullzelladenome oder, aufgrund ihrer Färbeeigenschaften, chromophobe Adenome genannt werden. Es hat sich allerdings inzwischen gezeigt, dass einige der sog. endokrin inaktiven Adenome in der Lage sind, Untereinheiten der Glykoproteidhormone zu bilden, die zwar einer Regulation unterliegen, aber wahrscheinlich keine oder nur geringe biologische Wirkung haben. Mit 45% sind die endokrin inaktiven Hypophysenadenome die häufigsten Hypophysenadenome (s.tabelle 1). Die Inzidenz beträgt etwa 4,5 pro 1 Million Einwohner pro Jahr. Allerdings wird es grundsätzlich erst dann diagnostiziert, wenn es aufgrund der Raumforderung zu endokrinen Ausfallserscheinungen führt oder die supraselläre Adenomextension Ursache von Visusstörungen ist [74]. Abhängig von der Größe ist als Erstsymptom der endokrin inaktiven Hypophysenadenomen die ophtalmologische Symptomatik mit Visusstörungen und durch das klinische Bild der HVL- Insuffizienz ein im Vordergrund stehender Hypogonadismus kennzeichnend. Außerdem kann durch die Makroadenome, die zu einer Vergrößerung der Sella turcica und häufig zur suprasellären Extension führen, eine Hyperprolaktinämie (Begleithyperprolaktinämie) hervorrufen werden. Die Therapie der Wahl ist die operative Entfernung des Tumors; entweder ausschließlich neurochirurgisch transsphenoidal und/oder transkraniell. Eine ergänzende Strahlentherapie ist bei nicht vollständig operativ sanierten Makroadenomen indiziert. Wegen der relativen Strahlenunempfindlichkeit der endokrin inaktiven Adenome ist eine primäre Radiotherapie nicht angebracht. Durch die operative Resektion des Hypophysenvorderlappens besteht bei den Patienten anschließend ein Mangel an Hypophysenvorderlappenhormonen, der durch die gezielte

25 25 Substitutionstherapie der gonadotropen, thyreotropen und adrenocorticotropen Achse erfolgreich behandelt wird. Der Wachstumshormonmangel dieser Patienten wird dabei in den letzten Jahren durch gentechnisch entwickeltes GH ersetzt. Die Problematik dieser GH- Substitution besteht darin, dass eine mitogene Wirkung von GH über den GH-Rezeptor auf eventuelle vorhandenes adenomatöses Restgewebe, und somit auf das Wachstum eines Adenomrezidivs, nicht ausgeschlossen werden kann.

26 Fragestellung Die häufigste Ursache einer Hypophysenvorderlappeninsuffizienz ist das Vorliegen eines Hypophysenadenoms bzw. ein Zustand nach Hypophysenadenomresektion. Neben der klassischen Substitution der adrenocorticotropen, thyreotropen und gonadotropen Achse wird in den letzten Jahren auch zunehmend gentechnisch hergestelltes Wachstumshormon zur Behandlung des sogenannten Wachstumshormonmangel des Erwachsenen eingesetzt. Eine der ungeklärten Fragen dieser Behandlung ist die Bedeutung einer chronischen GH-Therapie auf die Rezidivhäufigkeit von Hypophysentumoren. Da GH über das hepatisch oder lokal gebildete IGF-1 mitogene Effekte ausüben kann, gilt das Vorliegen eines malignen Tumors als Kontraindikation für eine GH-Therapie. Ob eine GH-Therapie das Wachstum benigner Hypophysenadenome stimuliert, ist unklar. Gängig ist heute das Konzept, dass bei signifikanten Hypophysentumorresten oder bei Rezidivtumoren auf eine GH-Therapie verzichtet werden sollte. Ob allerdings Hypophysentumore die respektiven Rezeptoren für GH und IGF-1 überhaupt exprimieren ist, z.z. unklar. Um mehr Aufschluss über die chronischen Auswirkungen einer GH-Substitution bei Hypophysenvorderlappeninsuffizienz zu bekommen, untersuchten wir die Expression der spezifischen mrnas der GH-IGF-1-Signaltransduktionskaskade in endokrin inaktiven Hypophysentumoren, derjenigen Gruppe von Tumoren, bei der besonders häufig ein HVL-Insuffizienz vorliegt und eine GH-Therapie prinzipiell in Frage käme. Daher stellten sich uns folgende Fragen: 1. Werden die Komponenten der GH-IGF-1-Kaskade (GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R) in endokrin inaktiven Hypophysenadenomen exprimiert? 2. Bestehen in dieser Hinsicht qualitative Unterschiede im Vergleich zu normalem Hypophysengewebe und zu Adenomgewebe endokrin-aktiver Hypophysentumore? 3. Besteht bei der Substitutionstherapie mit GH die Gefahr einer mitogenen Wirkung auf potentielles Tumorrestgewebe?

