Charakterisierung von potenziellen Markerpeptiden für die Rheumatoide Arthritis

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1 Charakterisierung von potenziellen Markerpeptiden für die Rheumatoide Arthritis Diplomarbeit im Studiengang Biotechnologie der Technischen Fachhochschule Berlin zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplomingenieurs (FH) vorgelegt von Vedat Durmaz Berlin, Oktober 2005

2 Diese Arbeit wurde am Universitätsklinikum Charité Berlin, Schwerpunkt Rheumatologie und klinische Immunologie, in der Arbeitsgruppe und unter der Leitung von Dr. Karl Skriner angefertigt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Wörner 2. Gutachter: Prof. Dr. Fischer

3 DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich mich bei all jenen bedanken, die mich mit ihrem Verständnis und ihrer Freundschaft durch das Studium und die Diplomarbeit begleitet haben. Ohne diese Unterstützung wäre mir in so manch einem Moment die Disziplin und der rechte Wille abhanden gekommen. Im Besonderen gilt mein Dank meinen Eltern, die mich immer vorbehaltlos unterstützt und mir das Studium erst ermöglicht haben. Auch den Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe, Alexandra, Kerstin und Nicole, allen anderen Mitarbeitern der diagnostischen Rheumatologie und gewiss nicht zuletzt Dr. Hausdorf und der Arbeitsgruppe um Dr. Zoltán Konthur vom MPI sowie meinem Betreuer von Seiten der TFH Berlin, die mir alle mit Rat und Tat zur Seite standen, bin ich zu Dank verpflichtet. Für den wohl wichtigsten Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit gerade in der besonders schwierigen Schlussphase durch meine Freundin Marie werde ich ihr so Gott will auf ewig verbunden sein.

4 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2.AKh 2.AKr ACR AFA AK AKA ANA APF APS AS BiP BSA CII CP CCP DMEM DRFZ DTT EBNA EBV EDTA ELISA EQ ER Fa. FKS HLA hnrnp HRP Hsp IDDM Ig IP MCTD MP MPI Gegen humane Antikörper gerichteter Zweitantikörper Gegen Kaninchenantikörper gerichteter Zweitantikörper American College of Rheumatology Antifilaggrin Antikörper Antikörper Antikeratin Antikörper Antinukleäre Antikörper Anti Perinukleärer Faktor - Antikörper Ammoniumpersulfat Aminosäure Binding protein Rinderserumalbumin Collagen-Typ II Citrulliniertes Peptid Cyclisches citrulliniertes Peptid Dulbecco's Modified Eagles Medium Deutsches Rheumaforschungszentrum Dithiothreitol EBV codiertes nukleäres Antigen Epstein-Barr-Virus Ethylendiamintetraessigsäure Enzyme-linked Immunosorbent Assay Extinktionsquotient Endoplasmatisches Reticulum Firma Fötales Kälberserum Human Leukocyte Antigen Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein Horseraddish Peroxidase Heatshock Protein Insulinabhängiger Diabetes mellitus Immunglobuline Immunpräzipitation Mixed Connective Tissue Disease Milchpulver Max Planck Institut

5 MS MTP mt NC OA PA PAD PAGE PBS Pen RA RF S-ARA S-KRA S-MS S-OA S-SLE SDS SLE Ssc Strep TCE TCR TEMED TMB TNF Multiple Sklerose Mikrotiterplatte Mycobakterium tuberkulosis Negativkontrolle des Serums (Serumkontrolle) beim Blotten und ELISA Osteoarthritis Polyarthritis Peptidyl-Arginin-Deiminase Polyacrylamid Gelelektrophorese Phosphatgepufferte Saline Penicillin Rheumatoide Arthritis Rheumafaktor/-en Adulte RA Seren Kinder RA Seren MS Seren OA Seren SLE Seren Natriumdodecylsulfat Systematischer Lupus Erythematosus Sytemische Sklerose Streptomycin Trichloressigsäure T Zellrezeptor N, N, N', N' Tetramethylethylendiamin Tetramethylbenzidin Tumornekrosefaktor

6 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINFÜHRUNG Autoimmunität Rheumatoide Arthritis (RA) Autoantigenitäten bei der RA Xenogene Antigene Gewebsspezifische Antigene Ubiquitäre Antigene Sonderfall Citrullinierung Zielsetzung dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN Materialien Chemikalien Puffer und Lösungen Verbrauchsgegenstände und Geräteliste Antigene Peptide und Proteine Seren Zelllinien und histologische Gewebsschnitte Zellkulturarbeiten Zellkultivierung Kryokonservierung Passagieren Zellzahlbestimmung Zellaufschluss und Proteinextraktion Proteinbiochemische und Immunologische Methoden SDS PAGE Westernblot Immunoblot Streptavidin ELISA Citrullinierung von Peptiden Immunaffinitätschromatographie Immunhistochemische Inkubation Immunpräzipitation in ProteinG - Mikrotiterplatten ERGEBNISSE Native und denaturierende Proteinextraktion aus HeLa S Untersuchung des citrullinierten Peptids P

7 3.2.1 Einfluss der Citrullinierung auf die Antigenität von P Sensitivität und Spezifität von P12 für die RA Untersuchung des Peptids P Sensitivität und Spezifität von P32 für die RA Einfluss der Citrullinierung auf die Sensitivität von P Isolierung von anti-p32 AK mittels Streptavidin ELISA Isolierung von anti-p32 AK mit Streptavidinbeads Immunoblot von anti-p32 AK gegen HeLa S3 Linie Fluoreszenzmikroskopische Detektion des zu P32 homologen humanen Autoantigens Präzipitation eines humanen Autoantigens aus einem HeLa S3 Extrakt mittels anti-p32 - AK Nachweis eines immunpräzipitierten Antigens Magnetic Streptavidinbeads vs. Streptavidin ELISA Epitopmapping an hnrnp A1 und A Häufigkeit einer B-Zellantwort gegen A1/A2 Peptide differenziert nach Krankheitsgruppen Sensitivitäten aller untersuchten A1 / A2 Peptide für unterschiedliche Krankheitsgruppen DISKUSSION P P ELISA mit und ohne Beads Epitopmapping an hnrnp A1 und A ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR... 48

8 Einführung 1 1 EINFÜHRUNG 1.1 Autoimmunität Eine gegen körpereigene Antigene gerichtete Immunantwort des Abwehrsystems bezeichnet man im Allgemeinen als Autoimmunität. Die zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen sind keine anderen als die bei Menschen mit gesundem adaptiven Immunsystem vorliegenden, verursachen aber gravierende direkte und indirekte gesundheitliche Schäden. Verantwortlich dafür ist die zelluläre Abwehr durch Makrophagen und cytotoxische T-Zellen in Verbindung mit einer humoralen Antwort, vermittelt von autoreaktiven T- und B-Zellen [1]. Erschwerend kommt für das unter diesen Umständen bereits geschädigte Abwehrsystem hinzu, dass das vom eigenen Organismus exprimierte Antigen ständig nachgeliefert wird, wodurch es häufig zu chronisch entzündlichen Gewebsschädigungen kommt. Andererseits kann ein einzelnes Antigen bildendes Organ vollständig zerstört werden. Als sinnvoll erscheint eine erste Einteilung nach der Gewebsspezifität der autoimmunen Antwort. Sie liefert zwei Gruppen von Autoimmunerkrankungen: organspezifische, die nur bestimmte Organe oder Gewebe schädigen wie bespielsweise IDDM und MS [2, 3] und systemische Autoimmunerkrankungen wie die RA und SLE, bei denen ubiquitäre, in fast allen Körperzellen vorkommende Antigene dem Immunsystem als Zielscheibe dienen [4]. Solche Fehlfunktionen sind zudem oft durch zahlreiche unterschiedliche und gemeinsam auftretende Autoreaktivitäten innerhalb eines Individuums geprägt. Ursachen der Autoimmunität Die genauen Ursachen für das Auftreten von Autoimmunerkrankungen konnten bisher nicht geklärt werden. Man geht heute davon aus, dass sowohl genetische Prädispositionen [5, 6] als auch Umweltfaktoren [7, 8] eine Verschiebung des Immunsystems zu einem ungesunden Gleichgewicht bewirken, was durch zahlreiche Versuche und insbesondere durch vergleichende empirische Untersuchungen an ein- und zweieiigen Zwillingen belegt werden konnte. Die genetisch bedingte Vielfalt an T-Zellrezeptoren (TCR) [9] ermöglicht die Erkennung vieler verschiedener, auch körpereigener Antigene. Im Normalfall sollte sich ein gesunder Organismus im Verlaufe einer natürlichen negativen Selektion im Thymus unter Anderem autoreaktiver T-Zellen apoptotisch entledigt und deren Migration in die Peripherie verhindert haben, was allerdings nicht in allen Fällen funktioniert [10]. Diese und andere Störungen in der komplexen Regulation des Immunsystems kön-

