LABORWELT. Post-Genomics & RNAi. Verbesserte Protein- Sekretion durch virale Signalsequenz. Humane SNPs: HTS und Datenauswertung

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1 LABORWELT Nr. 5 / Vol. 5 Das -Themenheft Verbesserte Protein- Sekretion durch virale Signalsequenz Humane SNPs: HTS Datenauswertung Post-Genomics & RNAi Molekulare Typisierung von angeborenen Herzfehlern Targetvalidierung von Apoptose-Genen mit RNAi-Technologien Marktübersicht: Genomics Services Biomarker-Suche Systemanalyse mit Metabolomics DNA-Chips zur Diagnose mikrobieller Pathogene BIOCOM AG

2 I N T R O Zum Thema Mehrwert durch Post-Genomics? Eine ihrer Verheißungen haben die sogenannten -omics-technologien bereits heute eingelöst: Die Verfahren um die aus den englischen Begriffen gene, protein etc. economics zusammengesetzten Substantive (genomics, proteomics viele mehr) haben neue Märkte entstehen lassen, wo vorher keine vergleichbaren waren. Allein der Markt für die wohl jüngste Hoffnungsträger-Technologie RNA-Interferenz, mit der den Genen Funktionen zugeordnet werden können, soll nach zwei aktuellen Studien bis 2009 um jährlich r 30% wachsen. In r 10 Jahren wäre danach ein Markt von immerhin 240 Mio. US-$ entstanden. Zusammen mit anderen Technologien (Proteomics, Expression Profiling, etc.) summiert sich das Marktvolumen für Post-Genomics-Produkte -Dienstleistungen (vgl. Marktübersicht S. 39) inzwischen auf Milliarden US-Dollars, die hauptsächlich von Laboranbietern umgesetzt werden. Das große Marktversprechen, bessere Arzneimittel, Diagnostika, Nahrungsmittel umweltfreliche Produkte auf Basis eines verbesserten Verständnisses der molekularen Biologie zu produzieren, ist dagegen nicht so schnell einzulösen. Zu komplex für das heutige Tech- Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name Adresse angeben faxen/mailen Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten. nologie-portfolio scheinen die von vielen Faktoren abhängigen molekularen Netzwerke, die Krankheit determinieren oder den pflanzlichen bakteriellen Stoffwechsel steuern. Doch langfristig deuten sich Teilerfolge auf dem langen Weg zu besseren Produkten an: Berliner Kliniker Genomforscher sind dabei, durch Vernetzen von Expressionsprofilen mit klinischen Daten erstmalig eine molekulare Phänotypisierung angeborener Herzfehler zu ermöglichen (siehe Seite 10). Pflanzenforscher versuchen durch Integration verschiedener Post-Genomics-Technologien, komplizierte pflanzliche Stoffwechselwege zu modellieren, um komplexe Merkmale von Nutzpflanzen zu beeinflussen (vgl. Seite 33). Auch die Genome von Bakterien, die nicht zu kultivieren sind, lassen sich nach noch unentdeckten Enzymen durchsuchen, mit deren Hilfe umweltbelastende chemische Prozesse ersetzt werden können (siehe Seite 14). Inwieweit die Anwendungsseite sowie die Forschung durch geplante neue Regularien der Gentechnik in Deutschland beeinträchtigt werden, ist Thema unseres neugestarteten Leserforums (vgl. S. 4). Wir freuen uns, wenn Sie mitdiskutieren (laborwelt@biocom.de). Eine interessante Lektüre wünscht Ihnen Thomas Gabrielczyk INHALT L E S E R F O R U M Gentechnik-Gesetz zurück in die siebziger Jahre 4 Prof. Dr. Jörg Hacker, Universität Würzburg W I S S E N S C H A F T Effiziente Proteinsekretion in Hefen: Neuartige virale Killertoxin-Signalsequenz 6 Prof. Dr. MJ Schmitt et al., Universität Saarbrücken B L I T Z L I C H T Angeborene Herzfehler als molekulares Puzzle 10 Dr. Silke Sperling et al., MPI für molekulare Genetik, Berlin B L I T Z L I C H T Technologien zum Erschließen nicht-kultivierbarer 14 Mikroorganismen Dr. Patrick Lorenz et al., BRAIN AG, Zwingenberg B L I T Z L I C H T DNA-Biochips für Forschung Diagnostik 17 an klinisch relevanten Mikroorganismen Dr. Holger Eickhoff, Scienion AG, Berlin B L I T Z L I C H T sirna Entwicklung einer neuen Wirkstoff-Klasse 21 Dr. Roland Kreutzer et al., Alnylam Europe AG, Kulmbach B L I T Z L I C H T Automatisierte RNAi-Plattform zur 24 Targetvalidierung PD Dr. Thomas Rudel et al., MPI für Infektionsbiologie, Berlin B L I T Z L I C H T Packaging the Genome to Accelerate Biology 26 Stephen Fodor, PhD, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA B L I T Z L I C H T Genetische Variabilität des Menschen: 31 Hochdurchsatz-Technologien Datenanalyse Dr. Bernd Timmermann et al., MPI für molekulare Genetik B L I T Z L I C H T Metabolomics diagnostisches Werkzeug 33 Schlüsseltechnologie der Systembiologie Dr. Wolfram Weckwerth et al., MPI für Pflanzenphysiologie, Golm B L I T Z L I C H T Proteinarrays rekombinante Proteine für 35 die Proteinanalyse Dr. Uwe Radelof et al., RZPD GmbH, Berlin M A R K T Ü B E R S I C H T Genomics-Services 36 Schema der Genfunktionsanalyse mittels Gene Silencing durch small interfering RNAs (sirna) der Quantifizierung des functional Knock-outs von Tagetgenen Schema: Promega Corp., Madison, USA Kennziffer 11 LW 05 Informationen ordern? Stellenmarkt 44 Verbände 50 Produktwelt 51 Fax-Seite 53 Termine/Impressum 54 LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/2004 3

3 L E S E R F O R U M Statement Zurück in die siebziger Jahre? Deutschland die Grüne Gentechnik Prof. Dr. Jörg Hacker, Universität Würzburg, Vizepräsident der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn Im Unterhaltungssektor haben momentan Nostalgie-Shows Konjunktur. Verfolgt man die laufende Debatte um ein neues Gentechnik-Gesetz in Deutschland, so muß man den Eindruck gewinnen, daß Debatten der 70er 80er Jahre noch einmal aufgelegt werden. Erinnern wir uns: Zu Beginn der 70er Jahre wurden durch die Arbeiten des Nobelpreisträgers Werner Arber anderer Wissenschaftler die Methoden der Gentechnik in die Laborpraxis eingeführt. Mit Hilfe der Restriktionsenzyme konnten Gene erstmals gezielt aus ihrer Umgebung herausgelöst in anderen Organismen vermehrt werden. Die Methode der Genklonierung war geboren. Wissenschaftler waren es, die damals sehr schnell auf mögliche Gefahren aufmerksam machten, etwa die Entstehung neuer Krankheitserreger. Verschiedene Sicherheitsstufen für gentechnische