Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef Hospital -Universitätsklinik- Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C.

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1 Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef Hospital -Universitätsklinik- Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger Synthese von IL-10 und IFN-γ in T-Helferzellen nach Stimulation mit β-laktoglobulin in Abhängigkeit von einer allergischen Sensibilisierung am Ende des ersten Lebensjahres Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Andrea Rinke aus Bochum 2001

2 Abstract Rinke, Andrea Synthese von IL-10 und IFN-γ in T-Helferzellen nach Stimulation mit β- Laktoglobulin in Abhängigkeit von einer allergischen Sensibilisierung am Ende des ersten Lebensjahres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die kindlichen Immunantworten nach spezifischer Antigen/Allergen Stimulation zum Zeitpunkt der Geburt, sechs Wochen, sechs Monate und zwölf Monate postnatal zu untersuchen. Es sollte in erster Linie der Frage nachgegangen werden, ob Differenzen in den Immunreaktionen zwischen Kindern mit einer atopischen Erkrankung (mit spezifischem IgE gegen Nahrungs- und Inhalationsallergene im Alter von einem Jahr) und solchen ohne ein atopisches Beschwerdebild (ohne spezifisches IgE) bestehen. Nach 72stündiger Inkubation der mononukleären Zellen mit β-laktoglobulin wurde die intrazelluläre IFN-γ und IL-10 Synthese auf Einzelzellniveau mit Hilfe eines Durchflußzytometers gemessen. Durch Anfärbung von speziellen Oberflächenantigenen gelang simultan eine Unterteilung in naive (CD4 CD45RA+) und Memory T-Helferzellen (CD4 CD45R0+). Es zeigte sich, daß Säuglinge mit spezifischem IgE im Alter von zwölf Monaten bereits im Nabelschnurblut nach β-laktoglobulin Stimulation signifikant mehr IL-10 positive Memory T-Zellen aufwiesen als die Kontrollgruppenkinder. Atopische Kinder lassen sich somit schon bei Geburt anhand ihres Zytokinprofiles (signifikant mehr IL-10 positive Memory T-Helferzellen) von den nicht-atopischen Kindern unterscheiden. Das bei den allergisch sensibilisierten Kindern aberrierende Zytokinmuster ist außerdem bereits vor der Krankheitsmanifestation präsent und daher nicht als Folge der Erkrankung sondern als deren Ursache anzusehen. Des weiteren weist die Differenzierung der neonatalen Helferzellen in Memory T-Zellen nach Stimulation mit dem Milcheiweiß β- Laktoglobulin darauf hin, daß bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine Sensibilisierung gegen Nahrungsallergene besteht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte kein direkter Zusammenhang zwischen einer prä- und postnatalen Tabakrauchexposition oder einem gehobenen sozialen Umfeld und der Manifestation einer allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr aufgezeigt werden. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, daß sich eine kuhmilchfreie Ernährung während des ersten Lebensjahres bei Allergierisiko-Kindern atopieprotektiv auswirkt. 2

3 Dekan: Referent: Prof. Dr. med. G. Muhr PD Dr. med. U. Schauer Korreferent: Tag der Mündlichen Prüfung: 3

4 Inhaltsverzeichnis 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 7 2 Einleitung Gegenwart und historische Hintergründe Die Pathogenese allergischer Erkrankungen T-regulatorische Zellen und ihre Bedeutung für immunpathologische Prozesse Nahrungsmittelallergien bei Kindern und Milcheiweiß als Allergen Die Struktur der verschiedenen Milchproteine und ihre allergene Potenz Fragestellungen 17 3 Probanden und Methoden Studienkonzept Probanden Festlegung des Atopierisikos Messung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes Bestimmung der spezifischen IgE-Werte Gewinnung und Aufarbeitung des Blutes Zytokin-Stimulation mit Laktoglobulin Darstellung der Oberflächenantigene und der intrazellulären Zytokine Färbung Bestimmung der Anzahl der CD4- und CD3-positiven T-Zellen Durchflußzytometrische Messung Statistik Herstellernachweis 29 4 Ergebnisse Spezifische IgE-Antikörper im Alter von einem Jahr Anzahl der CD4-positiven T-Zellen 32 4

5 4.3 Anzahl der CD3-positiven T-Zellen Anteil an CD45RA+ (naiven) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen Anteil an CD45R0+ (Memory) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen Messung von naiven und Memory T-Zellen ohne eine Stimulation IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach Stimulation mit β-laktoglobulin im Vergleich zwischen Kindern mit und ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr IFN-γ Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-laktoglobulin-stimulation im Vergleich zwischen Kindern mit und ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr Anteil IL-10 produzierender CD45RA-positiver (naiver) T-Zellen nach Stimulation mit dem spezifischen Antigen β-laktoglobulin im Vergleich zwischen allergisch sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kindern Anteil IFN-γ synthetisierender CD45RA-positiver T-Zellen nach β-laktoglobulin- Stimulation im Vergleich zwischen allergisch sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kindern IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-laktoglobulin-stimulation bei Kindern mit und ohne ein Allergierisiko Spezifisches IgE gegen inhalative und Nahrungsmittelallergene im Alter von einem Jahr in Korrelation mit unterschiedlichen Risikofaktoren Stillen und Beginn der Kuhmilchfütterung 45 5 Diskussion 46 6 Zusammenfassung 76 7 Dokumentationsbogen über Anamnese und Untersuchungsbefund Allgemein Anamnese der Mutter Allergieanamnese Sonstige Erkrankungen 81 5

6 7.2.3 Ernährungsgewohnheiten Rauchgewohnheiten Familienanamnese der Mutter Anamnese des Vaters Geschwisteranamnese Wohnung der Familie Schwangerschaftsanamnese Geburtsanamnese Vorsorgeuntersuchung des Kindes Bestimmung des Symptomscores der Haut für atopische Dermatitis nach SCORAD Ausdehnung (A) Intensität (B) Symptomatik (C) Berechnung des individuellen Schweregrades der atopischen Dermatitis 86 8 Abbildungsverzeichnis 87 9 Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis 89 6

7 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen CD DC FACS FITC FSC G-CSF GM-CSF HBSS HEPES IFN-γ Ig IL MAS MHC NK-Zellen PE PMT SSC TGF-β Th-Zelle TNF-α Tr1-Zellen Treg-Zellen Cluster of differentiation Dendritic cells Fluorescence activated cell sorter Fluoresceinisothiocyanat Forward light scatter Granulocyte colony-stimulating factor Granulocyte-makrophage colony-stimulating factor Hanks balanced salts solution Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure Interferon-gamma Immunglobulin Interleukin Multizentrische Atopiestudie Major histocompatibility complex Natural-Killer-Zellen Phycoerythrin Photomultiplier Sideward light scatter Transforming growth factor beta T-Helferzelle Tumor necrosis factor alpha T-regulatorische Zellen Subtyp 1 T-regulatorische Zellen 7