27 27 2. PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Patienten Für diese Arbeit wurde Tumorgewebe von 41 Patienten verwendet (s. Tabelle 2). Dieses Gewebe wurde zwischen 1996 und 1999 den Patienten mittels transsphenoidaler Resektion entnommen und unmittelbar in flüssigem Stickstoff aufbewahrt und transportiert. Der Operateur achtete dabei darauf, dass nur zentrale Tumoranteile Verwendung fanden. Patienten mit GHproduzierenden Tumoren hatten klassische Symptome der Akromegalie und erhöhte GH- und IGF-1-Konzentrationen im Serum. Die Diagnose wurde durch das Fehlen von GH-Suppression im oralen Glukosetoleranztest <1µg/l gesichert. Patienten mit endokrin inaktiven Hypophysentumoren wiesen klinisch und laborchemisch keine Hinweise eines Hormonexzesses auf. Alle Tumorgewebe wurden neuropathologisch mittels konventioneller Histologie und Immunhistochemie untersucht. Die dabei erhobenen Befunde entsprachen den klassischen histologischen Befunden GH-produzierender und endokrin inaktiver Hypophysenadenome. Für die weitere Verwendung wurde das Gewebe bei -80 C gelagert. Das nicht pathologisch veränderte Hypophysengewebe, wurde von Patienten entnommen, die an nicht endokrinologischen Erkrankungen gestorben waren. Es wurde im Jahr 2000 vom Pathologischen Institut der Universität Freiburg unter der Leitung von Frau Dr. Heike Göbel im Rahmen der aus anderen Gründen durchgeführten Sektion entnommen. Das Gewebe wurde 8 bis maximal 24 Stunden nach dem Tod entnommen, in Stickstoff schockgefroren und anschließend bei 80 C gelagert. Tabelle 2: Patientendaten Art des Gewebes Anzahl Adenomform Alter Geschlecht Endokrin inaktive Adenome Makroadenome W=5 M=13 Somatotrope Adenome 6 6 Makroadenome W=0 M=6 Normales Hypophysengewebe W=4 M=5

28 Arbeitsschritte im Überblick Ziel dieser Arbeit ist die Darstellung der mrna Expression einzelner Komponenten der GH- IGF-1-Kaskade in endokrin inaktiven Hypophysenadenomen im Vergleich zu normalem Hypophysengewebe und somatotropen Hypophysenadenomen. Neben der mrna Expression von GH, GH-Rezeptor, IGF-1 und IGF-1-Rezeptor wurde die Expression von â-aktin untersucht. Dies ist ein ubiquitär vorkommendes Gewebeprotein ( house keeping gene ) und deshalb ein Maß für die quantitative mrna Menge in dem Gewebe. Um eine Degradierung der mrna auszuschließen, wurden nur Gewebe verwendet, bei denen eine Expression der â-aktin mrna nachgewiesen werden konnte. Nach der Extraktion der mrna aus dem Gewebe (s ) wurde für die einzelnen Komponenten (GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R) das nachzuweisende mrna Fragment mit den dazugehörigen Primern mittels Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) vervielfältigt (s ). Diese RT-PCR-Produkte wurden auf ein Agarosegel geladen und unter UV-Licht zur Dokumentation photographiert. Diese Methode diente für den Nachweis der GH mrna und IGF-1 mrna. Da die mrna von GH-R und IGF-1-R unter UV-Licht nicht darstellbar war, wurde für ihren Nachweis nach der RT-PCR zusätzlich die Southern Blot- Methode (s ) verwendet. Nach dem Blotting der mrna auf eine Nylonmembran wurden die Proben radioaktiv markiert (s ). Um sie sichtbar zu machen, wurde ein auf die Membran gebrachter Röntgenfilm belichtet. Die Ergebnissignale der verschiedenen mrnas in den einzelnen Geweben wurden gemessen und durch die jeweiligen Ergebnisse der β-aktin mrna geteilt. Dadurch konnten diese Werte zueinander in Bezug gesetzt (s und 3.) und miteinander verglichen werden.

29 Material Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien Besondere Verbrauchsmaterialien und Geräte Salmon Sperm DNA, Quickhyb Firma Stratagene, Heidelberg RNeasy Total RNA Kit, Quiashredder, Quiabran Nylon Quiagen, Hilden Membran, DNase, Nucleotid Removel Kit Reverse Transkriptase RNA PCR Kit GeneAmp, PCR Kit Perkin Elmer, Branchburg, USA High Prime DNA Labeling Kit Boehringer Mannheim [α 32 P]-dATP, Nylon Transfer Membran Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England Aktin Primerpair, RetroSkript, SuperTaq TM Polymerase Gel-Blotting-Paper (Watmanpaper) Natrium Chlorid (NaCl) Natrium Hydrogencarbonat (NaOH), Salzsäure (HCL), Natrium Citrat (NaCitrat), Borsäure, β-mercaptoethanol, Isopropanol Trizma Base, Bromphenolblau, Glycerol SDS, GH- / GH-R- / IGF-1- / IGF-1-R - Primer, Ethidiumbromid Agarose, Horizontal Gel Electrophoresis System EDTA Zentrifuge Biofuge, Hybridisierungsofen Photometer Ultrospec Ambion, Austin,USA Schleicher und Schnell, Dassel Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz Merck KgaA, Darmstadt Sigma Chemicals, St.Louis, USA Carl Roth GmbH, Karlsruhe Life technologies, Paisley, Schottland Boehringer Ingelheim, Heidelberg Heraeus, Osterode Pharmacia Biotech, Cambridge, England