Arbeiten wurden eingeführt, entsprechend dem vermuteten Risiko der Experimente. Dieses Vorgehen hat sich außerordentlich bewährt. Die zuvor apostrophierten Risikoszenarien sind nicht Realität geworden. Statt dessen wurde mit der Roten Gentechnologie, der Anwendung der neuen Methoden in der Medizin Grlagenbiologie, ein Arsenal von experimentellen Techniken geschaffen, das heute weltweit in der Forschung in der Biotechnologie eingesetzt wird. Die Gentechnik hat sich insgesamt als sichere Wissenschaft erwiesen. Als Konsequenz wurden die gesetzlichen Rahmenbedingungen seit den 80er Jahren weltweit, auch in Deutschland, immer mehr liberalisiert. Die Arbeiten selbst haben zu sensationellen Ergebnissen geführt: die Prozesse der Zelldifferenzierung sind sehr viel besser bekannt, die Gesamtgenomsequenzen von mehr als 100 Organismen liegen vor erste systematische Analysen der Gensteuerung in gesamten Organismen wurden begonnen. Darüber hinaus sind mit Hilfe der Gentechnik viele Medikamente entwickelt worden, die erfolgreich eingesetzt werden. Die Rote Gentechnik ist also eine erfolgreiche sichere Technologie, für die nachvollziehbare gesetzliche Rahmenbedingungen bestehen. Momentan wird nun in Deutschland beiten mit gentechnisch veränderten Pflanzen deren Freisetzung regeln soll. Dabei werden die Debatten der 70er Jahre über die Rote Gentechnik wiederholt, es wird von einer prinzipiellen Gefährdung von Mensch Umwelt durch die Grüne Gentechnik ausgegangen. Ein entsprechendes Gesetzespaket hat mittlerweile den Bestag passiert. Nach einem Vermittlungsverfahren mit dem Besrat, der dem Gesetz in der jetzigen Fassung nicht zugestimmt hat, ist damit zu rechnen, daß das Gesetz zur Grünen Gentechnik noch im Jahre 2004 in Kraft gesetzt wird. Zurück zur Risikodebatte? technik angegangen. Spezielle Risiken im Hinblick auf transgene Pflanzen sind bisher nicht sichtbar geworden. Deshalb überrascht es, daß in Deutschland nun ein Gentechnik-Gesetz auf den Weg gebracht wird, das durch die rigiden Haftungsbestimmungen das Ausbringen von transgenen Pflanzen praktisch unmöglich macht. Darüber hinaus ist geplant, die sehr gut funktionierende Zentrale Kommission für Biologische Sicherheit (ZKBS) quasi zu duplizieren, also eine hervorragend etablierte Institution ohne Not zu verändern. All diese Regelungen würden dem Ausland den Menschen in Deutschland völlig falsche Signale geben: Statt Innovation neue Technologie zu erschließen, ist Deutschland im Begriff, sich diesen Neuerungen zu verschließen. Statt die Biotechnologie zu fördern auszubauen, werden ihr unüberwindliche Hindernisse in den Weg gelegt. Statt der Wissenschaft einen Vertrauensvorschuß zu geben, wird wissenschaftliches Arbeiten behindert. Das dies gerade im Jahr der Innovationen geschieht, ist eine besondere Ironie. Es bleibt zu hoffen, daß sich dennoch die Vernunft durchsetzen wird daß wir nicht die gleiche Situation erleben wie bei der Roten Gentechnik. Hier hat es etwa 15 Jahre gedauert, bis diese Technologie in Deutschland wirklich heimisch wurde. Wirtschaftsvertreter gehen von einem volkswirtschaftlichen Schaden von mehreren Milliarden Euro aus viele der großen wissenschaftlichen Entdeckungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie fanden außerhalb Deutschlands statt. Um der Grünen Gentechnologie ihren Anwendern ein ähnliches Schicksal zu ersparen, wäre es nötig, diese Technologie kraftvoll zu fördern, die Begleitforschung, wie dies von der Europäischen Union vorgesehen ist, auch in Deutschland zu entwickeln die Verbraucher wirklich aufzuklären. Noch ist es nicht zu spät, mit einem solchen Programm zu beginnen statt sich in rückwärtsgewandten Betrachtungen zu ergehen auf die Zukunft zu setzen. Ziel des Gesetzes ist es das Nebeneinander von ökologischer konventioneller Landwirtschaft von Landwirtschaft mit gentechnisch veränderten Pflanzen zu regeln. In der Praxis sieht es aber so aus, daß Landwirte sowie Forschungsinstitute, die gentechnisch veränderte Pflanzen ausbringen, haften, wenn sich Spuren dieser Pflanzen in konventionelle Produkte einschleichen. Es stehen also nicht vermeintliche oder wirkliche Risiken der Gentechnik im Mittelpunkt, sondern es geht allein um die Frage, ob Gentechnik bei der Herstellung landwirtschaftlicher Produkte Anwendung gefen hat. Dabei wird davon ausgegangen, daß es sich bei der Gentechnik per se um eine gefährliche Technologie handelt. Folgerichtig wird auch von genetischen Verunreinigungen oder gentechnischen Kontaminationen gesprochen, für die gehaftet werden muß. Insofern ähnelt die Diskussion sehr stark der Auseinandersetzung in den 70er Jahren, ohne daß die wissenschaftlichen Erfahrungen mit der Gentechnik aus den letzten 30 Jahren mit in den Blick genommen werden. Und dabei hat die Grüne Gentechnik momentan weltweit Konjunktur. 55% der Welt-Soja-Ernte, 21% der Baumwollernte gehen auf gentechnisch veränderte Pflanzen zurück. Auch werden viele grlegende Fragen der Forschung zum Stoffwechsel von Pflanzen, zum Verhalten von Pflanzen unter Extrembedingungen zur Infektionsresistenz momentan mit Hilfe der Grünen Gen- an einer Gesetzgebung gearbeitet, die das Ar- Kennziffer 12 LW Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

4 Expression Proteomics // Tools for Protein Separation and Analysis Decisive Advantage In one complete package, PDQuest 2-D analysis software 7.3 gives you more decision-making power. Now with spot-to-spot normalization for in-gel differential protein labeling Quick review and editing of matched spots XML export for streamlined reporting and databasing Automatic detection and advanced algorithms Complete process control, from image acquisition through spot cutting Advanced statistical, quantitative, qualitative, and Boolean queries Publication-quality images with versatile annotation Visit us on the Web at discover.bio-rad.com For more information call +49 (89)