8 2 Einleitung 2.1 Gegenwart und historische Hintergründe Atopische Erkrankungen, zu denen die endogene Dermatitis, das allergische Asthma bronchiale, die Rhinitis allergica und die IgE-vermittelte Urtikaria zählen, gehören mit einer Prävalenz von bis zu 20% zu den häufigen Krankheitsbildern in der heutigen Gesellschaft. Sie führen nicht nur zu einer starken Belastung für die Betroffenen selbst -vor allem wenn es sich um Säuglinge oder Kleinkinder handelt- sondern stellen auch eine große familiäre Herausforderung und zudem einen nicht unerheblichen sozioökonomischen Kostenfaktor dar [1]. Allein diese Tatsachen, aber ebenso die zunehmende Häufigkeit der Atopien rechtfertigen die zahlreichen Studien auf diesem Gebiet. Das Wort Atopie stammt aus dem Griechischen und bedeutet Ungewöhnlichkeit, Seltsamkeit. Heute versteht man unter dem Begriff Atopie eine zusammenfassende Bezeichnung für die klinische Manifestation einer Überempfindlichkeitsreaktion vom anaphylaktischen Typ (Typ I der Allergie nach Coombs und Gell). Es handelt sich dabei um eine Sofortreaktion, die durch den Kontakt zwischen einem bestimmten Antigen und IgE hervorgerufen wird. Die atopische Dermatitis ist in vielen Fällen die erste klinische Manifestation einer bestehenden Atopie. Häufig findet sich auch die Vergesellschaftung mit einer Nahrungsmittelallergie. Retrospektive Studien konnten zeigen, daß Patienten, welche an allergischer Rhinitis oder allergischem Asthma erkrankt sind, als Kleinkind meist unter einer Kuhmilchproteinallergie litten. Rückblickend finden sich erstmals in Aufzeichnungen des Hippokrates von vor mehr als 2360 Jahren Hinweise auf das Vorliegen einer Kuhmilchproteinallergie. Dieser hatte beobachtet, daß der Genuß von Kuhmilch zu Magenbeschwerden und eigentümlichen Hauterscheinungen führen kann [2]. 500 Jahre später beschrieb Galen einen Fall von Milchallergie [3]. Zu Beginn dieses Jahrhunderts erschienen dann auch in der deutschen Literatur Berichte über Symptome wie Diarrhoe und Gedeihstörungen in Zusammenhang mit den Eiweißkörpern der Milch [4; 5]. Finkelstein publizierte 1905 den ersten Fall von anaphylaktischem Schock mit Todesfolge aufgrund einer Kuhmilchingestion [6]. Bis Mitte 8

9 des Jahrhunderts wurden jedoch nur vereinzelte Fälle von Kuhmilchproteinallergien beschrieben [7], so daß man annahm, daß es sich um eine eher seltene Erkrankung handele. In den darauffolgenden Jahren schien die Inzidenz dann aber gerade in den Industrieländern zuzunehmen [8; 9]. Dies erklärte man sich zum Teil durch einen Rückgang des Stillens bei gleichzeitiger Zunahme der Säuglingsernährung mit Produkten auf Kuhmilchbasis. Bis heute folgten zahlreiche Arbeiten auf diesem Gebiet, die partiell zum Verstehen der Zusammenhänge beigetragen haben. Viele Sachverhalte bedürfen aber auch zum jetzigen Zeitpunkt noch einer Klärung, wie z.b. das komplizierte Zusammenspiel der einzelnen Zytokine in pathologischen Immunantworten oder die Gewichtung der verschiedenen Umweltfaktoren bei der Entstehung der atopischen Krankheitsbilder. 2.2 Die Pathogenese allergischer Erkrankungen Das Wort ALLERGIE setzt sich ursprünglich aus den griechischen Wörtern allos (anders) und ergon (Verrichtung) zusammen. Dies weist darauf hin, daß man bereits vor hunderten von Jahren erkannt hatte, daß es bei diesem Krankheitsbild zu einer Abweichung von den regelhaften Reaktionen der körpereigenen Abwehrzellen auf Fremdstoffe aus der Umwelt kommt. Es handelt sich bei den allergischen Reaktionen um eine gesteigerte, hypererge Antwort des erworbenen Immunsystems auf ein Antigen bzw. Allergen, welche nach erneutem Allergenkontakt mit dem Auftreten bestimmter Krankheitserscheinungen verbunden ist. Dabei kommt es zu lokalen Entzündungsreaktionen, die durch die Freisetzung von Mediatoren nach Bindung des Allergens an spezifische Immunglobulin E Antikörper verursacht werden. Die Mediatoren, welche aus Granula von Mastzellen freigegeben werden, sind vor allem Histamin, Heparin, Eosinophilen- und Neutrophilenchemotaktische Faktoren und Thrombozyten-aktivierender Faktor. Bei massivem Auftreten dieser Botenstoffe, wie bei einer Atopie, kommt es zur Bronchokonstriktion und Vasodilatation. Beim ersten Kontakt zwischen einem Antigen und den B-Lymphozyten findet die Aktivierung der B-Zellen statt, die zunächst zur Synthese von IgM führt. Erst bei einer wiederholten Antigen-Exposition werden Immunglobuline der Subklassen G oder E produziert. Ob nun die Weichen in Richtung der IgG- oder IgE-Synthese gestellt werden, 9

10 hängt vom Zytokinmilieu und den zytokinproduzierenden T-Zellen ab. Es konnte zunächst bei Mäusen nachgewiesen werden, daß Interferon-gamma (IFN-γ) die Synthese von IgG 2 stimuliert, während es andererseits die Proliferation von B-Zellen hemmt, welche IgG 1, IgG 3 und IgE sezernieren. Im Gegensatz dazu fördert Interleukin 4 (IL-4) den switch zur Bildung von IgE und IgG 1, während die Produktion von IgG 2, IgG 3 und IgM unterdrückt wird [10]. IFN-γ besitzt folglich eher allergieprotektive Wirkungen, wohingegen IL-4 die Entstehung von Allergien bzw. Atopien fördert. Jedoch sind IFN-γ und IL-4 nicht die einzigen Zytokine, welche die Immunreaktionen beeinflussen und in bestimmte Bahnen lenken. Ein anderes Zytokin, welches ebenfalls eine bedeutende Rolle zu spielen scheint, ist das IL-10. Es besitzt z.t. dem IL-4 ähnliche Wirkungen: unter seinem Einfluß kommt es zu einer Hemmung der Proliferation der Th1- Zellen und deren Zytokinfreisetzung. Die Zytokine, welche die Stärke und Dauer der Immunreaktionen steuern, werden vor allem von T-Lymphozyten, in geringerem Ausmaß auch von Makrophagen, produziert. Mosmann und Coffman nahmen 1986 erstmals im murinen System eine Einteilung der T- Helferzellen in Th1- und Th2-Zellen, basierend auf ihrem unterschiedlichen Zytokinprofil, vor: Th1-Zellen produzieren vor allem IFN-γ und IL-2, Th2-Zellen hingegen IL-4, IL-5 und IL- 6 [11-14]. Beide Subklassen sind in der Lage, sich gegenseitig zu hemmen. So unterdrückt IFN-γ die Ausdifferenzierung der T-Zellen zu Th2-Zellen, fördert jedoch die Reifung zu Th1-Zellen [15]. Umgekehrt ist IL-4 notwendig für die Entwicklung von Th2-Zellen, während es die Th1-Zelldifferenzierung hemmt [16-18]. Auch in ihren Funktionen und Eigenschaften verhalten sich beide Untergruppen gegensätzlich: die Th1-Zellen bewirken eine Makrophagenaktivierung, eine Sensibilisierung vom verzögerten Typ und die Synthese von IgG 2a, die Th2-Zellen hingegen führen zu einer vermehrten IgG 1 und IgE Synthese durch B-Zellen [19]. Studien an Mäusen zeigten außerdem, daß es noch eine weitere T-Zellsubpopulation gibt, welche ein intermediäres Zytokinmuster mit Th1- und Th2-typischen Zytokinen zu produzieren vermag: die Th0-Zellen. Diese Helferzellen herrschen in der frühen Phase nach Antigen-Kontakt vor. Dauert die Antigen-Exposition im weiteren an, stellt sich die Proliferation der Th1- und Th2-Zellen ein. Dies läßt vermuten, daß sich die Th1- und Th2-Effektorzellen aus den Th0-Zellen entwickeln [20]. 10