9 Einführung 2 nen zu entsprechenden Erkrankungen führen. Zur Aktivierung und Proliferation muss die T-Zelle des weiteren mit einem an ein MHC Molekül gebundenen Antigen konfrontiert werden, um weitere Schritte zu dessen Bekämpfung einleiten zu können. Dabei ist zu beachten, dass auch die Struktur der MHC Moleküle, insbesondere in der Peptidbindungsgrube, aufgrund der genetischen Polymorphie und Polygenie innerhalb eines Organismus sehr stark variiert [11, 12]. Ein immunrelevanter Kontakt (sog. Immunologische Synapse) zwischen TCR und MHC-Peptid Komplex kommt erst dann zustande, wenn sowohl Peptid als auch der MHC eine ausreichende Avidität zum TCR aufweisen [13]. Die verschiedenen allelischen Haplotypen des MHC Genotyps (HLA - Serotypen) begünstigen die Entstehung einer Autoimmunerkrankung in unterschiedlich starkem Maße [6, 14]. Andererseits belegen zahlreiche Untersuchungen den Einfluss von Umweltfaktoren wie molekulare Mimikrys auf die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, wobei ganz unterschiedliche Mechanismen zum Tragen kommen. So führen beispielsweise Kreuzreaktivitäten immunogener viraler oder mikrobieller Komponenten mit körpereigenen antigenen Strukturen zur Ausbildung spezifischer Effektorzellen die zusätzlich autoreaktives Potenzial besitzen [15, 16]. Aus weiteren Untersuchungen geht hervor, dass erst durch das Einwirken eines zusätzlicher Schadstoffes wie Zigarettenrauch räumliche Barrieren zwischen bereits vorliegendem AK und Antigen beseitigt und entsprechende immunrelevante Kontakte ermöglicht werden [17]. Über die Entstehung und die Mechanismen von Autoimmunerkrankungen ist oftmals nur sehr wenig bekannt. Ein komplexes System vieler verschiedener externer (Umwelt) sowie interner (genetischer) Faktoren versetzt das Immunsystem in ein Ungleichgewicht, das oft erst anhand der Symptomatik eindeutig identifiziert werden kann. Daher ist die Wissenschaft im Allgemeinen daran interessiert, schnellere und eindeutigere Diagnosemöglichkeiten zu entwickeln. Frühzeitigere und treffendere Therapien könnten Leben retten, erträglicher machen oder auch nur verlängern. Am Beispiel der RA sollen im Folgenden die Vielfältigkeit der zu Grunde liegenden Autoreaktivitäten und die damit einher gehenden Schwierigkeiten bei der Erstellung einer möglichst signifikanten Diagnose erörtert werden. Gerade die RA bietet sich aufgrund ihrer zahlreichen Autoantigenitäten für diese Betrachtungen an.

10 Einführung Die Rheumatoide Arthritis Rheumatische Erkrankungen sind die häufigsten chronischen Erkrankungen, die mit dem Auftreten autoreaktiver T- und B-Zellen verbunden sind. Bei der RA im Besonderen handelt es sich um eine systemische Autoimmunerkrankung, von der fast 1% der Weltbevölkerung betroffen ist, wobei die Wahrscheinlichkeit des Auftretens mit zunehmendem Alter steigt, und insbesondere bei Frauen in Erscheinung tritt. Letztere Tatsache kann zu der Vermutung verleiten, dass Geschlechtshormone an der Entstehung beteiligt sind [18]. Sie führt aufgrund auftretender spezifischer T- und B- Lymphozyten und inflammatorischer Zytokine bereits im Frühstadium zu einer systemischen, chronisch entzündlichen Erkrankung der Gelenke und ist zudem durch zahlreiche Autoreaktivitäten geprägt [18-20]. Man geht weiterhin von einer genetischen Prädisposition auf dem HLA-DR Locus aus, wobei Ätiologie und Pathogenese noch weitergehend ungeklärt sind [18]. Alleine die RA wirft viele Fragen über die Ursachen von Autoimmunerkrankungen und die beteiligten zellulären Komponenten, die als Autoantigene fungieren, auf. Diagnose der RA Die Diagnose der Erkrankung erfolgt primär anhand klinischer Symptome, wodurch meist Monate und Jahre ohne sinnvolle Therapierung verstreichen. In der Regel setzt zunächst eine Entzündung der Synovialmembran verschiedener Gelenke der Gliedmassen ein, gefolgt von Schmerzen und Schwellungen an Fuß und Handgelenken, die sich im weiteren Verlauf der Pathogenese auf größere Gelenke wie Knie, Ellbogen und Fußgelenke ausweiten. Aufgrund chronischer Entzündungen entstehen dauerhafte Schädigungen, die in den meisten Fällen zur Zerstörung der betroffenen Knochen und des Knorpels führen. Um das zu vermeiden, ist man an einer frühzeitigeren Diagnose interessiert, da eine Behandlung im frühen Stadium den Krankheitsverlauf signifikant zu Gunsten des Patienten beeinflussen kann [21, 22]. Viel Nutzen erhofft man sich insbesondere von der Erforschung der zahlreichen Autoreaktivitäten und Antigene, auf derer einige im Verlaufe dieser Arbeit näher eingegangen wird. So soll in ihr ein Schritt in Richtung frühzeitiger Diagnose der RA gemacht werden, nicht ohne Hoffnung, hier vielleicht auch einen Einblick in die Mechanismen der Erkrankung gewinnen zu können. Ein erster Erfolg versprechender Schritt zu einer schnelleren, serologischen Diagnose wurde mit der Beschreibung der sog. Rheumafaktoren (RF) in den Zwanzigern des letzten Jahrhunderts geleistet. Seither wurden zahlreiche Untersuchungen zur Herkunft und Spezifität der RA durchgeführt [23].