5 W I S S E N S C H A F T Proteinproduktion Ein virales Killertoxin- Sekretionssignal zur effizienten Proteinsekretion Dr. Frank Breinig, Dipl.-Biol. Antje Eiden-Plach, Dr. Tanja Breinig Prof. Dr. Manfred J. Schmitt Angewandte Molekularbiologie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken Hefe ist zu einem attraktiven Produktionsorganismus in der Biotechnologie geworden, um rekombinante Proteine zu exprimieren, prozessieren sekretieren. Obgleich die meisten heterologen Proteine im Zytosol exprimiert werden, blieb deren erfolgreiche Sekretion in das Hefe-Kulturmedium bisher auf wenige erfolgreiche Fälle beschränkt. Vor kurzem konnten wir zeigen 3, daß eine vom K28-Präprotoxin abgeleitete virale Aminosäure-Sequenz als neuartiges hocheffizientes Sekretionssignal für Fremdproteine dienen kann, auch bei den mit Saccharomyces weniger verwandten, biotechnologisch relevanten Hefe-Species. Die virale Präprotoxin-Signalsequenz kann möglicherweise als neuartiges Werkzeug eingesetzt werden, um eine effiziente Proteinsekretion sicherzustellen. Derzeit fokussieren wir daher unsere Arbeit auf die Toxin-getriebene Sekretion pharmazeutisch biotechnologisch bedeutender Proteine Biopharmazeutika in verschiedenen Hefe-Arten. Key Words: Hefen, Killertoxin, Präprotoxin-Prozessierung, Proteinsekretion; GFP Der effiziente Import rekombinant exprimierter Proteine in den sekretorischen Weg einer eukaryonten Wirtszelle ist ein wichtiger Schritt für viele Anwendungen in der Bio Gentechnologie. Einerseits erleichtert die Sekretion in das Kulturmedium die Aufreinigung des Zielproteins ganz erheblich; oft genügt bereits ein einziger weiterer Reinigungsschritt, da die Zahl der von einer Zelle ausgeschiedenen Proteine meist relativ gering ist. Des weiteren entfällt ein Zellaufschluß, der mehr oder weniger aufwendig sein kann, jedoch immer ein Gemisch aller Zellproteine ergibt, aus dem die Isolierung eines einzigen Proteins meistens schwerfällt, sehr zeitaufwendig sowie kostspielig ist. Andererseits ist das Einschleusen eines Proteins in den sekretorischen Weg unabdingbare Voraussetzung für spezielle posttranslationale Modifikationen, die oft für die biologische Funktion des jeweiligen Proteins essentiell sind. Als Beispiele sind hier das Anfügen spezifischer Zuckerreste (Glykosylierungen), das Knüpfen von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken oder proteolytische Prozessierungen durch spezielle Endo- Carboxypeptidasen (wie bei der Expression des Insulins) zu nennen. Das jeweilige Zielprotein besitzt nur in den seltensten Fällen bereits ein Sekretionssignal falls doch, so ist seine Effektivität im gewünschten Wirtsorganismus meist gering unzureichend. Dieses Problem tritt auch bei Verwendung des eukaryonten Einzellers Hefe als Wirt auf. Die Hefe als Expressionssystem ist in der Lage, die Vorteile eines prokaryonten Mikroorganismus (mit hohen Teilungsraten, geringer Zellgröße einfacher Kultivierung) mit den Vorzügen eines eukaryonten Wirtes mit der Fähigkeit zur Protein-N-Glykosylierung weiterer, komplexer posttranslationaler Protein-Prozessierungen zu verbinden. Obwohl im Laufe der vergangenen Jahre erfolgreich eine ganze Reihe eukaryonter sowohl therapeutisch als auch kommerziell relevanter Proteine heterolog in unterschiedlichen Hefegattungen (wie der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida glabrata oder Yarrowia lipolytica) hergestellt werden konnten, erwies sich deren Sekretion als schwierig. Folgerichtig wurden die meisten dieser Proteine intrazellulär exprimiert. K28-Präprotoxin als Sekretionssignal Der kritische Schritt für die Sekretion von Proteinen besteht in ihrer ko- oder posttranslationalen Translokation in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER), gefolgt vom anschließenden Transport über das Golgi- Netzwerk zur Zelloberfläche. Ein Import heterologer Proteine in das ER wird normalerweise durch eine in frame -Fusion des Zielproteins mit einem homologen Sekretionssignal erreicht, das von einem natürlich sezernierten Protein des jeweiligen Wirtsorganismus stammt. Erfolgreich in Hefe eingesetzt wurden dabei bisher die Signalpeptide der Invertase (Suc2p), der sauren Phosphatase (Pho5p), der α-galaktosidase (Mel1p) oder des Pheromons α-faktor. Im Kontext unserer Untersuchungen zur Prozessierung Sekretion des viralen Killertoxins K28 waren wir in der Lage, eine cdna des α/β-toxins erfolgreich in verschiedenen, biotechnologisch relevanten Hefegattungen (S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris sowie C. glabrata) zu exprimieren, was auf eine effiziente Einschleusung des entsprechenden Vorläuferproteins in allen untersuchten Gattungen hinwies 1-3. Beim Killertoxin K28 handelt es sich um ein Proteintoxin, das natürlicherweise von virusinfizierten Zellen, sogenannten Killerzellen, der Bäckerhefe gebildet wird. Dieses Toxin ist in der Lage, sensitive Hefezellen in einem Rezeptor-vermittelten Prozeß durch Induktion eines Zellzyklusarrestes Inhibition der DNA-Synthese abzutöten 1. In einem ersten Schritt wird in den toxinproduzierenden Zellen ein Vorläuferprotein (Abb. 1) gebildet, das mittels seines N-terminalen Signalpeptids überaus effizient in den sekretorischen Weg der Hefezelle eingeschleust wird. Dort wird das Sekretionssignal an Aminosäureposition 36 durch die Aktivität der ER-luminalen Signalpeptidase entfernt. Nach proteolytischer Prozessierung der Abb. 1: Analogie der Prozessierung des viralen K28-Vorläuferproteins (Präprotoxins) der Reifung humanen Insulins [SP: Signalpeptidase; Kex1p, Kex2p: Carboxypeptidase, Endopeptidase der Hefe; h-kex2p: humanes Homolog zur Hefe-Endopeptidase Kex2p]. Kennziffer 13 LW Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