30 30 Besondere Verbrauchsmaterialien und Geräte Power Pac 300 (Spannungsquelle) Firma BioRad, Hercules, USA Progene (PCR-Maschine) Eppendorfgefäße Pipetman (Pipettierer) Pipettenspitzen UVT-28 Maschine (UV-Schirm) Wasserbad Entwicklungskassette MR-Röntgenfilm Biomax Eurostar digital (Homogenisator) ß-Counter LB 1210B (Radioaktivemeßgerät) Techne, Cambridge, England Eppendorf-Nethele-Hinz GmbH, Hamburg Gilson, Frankreich Molecular Bio Products, San Diego, USA Herolab, Wiesloch Huber, Offenburg Dr. Goos Suprema Kodak Janke & Kunkel GmbH, Staufen Berthold 2.4 Arbeiten mit RNA RNA-Extraktion Prinzip Da die Gefahr des RNA-Abbaus durch sogenannte RNasen besteht, ist es bei der RNA- Extraktion unbedingt erforderlich, das Gewebe möglichst schnell zu lysieren und gleichzeitig die RNasen zu eliminieren. Für dieses Ziel hat sich das stark denaturierend wirkende Agens Guanidinium-Isothiocyanat (GIT) bewährt, das zusammen mit β-mercaptoethanol die Zellen lysiert, vorhandene RNasen hemmt und die Proteine von den Nukleinsäuren trennt. Im weiteren Verfahren muss die RNA an einen Träger gebunden werden, der es in verschiedenen Waschschritten ermöglicht, alle weiteren Moleküle der Zellen (Lipide, Proteine, DNA usw.) vollständig zu eliminieren. In unserem Fall besteht dieser Träger aus einer Membran, die auf der

31 31 Basis eines Silikatgels hergestellt worden ist. Es wird außerdem DNase auf die RNA gegeben, damit die vorhandenen DNA-Reste aufgetrennt werden. In einem Abschlussschritt wird unter veränderten Salz- und ph-bedingungen die RNA von dem Träger abgetrennt Durchführung Alle RNA-Extraktionen wurden mit dem RNeasy Mini Kit for Isolation of total RNA from Animal Tissue und nach einem modifizierten Protokoll der Firma QIAgen (RNeasy Handbook 5/1999) durchgeführt mg des Hypophysengewebes wurde in ein Gefäß, das den Lysis Buffer RLT (350µl) enthielt (der GIT enthält, zur sofortigen Inaktivierung von RNase und um die Isolation von intakter RNA zu sichern), gegeben und sofort homogenisiert. Um optimale Bedingungen zur Bindung von RNA an die RNeasy Membran zu schaffen, wurde das Lysat mit 70%igem Ethanol gemischt und auf ein RNeasy-Zentrifugenröhrchen gegeben. In diese Röhrchen war eine mit Silikatgel beschichtete Membran eingelassen, die unter hohen Salzbedingungen RNA einer Mindestgröße von 200 Basen binden kann. Nach einmaligem Waschen mit dem Puffer RW1, wurde die DNase auf die RNA gegeben, die noch fest mit der Silikat-beschichteten Membran verbunden war und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dem folgenden Waschschritt wurde diese DNase wieder von der Membran entfernt. Nach anschließendem dreimaligen Waschen mit den Waschpuffern RW1 und RPE, die unterschiedliche Salz- und Alkoholkonzentrationen haben, konnte die RNA mit RNase-freiem Wasser aus der Membranbindung eluiert werden. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 320 nm mit dem Photometer Ultrospec von Pharmacia Biotech Cambridge, England ermittelt. Als Kriterium für den Reinheitsgehalt der RNA wurde das Verhältnis der Absorption zwischen den Wellenlängen 260 nm und 280 nm gewertet. Nur Proben mit Ergebnissen zwischen 1.9 und 2.1 wurden der Weiterverarbeitung zugeführt. Die RNA wurde zur weiteren Verarbeitung auf 80 Grad gelagert.