11 Einführung 4 Therapiekonzepte für die RA Die heute angewandten Therapien gegen die RA basieren im Allgemeinen auf der Verabreichung unspezifisch wirkender, oft nicht ausreichend im Wirkmechanismus charakterisierter Präparate, die weitgehend ungezielt bestimmte Funktionen des Organismus (z.b Zellteilung) beeinflussen. Medikation und Dosierung wurden klinisch empirisch ermittelt und werden an den auftretenden Nebenwirkungen gemessen. Bei der T-Zell Vakzinierung beispielsweise erfordert die Vielzahl an Autoreaktivitäten innerhalb eines einzelnen Patienten eine auf diesen abgestimmte, spezifische Behandlung mit T-Zellen. Sie sollen das Immunsystem zur Bildung regulatorischer T- Zellen anregen, wodurch ihm wieder die Kontrolle über autoraktive T-Zellen zuteil wird. Eine andere wäre die Inhibition entzündungsfördernder Zytokine wie den TNF- oder die Verabreichung hemmender Zytokine. Den lebensbedrohenden, schweren systemischen Verlaufsformen der RA und SLE vorbehalten bleibt die autologe Stammzell Therapie, quasi ein Reset des Immunsystems. Hierbei werden dem Patienten seine eigenen entnommenen Stammzellen reappliziert, nachdem zuvor alle immunkompetenten Zellen des Immunsystems chemisch und radiologisch zerstört wurden [24]. 1.3 Autoantigenitäten bei der RA Aufgrund der sehr zahlreichen Autoreaktivitäten bei der RA sollen hier nur einige Autoantigene beschrieben werden. Viele treten nur bei einem geringen Teil aller RA Patienten auf und / oder auch bei zahlreichen anderen Autoimmunerkrankungen mit ähnlicher Pathogenese oder gar Gesunden. Gefragt sind insbesondere Kenntnisse ü- ber solche Antigene, die möglichst spezifisch für eine bestimmte Erkrankung sind, also bei anderen Patienten keine Immunantwort auslösen oder bei einem möglichst großen Teil der an einer bestimmten Erkrankung leidenden Menschen auftreten. Im Folgenden sollen nur einige der viel versprechendsten Autoantigene werden und in der Sensitivität und Spezifität beurteilt werden Xenogene Antigene Heatshock Proteine Heatshock Proteine sind an der Faltung natürlicher Proteine beteiligt, erzeugen also Tertiär- und Quartärstrukturen. Im Tiermodell konnte nachgewiesen werden, dass beispielsweise Mycobakterium tuberculosis bzw. eins seiner Proteine mt-hsp65 oder

12 Einführung 5 gegen diesen gerichtete AK in der Lage sind, die sog. Adjuvans Arthritis auszulösen, eine Erkrankung, die der menschlichen RA in gewissen Aspekten ähnelt [25]. Gegen mt-hsp65 gerichtete Antiköper und T-Zellen, die in der Synovialflüssigkeit von RA Patienten nachgewiesen werden konnten, legten die Vermutung nahe, dass eine Kreuzreaktivität mit dem homologen Säuger HSP60 eine Autoreaktivität gegen das Säuger Protein auslöst. Allerdings sind die AK nicht RA spezifisch, sondern treten auch bei Erkrankungen wie SLE, Reiter Syndrom, Tuberkulose aber auch bei gesunden Menschen auf [26]. Shared Epitope Das bakterielle Stressprotein Dna J mit Homologie zum Säuger Hsp70 enthält die für die RA prädisponierende Sequenz QKRAA (Shared Epitope) [27]. Das Epitop ist zudem Bestandteil des EBV (Epstein-Barr-Virus) codierten Proteins gp110. Dna J ist das Ziel autoreaktiver T-Zellen von RA Patienten, nicht aber bei Gesunden [28]. EBNA-1 Das EBV codierte nukleäre Antigen (EBNA-1) konnte erst spät in der Synovialflüssigkeit von RA Patienten nachgewiesen werden [29, 30]. Es wurde schon lange zuvor mit der Entstehung von RA in Verbindung gebracht. Ein gegen EBNA-1 gerichteter AK konnte zeigt Reaktivität bei p62, einem Protein der synovialen Deckzellen bei RA Patienten [31]. Eine in EBNA-1 enthaltene Glycin-Alaninreiche Repeatsequenz (IR-3) ist das Ziel von Autoantikörpern von Patienten, die an RA, SLE, Ssc oder infektiöser Mononucleose erkrankt sind, aber auch von Gesunden [32]. EBNA-1 zeigt über die IR-3 Kreuzreaktionen mit zahlreichen humanen Proteinen, wie beispielsweise p62 und p542. Letzteres reagiert vornehmlich mit Seren von Patienten mit infektiöser Mononucleose und RA [15]. Man vermutet aufgrund der hohen Sequenzhomologie mit Maus - hnrnp, dass es sich bei p542 um eine 71kDa - Komponente von hnrnps handelt [16]. Die hnrnps, derer Untersuchung diese Arbeit einen Großteil ihres Umfangs widmet, werden unter (Ubiquitäre Autoantigene) detailierter abgehandelt Gewebsspezifische Antigene Sa - Protein Das 50 kda große Sa Protein konnte in der humanen Milz, der Placenta und im RA Pannusgewebe, aber nicht in kultuvierten Zellen nachgewiesen werden [33]. Die Krankheitsspezifität für RA liegt mit % sehr hoch [34]. Man vermutet, bei dem Sa Protein handle es sich um die citrullinierte Form von Vimentin [35]. Aus

13 Einführung 6 anderen Untersuchungen wiederum geht hervor, dass die Sa Aktivität mit der der humanen - Enolase identisch ist [36]. Filaggrin Das Filaggrin (Filament Aggregating Protein), ein 42k Protein des Endothels, ist an der Organisation des Zytoskeletts in Epithelzellen beteiligt. Es vernetzt intermediäre Filamente, insbesondere Cytokeratin und wird aus der stark phosphorylierten Proteinvorstufe Profillagrin gebildet. Die gegen Filaggrin gerichteten Antikörper (AFA) sind anscheinend dieselben wie die gegen Keratin (AKA) und den Perinukleären Faktor (APF) gerichteten [37]. Als Haupdeterminante des Epitops/der Epitope besitzt der AFA Citrullin, posttranslational modifiziertes Arginin [38, 39], wobei etwa 20 % des Arginins, deiminiert von der Peptidylarginin Deiminase (PAD), als Citrullin vorliegt [40]. Die Sensitivität des Filaggrins für AFA aus RA Seren liegt zwischen 36 % und 91 % bei einer Spezifität von 66 % bis 100 %. Citrullin konnte in Synovialzellen nachgewiesen werden, obwohl Filaggrin nur extraartikulär vorliegt [41]. Collagen-Typ II Collagen-Typ II (CII) ist ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels und beteiligt an der Bildung von Tripelhelices aus Tropocollagen - Unteinheiten. B-Zellen gegen CII wurden vermehrt in entzündeten Gelenken von RA - Patienten nachgewiesen [42]. Maus T-Zellen, die mit bovinem CII reagieren, sind spezifisch für ein Epitop, das auch in humanem CII vorkommt und überlappen zudem mit einem T-Zellepitop von Mäusen mit induzierter Arthritis [43]. CII spezifische T- Zellen konnten sowohl bei Gesunden als auch bei RA Patienten nachgewiesen werden [44]. Bei einer serologischen Gesamtspezifität von 30 % unter RA Patienten scheinen derer HLA-DR4 positive zudem genetisch prädisponiert [45]. Im Vergleich hierzu enthält das Synovialgewebe der Mehrheit von RA Patienten Anti-CII produzierende B- Zellen und entsprechende AK [45, 46]. Allerdings lässt die Spezifität für RA zu wünschen übrig, da auch Patienten mit z.b. SLE (20 %), Ssc (15 %) und infektiösen Erkrankungen wie Lepra (50 %) anti-cii AK aufweisen. Dessen Titer im Serum und in der Synovialflüssigkeit scheint direkt mit dem Vorkommen von Zytokinen wie TNF- und IL-6 zu korrelieren [47]. CH65 Das knorpelspezifische CH65 aus Chondrozytenmembranen, das bei RA und Arthrosepatienten als Autoantigen beschrieben wurde [48], während T-Zellen Gesunder keine Reaktivität zeigten, besitzt eine Sensitivität für AK aus RA Seren von 70 %.