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7 W I S S E N S C H A F T potentiell N-glykosylierten γ-untereinheit durch die Endopeptidase Kex2p werden die im späten Golgi-Apparat freigesetzten durch eine einzelne Disulfidbrücke miteinander verbenen α- β-untereinheiten schließlich als heterodimeres Proteintoxin in das Kulturmedium sezerniert. Aufbau Prozessierung dieses Vorläuferproteins sowie die Struktur des sezernierten Heterodimers sind dabei dem humanen Insulin sehr ähnlich, wie auch die für die proteolytische Spaltung A B Abb. 2: (A) Kex2p-vermittelte Prozessierung des viralen K28-Präprotoxins in Hefe Konstruktion eines Fusionsproteins aus K28-Sekretionssignal GFP. Spaltstellen der ER-ständigen Signalpeptidase [SP] der Golgi-Endopeptidase Kex2p sind angegeben. Die drei N-Glykosylierungsstellen in γ sind durch ausgefüllte Kreise markiert. [S: Sekretionssignal am pptox N-Terminus]. (B) Schemata der zur konstitutiven/regulierten Expression des K28/GFP-Fusionsproteins in S. cerevisiae, Sz. pombe, P. pastoris C. glabrata verwendeten Plasmide. Das Fusionsgen steht unter der Transkriptionskontrolle der jeweils angegebenen Promotor-/Terminatorkombination. Der Replikationsursprung (ARS), hohe- oder geringe Kopienzahl der Vektoren (2µ CEN) sowie die Markergene zur Selektion der Hefetransformanten (HIS4, URA3 LEU2) sind angegeben. verantwortlichen Enzyme einen hohen Verwandtschaftsgrad aufweisen (Abb. 1). Die in allen untersuchten Hefegattungen beobachtete effiziente Sekretion von K28 legte die Vermutung nahe, daß das Signalpeptid des K28-Vorläufers das Potential für ein neuartiges universell geeignetes Sekretionssignal aufweist, das in unterschiedlichen Hefegattungen Anwendung finden könnte. Aufbauend auf diesen Daten gingen wir daher der Frage nach, ob ein auf dem K28-Vorläuferprotein basierendes Signalpeptid in der Lage ist, auch solche Proteine in den sekretorischen Weg einzuschleusen, die in Hefe bislang nur sehr schwer oder ineffizient zur Sekretion gebracht werden konnten. Beim grün fluoreszierenden Protein (GFP) handelt es sich um ein solches Protein. Obwohl sich GFP in einer Vielzahl von Studien als wertvolles Hilfsmittel für die biologisch aktive Markierung subzelluläre Lokalisation von Proteinen bewährt hat, erwies sich dessen Sekretion aus bislang unbekannten Gründen als äußerst schwierig. Häufig resultierte die Sekretion von GFP oder von GFP- Fusionen in einer fehlgeleiteten Zielsteuerung der betreffenden Proteine, die daraufhin entweder zur Vakuole transportiert abgebaut oder in ER/Golgi retendiert wurden. Auch durch Verwendung der bislang erfolgreich in der Bäckerhefe eingesetzten Sekretionssignale Hefe-eigener Proteine konnte keine Sekretion von GFP in das Kulturmedium erreicht werden. Dieses Problem war dabei nicht nur auf Hefen beschränkt, sondern trat auch in Säuger- Insektenzellkulturen auf 4,5. Um das Potential des K28-Sekretionssignals zu überprüfen, konstruierten wir daher Fusionsproteine, die aus dem Signalpeptid des K28-Vorläuferproteins (36 N-terminale Aminosäuren) sowie GFP bestanden brachten diese mittels verschiedener Expressionsvektoren (Abb. 2) in unterschiedlichen Hefegattungen zur Expression. Die entsprechenden Fusionsgene standen dabei entweder unter der Transkriptionskontrolle konstitutiver (PGK1) oder induzierbarer/reprimierbarer (GAL1-, AOX1- oder NMT1-) Promotoren. Bei allen untersuchten Hefen waren nach Proteinexpression sowohl ein Einschleusen von GFP in den sekretorischen Weg der Zellen als auch eine effiziente Sekretion in das Kulturmedium zu beobachten, was durch Fluoreszenzmikroskopie durch Western-Blot bestätigt werden konnte (Abb. 3). Alle GFPexprimierenden Hefen zeigten ein für sezernierte Proteine typisches Fluoreszenzmuster sowohl im ER/Golgi-System als auch an der Zelloberfläche war eine deutliche GFP-Fluoreszenz zu erkennen. Da es sich bei S. pombe um die größte der untersuchten Hefen handelt, war hier die ER/Golgi-Lokalisation am stärksten ausgeprägt (Abb. 3). Um auszuschließen, daß GFP nicht an der Zelloberfläche retendiert, sondern tatsächlich in das Kulturmedium der betreffenden Hefen ausgeschieden wird, wurde der zellfreie Kulturüberstand durch SDS-PAGE aufgetrennt mittels monoklonaler Antikörper auf GFP-Sekretion hin untersucht. GFP wurde von allen Hefegattungen effizient in das Medium ausgeschieden; es konnte jeweils ein einziges Signal detektiert werden, wobei S. pombe sowie P. pastoris GFP am effektivsten sezernierten. Auf diese Weise konnten Proteinmengen von bis zu 2 mg GFP pro Liter Kulturmedium erhalten werden Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

8 W I S S E N S C H A F T Abb. 3: K28-Signalpeptid-vermittelte Sekretion von GFP in unterschiedlichen Hefegattungen. Fluoreszenzmikroskopie Western-Analyse von Hefetransformanten nach in vivo-expression eines Fusionsproteins aus dem viralen K28-Sekretionssignal dem grün fluoreszierenden Protein (GFP). Spur 1: Rekombinantes GFP (Positivkontrolle), Spur 2: Molekulargewichtsmarker, Spur 3: durch C. glabrata sezerniertes GFP, Spur 4: C. glabrata mit Leervektor, Spur 5: durch P. pastoris unter induzierenden Bedingungen sezerniertes GFP, Spur 6: P. pastoris unter nicht-induzierenden Bedingungen, Spur 7: durch S. cerevisiae unter induzierenden Bedingungen sezerniertes GFP, Spur 8: S. cerevisiae unter reprimierenden Bedingungen, Spur 9: S. pombe mit Leervektor, Spur 10: S. pombe unter reprimierenden Bedingungen, Spur 11: durch S. pombe unter induzierenden Bedingungen sezerniertes GFP. Zusammenfassend belegen unsere Daten das enorme Potential des K28-Sekretionsignals als neuartiges Werkzeug für biotechnologische pharmazeutische Anwendungen. Die Vorteile eines solchen Systems, das offensichtlich in verschiedenen Hefegattungen funktionell ist, liegen auf der Hand: die Herstellung eines einzigen Konstrukts auf genetischer Ebene erlaubt die Sekretion des jeweiligen Zielproteins in unterschiedlichen, biotechnologisch relevanten Hefen wie S. cerevisiae, Sz. pombe, Pichia pastoris oder C. glabrata. Diese Hefen unterscheiden sich zwar in einigen wichtigen biotechnologischen pharmazeutischen Eigenschaften wie etwa der Kapazität zur Sekretion Modifikation der rekombinant exprimierten Proteine im Vergleich zum jeweiligen Säugerprotein (insbesondere im O- N-Glykosylierungsmuster), im Unterschied zu Säugerzellen können sie jedoch stets in kostengünstigen Nährmedien kultiviert werden. Mit der Entdeckung eines in Hefen offenbar universell einsetzbaren Sekretionssignales entfällt damit die zeitaufwendige Suche nach einem für die jeweilige Hefe am besten geeigneten, homologen