11 Diese Unterteilung der T-Helferzellen in die Th1- und Th2-Subpopulationen ist beim Menschen nicht so streng und absolut zu sehen wie im Mausmodell, da es keine derart strikte Trennung der Zytokinproduktion zu geben scheint [21]. Grundsätzlich gilt jedoch auch für die humanen T-Zellen, daß die Th1-Zellen atopieprotektiv, die Th2-Zellen atopiefördernd wirken. Die T-Helferzellen können aufgrund von unterschiedlichen Isoformen des Leukozytenoberflächen-Antigens CD45 in naive (CD4+ CD45RA+) und Memory (CD4+ CD45R0+) T-Zellen differenziert werden. Die naiven Helferzellen produzieren nach ihrer Aktivierung IL-2 und in kleinsten Mengen auch IL-10 [22]. Erst nach ihrer Ausreifung zu Memory Zellen sollen sie die Fähigkeit besitzen, zusätzlich noch andere Zytokine, wie z.b. IL-4, IL-5, IFN-γ zu synthetisieren [22-24]. IL-2 wird von den reifen Memory Zellen nur noch in geringen Mengen produziert. Bei den menschlichen neonatalen CD4 T-Zellen handelt es sich zunächst fast ausschließlich um naive Zellen (zu etwa 90%). Diese besitzen funktionell betrachtet auch noch keine Helferaktivität, sie sind aber in der Lage, CD8 Suppressor-Zellen zu induzieren. Memory T-Zellen finden sich bei Neugeboreren nur in geringer Anzahl, da sie erst nach Antigenstimulation heranreifen. Sie nehmen jedoch im Laufe des Lebens stetig an Zahl zu und ersetzen allmählich die naiven T-Zellen, bis sie während der Pubertät ein Plateau erreichen. Die Entwicklung von naiven T-Zellen in entweder Th1- oder Th2-Zellen hängt von verschiedenen Faktoren zum Zeitpunkt der T-Zell-Ausdifferenzierung ab. Eine vorherrschende Rolle spielt dabei das Zytokinmilieu [25]: IL-4 bewirkt vor allem einen Anstieg der Th2-spezifischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 und führt somit in eine eher allergiefördernde Richtung. Überwiegt während der Prägung hingegen das Zytokin IL-2, kommt es zwar auch zu einer Zunahme der Zytokinproduktion, jedoch sowohl bei den Th1- als auch Th2-typischen Botenstoffen. In der vorliegenden Arbeit wurde nun als Th1 typisches Zytokin das IFN-γ untersucht. Die genaue Rolle des IL-10 bei der Regulation von Immunantworten, und damit die Frage, ob es sich tatsächlich um ein atopiebegünstigendes, Th2 gewichtetes Zytokin handelt, sollte mit Hilfe dieser Studie erst noch weiter untersucht werden. 11

12 2.3 T-regulatorische Zellen und ihre Bedeutung für immunpathologische Prozesse In den letzten Jahren hat das Interesse an Zellen zugenommen, welche maßgeblich an der Suppression pathologischer Immunantworten beteiligt sind. Es handelt sich hierbei um sogenannte T-regulatorische Zellen (Treg-Zellen), zu denen unter anderem CD4+CD25+ T-Zellen, Tr1- und anergische Zellen zählen [26-29]. Man nimmt an, daß diese Zellen die Fähigkeit besitzen, Immunreaktionen sowohl gegen Allo- als auch Autoantigene zu unterdrücken [29-31]. Zunächst gelang es in Tiermodellen, die Ausbildung von Autoimmunkrankheiten durch den Transfer von peripheren CD4+ T-Zellen gesunder Spendertiere zu inhibieren. Bei Mäusen konnte auf diesem Wege bereits die Manifestation von autoimmunbedingtem Diabetes mellitus [32] und Colitis [31] verhindert werden. Ein Merkmal zur Identifikation der T-regulatorischen Zellen unter den übrigen T-Zellen scheint das CD25-Oberflächenantigen zu sein. Es bleibt jedoch anzumerken, daß nicht alle CD4+ Treg-Zellen das CD25-Antigen exprimieren [32]. Außerdem kann anhand dieses Markers nicht zwischen regulatorischen Zellen und aktivierten Effektorzellen differenziert werden. Die Zuordnung von T-Zellen zum Treg-Zellpool allein anhand einer phänotypischen Analyse der Zellen erscheint daher nicht sinnvoll. Vielmehr könnten zusätzliche Zytokinbestimmungen ein weiteres Charakteristikum offerieren, da bekannt ist, daß beispielsweise Treg-Zellen vom Subtyp 1 (Tr1) große Mengen an IL-10 und Transforming growth factor-beta (TGF-β) produzieren [30; 33]. Im Mausmodell werden natürlich bzw. permanent vorkommende (CD4+CD25+) von den induzierten Treg-Zellen (z. B. Tr1) unterschieden, welche erst nach wiederholter Antigenstimulation in Anwesenheit von IL-10 aus naiven CD4+ Zellen heranreifen [31]. Diese Zellen produzieren nach erneuter Stimulation in großen Mengen IL-10 und sind in der Lage, Th1- und Th2- Immunantworten zu inhibieren. Die bisher bekannten Eigenschaften der regulatorischen T-Zellen deuten auf ihre bedeutende Rolle bei der Kontrolle von Immunantworten hin. Wenn es gelingen sollte, ihre Wirkungsmechanismen exakter zu analysieren und die Zellen Antigen-spezifisch zu synthetisieren, könnten diese Zellen in Zukunft vielleicht auch beim Menschen für zelluläre Therapien immunologischer Erkrankungen genutzt werden. 12