14 Einführung 7 Obwohl CH65 insbesondere aufgrund seines hohen Glycinanteils eine Sequenzähnlichkeit mit mt-hsp65 und einigen Cytokeratinen aufweist, konnten keine Kreuzreaktivitäten zwischen den gegen diese gerichteten monoklonalen AK festgestellt werden [49]. Fibronectin Das Fibronectin ist ein dimeres Glykoprotein, das in der Bindegewebsmatrix, auf O- berflächen von Epithelzellen aber auch im Plasma und anderen Körperflüssigkeiten vorkommt. Es interagiert mit Collagen, Fibrin(ogen), Heparin und verschiedenen Zelloberflächen Proteinen. In 14 % der untersuchten RA Patienten konnten gegen ihn gerichtete AK nachgewiesen werden, was allerdings auch bei Patienten mit anderen Erkrankungen (z.b. SLE: 34 %) zutrifft [50]. Human Cartilage Glycoprotein (HC gp39) HC gp39 wird von artikulären Chondrozyten, Synovialzellen, Makrophagen und Neutrophilen sezerniert. Es ist am Umbau von Gewebe und an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt. Der gp39 Spiegel im Serum und in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit degenerativen Gelenkserkrankungen ist signifikant höher als der gesunder Menschen [51, 52]. Gegen gp39 gerichtete T-Zellen tauchen bei 44 % der untersuchten RA Patienten und 27 % der Gesunden auf [53] Ubiquitäre Antigene Calpastatin Das zytoplasmatische 72 kda Protein Calpastatin besitzt vier inhibitorische Domänen für Calpaine, eine Familie von Cysteinproteasen. Die Regulierung der Calpaine erfolgt über Calpastatin (inhibierend) und Calciumionen (aktivierend). Nach einer Zellaktivierung tritt Calpastatin auch extrazellulär auf, wodurch es für AK zugänglich wird [54]. Gegen ein rekombinant gewonnenes Calpastatin reagieren 45 % der untersuchten RA Seren positiv. Allerdings wird es auch bei Krankheiten wie SLE, MCTD, Ssc, aktivierter Arthrose und Anderen als Antigen [55, 56] und sogar bei Gesunden [57] mit vergleichbaren Häufigkeiten erkannt. Es wird angenommen, dass durch die Eliminierung des Calpastatins und die damit einher gehende Steigerung der Calpainaktivität schwere Gelenksschädigungen gefördert werden [54]. IgG - Fc Der Rheumafaktor (RF) ist der bislang am besten untersuchte Antikörper, der bei Rheumapatienten in Erscheinung tritt. Er wurde kurz nach dem 1. Weltkrieg entdeckt

15 Einführung 8 und wird als bislang einziges serologisches Nachweiskriterium vom American College of Rheumatology (ACR) anerkannt [58]. Nachgewiesen werden kann er bei 75% aller RA Patienten aber auf Kosten der Spezifität auch bei anderen rheumatischen Autoimmun (wie SLE oder Sjögren Syndrom) und Infektionserkrankungen (z. B. Hepatitis, Tuberkulose). Selbst 5 % 15 % der gesunden Bevölkerung weisen den RF auf, wobei die Prävalenz mit zunehmendem Alter steigt. Zudem korreliert der RF Titer nicht streng mit der klinischen oder serologischen Aktivität der RA oder der Gelenkszerstörung [24]. Aufgrund der Anerkennung durch das ACR findet sein Nachweis in nahezu allen klinischen Laboren Verwendung. Um eine gute diagnostische Spezifität und Sensitivität, zu erreichen, die auch gewisse Prognosen erlauben, wird eine kombinierte Untersuchung des Vorkommens von IgM, IgA und IgG RF empfohlen [59, 60]. Der RF ist gegen die Fc - Region von IgG Molekülen gerichtet und taucht in allen Antikörper - Subklassen (IgE, IgM, IgA, IgG) auf. Zudem besitzt er die Fähigkeit, sich selbst zu binden und dadurch größere Immunkomplexe zu bilden, die imstande sind, das Immunsystem zu aktivieren [61]. hnrnp's Bei den hnrnp's (heterogeneous nuclear Ribonucleoproteinen), derer einige (A1, A2, A3) im Verlauf der vorliegenden Arbeit auf Peptidebene untersucht werden sollen, handelt es sich um Kernproteine, die als Komponente des Spliceosoms [62] an der posttranskriptionalen Modifikation von prämrna beteiligt sind und nach gewebsspezifischen Isotypen differenziert exprimiert werden [63]. Die hoch konservierten Proteine sind in der Lage, RNA / DNA zu binden [64]. Abb. 1: Funktion der hnrnps bei der Transkription. (Foto: Nobelprize.org) Das hnrnp A2 beispielsweise, das ursprünglich gegen Ende der Achtziger als ein für die RA spezifisches Antigen RA33 beschrieben wurde [65], besitzt zwei RNA Bindungsdomänen und ein Export- /Importsignal, wobei A2 spezifische ANA (Antinucleäre AK) gegen den zwischen den RNA Bindungsdomänen gelegen Bereich gerichtet sind [63]. Spätere Untersuchung zeigten, dass es sich bei RA33 vermutlich um hnrnp A2 Protein handelt [66]. Zudem wurden die Angaben über die Spezifität des Antigens für die RA nachträglich relativiert, da auch Patienten mit anderen Erkrankungen wie MCTD und SLE dagegen gerichtete AK ausbilden [67]. Makeyev et al. legte die Vermutung nahe, das A2 Protein könne als molekularer Adapter zwischen

16 Einführung 10 einsträngigen Telomer Repeatsequenzen oder Telolerase RNA und anderen ssdnas fungieren und an der Erhaltung der Telomere beteiligt sein [68]. Auch die A1 Komponente der hnrnp's besitzt zwei Bindungsdomänen, die gewisse Homologien mit den Consensussequenzen der 3' und 5' Splicesites von Vertebraten aufweisen [69]. Anderen Untersuchungen zu Folge reagiert A1 auf posttranskriptionaler Ebene mit der 3'-UTR (3' untranslated region) von Collagen Typ 1 und 3 mrna. Er gilt als positiver Effektor der Collagenexpression durch Stabilisierung der RNA, wobei ein erhöhter Titer bei Patienten mit cardiovaskulären Erkrankungen nachgewiesen werden konnte [70] Sonderfall Citrullinierung Citrullinierte Proteine (CP) bilden eine ganz neue Gruppe von Antigenen mit sehr hoher Spezifität für die RA. Zudem liegt die Sensitivität im Bereich derer der RFen bei teilweise weit über 80 %. Die Autoren der Publikation empfehlen eine Ersetzung des offiziellen serologischen Markers RF durch auserwählte und gut untersuchte CP [71]. Katalysiert wird die Deiminierung des Pepid Arginins durch das Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD), das in verschiedenen Isotypen vorliegt und Ca 2+ als Cofaktor benötigt. Ihre Expression wird durch verschiedene molekularbiologische Vorgänge /Faktoren wie Transkription, Translation auch der Lokalisierung innerhalb der Zelle und der Expression notwendiger Proteine reguliert [72]. Zwar wurden ctrullinierte Peptide auch bei Menschen beobachtet, die nicht unter RA leiden [73, 74], doch werden AK gegen CP nach dem Stand bisheriger Untersuchungen ausschließlich von Patienten mit RA gebildet. Das citrullinierte humane Collagen I (CI) beispielsweise stellt ein sehr spezifisches Ziel autoreaktiver Vorgänge im Menschen dar. Zudem korreliert der AK Titer mit dem der gegen cyclische citrullinierte Peptide (CCP) gerichteten AK [75]. Auch die Deiminierung der - und -Kette des Fibrins im Synovialgewebe lässt sich nicht nur bei RA Patienten nachweisen [76], entsprechende AK allerdings wurden nur bei dieser Gruppe und bereits in frühen Stadien der Pathogenese gefunden [76]. Als Hauptdeterminante des Filaggrinepitops konnte ebenfalls Citrullin nachgewiesen werden [38, 39]. Bei dem bereits erwähnten RA Antigen Sa soll es sich, so vermutet man, um eine citrullinierte Form von Vimentin handeln [35]. 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit Im Rahmen dieser Arbeit sollen an Peptiden unterschiedlicher Herkunft Untersuchungen durchgeführt werden, die der schnelleren Diagnose und einem vielleicht besse-