Sekretionssignal. Unsere zukünftigen Untersuchungen werden sich demzufolge auf die Sekretion von biotechnologisch/pharmazeutisch interessanten Proteinen konzentrieren, wobei wir das Potential des viralen Sekretionssignals nicht nur in weiteren biotechnologisch relevanten Hefen, sondern auch in filamentösen Pilzen sowie in Säuger- Insektenzellen analysieren werden. Literatur [1] Schmitt, M.J., Breinig, F., FEMS Microbiol Rev 26 (2002), [2] Heintel, T., Zagorc, T., Schmitt, M.J., Appl Microbiol Biotechol 56 (2001), [3] Eiden-Plach, A., Zagorc, T., Heintel, T., Carius, Y., Breinig, F., Schmitt, M.J., Appl Environ Microbiol 70 (2004), [4] Kunze, I., Hensel, G., Adler, K., Bernard, J., Neubohn, B., Nilsson, C., Stoltenburg, R., Kohlwein, S.D., Kunze, G., Biochim Biophys Acta 1410 (1999), [5] Laukkanen, M.L., Oker-Blom, C., Keimanen, K., Biochem Biophys Res Commun 226 (1996), Korrespondenzadresse Prof. Dr. Manfred J. Schmitt Lehrstuhl für Angewandte Molekularbiologie Universität des Saarlandes Postfach , D Saarbrücken Tel.: , Fax: mjs@microbiol.uni-sb.de Kennziffer 14 LW 05 LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/2004 9

9 B L I T Z L I C H T Molekulare Medizin Angeborene Herzfehler als molekulares Puzzle Silke Sperling, AG Cardiovascular Genetics, Abt. Vertebrate Genomics, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin Seit Jahrherten steht das Herz als bedeutendes Organ des menschlichen Körpers im Fokus des Interesses von Entwicklungsbiologen Medizinern. Dank der rasanten Entwicklung der Molekularbiologie konnten in den vergangenen 20 Jahren zahlreiche Gene zelluläre Interaktionen bei der Herzbildung Spezialisierung der kardialen Komponenten identifiziert werden. Heute stehen eine Vielzahl von Daten Techniken zur Sequenzierung, Annotierung funktionellen Charakterisierung des menschlichen Genoms der wichtiger Modellorganismen zur Verfügung. Dies eröffnet die Möglichkeit einer systematischen Untersuchung der Herzentwicklung. Ihr Ziel ist die Aufklärung des komplexen molekularen Interaktionsnetzwerkes auf den verschiedenen molekularen zellulären Ebenen immer betrachtet im Kontext des sich daraus entwickelnden morphologischen anatomischen Phänotyps. Vorangetrieben wird das Interesse für die Herzentwicklung auch von der klinischen Bedeutung angeborener Herzfehler. Das wachsende Verständnis der genetischen molekularen Basis von Entwicklung, Funktion Pathologie des Herzens führt zu einer Neudefinition der kardialen Pathophysiologie öffnet die Tür für die Entwicklung neuer Prognose- Diagnose-Verfahren sowie neuer Therapeutika (Biopharmazeutika, Gentherapien Organkulturen). Verbindungen zwischen den beiden Seiten oder auf Verengungen der Herzklappen. In ihrer Folge kommt es zur morphologischen molekularen Anpassung des Herzmuskels an die pathologischen Gegebenheiten. Das Verständnis der basalen Mechanismen der Entwicklung angeborener Herzfehler sowie der darauf basierenden Anpassungsvorgänge ist zur Zeit noch gering. Da die Vererbung angeborener Herzfehler nur selten den Mendelschen Gesetzen folgt mit einer inkompletten Penetranz einhergeht, gibt es nur wenige große Familien, welche für Kopplungsanalyse zur Identifizierung der ursächlichen Gene zur Verfügung stehen. Aus heutiger Sicht wird die Mehrheit der Herzfehler wahrscheinlich durch das Zusammenspiel vieler Gene verursacht (multigenetische Erkrankung), nur in wenigen Fällen liegt ein isolierter Gendefekt vor (z.b. NKX2.5, TBX5). Das breite phänotypische Spektrum bei identischen zugreliegenden Allelen verweist auf die Existenz bedeutender Modifikatoren, wobei unter anderem epigenetische Effekte, Polymorphismen Umweltfaktoren in Betracht gezogen werden. Korrelation klinischer molekularer Phänotypen Angeborene Herzfehler (AHF) werden definiert als strukturelle oder funktionelle Defekte des Herzens, die zum Zeitpunkt der Geburt bereits präsent sind, deren klinische Manifestation jedoch auch zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen kann. Man unterscheidet zwischen funktionellen Störungen des Herzmuskels (Kardiomyopathien), Arrhythmien strukturellen Defekten des Herzen (Malformationen). Letztere stellen mit einer Inzidenz von 0,8% die größte Gruppe aller angeborenen Fehlbildungen des Menschen dar. Allein in Deutschland werden jährlich etwa Kinder mit einem Herzfehler geboren. Im Verlauf der Embryogenese entsteht das Herz als erstes funktionsfähiges Organ. Es entwickelt sich beim Menschen zwischen der dritten siebten Embryonalwoche aus teilweise paarig angelegten Vorläuferstufen; als Ergebnis entsteht das vierkammrige Herz. Seine rechte Seite ist mit dem Niederdrucksystem der Lunge verben, die linke mit dem Hochdrucksystem des Körperkreislaufes. Herzmalformationen beruhen im allgemeinen auf nicht geschlossenen Für die Archivierung Analyse von Amino- Nukleinsäuresequenzen, Proteinen zellulären Strukturen verschiedener Spezies wurden in den vergangenen Jahren große internationale nationale Datenbanken angelegt (NCBI, EMBL etc.). Erkrankungs-spezifische oder Genmutations-spezifische Datenbanken enthalten sowohl klinische als auch genetische Informationen 1. Für die Verknüpfung von molekularen klinischen Phänotypen müssen jedoch beide in annähernd gleicher Detailschärfe dokumentiert werden. Für komplexe klinische Erkrankungen mit einer großen phänotypischen Variabilität stellt dies eine Herausforderung dar. In diesem Kontext entwickelten wir die CardioVascular Genetic-Datenbank (CVGdb) zur Korrelation des molekularen klinischen Bildes bei angeborenen Herzfehlern. Ein wesentlicher Schritt war die Entwicklung eines Phänotypschemas für angeborene Herzfehler, welches die Korrelation mit molekularen Daten (Genexpression, Sequenzvariationen) fördert. Die klinische Klassifizierung angeborener Herzfehler basiert auf anatomischen Charakteristika (Vorhofseptumdefekt, Hypoplastisches Linksherz) oder funktionellen Gesichtspunkten (verminderte Pumpfunktion, Vorhoftachykardie). Dies ist essentiell für die klinische Diagnose Therapie, jedoch nur sehr begrenzt geeignet für die Verknüpfung Abb. 1: Graphischer Output von d-matrix. Der Output besteht aus der Matrix, der Achsenbeschreibung, der Statistik sowie der hierarchischen Sortierfolge Links zu externen Ressourcen. In dem dargestellten Beispiel repräsentiert die x-achse der Matrix die Patienten-Records die y-achse die ausgewählten klinischen Charakteristika sowie Lokalisationen von Sequenzvariationen. Kennziffer 15 LW Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