32 Das Polymerase Chain Reaktion (PCR) - Verfahren Das Prinzip Die Polymerase Chain Reaktion (PCR) dient dem Nachweis kleinster Mengen spezifischen genetischen Materials und wurde erstmals von Karry Mullis 1985 entwickelt und von Saiki et al weiterentwickelt. Die Methode besteht darin, dass man bestimmte Abschnitte der DNA vervielfältigen und anschließend sichtbar machen kann. Die PCR wird in 3 Schritten durchgeführt. Die (doppelsträngige) Template-DNA wird durch Hitzebehandlung bei 94 C denaturiert (1. Denaturierungsschritt), wodurch sich die doppelsträngige DNA in ihre beiden Einzelstränge auftrennt. Die 2 Primer, die an den Rändern des gesuchten Bereichs jeweils komplementär zu einem Strang sind, rahmen dementsprechend den gesuchten Bereich auf den Einzelsträngen ein. Durch Abkühlen auf C (2. Annealingschritt) legen sich die Primer an die DNA-Einzelstränge und durch erneute Erwärmung auf 72 C (3. Elongationsschritt), das als Temperaturoptimum der Taq-Polymerase gilt, verlängert die DNA-Polymerase die Primer in 3 Richtung. Somit wird ausgehend von jedem Primer ein neuer DNA-Strang synthetisiert, der wiederum als Matrize dienen kann. Dadurch vergrößert sich die Anzahl an Strängen exponentiell in jedem Zyklus. In der Regel werden ca Zyklen durchlaufen, so dass man genug Material zur Analyse hat. Zusätzlich zu den 3 Schritten werden die Proben für die initialen Denaturierung am Anfang 5 min auf 94 C erhitzt und nach den abgelaufenen Zyklen 5 min auf 72 C erhitzt, eine finale Elongation, um noch nicht komplette Stränge zu vervollständigen. Wenn als Template nicht DNA, sondern RNA zur Verfügung steht, wird eine Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) durchgeführt. Es gibt zwei verschiedene Möglichkeiten diese RT- PCR durchzuführen. In beiden Möglichkeiten wird aus RNA erst complimentary DNA (cdna) hergestellt. Bei dem ersten Verfahren wird die hergestellte cdna sofort weiterverwendet. Zuerst wird die RNA mit einer thermostabilen reversen Transkriptase-Polymerase (rtth Polymerase), salzhaltigen Puffern, Nucleotiden, Manganchlorid und einem spezifischen Primer oder spezifischen Primerpaar 15 min auf 70 C erhitzt, damit cdna-stränge amplifiziert werden. Um die Eigenschaften der Polymerase zu ändern, werden in einem 2. Schritt Puffer mit anderen Salzkonzentrationen und der zweite spezifische Primer (wenn kein Primerpaar im ersten Schritt benutzt wurde) hinzugegeben. Zusätzlich wird Manganchlorid mit einem Chelatbildner wirkungslos gemacht und statt dessen Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) hinzugefügt. Jetzt werden die Zyklen gestartet, um

33 33 die nachzuweisenden Stränge zu amplifizieren. Diese Methode ist sehr empfindlich und konnte in unserem Fall zum Nachweis der einzelnen mrna s in endokrin inaktiven und somatotropen Hypophysenadenomen verwendet werden. Im Gegensatz zu der ersten Möglichkeit (s.o.), bei der im ersten Schritt die spezifischen Primer benutzt werden und so gleich die spezifische RNA amplifiziert wird, wird bei der zweiten Möglichkeit in einem ersten Schritt cdna von der gesamten RNA hergestellt. Die RNA wird mit einem Primerpaar erst 3 min bei C erhitzt. Anschließend wird ein magnesium- und salzhaltiger Puffer, die Nucleotide, ein RNase-Inhibitor, der vorhandene RNasen hemmen soll, und die MMLV-Reverse Transkriptase (MMLV-RT) zu der RNA und den Primern gegeben und für eine Stunde bei C inkubiert. Danach wird das Gemisch noch für 10 min bei 92 C inkubiert, um die MMLV-RT zu inaktivieren. Die jetzt hergestellte cdna wird auf 4 C zwischengelagert und kann weiterverwendet werden. In einem zweiten Schritt werden 1-5µl der hergestellten cdna mit einem magnesium- und salzhaltigen Puffer, den beiden für den Nachweis der mrna spezifischen Primern und einer thermostabilen DNA Polymerase vermischt und die Zyklen gestartet. Anschließend wird das PCR-Produkt in ein Agarosegel geladen, um die nachzuweisenden Stränge sichtbar zu machen. Diese Methode ist stabiler und weniger empfindlich und wurde von uns für den Nachweis der verschiedenen mrnas in normalem Hypophysengewebe verwendet Durchführung In unserem Fall wurde die mrna der einzelnen Hypophysenadenome mit dem Reverse Transkriptase RNA PCR Kit von Perkin Elmer, USA und mit der unter als erstes beschriebenen Methode und wie folgt durchgeführt: 1. Reaktionsansatz: 1 µl RNA (aus dem Gewebe extrahiert) 9,4µl steriles Wasser 2 µl 10x rtth-pcr-buffer 2 µl Manganchlorid 1,6 µl NTP s (1ATP : 1TTP : 1GTP : 1CTP) 2µl 3 Primer 2µl rtth DNA Polymerase