17 Einführung 11 ren Verständnis für die Ursächlichkeiten der RA förderlich sein sollen. Dabei wird der Fokus der Betrachtungen auf die Eignung der eingesetzten Peptide als serologische Marker in Diagnostik der RA gesetzt. Für das citrullinierte Peptid P12 (15 AS), dessen unmodifizierte Sequenz einem Bereich der M9-Region des hnrnp A3 entspricht, und das Peptid P32 (15AS), das im Rahmen einer im Jahre 2002 und innerhalb der Arbeitsgruppe angefertigten Diplomarbeit bei einem Phagedisplay humaner cdna nachgewiesen wurde, sollen bei vergleichenden Untersuchungen an unterschiedlichen Erkrankungen wie SLE, OA und natürlich RA die Spezifität und die Sensitivität für die RA ermittelt werden. Insbesondere der Einfluss der Citrullinierung beider Peptide auf die Sensitivität für die genannten Patientengruppen soll geklärt werden. Mit Hilfe des erst genannten Peptids P12 soll weiterhin die Frage erörtert werden, ob denn der Befund des derzeit einzigen kommerziell erhältlichen Markerpeptids für CP (Fa. Eurodiagnostics) allgemein verlässlich ist und bei entsprechenden Ergebnissen mit P12 eine Alternative oder Ergänzung zu den aktuellen serologischen Markern geboten werden. Durch voran gegangene serologische Tests an der P32 Vorstufe (41 AS), die bei oben genanntem Phagedisplay in Erscheinung war, konnte eine Sensitivität des Peptids für RA Seren nachgewiesen werden. Um der Frage nach dem Ursprung des unbekannten Peptids und der Auslösung der B-Zellwort nachzugehen, sollen P32 - spezifische AK aus entsprechend positiven Seren affinitätschromatographisch isoliert werden und zur Immunpräzipitation des passenden Antigens aus dem nativ gewonnenen Proteinextrakt einer HeLa S3 Linie eingesetzt werden. Mittels Massenspektroskopie und Immunhistologischer Untersuchungen soll eine Sequenzierung und Lokalisierung des möglicherweise gewonnenen und neuen Antigens erfolgen. In einer letzten Versuchsreihe soll bei den bislang bekannten Vertretern der hnrnp A Reihe A1 bis A3 ein Epitopmapping durchgeführt werden. Die Betrachtung erfolgt dabei serologisch differenziert nach unterschiedlichen Erkrankungen und Altersgruppen innerhalb der RA. Auch die Seren gesunder Menschen sollen bei den Untersuchungen der Peptide zum Tragen kommen. Nachdem bereits bekannt ist, dass gegen hnrnps gerichtete AK auch in anderen als RA Seren nachgewiesen werden konnten [67], stellt sich die Frage, ob die Epitope bei den unterschiedlichen Erkrankungen die Selben sind.

18 Material und Methoden 12 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Materialien Chemikalien Acrylamid (Rotiphorese Gel 30), Fa. Carl Roth GmbH APS, Fa. Carl Roth GmbH Bromphenolblau, Fa. Sigma Chemical Co BSA, Fa. Servas Electrophoresis GmbH CaCl 2, Fa. Merck KGaA Coomassie R 250, Fa. Merck KGaA DTT, Fa. Carl Roth GmbH EDTA, Fa. Sigma Chemical Co Essigsäure (99%ig), Fa. Merck KGaA Glycerol, Fa. Fa. Carl Roth GmbH Glycin, Fa. Carl Roth GmbH Harnstoff, Fa. Carl Roth GmbH HCl, Fa. Merck KGaA H 2 SO 4, Fa. Merck KGaA KCl, Fa. Merck KGaA KH 2 PO 4, Fa. Merck KGaA Methanol, Fa. Merck KGaA Milchpulver, Fa. Carl Roth GmbH Na 2 HPO 4, Fa. Merck KGaA NaCl, Fa. Merck KGaA NaOH, Fa. Merck KGaA Ponceau, Fa. Merck KGaA SDS-Na, Fa. Servas Electrophoresis GmbH Sulfosalicylsäure, Fa. Sigma Chemical Co TCE, Fa. Merck KGaA TEMED, Fa. Carl Roth GmbH Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, Fa. Carl Roth GmbH Triton X100, Fa. Roche Diagnostics GmbH Trypsin, Fa. Sigma Chemical Co Tween 20, Fa. Servas Electrophoresis GmbH

19 Material und Methoden Puffer und Lösungen PAD, Fa. Sigma Chemical Co AK Elutionspuffer: ImmunoPure Elution Buffer, Fa. Pierce Proteinmarker für SDS PAGE, Fa. BioRad Zellkulturmedium: DMEM, Fa. Biochrom FKS, Fa. Hyclone Pen/Strep Mischung 100fach, Fa. Cambrex Bio Science Trispuffer: 25 mm Tris.HCl, ph 7,4 PBS: 0,2 g KCl + 0,2 g KH 2 PO g NaCl + 14,4 g Na 2 HPO 4 ph 7,4 mit 1 M HCl ad 1 l mit H 2 O bidest 6x Ladepuffer: 0,35 M Tris.HCl (ph 6,8) 0,35 M SDS 30 % (v/v) Glycerol 0,6 M DTT 0,18 M Bromphenolblau Elektrodenpuffer: 25 mm Tris 0,2 M Glycin 0,1 % SDS Sammelgel (4 %): 0,67 ml Acrylamid (für ca. 5 Gele) 1,25 ml Tris.Cl (0,5 M, ph 6,8) 0,05 ml SDS (10 %) 3,00 ml H 2 O bidest 25 µl APS (10 %) 2,5 µl TEMED Trenngel (10 %): 10 ml Acrylamid (für ca. 6 Gele) 7,5 ml Tris.HCl (1,5 M, ph 8,8) 0,3 ml SDS (10 %) Tankblotpuffer: 12,1 ml H 2 O bidest 150 µl APS (10 %) 15 µl TEMED 15 mm Tris 0,1 mm Glycin