13 2.4 Nahrungsmittelallergien bei Kindern und Milcheiweiß als Allergen Die Entstehung von Nahrungsmittelallergien hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem von der genetischen Disposition und von variablen Umweltbedingungen, ab. Es existieren mannigfaltige Hypothesen zur Ätiologie der Sensibilisierung gegen diese Allergene, zu denen bei Kindern vor allem Hühnereiweiß (Ovalbumin) und Kuhmilcheiweiß (Casein, β-laktoglobulin) und in den folgenden Jahren auch Nüsse und Fisch zählen: diskutiert werden unter anderem die Rolle der Darmflora, Zytokine in der Muttermilch und unterschiedliche Hygieneverhältnisse. Auf der immunzellulären Ebene scheinen zwei Mechanismen von essentieller Bedeutung zu sein: einerseits die Freisetzung von Th2-typischen Zytokinen [34], andererseits der Aktivationsgrad der involvierten T- Zellen [35]. Während der ersten Lebenswochen und monate werden die Neugeborene ständig mit einem großen Pool unterschiedlichster Antigene konfrontriert. Hierunter sind Kuhmilchproteine in der Regel die ersten oralen Allergene, denen Neugeborene entweder direkt nach der Geburt oder nach Beendigung des Stillens ausgesetzt sind. Es wird angenommen, daß gerade dieser erste Kontakt des Immunsystems des Neugeborenen bzw. Säuglings mit den Allergenen in der Milch (zusammen mit anderen Faktoren) entscheidend ist für eine mögliche spätere Entwicklung allergischer Erkrankungen bei atopiegefährdeten Kindern. Von großer Bedeutung sind in diesem Kontext die sowohl qualitativen als auch quantitativen Differenzen in der Zusammensetzung der Mutter- im Vergleich zur Kuhmilch. So besitzt die Kuhmilch einen etwa dreifach höheren Proteingehalt (ca. 33g/l versus ca. 11g/l) und sechsmal mehr Casein (ca. 25g/l versus ca. 4g/l) als die menschliche Milch [36]. Laktoglobulin, eines der Hauptallergene der Milch, findet sich nur in der Kuhmilch, nicht in der menschlichen Milch. Während der größte Eiweißanteil der Muttermilch auf die Molkeproteine, hierunter v. a. das Lactalbumin, entfällt, stellt das Casein in der bovinen Milch den Hauptanteil dar. Obwohl der Proteingehalt der Muttermilch während der späten Schwangerschaft und kurz nach der Geburt leicht zunimmt (auf ca. 1,5%), erreicht er nicht die Hälfte des Eiweißgehaltes der Kuhmilch. Die jährliche Inzidenzrate der Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene liegt im ersten Lebensjahr bei etwa 10% und fällt dann bis zum 6. Lebensjahr auf ca. 3% ab [37]. In den ersten zwölf Lebensmonaten herrschen bei den allergischen Kindern 13

14 gastrointestinale Symptome sowie Hautveränderungen im Sinne einer atopischen Dermatitis vor. Die Sensibilisierung gegen inhalative Allergene nimmt hingegen erst mit dem Alter zu (von einer Inzidenz von 1,5% im Alter von einem Jahr auf 8% mit sechs Jahren), so daß bei Kindern ab einem Alter von etwa vier Jahren das allergische Asthma unter den Atopien überwiegt. Bei einer manifesten Milcheiweißallergie entwickeln die betroffenen Säuglinge die Symptome meist innerhalb des ersten Lebensmonates, oft sogar schon eine Woche nach Beginn der Kuhmilchfütterung bzw. der Gabe von auf Kuhmilch basierender Säuglingsfertignahrung. Ein Auftreten der Erkrankung nach dem 12. Lebensmonat gilt als äußerst selten. Die Symptome beschränken sich auf drei Organsysteme, wobei in der Mehrheit mindestens zwei davon betroffen sind: in etwa 50-70% bestehen Symptome an der Haut (atopische Dermatitis; Urtikaria), in etwa 50-60% gastrointestinale (Erbrechen; Diarrhoe) und in etwa 20-30% respiratorische Symptome (rezidivierende Rhinitiden; asthmoide Bronchitiden). Die Anamneseerhebung und Untersuchung der Studienkinder erfolgte daher unter besonderer Berücksichtigung der oben genannten Beschwerden (s. Anamneseerhebungsbogen im Anhang). Bisher ging man davon aus, daß das Vorliegen von spezifischem IgE zunächst gegen Hühnereiweiß, gefolgt von spezifischem IgE gegen Milcheiweiß der früheste verläßliche serologische Marker ist, welcher auf eine atopische Immunlage in der Kindheit hinweist [37]. In Kenntnis dieser Tatsache wurde in der vorliegenden Studie am Ende des ersten Lebensjahres das spezifische IgE gegen Hühner- und Milcheiweiß, Fischeiweiß sowie unterschiedliche Inhalationsallergene als primären Hinweis auf eine atopische Erkrankung bestimmt. Obwohl sich die allergischen Reaktionen auf Milchproteine und Ei häufig (in etwa 80% der Fälle) innerhalb der ersten drei bis fünf Lebensjahre zurückbilden [38], besitzen sie trotzdem für die betroffenen Säuglinge eine weitere klinische Relevanz. Wie jüngere Arbeiten zeigen konnten, besteht bei Kindern mit einer Nahrungsmittelallergie in der frühen Kindheit ein deutlich erhöhtes Risiko, in den folgenden Jahren an allergischer Rhinitis, atopischer Dermatitis und/ oder allergischem Asthma zu erkranken [39; 40]. 14

15 2.5 Die Struktur der verschiedenen Milchproteine und ihre allergene Potenz Für das Auftreten von Milchallergien lassen sich mehrere Proteine (α-laktalbumin, β- Laktoglobulin, Casein, Lactoferrin etc.) verantwortlich machen. Die unterschiedlichen Eiweißvarianten sind durch den punktuellen Ersatz von einzelnen Aminosäuren, den Verlust von Peptidfragmenten und durch posttranslationale Modifizierungen, w. z. B. Glykosylierungen oder Phosphorylierungen, hervorgerufen. Für die Auslösung der Allergie kann keine einheitliche, immer wiederkehrende Molekülstruktur verantwortlich gemacht werden. Vielmehr scheinen einzelne, kurze Peptidabschnitte mit nur Aminosäuren einen entscheidenden Part für die Allergenität des Proteins zu spielen [41]. Entlang des Eiweißmoleküls befinden sich nun unterschiedliche Epitope. Diese können in hydrophoben Bereichen liegen, wo sie für IgE-Antikörper zunächst unerreichbar sind. Zum Teil kann daher erst nach digestiven Prozessen eine Verbindung zwischen dem Epitop und dem Antikörper eingegangen werden [41]. Eine Arbeit von Jarvinen et al., welche mit Patienten mit und ohne eine persistierende Kuhmilchallergie durchgeführt wurde, konnte zeigen, daß es eine unterschiedliche Anzahl an strukturellen Epitopen für IgE- und IgG- Antikörper auf Milchproteinen gibt. Auf α-laktalbumin konnten vier IgE- und drei IgG- Bindungsregionen identifiziert werden. Das β-laktoglobulin wies sieben IgE- und sechs IgG-spezifische Epitope auf [42]. Es ist anzunehmen, daß eine Verbindung zwischen dem Erkennen bestimmter Epitope und der Manifestation einer Kuhmilchallergie besteht. Die mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes reagieren nicht auf jedes der verschiedenen Milchproteine in gleicher Weise. Es konnte gezeigt werden, daß sie eine höhere Proliferationsrate nach Stimulation mit α-laktalbumin, β-laktoglobulin und α- Casein entwickeln als nach einer Stimulation mit β-casein, κ-casein und bovinem Serumalbumin [43]. Der Grund hierfür könnte in den unterschiedlichen biochemischen und strukturellen Eigenschaften dieser Eiweiße begründet sein. Während es sich bei β- Laktoglobulin um ein lösliches Molkeprotein mit einer Aminosäuresequenz von 57 handelt, zählt Casein (α-s1-casein: 51 Aminosäuren, β-casein: 146 Aminosäuren, λ- Casein: 53 Aminosäuren) [44-46] zu den nicht löslichen Proteinen. Außerdem scheint der ph-wert eine wichtige Rolle für die Gestalt der Eiweiße zu spielen. Dies soll am Beispiel des β-laktoglobulin genauer erläutert werden: bei einem ph-wert 15