34 34 Das Gemisch wurde 15 min auf 70 C erhitzt und anschließend wurden für die PCR folgende Komponenten dazugegeben: 2. Reaktionsansatz: 64µl steriles Wasser 8µl Chelating Buffer 6µl MgCl 2 2µl 5 Primer Anschließend wurde das Gemisch in den Pyogene-Cycler gegeben und Zyklen mit den in Tabelle 4 aufgeführten Primer-spezifischen Temperaturen gestartet. Die mrna der nicht pathologisch veränderten Hypophysen wurde mit der unter als zweites beschriebenen Methode und mit dem RetroScript Kit von Ambion, USA wie folgt nachgewiesen: 1. Reaktionsansatz: 2µl RNA (aus dem Gewebe extrahiert) 8µl steriles Wasser 2µl Oligo-Primerpaar Das Gemisch wurde 3 min bei 73 C erhitzt und dabei leicht geschüttelt. Anschließend wurden folgende Substanzen dazugegeben: 2µl 10x RT PCR Buffer 4µl NTP s (1ATP : 1TTP : 1GTP : 1CTP) 1µl RNase Inhibitor 1µl MMLV-RT Dieses Gemisch wurde eine Stunde auf 44 C inkubiert, anschließend für 10 min bei 92 C erhitzt. Die cdna wurde bis zur weiteren Verwendung bei 4 C im Kühlschrank gelagert. Um die nachzuweisenden DNA-Stränge zu amplifizieren wurde für die PCR wie folgt weitergearbeitet: 2. Reaktionsansatz: 2 µl cdna 5 µl 10x PCR Buffer 2,5 µl NTP s (1ATP : 1TTP : 1GTP : 1CTP) 40,5µl steriles Wasser 1,25µl 3 Primer

35 35 1,25µl 5 Primer 2 µl thermostabile SuperTaq TM -Polymerase Die Probe wurde in den Progene-Cycler gegeben und die Zyklen wurden abhängig von den Primer-spezifischen Temperaturen wie in Tabelle 4 aufgeführt gestartet. Tabelle 4: Sequenzen der intronüberspannenden Primer und die Länge der amplifizierten Basenpaare (Bp) Primer Basensequenz Länge der Bp GH 5 Primer GH 3 Primer GH-R 5 Primer GH-R 3 Primer IGF-1 5 Primer IGF-1 3 Primer IGF-1-R 5 Primer IGF-1-R 3 Primer 5 GTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCT 3 5 GAGTAGTGCGTCATCGTTGTGT 3 5 GGATAAGGAATATGAAGTGC 3 5 GATTTCTCATGGTCACTGC 3 5 TCGCATCTCTTCTACCTGGC 3 5 GTAGTTCTTGTTTCCTGCAC 3 5 CACGAGGCTGAGAAGCT 3 5 AGGCATACAGCACTCCA Die mrna von β-aktin wurde mit einem 18S Primer-Pair der Firma Ambion, Austin, USA nachgewiesen. Die verschiedenen Primer sind Intron-überspannende Primer und haben unterschiedliche Annealing-Temperaturen, bei denen sie sich an die DNA anlegen und sich mit dieser verbinden. Diese verschiedenen Temperaturoptimi sind in Tabelle 5 aufgeführt und wurden dementsprechend eingehalten.

36 36 Tabelle 5. Temperaturprogramme Initiale Denaturierung 94 C 1min Denaturierung Annealing Elongation Zyklen GH 94 C 1min 56 C 1min 72 C 1min 35 GH-R 94 C 30sec 55 C 30sec 72 C 40sec 35 IGF-1 94 C 30sec 60 C 30sec 72 C 40sec 35 IGF-1-R 94 C 30sec 58 C 30sec 72 C 40sec 40 β-aktin 94 C 30sec 50 C 30sec 72 C 40sec 30 Finale Elongation 72 C 10min Für den Nachweis der mrna wurde neben den einzelnen Geweben immer eine negative und eine positive Kontrolle amplifiziert. Die negative Kontrolle enthielt jeweils das Reaktionsgemisch, aber keine mrna. Die positive Kontrolle wurde mit dem Reaktionsgemisch und einer mrna aus einem Gewebe amplifiziert, das das jeweilige Hormon physiologischerweise exprimiert. Als positive Kontrolle für die β-aktin Expression wurde eine Template DNA der Firma Ambion verwendet; für die GH Expression die mrna von Hypophysengewebe eines Patienten mit Akromegalie. Zum Nachweis des GH-Rezeptors und von IGF-1 benutzten wir die mrna von normalem Lebergewebe und für den IGF-1-Rezeptor die mrna von Nebennierengewebe eines Patienten mit Cushing-Syndrom Analyse der PCR-Produkte Die Analyse erfolgte mittels gelelektrophoretischer Auftrennung. Die Proben wurden auf ein Agarosegel geladen, das 1,6 g Agarose in 200 ml 1xTBE, entsprechend einem 0,8%igen Gel (s. Anhang), und 10ìl Ethidiumbromid enthält. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 100 Volt für 30min.