20 Material und Methoden 14 Coomassie Lösung: 5 g Coomassie (für 0,25 %ige Lösung) 800 ml Methanol 140 ml Eisessigsäure ad 2 l mit H 2 O bidest Ponceau S Lösung: 0,2 g Ponceau S + 3 g TCE + 3 g Sulfosalicylsäure ad 100 ml mit H 2 O bidest ELISA-Puffer: Blockpuffer: 5 % MP in PBS Waschpuffer: 0,1 % Tween20 in PBS Peptidverdünnung: 0,1 % BSA in PBS Serum-/AK- Verdünnung: 2 % MP in PBS Immunoblot-Puffer: Blockpuffer: 3 % MP in PBS Waschpuffer: 0,05 % Triton X100 in PBS Serum-/AK- Verdünnung: 2 % MP / 0,05 % Triton X100 in PBS PAD Puffer A: 10 mm CaCl 2 5 mm DTT 0,1 M Tris.Cl ph 7,5 PAD Puffer B: 10 mm EDTA (Kontrolle zu A) 5 mm DTT 0,1 M Tris.Cl ph 7,5 IP Puffer: 0,05 % Triton X100 in PBS Wurde sowohl für die Verdünnung (von Antikörper und Zellextrakt) als auch als Waschpuffer verwendet. Zweitantikörper, Fa. Dako Cytomation: 2.AKr: Polyclonal swine anti rabbit Ig HRP (1,3 g/l), für ELISA 2.AKh: Polyclonal rabbit anti human IgG HRP (1,3 g/l), für Blot und ELISA Zweitantikörper für Immunhistochemische Detektion, Fa. The Binding Site: Polyclonal rabbit anti human IgGAM AFF FITC, gebrauchsfertig HRP Substrat (TMB), Fa. Seramun Diagnostics GmbH: Für Immunoblot: SeramunBlauFast (Membran Peroxidase Substrate) Für ELISA: SeramunBlauFast (Microwell Peroxidase Substrate) Verbrauchsgegenstände und Geräteliste Amicon Ultra-4 ( MW CO), Fa. Millipore Analysenwaage, Fa. SatoriusResearch Brutschrank Functionline, Fa. Heraeus

21 Material und Methoden 15 Dynabeads m-280-streptavidin, Fa. Dynal Electrophoresis Power Supply EPS 600, Fa. Pharmacia Biotec Elektrophorese-Temperiergerät Multitemp3, Fa. Pharmacia Biotec ELISA-Platten, ProteinG-bechichtet, Fa. Pierce ELISA-Platten, Streptavidin-beschichtet, Fa. Biotez ELISA-Reader SLT Spectra & Software Magellan, Fa. Tecan ELISA-Reader (am MPI) Spectramax 250, Fa. Molecular Devices ELISA-Schüttler Titramax, Fa. Heidolph Flaschenhandpumpsystem, Fa. Walu Genius Gelkammer Mighty Small II, Fa. Amersham Pharmacia Biotech International GS 6R Zentrifuge, Fa. Beckmann King Fisher Prototyp, Fa. Thermolab Systems Magnet MPC-S, Fa. Dynal Mechan. Zellaufschluss mittels Miccra-D1, Fa. Art Microskop DM IL, Fa. Leica Nitrocellulosetransfermembran Protran, Fa. Schleicher & Schuell BioScience Photo-/ Spektrometer UV-160A, Fa. Shimadzu Pipettierhilfe Pipetus-Aktiv, Fa. Hirschmann Proteinextraktionskit NucBuster, Fa. Novagen Schuettler Promax 1040, Fa. Heidolph Streptavidin-Kit µmacs, Fa. Miltenyi Biotec Tischzentrifuge Biofuge 22R, Fa. Heraeus Sepatec Vortex-Genie 2, Fa. Scientific Industries Wasserbad, Fa. GFL Workbench AntairBSK, Fa. Heraeus Zellkulturflasche, 250 ml, Fa. Falcon Antigene Peptide und Proteine Die Synthese sowie eine N-terminale Erweiterung mit einem Spacer (Aminohexan) und die Biotinylierung aller verwendeten Peptide bis hin zur Lyophilisierung erfolgte durch die Fa. Peptides & Elephants. Das Biotin gewährleistet eine starke Bindung zu der mit Streptavidin beschichteten Oberfläche der ELISA Platten. Die Peptide wurden in 8 M Harnstoff aufgelöst (1 mg Peptid / ml) und bis zum Einsatz im ELISA bei -80 C gelagert. Die Veröffentlichung der Sequenzen im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mir von meinem Projektleiter aus patentrechtlichen Gründen nicht gestattet.

22 Material und Methoden 16 hnrnp Peptide Die Peptide der einem Epitopmapping zu unterziehenden hnrnps (-A1, -A2) wurden so hergestellt, dass ihre Sequenzen über einen konstanten Bereich mit denen benachbarter Peptide überlappten. Untersuchung der Eignung potenzieller Markerpeptide für die RA Das zu untersuchende, citrullinierte Peptid P12, und das entsprechende nicht citrullinierte Kontrollpeptid P16, das stattdessen methyliertes Arginin besitzt, sind Bestandteil des hnrnp-a3 und wurden bei vorangegangenen Untersuchungen der selben Arbeitsgruppe als Ziel autoreaktiver AK aus RA Seren in Erscheinung getreten. Abb. 1 zeigt die Strukturformeln beider Aminosäuren. Abb. 1: Strukturformeln von Citrullin (rechts) und methyliertem Arginin der internen Kontrolle (links) bei den Untersuchungen des potenziellen Markerpeptids P12. Das zweite potenzielle Markerpeptid P32, bestehend aus 15 AS, bzw. das 41 AS langes Vorläuferpeptid war bei einem Phagedisplay humaner cdna innerhalb der Arbeitsgruppe im Rahmen einer Diplomarbeit entdeckt worden (Alexander Sternjak, U- niversität Wien 2002) und konnte bisher nicht klar identifiziert werden. weiteren Untersuchungen hatte man festgestellt, dass es eine Bindestelle für AK aus RA Seren besitzt. Das vermutlich lineare Epitop liegt im Bereich der synthetisierten 15 AS des Peptids P32. Positivkontrolle Das Peptid P27-11, ein Fragment des Proteins hnrnp-a3 wurde in Verbindung mit dem Serum eines gegen hnrnp A3 immunisierten Kaninchens als Positivkontrolle beim ELISA eingesetzt Seren Die verwendeten Seren entstammten Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen und aus verschiedenen Instituten. Aber auch Seren Gesunder kamen bei vergleichenden Untersuchungen zum Einsatz.

23 Material und Methoden 17 SLE Seren Es wurden zwölf SLE Seren eingesetzt. Sie waren vom University Medical Centre Ljubliana (Slowenien) zur Verfügung gestellt worden. OA Seren Auch von den OA Seren wurden für diese Arbeit zwölf verwendet. Sie stammten aus dem Institut für Physiologie (Charité). MS Seren Von Dr. Wandinger vom Physiologieinstitut der Charité waren unserer Arbeitsgruppe MS Seren zur Verfügung gestellt worden. Von denjenigen, die bei voran gegangenen Untersuchungen positiv auf rekombinantes hnrnp A1, -A2 oder -A3 reagiert hatten, kamen 17 Seren zum Einsatz. Adulte RA Seren Es wurden bei den Untersuchungen mit erwachsenen RA Patienten Seren unterschiedlicher Herkunft eingesetzt. 24 Patientenseren stammten aus dem Institut für Rheumatologie der Charité, weitere 38 Seren waren von der Rheumaklinik Eisenmoorbad in Bad Liebenwerda zur Verfügung gestellt worden. Kinder RA Seren Die Seren von Kindern mit einer sehr früh auftretenden Form der RA wurden von einer Klinik in den Niederlanden (eine genauere Angabe war leider nicht möglich). Positivkontrolle Das A3 Kaninchenserum der Fa. Seramun Diagnostics GmbH fand als Positivkontrolle im ELISA Verwendung. Es stammte von Kaninchen, die gegen hnrnp-a3 immunisiert worden waren Zelllinien und histologische Gewebsschnitte Die Zelllinien HeLa S3 und Lungencarcinom H 2170 stammten vom Institut für Rheumatologie, Charité. Die histologischen Gewebsschnitte von HEp2 Zellen für die Lokalisierung eines Antigens im humanen Gewebe wurden uns zur Verfügung gestellt von Mitarbeitern der Rheumadiagnostischen Labors der Charité. Sie trugen auch dafür Sorge, dass die Schnitte unter Verwendung eines Einbettmittels auf Objektträger fixiert wurden.