10 TILLING : Automated Reverse Genetics Rapid acquisition of genomic sequence data has elevated a new discipline, functional genomics, which focuses on determination of gene function. Reverse genetics methodologies are an important part of functional genomics. Traditional reverse genetic methods, such as the use of transposons to knock out a specific gene, can accurately determine phenotype but require time consuming transgenic or sophisticated tissue culture methodologies 1. Such knockout methods are limiting because the entire gene is knocked out the effects of partial loss of function of an active gene cannot be observed. DETERMINING GENE FUNCTION THROUGH TILLING To overcome the limitations of knocking out an entire gene and to expand knowledge of active gene mutations, researchers from Fred Hutchinson Cancer Research Center developed a process for Targeting Induced Local Lesions In Genomes, or TILLING 2. Elegantly simple, yet highly efficient, TILLING uses chemical mutagenesis to yield a traditional allelic series of point mutations for virtually all genes. The TILLING process is of particular value for essential genes where sublethal alleles are required for phenotypic analysis. GENERATING HIGH QUALITY TILLING IMAGES The new LI-COR 4300 DNA Analysis System is uniquely suited for TILLING because it uses two-color infrared fluorescence detection to generate two true gel images during electrophoresis. Unprocessed image data are critical for TILLING because systems that highly process fluorescence data during detection will likely filter out most, if not all, mutations. With the 4300 System as the enabling technology, the following TILLING performance results can be achieved with a single instrument*: Up to 750,000 base pairs screened per run. Up to 2000 samples screened per day. Up to 2 million base pairs screened per day base pairs per sample. * Results are dependent on species and other factors. To Learn more about TILLING and the LI-COR System, visit our web site at or call today. References 1. Colbert, T., Till, B.J., et al High Throughtput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiology 126: McCallum, C.M., et al Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics. Plant Physiology 123: LI-COR Model 4300 DNA Analysis System LI-COR (Germany, Austria, Switzerland): +49 (0) LI-COR UK Ltd.: +44 (0) North America: TILLING is a registered trademark of Anawah, Inc.

11 B L I T Z L I C H T Genexpressionsprofile von normalen malformierten Herzen Abb. 2: Schematische Darstellung der molekularen Portraits der untersuchten Phänotypen ihrer Relation zu einander. norrv, norlv normaler rechter linker Ventrikel; TOF Morbus Fallot; RVH rechtsventrikuläre Hypertrophie; RVdis verschiedenste Fehlbildung mit RVH Förderung der Aufklärung des molekularen Bildes. Im Gegensatz zur klinischen Klassifizierung basiert die anatomische pathologische Beschreibung angeborener Herzfehler auf einer Segmentanalyse des Herzen; sie diente daher als Grlage zur Entwicklung der Phänotypisierung für die CVGdb. Der Phänotypisierungskatalog beinhaltet die anatomische, morphologischen, hämodynamischen elektrophysiologischen Charakteristika des Herzens. Er entstand in Kooperation mit dem Deutschen Herzzentrum in Berlin. In den vergangenen Jahren menhänge zwischen klinischem Bild molekularen Grlagen. Motiviert durch die Erfordernisse bei der Datenanalyse der angeborenen Herzfehler entwickelten wir d- matrix, eine Software zur Extraktion, Visualisierung Analyse von Daten. d-matrix ist Web-basiert kann mit gebräuchlichen Datenbanksystemen (Oracle, SQL, MS Access) interagieren. Das Visualisierungsmodell basiert auf der Form einer Matrix, die sich aus farbigen Boxen zusammensetzt. Deren Farbe gibt die Qualität der zugreliegenden Daten in ihrem Kontext wieder. Um ein detailliertes Bild der Genexpression in den verschiedenen Kompartimenten des Herzens zu erhalten, analysierten wir Gewebeproben der vier Herzkammern (rechter linker Vorhof Ventrikel) sowie der Hauptkammerscheidewand (interventrikuläres Septum) geser Herzen. Des weiteren verglichen wir die Expressionsmuster kardialer Gewebeproben von Patienten mit verschiedenen angeborenen Herzfehlern (Morbus Fallot (TOF); Ventrikelseptumdefekt (VSD) mit denen geser Herzen. Als Folge der Fehlbildung kommt es zu einer Adaptation der Herzmuskelzellen an die veränderten biomechanischen Verhältnisse. Außerdem sind die Herzen durch ihr genetisches Potential charakterisiert, welches Anteil an der Entwicklung des Herzfehlers selbst hatte. Es entstehen so komplexe Phänotypen, bei denen die biologischen Abläufe in den Zellen durch die verschiedenen primären sekären Faktoren bestimmt sind. Unser Ziel war es, durch Vergleich verschiedener Phänotypen deren typische Charakteristika herauszuarbeiten den Einfluß des genetischen Hintergres von sekären Adaptationsvorgängen zu unterscheiden. So verglichen wir Abb. 3: Übersicht über die molekularen Portraits verschiedener Phänotypen. Dargestellt sind die annotierten Gene, die in mindestens einem Phänotyp-Vergleich signifikant differentiell exprimiert sind (P<0.01). Die Spalten (horizontal) entsprechen den verschiedenen Vergleichen, jede Zeile (vertikal) repräsentiert ein Gen. Der log10(p) ist farbkodiert in gelb bis rot für hoch-regulierte Gene in gelb bis grün für herunter-regulierte Gene. Vergleich zwischen TOF bzw. VSD versus normales Herzgewebe der gleichen Lokalisation TOF in RV bzw. VSD in RA. Vergleich Vorhof versus Ventrikel A vs V. Vergleich rechter versus linker Ventrikel RV vs LV. wurden so mehr als 500 Herzen detailliert charakterisiert. Um ein ebenso detailliertes Bild des molekularen