37 Gelelution Um PCR-Produkte nach Auftrennung auf einem Gel weiterzuverwenden, musste die DNA aus dem Gel eluiert werden. Dies wurde mit dem Agarose Gel Extraction Kit der Firma QIAgen durchgeführt. Hierzu wurden die spezifischen Banden aus dem Agarosegel mit einem Skalpell herausgeschnitten und 10 min auf 50 C mit dem salzhaltigen Puffer QX1 inkubiert, der das Agarosegel auflöst. Die DNA wurde anschließend in ein Röhrchen gegeben, das eine mit Silikongel beschichtete Membran enthält. Die DNA wurde an diese Membran gebunden und in mehreren Schritten gewaschen, um gelöstes Agarosegel, Proteine, Ethidiumbromid und Salzreste zu entfernen. Anschließend wurde die DNA mit einem Elutionspuffer (50mM Tris HCL ph 8,5) eluiert und zur weiteren Verwendung auf 20 C gelagert das Southern Blot Verfahren Prinzip Bei dieser Methode, benannt nach E.M.Southern (1975), wird ein Abschnitt der DNA auf eine flexible Nylonmembran übertragen. Als erstes werden die Doppelstränge voneinander durch Aufschmelzen getrennt und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nachdem die DNA auf die Membran übertragen worden ist, wird sie durch UV-Licht immobilisiert. Ziel ist der qualitative und semiquantitative Nachweis bestimmter DNA-Abschnitte. Die verschiedenen Vorgehensweisen werden im weiteren kurz beschrieben. Als erstes wird die DNA zur Denaturierung auf 95 C für 5 min erhitzt, um die DNA- Doppelstränge zu trennen und anschließend auf das Gel geladen. Die DNA wird gelelektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt, wobei die Nukleinsäuren als negativ geladene Moleküle im elektrischen Gleichstromfeld in Richtung Anode laufen und unter UV-Licht im Gel sichtbar gemacht werden. Anschließend wird das Gel in mehreren Waschschritten aufgelockert und es wird für die Moleküle beim Blotten einfacher passierbar. Der Transfer der DNA aus dem Gel auf die Membran erfolgt langsam und kontinuierlich im Kapillarblotting-Verfahren. Der Puffer wird durch Kapillarkraft durch das Gel und die Membran in einen Stapel saugfähiger Tücher gesogen. Die Nukleinsäuren werden so an die Membranoberfläche transportiert und heften sich dort an.

38 38 Abbildung 7: Kapillarblotting-Verfahren Saugfähige Tücher Nylonmembran Agarosegel Molekül Eine kurze Bestrahlung der Membran mit UV-Licht (254nm) im GS Gene Linker von Bio Rad, Hercules, USA sorgt dafür, dass es zu Strangbrüchen in der DNA kommt und die Nukleotide der Bruchenden sich mit den positiv geladenen Aminogruppen der Nylonmembran fest verbinden, und die DNA irreversibel auf der Membran fixiert bleibt (sog. Crosslinking ).

39 Durchführung Gelelektrophorese Die DNA-Proben (20µl pro Ansatz), die vorher durch RNA-Extraktion und anschließender RT- PCR (s und 2.4.2) hergestellt worden waren, wurden mit 2 µl Ladepuffer resuspendiert. Der Ladepuffer setzt sich wie folgt zusammen: 20µl Bromphenolblau 350µl Glycerol in Wasser 630µl 1xTBE-Puffer Das Agarosegel enthielt bei 300 ml Endvolumen 3 mg Agarose, das einem 1%igen Gel entspricht. Nach der Denaturierung der Proben (erhitzen auf 95 C) wurden die DNA-Proben sofort geladen. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA erfolgte bei 40V für 8h in 1xTBE- Puffer Kapillartransfer auf Nylonmembran ( Blotten) Nach Ablauf der Elektrophorese wurde die Vollständigkeit der Auftrennung unter UV-Licht kontrolliert und zur Dokumentation photographiert. Zur Transfervorbereitung wurde das Gel erst 15min mit 0,2 molaren Salzsäure (HCL), dann 1 Stunde mit einer 1 molarer NaOH Lösung inkubiert, um die Struktur des Gels aufzulockern, damit die Moleküle später besser durch das Gel wandern können. Anschließend wurde das Gel 1 Stunde mit einer neutralisierenden Lösung (121,1 g Tris, 87,6 g NaCl, ph 7,6) und 30 min mit 10xSSC Puffer gewaschen. Zum eigentlichen Transfer wurde das Gel auf eine Lage Watmanpaper gelegt, das mit 10xSSC vollgesogen war. Auf das Gel wurde blasenfrei die Nylonmembran gelegt. Als Saugpapier waren auf der Membran noch drei Lagen Whatmanpaper und mehrere Lagen Papiertücher. Um einen kompletten DNA-Transfer aus dem Gel auf die Membran zu erreichen, waren Blotzeiten von mindestens 4 h bis 24 h nötig.