24 Material und Methoden Zellkulturarbeiten Zellkultivierung Für die immunologischen Untersuchungen mit Rheumaseren und hieraus affinitätschromatographisch isolierten, gegen humane Proteine gerichtete Antikörper wurden Krebszelllinien gezüchtet (HeLa S3, Lungencarcinom 2170). Sie lagen zu Beginn meiner Diplomarbeit in flüssigem Stickstoff vor (siehe auch unter Kryokonservierung). Die Kultivierung der adhärenten Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 C und einem CO 2 Partialdruck von 5 %. Das Nährmedium (DMEM) enthielt zusätzlich 5 % hitzeinaktiviertes (30 min bei 56 C) und sterilfiltriertes FKS sowie die Antibiotikakonzentrationen [Pen] = 100 U/ml und [Strep] = 100 µg/ml. Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt Kryokonservierung Für eine Lagerung über sehr lange Zeiträume eignet sich die Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff bei ca C. Ein Einfrieren der kultivierten Zellen war für die Durchführung dieser Arbeiten nicht notwendig, jedoch das Auftauen der Zellen zur Anzucht. Die Kryoröhrchen wurden aus dem flüssigen Stickstoff direkt in ein auf 37 C temperiertes Wasserbad gegeben und vollständig aufgetaut. Es folgte die Aufnahme der Zellen in etwa 10 ml des ebenfalls auf 37 C temperierten Kulturmediums. Nach einer Pelletierung der Zellen bei 100 x g wurden diese erneut in 10 ml Medium aufgenommen und einer Kulturflasche ausgesät. Es erfolgte nach 24 Stunden eine Versorgung der Zellen mit frischem Nährmedium, indem das alte Medium abgesaugt wurde, und nach einer Waschung mit 10 ml PBS und dessen Entfernung 10 ml frisches Medium zugegeben wurde Passagieren Eine Passagierung oder die Ernte der adhärenten Zellen zwecks Gewinnung eines Proteinextraktes (2.2.5) wurde dann durchgeführt, wenn eine annähernd 100 %ige Konfluenz in der Kulturflasche erreicht war. Nach dem Entfernen des Mediums erfolgte zunächst ein Waschschritt mit 10 ml PBS. Anschließend wurde 1ml Trypsin (1 M) zugegeben und auf dem Zell Monolayer durch Schwenken der Kulturflasche verteilt, um die Verbindung der Zellen von der Oberfläche und von einander zu lösen. Ein endgültiges Lösen kam erst durch ein kräftiges Schlagen mit der flachen Hand

25 Material und Methoden 19 gegen die Flaschenseite zustande. Unmittelbar danach wurden 9 ml frisches Medium zugegeben. Für eine Proteinextraktion wurden die Zellen (nach der Entnahme von etwa 30µl für die Zellzahlbestimmung) für 10 Minuten bei 100 x g pelletiert, in ca. 10 ml PBS resuspendiert und gewaschen um erneut wie oben beschrieben pelletiert zu werden. Nach dem Abdekantieren der Waschlösung wurden die Zellen bis zur Proteinextraktion bei -20 C eingefroren. Ansonsten wurden die in 10 ml Nährmedium aufgenommenen Zellen auf mit einem entsprechenden Volumen frischen Mediums versetzte Flaschen so verteilt, dass sich je nach Bedarf Verdünnungen zwischen 1:2 bis 1:5 ergaben. Alle verwendeten Lösungen (Trypsin, PBS, Nährmdium) wurden vor der Verwendung auf 37 C temperiert Zellzahlbestimmung Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde die Neubauer Zählkammer (neu) verwendet. Anhand der Zellenzahl pro Großquadrat (1mm²) kann der Zelltiter mit Hilfe folgender Formel errechnet werden: Zellzahl ml Zellzahl Grossquadrat 4 10 Durch Multiplikation mit dem Volumen, in dem die Zellen aufgenommen worden waren, ergibt sich wiederum die Gesamtzellzahl Zellaufschluss und Proteinextraktion Denaturierende Proteinextraktion Die für einen Western und die anschließende Detektion mit aufgereinigten AK vorgesehene Proteinextraktion wurde mit dem chaotrophen Reagenz Harnstoff durchgeführt, wobei die pelletierten und unter Umständen aufgetauten Zellen in einer möglichst gesättigten Harnstofflösung (8M) aufgenommen wurden. In einem Reaktionsgefäß wurden pro 10 6 Zellen 100 µl eingesetzt. Bei diesem Verfahren wird durch Einlagerung des Reagenzes die Struktur der Zellmembran und der meisten Proteine zerstört. Die Zellfragmente wurden anschließend 10 min bei 1000 x g und abzentrifugiert, der Überstand für eine SDS-PAGE vorbereitet. Native Proteinextraktion

26 Material und Methoden 20 Bei der nativen Extraktion der Proteine kam ein erworbener Kit der Fa. Novagen (NucBuster) zum Einsatz. Er ermöglicht die getrennte Extraktion von Plasma und Kernproteinen für die Weiterverarbeitung in nativer Form. Die Durchführung entsprach im Grunde der Anleitung des Kitherstellers und erfolgte durchweg auf Eis: 100 µl Zellpellet (entspricht etwa 2*10 7 Zellen) wurden in 300 µl Reagenz 1 aufgenommen, 15 s bei maximaler Geschwindigkeit gevortext, 5 min auf Eis gestellt, erneut 15 s gevortext und 5 min lang bei 4 C und Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand (Zytoplasmafraktion) wurde in ein frisches 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Das Pellet mit 2 µl Proteaseinhibitorcocktail, 2 µl DTT und 150 µl Reagenz 2 versetzt und resuspendiert. Es folgten 15 s Vortexen, eine Inkubation auf Eis für 5 min und ein erneutes Vortexen für 15 s. Abweichend vom Protokoll des Herstellers wurde an dieser Stelle eine zusätzlicher mechanischer Aufschluss mit Miccra- D1 der Fa. Art durchgeführt (2 x 10 s bei maximaler Umdrehungszahl), um den Aufschluss zu intensivieren und die DNA zu zerstückeln. Es folgte erneut eine Zentrifugation wie oben beschrieben. Der Überstand, der Kernextrakt, wurde mit dem Plasmaextrakt zusammen geführt und bei -4 C bis zum Einsatz bei der Immunpräzipitation gelagert. 2.3 Proteinbiochemische und Immunologische Methoden SDS PAGE SDS PAGE mit Proteinextrakt Für den Gellauf wurden pro Slot je 15 µl des Proteinextraktes mit 3 µl des 6x Ladepuffers versetzt, 5 min bei 95 C inkubiert und auf neun der zehn Slots aufgetragen. Ein Slot wurde mit 5 µl des BioRad Markers bestückt. Anschließend erfolgte der Gellauf in der wassergekühlten Gelkammer bei 25 ma pro Gel bis die Lauffront das Gel verlassen hatte. Nach dem Gellauf wurde das Gel je nach Bedarf entweder eine halbe Stunde in Coomassie gefärbt und über Nacht in Leitungswasser auf dem Schüttler Promax 1040 entfärbt oder western geblottet.