16 von 7 (ph der Milch zwischen 6,5 und 6,9) liegt β-laktoglobulin als Dimer vor, während es bei einem ph-wert von 2, 3 und 9 seine monomere Struktur beibehält [47-49]. Die Transition des Moleküls vom Dimer zum Monomer ist mit einer Abnahme des Volumens und gleichzeitig einer Zunahme der Hydratation verbunden [49]. Insgesamt sind allein beim β-laktoglobulin sechs verschiedene Strukturzustände bekannt, welche mit dem ph- Wert wechseln [49]. Es kann angenommen werden, daß diese strukturellen Unterschiede auch bei den anderen Milchproteinen auftreten. Letztendlich bleibt weiterhin zu klären, welche morphologischen Charakteristika für die allergische Potenz des jeweiligen Antigens von Bedeutung sind. In dieser Arbeit wurde nun stellvertretend für die übrigen Allergene der Milch β- Laktoglobulin als Immunstimulans für die kindlichen T-Helferzellen ausgewählt. 16

17 2.6 Fragestellungen Daß die Prävalenz atopischer Erkrankungen und damit auch ihre Bedeutung für das Gesundheitssystem stetig zunimmt, konnten bereits zahlreiche Arbeiten auf diesem Gebiet zeigen. Leider ist es bisher noch nicht gelungen, das komplizierte Gefüge der immunregulatorischen Vorgänge vollständig zu analysieren und zu verstehen, so daß nur eingeschränkt präventive Maßnahmen zur Verfügung stehen. Gelänge es, bereits zu einem frühen Zeitpunkt, wie zum Beispiel direkt nach der Geburt, Kinder mit einer sich später manifestierenden Atopie zu identifizieren, so wäre es möglich, diese betroffenen Neugeborenen frühzeitig einer optimalen Behandlung zuzuführen. Als sicher gilt zum jetzigen Zeitpunkt, daß gerade die ersten Lebenswochen und -monate für die Etablierung einer entweder allergiefördernden oder -hemmenden Immunlage von großer Bedeutung sind. Zunehmend steht auch die Rolle von Zytokinen und den sogenannten T-regulatorischen Zellen als Immunmodulatoren im wissenschaftlichen Interesse. In der vorliegenden Studie sollte daher folgenden Fragestellungen nachgegangen werden: Gibt es Unterschiede in der Zytokinproduktion zwischen Kindern mit einer allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr und Kindern ohne eine Sensibilisierung? Zu welchem Zeitpunkt lassen sich eventuelle Differenzen verifizieren? Findet sich eine unterschiedliche T-Zellausreifung bei Kindern mit einer Atopie im Vergleich zu Kindern ohne eine derartige Erkrankung? Wie reagieren die naiven und die Memory T-Zellen auf eine Stimulation mit dem Milcheiweiß β-laktoglobulin? Welche Rolle spielen IFN-γ und IL-10 in der Entwicklung von atopischen Krankheiten? Könnte IL-10 ein Marker für T-regulatorische Zellen sein? Welche Faktoren haben Einfluß auf die Manifestation einer allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr und damit auf die Entstehung einer atopischen Erkrankung? 17

18 3 Probanden und Methoden 3.1 Studienkonzept Bei der durchgeführten Studie handelt es sich um eine prospektive Untersuchung von der Geburt bis zur Vollendung des ersten Lebensjahres. Ziel war es, die Zytokinsynthese und die Entwicklung der T-Helferzellen bei Kindern mit spezifischem IgE mit einem Lebensjahr und solchen ohne IgE sowie bei Säuglingen mit Atopierisiko und ohne Atopierisiko über ein Jahr zu vergleichen. Die Zuteilung zur Atopierisikogruppe konnte bereits kurz nach der Geburt (nach Bestimmung des Nabelschnur IgE-Wertes und Erhebung der Familienanamnese) erfolgen. Die Zuordnung zur Gruppe mit allergischer Sensibilisierung und ohne Sensibilisierung wurde nach Vollendung des ersten Lebensjahres vorgenommen. 3.2 Probanden Die Nabelschnurblutproben stammen von Neugeborenen, die in einem Zeitraum von fünf Monaten (von September bis Januar) in der Augusta-Krankenanstalt und im St. Elisabeth- Hospital in Bochum geboren wurden. Weitere Blutentnahmen sowie eine vollständige körperliche Untersuchung und Anamneseerhebung (s. Anhang) erfolgten sechs Wochen, sechs Monate und zwölf Monate post partum. Vor Beginn der Studie wurden zwei Monate lang Voruntersuchungen zur Optimierung der Meß- und Kulturbedingungen durchgeführt. Die Studie erfolgte dann im weiteren an einem Kollektiv von 52 Neugeborenen. Als Ausschlußkriterien galten Komplikationen während der Schwangerschaft und der Geburt, chronische Erkrankungen der Schwangeren sowie Frühgeburtlichkeit. Es sollten so mögliche Defekte und Transformierungen des kindlichen Immunsystems weitestgehend ausgeschlossen werden. Die Eltern der Neugeborenen wurden mündlich und anhand eines Informationsbogens über die Art der Durchführung und die Zielsetzung der Arbeit aufgeklärt. Erst nach Vorliegen der schriftlichen Einwilligung der Eltern wurden die Kinder in die Studie aufgenommen. 18

19 Folgende anamnestische Daten wurden nach der Geburt und während des ersten Lebensjahres erhoben: 1. Zum Zeitpunkt der Geburt wurden folgende Daten dokumentiert: Schwangerschaftsdauer und -verlauf Ernährung und Medikamenteneinnahme der Mütter während der Schwangerschaft Geschlecht des Kindes Geburtsgröße und Geburtsgewicht Geburtskomplikationen Elternanamnese in Bezug auf allergische Symptome und andere Erkrankungen Familienanamnese in Bezug auf Allergien (Geschwister des Studienkindes sowie Großeltern) Umgebungsanamnese, Wohnumfeld und sozialer Status der Familie 2. Bei den Kontrolluntersuchungen der Studienkinder im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr wurden folgende Daten ermittelt: Auftreten und Dauer und ggf. erforderliche Therapie der folgenden Symptome: Erbrechen, Durchfall, Koliken, Hautrötungen, Ekzeme, Urtikaria, Juckreiz, Husten, bronchiale Obstruktion, Atemnot, Schlafstörungen, Rhinitis, Niesattacken und Konjunktivitis Dauer des ausschließlichen Stillens, Dauer des teilweisen Stillens, Ernährung der Mutter während des Stillens Zeitpunkt der Umstellung auf Fertigmilchen mit ggf. dem Zeitpunkt des Wechsels von hypoallergener Milch zu normalen Kuhmilchprodukten Zeitpunkt der Zufütterung weiterer Nahrungsmittel (Gemüse, Obst, Fleisch, Getreideprodukte etc.) Erfassung der Daten aus dem Vorsorgeheft und der durchgeführten Impfungen Des weiteren fand bei jedem Untersuchungstermin eine komplette körperliche Untersuchung der Kinder statt. 19