40 40 Nach dieser Zeit wurde die Membran von dem Gel entfernt, beschriftet und datiert. Die RNA wurde unter UV-Licht mittels Crosslinking bei 150 Joule (GS Gene Linker, Bio Rad, Hercules, USA) dauerhaft auf der Membran fixiert (s ). Nach diesem Schritt wurde die Membran bis zur Hybridisierung im Kühlschrank bei 4 C gelagert Radioaktive Markierung der Blots Das Prinzip Nachdem die DNA-Fragmente auf die Membran übertragen worden sind und die Proben auf der Membran immobilisiert worden sind, werden die Proben anschließend mit einer radioaktivmarkierten cdna-sonde hybridisiert. Diese Sonde wird mit dem PCR-Verfahren und den spezifischen Primern der nachzuweisenden mrna hergestellt (s ), damit ein Abschnitt des DNA-Stranges entsteht, der dem nachzuweisenden Fragment komplementär ist. Mit dem Nucleotid Prime Labeling Kit der Firma Boehringer Mannheim werden radioaktive Nukleotide durch PCR mit dem Klenow-Enzym in die zu amplifizierenden Fragmente eingebaut und man erhält DNA-Stränge, die jetzt radioaktiv markiert sind. Diese markierte Sonde wird auf die Membran gegeben und in einem Hybridisierungsofen von der Firma Heraeus mindestens eine Stunde inkubiert, damit sich die Sonde an die DNA-Stränge auf der Membran anlegen kann. In anschließenden Waschschritten wird die Membran gesäubert, so dass die Radioaktivität nur noch an den Stellen zu finden ist, an denen es zu einer festen Bindung der Sonde mit der DNA gekommen ist. Abschließend werden diese Bindungen durch Exposition eines Röntgenfilms als Banden visualisiert Herstellung der cdna-sonde Um die cdna-sonden herzustellen wurde cdna nach dem RT-PCR-Verfahren(s ) hergestellt. Für die Herstellung der GH-Rezeptor-cDNA und der IGF-1-Rezeptor-cDNA wurden die in Tabelle 4 aufgeführten Primer verwendet und mit den für diese Primer spezifischen Temperaturen (s. Tabelle 4) in Zyklen amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf ein 0,8%iges Agarosegel geladen und mittels Gelelekrophorese acht Stunden bei 40 Volt aufgetrennt. Diese Auftrennung wurde unter UV-Licht kontrolliert und zur

41 41 Dokumentation photographiert. Anschließend konnte die cdna aus dem Gel eluiert werden (s ) Markieren der cdna-sonde ( Labelling ) 25 ng cdna wurden mit Hilfe des Random Primed DNA Labeling Kits der Firma Boehringer Mannheim entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit [á 32 P]-dATP der Firma Amersham Pharmacia Biotech markiert. Dazu wurde die Sonde zunächst 5 Minuten bei 100 C denaturiert und anschließend wurden die Nukleotide, jeweils 0,5 mm, dctp, dgtp, dttp (je 1µl) und 5µl [á 32 P]- datp, 2µl Reaktionspuffer (Hexanukleotidgemisch in 10fach konzentriertem Reaktonspuffer) und 1µl Klenow-Enzym zugefügt und 30 min bei 37 C inkubiert. Mit einer 0,1 M EDTA-Lösung wurde die Reaktion gestoppt und anschließend mit dem QIAquick Nukleotid Removal Kit gewaschen, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Anschließend wurden 100µl sonicated Lachsrogen zu den Proben gegeben und 2 min gekocht, um eine Wiederzusammenlagerung der einzelsträngigen radioaktiv markierten Sonden untereinander zu verhindern Hybridisierung und Waschschritte Die Membran wurde in dem Hybridisierungsofen von der Firma Heraeus, Osterrode bei 68 C für 30 min mit 10 ml Quickhyb Lösung vorhybridisiert. Anschließend wurde die markierte Sonde der Hybridisierungslösung beigefügt. Die Hybridisierung selbst wurde über 1 h bei 68 C durchgeführt. Um unspezifische Bindungen zu lösen, wurden anschließend Waschschritte mit verschieden stark konzentrierten Salzlösungen durchgeführt. Als erstes wurde zweimal 15 min mit 1xSSC,0,1%SDS gewaschen und dann zweimal 15 min mit 0,5xSSC,0,1%SDS. Der Erfolg des radioaktiven Einbaus wurde an einem â-counter überprüft Detektion der spezifischen RNA-Sequenzen (Autoradiographie)