Phänotypus zu erhalten, analysierten wir in einer ersten Studie mit 50 Patienten die Aktivität weitestgehend aller Gene führten Sequenzanalysen zur Identifizierung von Mutationen krankheitsrelevanten Polymorphismen durch. Neben der Akquirierung der klinischen molekularen Daten spielen Exploration, Analyse Mining von Daten eine zentrale Rolle bei der Aufdeckung der Zusamd-matrix ermöglicht sowohl die Fokussierung auf einzelne Datenpunkte die verbenen Informationen als auch den Überblick über Datengruppen. Neben der implementierten deskriptiven analytischen Statistik helfen Sortierung Clusterbildung bei der Vermittlung eines Bildes über die Daten die Zusammenhänge zwischen ihnen. Die Anwendung von d-matrix auf CVGdb zur Analyse von klinischen Charakteristika angeborener Herzfehler im Zusammenhang mit Sequenzvariationen ist in Abbildung 1 dargestellt. den Phänotyp bei Morbus Fallot, für den ein enger genetischer Hintergr anzunehmen ist der mit einer adaptativen rechtsventrikulären Hypertrophie (RVH) einhergeht, mit verschiedenen anderen Fehlbildungen (RVdis), die jedoch im adaptativen Prozeß gleich sind. Das Konzept dieser Analysen ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Vergleich der Expressionsmuster der normalen malformierten Herzen zeigte charakteristische Profile für die verschiedenen Phänotypen (Abb. 3). Der wesentliche molekulare Unterschied zwischen den beiden Vorhöfen Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

12 B L I T Z L I C H T Ventrikeln konnte bestätigt zusätzlich blind durch eine Klassendifferenzierungsmethode (ISIS) herausgefiltert werden. Aufgr des genomweiten Ansatzes der Untersuchungen der großen Datenmenge von r 9 Millionen Genexpressionsmeßwerten, verben mit den allgemeinen, interindividuellen Unterschieden bei der Analyse von humanen Proben, stellt die Auswertung solcher Daten die Zusammenfassung der Analysen zu interpretierbaren biologischen Aussagen eine Herausforderung dar. Wir verwandten unter anderem die statistische Methode der Korrespondenzanalyse, welche es erlaubte, die Assoziation funktioneller Genkategorien mit bestimmten Phänotypen zu visualisieren (Abb. 3). Je weiter ein biologischer Prozeß (blau) vom Mittelpunkt des Ursprungs der Linien (kardiale Phänotypen) entfernt ist je näher er an einer bestimmten Linie liegt, desto stärker sind die an diesem Prozeß beteiligten Gene bei dem jeweiligen Phänotyp in ihrer Aktivität verändert. Bei der rechtsventrikulären Hypertrophie spielen beispielsweise die Gene eine wichtige Rolle, die an der Reaktion der Herzmuskelzelle auf äußere Reize oder Streß beteiligt sind. Ausblick Die identifizierten spezifischen Genexpressionsprofile der Herzkompartimente deren Fehlbildungen sind ein kleines Teil im Puzzle des komplexen Netzwerkes, welches diesen Phänotypen zugre liegt. Darauf aufbauend richtet sich der Fokus unserer aktuellen Forschung auf die Regulationsmechanismen, welche zu ihrer Entstehung beitragen. Einen ersten Hinweis auf Transkriptionsfaktoren, die die Regulation der Expression dieser Gene kontrollieren, geben bioinformatisch ermittelte potentielle DNA-Bindungsstellen innerhalb der Promotorregion dieser Gene. Dabei erscheint insbesondere die Fokussierung auf konservierte Sequenzbereiche des Menschen im Vergleich zur Maus sinnvoll. So konnten die von uns gefenen spezifischen Profile der verschiedenen Herzkompartimente durch eine Studie in der Maus bestätigt werden. Die potentiellen Regulationsmechanismen können mittels der Chromatin-Immunpräzipitation verifiziert werden. In diesem Zusammenhang sollten auch epigenetische Einflüsse, Abb. 4: Zusammenfassende Darstellung der Genexpressionsmeßwerte durch Korrespondenzanalyse. Die Assoziation bestimmter biologischer Prozesse mit den untersuchten angeborenen Herzfehlern dem gesen Herzen sind visualisiert (siehe Text). die Regulation durch DNA-Methylierung Histonmodifizierung beachtet werden. Die detaillierte klinische molekulare Phänotypisierung angeborener Herzfehler, verben mit hochentwickelten bioinformatischen Analysen, eröffnet die Möglichkeit zur Charakterisierung der zugreliegenden komplexen Netzwerke. Eine detaillierte Aufschlüsselung der Zusammenhänge Grlagen des Netzwerkes der Herzentwicklung wird ein in hohem Maße verbessertes Verständnis dieser Prozesse ermöglichen zur Entwicklung neuer interventioneller Strategien zur Therapie der Erkrankungen beitragen. Danksagung Die vorgestellten Arbeiten entstanden in enger interdisziplinärer Kooperation zwischen den Abteilungen für Kinderkardiologie Herzchirurgie des Deutschen Herzzentrums Berlin (Dr. S. Mebus, Dr. H.-P. Sperling, Prof. Dr. Peter E. Lange, Prof. Dr. Roland Hetzer), der Abteilung für Computational Biology (Dr. A. von Heydebreck, Prof. Dr. Martin Vingron) in der Abteilung Vertebrate Genomics (Prof. Dr. Hans Lehrach) der Arbeitsgruppe Cardiovascular Genetics (B. Kaynak, S. Seelow, R. Galli, Dr. C. Grimm, Dr. Silke Sperling). Die Arbeiten wurden durch die Max-Planck-Gesellschaft als Tandem-Projekt dem Besministerium für Bildung Forschung (Projekt 01GR0105/1055) unterstützt. Literatur [1] GenomeWeb. [2] Kaynak, B., von Heydebreck, A., Mebus, S., Seelow, D., Hennig, S., Vogel, J., Sperling, H. P., Pregla, R., Alexi-Meskishvili, V., Hetzer, R., Lange, P. E., Vingron, M., Lehrach, H. and Sperling, S. (2003). Genome-wide array analysis of normal and malformed human hearts. Circulation, 107, [3] von Heydebreck, A., Huber, W., Poustka, A. and Vingron, M. (2001). Identifying splits with clear separation: a new class discovery method for gene expression data. Bioinformatics, 17 Suppl 1, S [4] Fellenberg, K., Hauser, N. C., Brors, B., Neutzner, A., Hoheisel, J. D. and Vingron, M. (2001). Correspondence analysis applied to microarray data. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, [5] Tabibiazar, R., Wagner, R. A., Liao, A. and Quertermous, T. (2003). Transcriptional profiling of the heart reveals chamber-specific gene expression patterns. Circ Res, 93, [6] Gruber, P. J. and Epstein, J. A. (2004). Development gone awry: congenital heart disease. Circ Res, 94, Korrespondenzadresse Dr. Silke Sperling Max-Planck-Institut für molekulare Genetik Ihnestr. 73, D Berlin sperling@molgen.mpg.de Kennziffer 16 LW 05 Informationen ordern? LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/