20 Die genaue Anamneseerhebung anhand eines Fragebogens sowie das Vorgehen bei der körperlichen Untersuchung sind im Anhang detailiert nachzulesen. Der verwendete Fragebogen wurde vor dem Beginn der Untersuchungen von Frau Dr. A. Eckart-Ringel an einem Probandenkollektiv von 130 Kindern validiert. Unter den 52 teilnehmenden Säuglingen befanden sich 22 weibliche und 30 männliche, welche zwischen der vollendeten 37. und 41. Schwangerschaftswoche geboren wurden. Das Geburtsgewicht lag zwischen 2500 und 4150g, die Größe zwischen 46 und 55cm, der Kopfumfang zwischen 32 und 36,5cm. Die Mütter waren zwischen 17 und 40 Jahre, die Väter zwischen 21 und 49 Jahre alt. Sämtliche erhobene Daten wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kindergruppe mit spezifischem IgE im Alter von einem Jahr und der Gruppe ohne spezifisches IgE auf (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Auflistung von Kopfumfang, Größe und Gewicht der Kinder bei den Untersuchungen U1 und U2 sowie des Alters der Mutter und des Vaters für die Kindergruppe mit spezifischem IgE (n=12) und ohne spezifisches IgE (n=40). Aufgezeigt sind der Median, das Minimum und das Maximum der Werte. Als Signifikanzniveau wurde p=0,05 gewählt (n. s.= nicht signifikant). Kinder mit spezif. IgE Kinder ohne spezif. IgE p Kopfumfang in cm bei U1 34 (32,5-36) 1 35 (32-36,5) n. s. Größe in cm bei U1 51 (47-55) 51 (46-54) n. s. Kopfumfang bei U2 34 (32,5-36) 34,75 (32-36,5) n. s. Größe in cm bei U2 51 (47-55) 51 (46-54) n. s. Gewicht in g bei U ( ) 3410 ( ) n. s. Gewicht in g bei U ( ) 3270 ( ) n. s. Gewicht in g bei U ( ) 4620 ( ) n. s. Alter: Mutter 28 (17-38) 29 (19-40) n. s. Alter: Vater 31 (22-49) 30 (21-46) n. s. 1 Median (Minimum und Maximum) 20

21 Von allen Elternpaaren (n=52) gaben 39 an, daß entweder ein Elternteil oder sogar beide unter einer allergischen Erkrankung (allergisches Asthma bronchiale, allergische Rhinitis, Neurodermitis) leiden oder litten. Signifikante Differenzen zwischen der Kindergruppe mit spezifischem IgE am Ende des ersten Lebensjahres und ohne IgE waren nicht zu eruieren. Tabelle 2: Allergische Erkrankungen der Mütter und Väter in der Kindergruppe mit spezifischem IgE und ohne spezifisches IgE im Alter von einem Jahr Kinder ohne spezif. IgE Kinder mit spezif. IgE p (n=40) (n=12) Mutter: allerg. Asthma 6 2 n. s. 2 Mutter: Neurodermitis 2 1 n. s. Mutter: allerg. Rhinitis 8 3 n. s. Vater: allerg. Asthma 3 2 n. s. Vater: Neurodermitis 7 2 n. s. Vater: allerg. Rhinitis 12 4 n. s. 2 n. s.= nicht signifikant 21

22 3.3 Festlegung des Atopierisikos Die Neugeborenen wurden anhand ihres Nabelschnurblut IgE-Wertes sowie ihrer Familienanamnese entweder einer Atopierisikogruppe (n=39) oder einer Nicht- Risikogruppe (n=13) zugeordnet. Als Einschlußkriterium in die Risikogruppe galt ein Nabelschnur IgE-Wert über 0,9 ku/l und/oder ein familienanamnestisch erhöhtes Atopierisiko (ein oder beide Eltern und/oder ein Geschwisterkind leiden oder litten unter einer atopischen Erkrankung). 3.4 Messung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes Zur Bestimmung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes wurden nach erfolgter Abnabelung 2ml Nabelschnurblut steril aus der Vena umbilicalis der Plazenta entnommen und in 2ml Reaktionsgefäße gefüllt. Nachdem die Gerinnung beendet war, wurden die Proben 15 Minuten mit 1850 x g zentrifugiert. Im weiteren wurde aus 100µl des Serumüberstandes der Gesamt IgE-Wert mit Hilfe eines kommerziellen Immunoassays gemessen. Die meßtechnischen Vorgänge erfolgten gemäß der Herstellervorschrift. 3.5 Bestimmung der spezifischen IgE-Werte Im Alter von einem Jahr wurden bei 52 Kindern mit Hilfe des CAP-Testes (Firma Pharmacia) im Serum die spezifischen IgE-Werte gegen die häufigsten Inhalationsallergene (Sx1) und gegen Nahrungsmittelallergene (Fx5) bestimmt. Zu den getesteten inhalativen Allergenen gehörten Lieschgras, Roggen, Beifuß, Birke, Katzenund Hundehaare, Cladosporium herbarum und Dermatophagoides pteronyssinus; zu den Nahrungsmittelallergenen zählten Hühnereiweiß, Milcheiweiß, Weizenmehl, Erdnuß, Soja und Fisch (Dorsch). Die Messung wurde genau nach Herstellervorschrift vorgenommen. 3.6 Gewinnung und Aufarbeitung des Blutes In sterile 50ml Falcon tubes wurden jeweils 2ml Heparin-Natrium 100 IE/ml, 0,1ml HEPES-Buffer (1M), 0,1ml Penicillin/Streptomycin IE/ml und 0,1ml Amphotericin 250µg/ml gegeben, um dann auf 10ml mit HBSS steril ohne Azid aufzufüllen. Diese Pufferlösung diente der Keim- und Gerinnungshemmung. Die Vorbereitung fand unter einer Sterilbank statt. 22

23 Das Blut der Neugeborenen (ca. 10ml) konnte nun nach der Abnabelung steril von der Vena umbilicalis in die präparierten Röhrchen gefüllt werden. Weitere 5ml des Nabelschnurblutes wurden für Serumuntersuchungen gebraucht. Zwischen der Abnahme des Nabelschnurblutes und der Aufarbeitung im Labor durften höchstens sechs Stunden liegen. Erfolgte die Stimulation der Zellen nicht sofort, mußte das Blut bei einer Temperatur von 4 C gekühlt gelagert werden. Bei den Kontrollterminen nach sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr wurden den Säuglingen jeweils ca. 3ml Blut zur Serumgewinnung und 1-2ml Heparinblut zur zellulären Untersuchung venös entnommen Zytokin-Stimulation mit Laktoglobulin In einer 96-Loch-Gewebekulturplatte wurden 10 well (Vertiefungen) mit je 160µl RPMI- Kulturmedium gefüllt. Das RPMI-Kulturmedium bestand aus folgenden Anteilen: zu 86% aus RPMI 1640 zu 10% aus FCS zu 1% aus nicht-essentiellen Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparagin x H 2 O, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, L-Serin) zu 1% aus L-Glutamin 200mM zu 1% aus Natrium-Pyruvat 100mM und je 0,5% aus Penicillin IE/ml und Streptomycin 10000µg/ml. Die nicht-essentiellen Aminosäuren, das L-Glutamin, das Natrium-Pyruvat und das Penicillin/Streptomycin wurden vorab zu gleichen Teilen gemischt (z.b. je 1ml), tiefgefroren und bei Bedarf im Wasserbad aufgetaut. Das FCS konnte ebenfalls in Portionen eingefroren werden. Zu den 160µl RPMI-Medium wurden nun 40µl des Nabelschnurblutes des jeweiligen Probanden pipettiert. Die Stimulation erfolgte mit 10µl der Arbeitsverdünnung des ß- Laktoglobulin. Das Laktoglobulin wurde zuvor im Verhältnis 2:1 in destilliertem Wasser aufgelöst und steril filtriert. Diese Verdünnung konnte in kleinen Mengen (z.b. zu je 50µl) in Eppendorff-Hütchen eingefroren und bei Bedarf bei Zimmertemperatur aufgetaut werden. Um die endgültige Arbeitsverdünnung zu erhalten, wurde die vorbereitete 2:1-23