42 42 Auf die gewaschenen Membranen wurde ein BIOMAX-MR-Röntgenfilm der Firma Kodak aufgebracht, der bei -80 C in einer Kassette mit Verstärkerfolie zwischen 4 Stunden und 4 Tagen belichtet und anschließend entwickelt wurde Blot stripping und Rehybridisierung Um den jeweiligen Blot noch ein weiteres Mal mit einer Sonde hybridisieren zu können, musste dieser vorher stringent genug gewaschen werden (sog. Blot stripping ), um die Sonde, die davor an der DNA der Membran haftete, zu lösen. Hierfür wurde die Membran dreimal 15 min bei 95 C mit 0.1xSSC,0.1%SDS inkubiert. Anschließend wurde das erfolgreiche Ablösen der Sonde durch Belichten eines Röntgenfilms kontrolliert und die Blots konnten mit einer weiteren Sonden rehybridisiert werden. Auf diese Weise war es möglich, die Blots mehrmals wiederzuverwenden Semiquantitative Auswertung Zur Auswertung wurden sowohl die Bilder der Agarosegele, die zum Nachweis von β-aktin, GH und IGF-1 dienten, als auch die belichteten Röntgenfilme, die zum Nachweis von IGF-1-R und GH-R dienten, mit einer Videokamera in einen Macintosh PowerMac Computer aufgenommen und dann densitometrisch ausgewertet. In die Berechnung gingen jeweils die Lichtintensität und die Größe der Banden unter Abzug des Hintergrundes ein. Diese Lichtintensität wurde mit Hilfe des IMAGE-Programms (NIMH National Institutes of Health, Bethesda, USA) berechnet.

43 43 Die Ergebnisse der Hypophysenadenome wurden alle durch die Expression der β-aktin mrna geteilt und jeweils im Vergleich zu dem Mittelwert von normalem Hypophysengewebe (=100%) in Prozent ± der jeweiligen Standardabweichung angegeben. Dies wurde mit dem Programm Excel von Microsoft und folgender Formel berechnet: Expression der mrna eines Hormons = Expression der mrna β-aktin mrna Mittelwert * Expression der mrna ( ) β-aktin mrna von normalem Hypophysengewebe

44 44 3. ERGEBNISSE 3.1 Nachweis der mrna Expression von GH, GH-Rezeptor, IGF-1, IGF-1-Rezeptor und b -Aktin in den Adenomen Die mrna von GH wurde in normalem Hypophysengewebe entsprechend einer Expressionsrate von 100 % in 9 von 9 Geweben nachgewiesen. In endokrin inaktiven Hypophysenadenomen dagegen war die mrna von GH nur in 6 von 18 Geweben detektierbar, entsprechend einer Rate von 33%. In somatotropen Hypophysenadenomen wurde die mrna von GH in allen Adenomen wie erwartet nachgewiesen. Die GH-Rezeptor mrna wurde wie die von GH in normalem Hypophysengewebe zu 100 % nachgewiesen. In endokrin inaktiven Hypophysenadenomen wurde sie in 17 von 18 Geweben entsprechend einer Rate von ca. 94 % und in somatotropen Hypophysenadenomen in 4 von 6 Geweben mit einer Rate von etwa 66% detektiert. Die mrna von IGF-1 wurde in normalem Hypophysengewebe (5/9) mit einer Rate von 55% und in endokrin inaktiven Hypophysenadenomen (13/18) mit einer Rate von etwa 72% nachgewiesen. In somatotropen Hypophysenadenomen wurde die IGF-1 mrna in 5 von 6 Geweben entsprechend einer Rate von 83% nachgewiesen. Die IGF-1-Rezeptor mrna wurde in normalem Hypophysengewebe in allen Geweben nachgewiesen. In endokrin inaktiven Adenomen wurde die IGF-1-R mrna in 14 von 18 Geweben (mit 77%) detektiert. In somatotropen Hypophysenadenomen wurde die IGF-1-R mrna in 5 von 6 Geweben, entsprechend einer Rate von etwa 83% nachgewiesen.

45 45 Tabelle 6: Häufigkeit der mrna-expression von GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R in dem untersuchten Gewebe GH GH-R IGF-1 IGF-1-R Normales Hypophysengewebe 9/9 (100%) 9/9 (100%) 5/9 (55%) 9/9 (100%) Endokrin inaktive Hypophysenadenome 6/18 (33%) 17/18 (94%) 13/18 (72%) 14/18 (77%) Somatotrope Hypophysenadenome 6/6 (100%) 4/6 (66%) 5/6 (83%) 5/6 (83%)

46 Genexpression der mrna in normalem Hypophysengewebe Abbildung 9: Darstellung der elektrophoretischen Auftrennung der RT-PCR-Produkte von GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R und Aktin von normalem Hypophysengewebe GH: Marker pk 210Bp GH-Rezeptor: 452Bp IGF-1: 366Bp IGF-1-Rezeptor: 505Bp β-aktin: 310Bp

47 Genexpression in endokrin inaktiven Hypophysenadenomen Abbildung 10: Darstellung der elektrophoretischen Auftrennung der RT-PCR-Produkte von GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R und Aktin von endokrin inaktiven Hypophysenadenomen GH: Marker pk 210Bp GH-Rezeptor: 452Bp IGF-1: 366Bp IGF-1-Rezeptor: 505Bp β-aktin: 310Bp

48 Genexpression in somatotropen Hypophysenadenomen Abbildung 10: Darstellung der elektrophoretischen Auftrennung der RT-PCR-Produkte von GH, GH-R, IGF-1, IGF-1-R und Aktin von somatotropen Hypophysenadenomen GH: Marker pk 210Bp GH-Rezeptor: 452Bp IGF-1: 366Bp IGF-1-Rezeptor: 505Bp β-aktin: 310Bp