27 Material und Methoden 21 SDS PAGE mit Immunpräzipitat Mit dem Immunpräzipitat (2.3.8 Immunpräzipitation) wurde beim Gellauf im Grunde ebenso verfahren wie mit dem Proteinextrakt, abgesehen von der Tatsache, dass das Präzipitat nach Abschluss der Präzipitation bereits im Ladepuffer vorlag und gleich aufgetragen werden konnte Westernblot Das Gel wurde nach abgeschlossener SDS PAGE wie in Abb. 1 dargestellt in die mit Tankblotpuffer befüllte Blotkammer eingelegt. Der Lauf dauerte 1 h bei 400 ma, wobei die Kammer wassergekühlt und gerührt wurde. Abb. 1: Westernblot. Aufbau des Westernblots innerhalb der Blotkammer und im angelegten elektrischen Feld (+ und -). Im Anschluss erfolgte eine ca. 5 minütige Ponceau S Behandlung der Blotmembran, die dann so lange mit Leitungswasser gewaschen wurde, bis sich Proteinbanden abzeichneten. Zum Trocknen und zur Lagerung bei 4 C wurden die Blots zwischen Filterpapier gepackt, wo sie bis zur Verwendung im Immunoblot aufbewahrt wurden Immunoblot Der in dünne Streifen geschnittene Westernblot mit dem elektrophoretisch aufgetrennten Proteinextrakt, gewonnen nach der denaturierenden Methode mit Harnstoff und dem mitgeführten Roth Marker wurde zunächst für 1 h geblockt, 2x 5 min in Waschpuffer gewaschen, anschließend entweder in einem 1:25 verdünnten Serum 2 h oder einer affinitätsgereinigten (ohne Beads), 1:2 verdünnten AK Lösung inkubiert, 4x gewaschen, 45 min lang mit 1:1000 verdünntem 2.AKh bedeckt. Nach 5x Waschen erfolgte die Substratbehandlung (500 µl), die unter Beobachtung der sich ausbildenden Banden und durch Abgießen der Substratlösung mit anschließender Inkubation im Waschpuffer abgebrochen wurde. Aufbewahrt wurden alle immunologisch behandelten Blots zwischen Filterpapierlagen und bei 4 C.

28 Material und Methoden Streptavidin ELISA In Mikrotiterplatten Nach einem halbstündigen Blocken und Waschen der mit Streptavidin beschichteten Wells erfolgte 1 h lang die Beladung mit 1:1000 verdünnten, biotinylierten Peptiden und eine erneute Waschung. Die anschließende Inkubation in 1:200 verdünntem Serum dauerte ebenfalls 1 h. Nach dem Waschen und der Beladung mit 1:5000 verdünntem 2AKh (bzw. 2AKr bei mitgeführten Kontrollen) für 1 h gefolgt von einem weiteren Waschschritt wurde das Substrat aufgetragen und nach ausreichender Blaufärbung (Beobachtung der Positivkontrolle, etwa 3-5 min) durch Zugabe einer 0,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte der auftretenden Gelbfärbung wurde am ELISA Reader photometrisch bei einer Messwellenlänge von 450 nm und gegen eine Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen und mit Hilfe Software Magellan dargestellt. Von allen Lösungen wurden pro Well 100 µl aufgetragen. Zur anschließenden Waschung wurden nach jedem ELISA Schritt (abgesehen von der Substratzugabe) 4x 300 µl Waschpuffer pro Well aufgewendet. Kontrollen Tab. 1: ELISA-Kontrollen. Beladungsreihenfolge der beim ELISA mitgeführten Kontrollen: I: Nullabgleich der photometrischen Messung, II: Prüfung auf unspezifische Anlagerung des 2.AKh an die Welloberfläche, III: Prüfung auf unspezifische Bindungen des 2.AKh an in dieser Kombination nicht-antigenes Peptid P27-11, IV: Positivkontrolle, V: Prüfung auf unspezifische Anlagerung des 2.AKr an die Welloberfläche, VI: Prüfung auf unspezifische Bindungen des 2.AKr an in dieser Kombination nicht-antigenes Peptid P27-11, VII: Negativkontrolle der verwendeten Seren; Prüfung auf unspezifische Bindung des Serum- Antikörpers an Welloberfläche. Antigen Antikörper (Serum) 2.AK Kontroll - Ansatz Kontrollpeptid P h r I blank II Akh - Kontrolle III IV Positivkontrolle + + (rabbit) - + V Akr - Kontrolle VI VII Serumkontrolle NC - + (humane Probe) + - An magnetischen Microbeads Der Immunoassay an Microbeads verlief im Grunde analog zum ELISA, jedoch wurde er automatisiert und mit Hilfe eines eigens entwickelten computerunterstützten Prototyps (Fa. Thermolab Systems) des MPI für Molekulare Genetik und unter Betreuung durch die Arbeitsgruppe Dr. Zoltan Konthur durchgeführt.

29 Material und Methoden 23 Es wurden ELISA - Platten mit den entsprechenden Puffern (Waschpuffer, Seren, 2.AK, Substrat) vorgelegt und in den Automaten gesetzt. 2 x 10 µl Beads (Fa. Dynal) pro eingesetztes Serum (Probe + NC) sowie je 10 µl für die Standardkontrollen (Tab. 1, I IV) wurden zunächst in einem Ansatz 1 h geblockt, gewaschen und 1 h lang mit biotinyliertem Peptid (1:1000) beladen. Nach der Waschung wurden die Beads entsprechend der Anzahl an verwendeten Seren und Kontrollen auf die Wells einer ebenfalls zuvor in 5% Milchpulver PBS geblockten E- LISA Platte aufgeteilt. Beim Austausch der Puffer kam ein Magnet (MPC-S, Fa. Dynal) zum Einsatz, der die Beads in Eppendorf Reaktionsgefäßen fixierte. Mit dem Einsetzen der mit Peptid beladenen Platte in den Automaten und dem Start des an die Bedürfnisse angepassten Programms (Tab. 2) setzte der Automatismus ein. Tab. 2: Protokoll des Immunoassays an magnetischen Streptavidinbeads. Die automatisierte Durchführung übernahm ein computergestütztes System, das vom MPI selbst entwickelt worden war. Es übertrug die Beads nach den vorgegebenen Zeiten von MTP zu MTP. Schritt Verdünnung Volumen Dauer Serum 1: µl 1 h 4x Waschen µl 4x 5 min 2. AK 1: µl 1 h 4x Waschen µl 4x 5 min Substrat µl 5 min Nach Abschluss der Programms wurden per Hand in jedes Well 100 µl Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) gegeben und die Bestimmung der optischen Dichte bei 450 nm am ELISA Reader der Arbeitsgruppe Konthur (MPI) durchgeführt. Da der Automat Volumen von mindestens 200 µl pro Well benötigt, wurden der Verdünnungsfaktor der AK und 2.AK im Vergleich zum Strepdavidin ELISA verdoppelt, andererseits jedoch das doppelte Volumen aufgetragen, um die gleiche AK Menge pro Well zu erhalten Citrullinierung von Peptiden Die Citrullinierung (Deiminierung der Peptidylarginine) eines (biotinylierten) Peptids fand im Zuge eines ELISA Durchgangs (2.3.4) statt. Nach der Beladung eines Wells mit Peptid und der anschließenden Waschung wurde es über Nacht und auf einem Schüttler bei 37 C in 100 µl PAD haltigem PAD Puffer A (0,5 µg PAD pro ml) inkubiert und ebenfalls vier mal mit Waschpuffer gewaschen um dann mit verdünntem Serum bedeckt zu werden. Die weitere Behandlung wich nicht vom ELISA Protokoll ab. Parallel wurde unter Verwendung von PAD Puffer B mit derselben PAD - Kon-