24 Lösung nochmals im Verhältnis 1:10 mit RPMI-Medium versetzt (z.b. 15µl Laktoglobulin-Verdünnung mit 135µl RPMI-Medium). Diese konnte nicht noch einmal zur weiteren Verwendung eingefroren werden, sondern mußte zu jedem Ansatz neu hergestellt werden. Die Gewebekulturplatte wurde fest verschlossen 72 Stunden lang in einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank bei 37 C inkubiert. Zusätzlich wurden bei jedem Ansatz in gleichen Mengen Kontrollen ohne eine Stimulation mit β-laktoglobulin angesetzt. 3.7 Darstellung der Oberflächenantigene und der intrazellulären Zytokine Färbung Nach 72 Stunden wurden die mit β-laktoglobulin stimulierten Zellen in ein 15ml Falcon Röhrchen geerntet, welches auf 15ml mit HBSS ohne Azid 3 aufgefüllt wurde. Der HBSS- Puffer diente zur Auswaschung der Proteine, die im Kulturmedium vorhanden waren. Daraufhin erfolgte eine fünfminütige Zentrifugation bei 300 x g. Nach vorsichtigem Abgießen des Überstandes verblieben ein Rest Puffer und Pellet von ca. 200µl im Röhrchen. Zur anschließenden Fixierung wurde die gleiche Menge 4%iges eiskaltes Paraformaldehyd hinzugegeben und mit der Pipette gründlich resuspendiert. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen wiederum auf 15ml mit HBSS-Puffer ohne Azid aufgefüllt, gut gemischt und bei 300 x g fünf Minuten lang zentrifugiert. Falls die Färbung nicht sofort vorgenommen wurde, wurden die Zellen nach Abschütten des Überstandes in 1ml HBSS-Puffer ohne Azid aufgenommen und im Kühlschrank gelagert. Um die Zellen zu permeabilisieren, wurde dem Zellpellet 300µl Saponinpuffer (HBSS mit 0,01 M HEPES und 0,1% Saponin) zugefügt. Nun wurde die simultane Färbung der Oberflächenantigene und der intrazellulären Zytokine vorgenommen. Die Differenzierung der mononukleären Zellen erfolgte mit Hilfe von Antikörpern, welche gegen Leukozytenoberflächenantigene gerichtet und mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (= PE) markiert sind. Zur Anwendung kamen hierbei 3 HBSS= Hanks Balanced Salts 24

25 die folgenden Antikörper: anti-cd45ra-pe zur Markierung der naiven T-Zellen und anti-cd45r0-pe zur Markierung von Memory T-Zellen. Der Nachweis der intrazellulären Zytokine IL-10 und IFN-γ geschah mit anti-il-10 (gekoppelt an Biotin) und anti-ifn-γ (gekoppelt an FITC). Je 100µl der Zellsuspension wurden nun versetzt mit: a) 1µl anti-cd45ra-pe und 10µl anti-il-10-biotin und anti-ifn-γ - FITC b) 1µl anti-cd45r0-pe und 10µl anti-il-10-biotin und anti-ifn-γ - FITC c) Kontrolle FITC und Kontrolle PE. Die so gewonnenen Proben wurden dann für 20 Minuten bei 4 C in Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurde jeweils 1ml Saponinpuffer zugegeben, und die nicht gebundenen Antikörper wurden durch eine erneute Zentrifugation ausgewaschen. Da Biotin allein keine Fluoreszenz zeigt, mußte es mit dem Antikörper Strept-Avidin-Tricolor kombiniert werden, der den ersten beiden Zellpellets, nicht jedoch der Kontrolle, in einer Menge von 0,5µl zugesetzt wurde. Nach 20minütiger Inkubation bei 4 C in Dunkelheit erfolgte wiederum die Auswaschung mit jeweils 1ml Saponinpuffer und die Aufnahme in jeweils 100µl HBSS ohne Azid. Mit den Kontrollansätzen ohne Stimulus wurde ebenso verfahren Bestimmung der Anzahl der CD4- und CD3-positiven T-Zellen Die Bestimmung der CD4+ und CD3+ T-Helferzellen erfolgte parallel zur Messung der CD45RA+ und CD45R0+ Zellen wie unter beschrieben, jedoch ohne eine vorherige Stimulation mit β-laktoglobulin. Als Antikörper wurden CD3 FITC Anti-Leu-4F zur Markierung der CD3-positiven Zellen und CD4 PE 100T/ Anti-Leu 3A PE zur Markierung der CD4-positiven Helferzellen in einer jeweiligen Konzentration von 5µl verwendet. Die zur Umrechnung in die Anzahl der Zellen pro Mikroliter benötigten Differentialblutbilder der Säuglinge stammen von simultan durchgeführten Untersuchungen Durchflußzytometrische Messung Die Differenzierung der monoklonalen Zellen erfolgte mit Hilfe eines FACScan Durchflußzytometers anhand von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Durch die 25

26 Messungen mit dem Durchflußzytometer war es möglich, simultan die Oberflächenmarker und die intrazelluläre Zytokinproduktion zu bestimmen. Zur Messung der intrazellulären Zytokinsynthese wurde die von T. Jung beschriebene Methode in gering modifizierter Form angewendet [50]. Dabei liefen die Messungen wie folgt ab: die vorbereiteten Zellsuspensionen wurden durch Überdruck in die Meßküvette eingebracht. Durch hydrodynamische Fokussierung durchliefen die Zellen die Meßkammer aneinandergereiht, Zelle für Zelle. Angeregt durch den Strahl eines 15mW Argon-Ionenlasers kam es dann zur Abgabe von Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht, welches nach der Aufnahme durch Detektoren in entsprechende Signale umgewandelt wurde (s. Abbildung 1). Zum Prinzip der Messung: Die Lichtstreuung kann unterteilt werden in ein Vorwärtsstreulicht (forward light scatter=fsc) und ein Seitwärtsstreulicht (side light scatter=ssc). Das Vorwärtsstreulicht ist in erster Linie ein Maß für die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht hauptsächlich von der intrazellulären Granularität abhängt. Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie über einen weiten, für sie charakteristischen Wellenlängenbereich. Mit dieser Energie werden Elektronen in ein höheres Energieniveau gehoben. Springt das Elektron nun auf das Grundniveau zurück, so emittiert es ein Photon. Diesen Strahlungsübergang nennt man Fluoreszenz. Der Lichtbereich, über den eine fluoreszierende Verbindung angeregt werden kann, ist dessen Absorptionsspektrum. Da beim Absorptionsvorgang mehr Energie aufgenommen wird, als beim Fluoreszenzübergang später emittiert wird, ist das abgestrahlte Licht langwelliger als das Anregungslicht und bildet das Emissionsspektrum. Dabei ist die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Anzahl der gebundenen Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffes. In der Studie wurden drei fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt (Dreifarben- Immunfluoreszenzmessung): Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und TRI-Color (Medac; Tandemfarbstoff, welcher R-Phycoerythrin und Cyanin 5 enthält) mit Fluoreszenzoptima bei 530nm, 585nm und 640nm. Pro Messung wurden folglich fünf Parameter, nämlich Zellgröße, Zellgranularität und drei verschiedene Fluoreszenzen, simultan untersucht und nach dem LIST-MODE Prinzip gespeichert. Je Meßvorgang wurden Zellen analysiert. Nach Beendigung der 26

27 Messung konnten die gespeicherten Daten abgerufen und ein gating der Zellen durchgeführt werden. Unter gating versteht man ein Herausfiltern der gesuchten Zellpopulation, indem durch Vorgabe von Begrenzungswerten innerhalb der verschiedenen Parameter die Zellauswahl eingegrenzt wird. Auf diese Weise ließen sich aktivierte Lymphozyten beispielsweise von Monozyten und Granulozyten unterscheiden. Die erhobenen Daten wurden anschließend mit Hilfe der korrelierten Zweiparameterdarstellung abgebildet. Dabei wurden die Oberflächenmarker (CD45RA und CD45R0) gegen die fluoreszenzmarkierten Zytokine (IL-10 und IFN-γ) in einem Diagramm aufgetragen. Anhand dieser korrelierten Darstellung war es möglich, den Prozentsatz Zytokin-produzierender Zellen innerhalb einer definierten Lymphozyten- Subpopulation (naive gegenüber Memory T-Zellen) zu bestimmen. 27

28 Abbildung 1: Durchflußzytometer Schematische Darstellung eines Durchflußzytometers mit Linsen- und Spiegelkombinationen, welche zur Aufspaltung der Signale der gefärbten Zellen genutzt werden. Zum Prinzip der Messung: der Strahl eines Argonionenlasers trifft auf die gefärbte Zelle, die daraufhin ein FSC und ein SSC entsendet. Bevor das Vorwärtsstreulicht mit einer Photodiode gemessen wird, wird es durch einen ein- oder zehnprozentigen Filter geschickt. Da es sich bei dem Seitwärtssteulicht um ein schwächeres Signal handelt, muß dies mit Hilfe eines Photomultipliers analysiert werden. Licht, welches den 495nm Spiegel passieren konnte, wird durch 515nm Filter gelenkt. Ein dichroischer Spiegel, der hinter den Filtern und in 45 zum Lichtstrahl plaziert ist, lenkt das langwellige Licht auf einen Photomultiplier (PMT) zur Aufnahme des roten Lichtes (Phycoerythrin PMT). Das kurzwelligere (grüne) Licht geht ungehindert durch den Spiegel hindurch und trifft auf den Fluorescein PMT [51]. 3.8 Statistik Die Vergleiche zwischen den Probandengruppen erfolgten mit Hilfe des Mann- Whitney U-Tests. Es wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt. Die Korrelationsberechnungen erfolgten anhand der Spearman-Rangkorrelation. Sämtliche Berechnungen einschließlich des relativen Risikos (Odds ratio) sowie des 95% Konfidenzintervalles (CI) wurden mit Hilfe des Computerprogrammes PC-Statistik (Top Soft, Hannover) vorgenommen. 28

29 3.9 Herstellernachweis Aminosäuren, nicht-essentielle Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0293 Amphotericin B Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2612 Anti-CD45RA-PE Coulter, Krefeld, Best.-Nr Anti-CD45R0-PE Coulter, Krefeld, Best.-Nr Anti-IFN-γ (Klon biotin) Anti-IL-10 Brutschrank CD3 FITC Anti-Leu-4F CD4 PE 100T/ Anti-Leu 3 A PE, Durchflußzytometer Freundliche Gabe von Dr. C. Heusser, Ciba Geigy, Basel Pharmingen, Best.-Nr D Heraeus Biosciences, Pharmingen, Best.-Nr Biosciences, Pharmingen, Best.-Nr FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg DiaTOP Allergiescreening SX1 Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Freiburg DiaTOP Allergiescreening FX5 FCS (mitogengetestet) Hanks balanced salts solution (HBSS) Heparin-Natrium ( Vetren 200 ) Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Freiburg Biochrom, Berlin, Best.-Nr. S 0115 (500ml), S 0113 (100ml) Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 2045 Promonta, Hamburg, Reg.-Nr. V 767 HEPES-Pufferlösung (1M) Biochrom, Berlin, Best.-Nr. α-1613 ß-Lactoglobulin A u. B (5g) Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.-Nr. α-0130 L-Glutamin 200 mm Kopplungskit Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0282 (50ml) Calbiochem, Bad Soden/Ts., Best.-Nr

30 Lysis II Softwarepaket Microtest Gewebekulturplatte (96 Vertiefungen) Nabelschnurblut Gesamt-IgE Immunoassay Natrium-Pyruvat Becton Dickinson, Heidelberg Falcon/BD 4, Heidelberg, Best.-Nr Pharmacia, Uppsala, Schweden, Best.-Nr Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 0473 (100mM) Paraformaldehyd-Pulver Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr Penicillin/Streptomycin E/ g/ml Polystyren Reagenzgläser (Rundboden) Reagenzröhrchen 50ml, konisch, mit Verschluß Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2212 (50ml), Best.-Nr. A 2213 (100ml) Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr Reaktionsgefäße (1.5/ 2.0 ml) Eppendorf, Hamburg, Best.-Nr / RPMI 1640 mit 2,0 g/l Biochrom, Berlin, Best.-Nr. F 1215 NaHCO 3 Saponin Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr ml Serologische Pipette Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr ml Serologische Pipette Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr Serumröhrchen 15ml, Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr konisch, mit Verschluß Strept-Avidin-Tricolor (=SATC) Caltag Laboratories, Burlington, Code No. SA BD= Becton Dickinson 30

31 4 Ergebnisse 4.1 Spezifische IgE-Antikörper im Alter von einem Jahr Um bei den Studienkindern im Alter von einem Jahr eine allergische Sensibilisierung nachzuweisen, wurde in den Einjahresseren spezifisches IgE gegen die häufigsten inhalativen Allergene (Sx1) und gegen Nahrungsmittelallergene (Fx5) bestimmt. Es konnte so bei 52 Kindern eine Messung des spezifischen IgE-Wertes erfolgen. Bei 40 Säuglingen (40/52=76,92%) ließ sich kein spezifisches IgE gegen die oben genannten Allergene nachweisen, während zwölf der teilnehmenden Kinder (12/52=23,08%) nach zwölf Monaten spezifisches IgE gebildet hatten. 31