13 B L I T Z L I C H T Metagenomics Technologien zum Erschließen nicht-kultivierbarer Mikroorganismen Dr. Patrick Lorenz, Dr. Jürgen Eck Dr. Holger Zinke, BRAIN AG Zwingenberg, Deutschland In den letzten Jahren ist es aufgr neuartiger in situ-markierungsmethoden für Bakterien Archaea klar geworden, daß nur ein Bruchteil der in einer durchschnittlichen Umweltprobe vorliegenden mikrobiellen Spezies im Labor kultiviert werden kann. Da eine Vereinzelung Reinkulturdarstellung jedoch bis dato eine Voraussetzung für die Charakterisierung damit die biotechnologische Erschließung von Mikroorganismen darstellte, war die überwiegende Mehrzahl der Vertreter dieser taxonomisch physiologisch diversen Gruppe von Organismen mit ihrer zu erwartenden Vielzahl neuartiger Enzyme außerhalb der Reichweite einer technologischen Nutzung. Neuartige Methoden der direkten Extraktion Klonierung von DNA aus Umweltproben erlauben es, die Kultivierung zu umgehen das genetische Material ganzer Konsortien unbekannter Mikroorganismen das Metagenom in leicht kultivierbare Wirtstämme wie Escherichia coli zu transferieren dort zu vermehren. Die Herausforderung besteht darin, in solchen Genbanken die Gene für technisch interessante Enzyme Wirkstoffe aufzuspüren zu isolieren, die Substanzen rekombinant herzustellen auf ihre Eigenschaften hin zu überprüfen. zu benötigten Faltungshilfen Cofaktoren der gesuchten Genprodukte. Während E. coli als primäres Wirtssystem zur heterologen Expression dem aktivitätsbasierten Screening erfolgreich die Beschreibung neuartiger Enzyme bioaktiver Proteine Peptide ermöglicht (Abb. 2), zeigt sich für einzelne Enzymklassen insbesondere für die Darstellung von Sekärmetaboliten aus großen Synthesegen-Clustern eine Beschränkung Limitierung des E. coli-systems. Eine Lösung des Problems breitere funktionelle Erschließung von Metagenom- Ressourcen bietet die Entwicklung eines Shuttle-Vektor-Systems, welches das Übersetzen Spiegeln der umfangreichen Metagenom-Genbanken in verschiedene Wirtsorganismen ermöglicht. Dieses Shuttle-System erlaubt ein Aktivitäts-basiertes Screening sogenannter Large-Insert-Libraries (LIL) mit mehr als 40 kbp großen Synthesegen-Clustern für Sekärmetabolite sowie die funktionelle Darstellung anspruchsvoller Enzymklassen Biomaterialien. Mit der Entwicklung des plil EX-Systems stehen nun mit E. coli, Key Words: Metagenom, nicht kultivierbare Mikroorganismen, Screening, Genbank, Enzyme, Wirkstoffe Mit Einführung der molekularen Taxonomie, die eine phylogenetische Einordnung von Organismen anhand ihrer Nukleinsäuresequenzen (insbesondere der ribosomalen 16SrDNA) erlaubt, von Methoden zur ebenfalls DNA-basierten direkten spezifischen Visualisierung von Mikroorganismen in Umweltproben (FISH Fluoreszenz in situ-hybridisierung) wurde deutlich, daß nur ein verschwindend geringer Anteil (<1%) der in einer Bodenprobe vorkommenden Bakterienarten (bis zu unterschiedliche Spezies) kultivierbar sind 1. Da eine Kultivierung bislang die Voraussetzung für eine Charakterisierung auch die biotechnologische Nutzung von Mikroorganismen ihren Enzymen darstellte, blieb der größte Anteil der mikrobiellen Diversität bislang unsichtbar, unbekannt ungenutzt. Mit der Entwicklung von Technologien zur direkten, kultivierungsunabhängigen Extraktion von Nukleinsäuren ganzer mikrobieller Konsortien aus Umweltproben (Metagenom) ist es möglich, Gene unbekannter Bakterien zu gewinnen rekombinant, mittels geeigneter Vektoren in Ersatzwirten wie Escherichia coli zu vermehren, zu analysieren zu exprimieren (Abb. 1) 2. Dieser wesentlich erweiterte genetische Zugang zur Enzymausstattung hochdiverser Mikroorganismen verspricht die Implementierung neuartiger Enzyme in einer Vielzahl biotechnologischer Anwendungen, für die in der kul- tivierbaren Biodiversität bislang kein geeigneter Biokatalysator gefen werden konnte 3,4. Die Dimensionen dieses erweiterten Angebots an zugänglichen neuartigen Proteinen, Enzymen Wirtstoffen wurde jüngst in einer Arbeit von US-Genomicspionier Craig Venter verdeutlicht 5. Die Sequenzierung metagenomischer DNA nicht-kultivierter planktonischer Bakterien aus der Sargasso-See im Atlantischen Ozean förderte weit mehr als eine Million unbekannter proteinkodierender Gene zu Tage. Dies übertrifft die Anzahl der Einträge in der Standard-Datenbank für Enzyme (SwissProt) bereits um den Faktor 10. Functional Metagenomics Abb. 1: Metagenomics versus klassische Isolationsstrategien. Klassische Strategien (links) zur Gewinnung biotechnologisch relevanter Mikroorganismen setzen deren Kultivierbarkeit die Darstellung von Reinkulturen voraus. Typischerweise sind höchstens 1% der vorhandenen mikrobiellen Spezies kultivierbar (rot). Sie können z.t. nach Vereinzelung direkt zur Produktion von Enzymen oder Wirkstoffen genutzt werden. Alternativ ist es möglich, relevante Gene aus der isolierten genomischen DNA (rot) dieser Organismen in Vektoren zu klonieren in Wirtszellen wie E. coli rekombinant zu exprimieren. Der Metagenomansatz (rechts) erfaßt im Gegensatz dazu theoretisch alle in einem Biotop vorhandenen Organismen. Deren genomische DNA wird direkt isoliert (Metagenom-DNA, rot, grün, blau, gelb) mittels geeigneter Vektoren in E. coli kloniert vermehrt. Die als Genbank im Wirtsorganismus abgelegte metagenomische DNA zahlreicher Spenderorganismen kann anschließend nach Sequenzhomologie bevorzugt nach exprimierter Aktivität interessierender Biokatalysatoren (rot, grün, blau, gelb) durchsucht werden. Mit dem Zugang zu codierenden Gensequenzen nicht-kultivierter Mikroorganismen in umfangreichen Genbanken tritt die Metagenom-Forschung in die nächste Phase ein. Für eine biotechnologische Nutzung ist das funktionelle Erschließen des Metagenoms das Bereitstellen aktiver Enzyme, bioaktiver Naturstoffe funktioneller Biomaterialien aus den nichtkultivierbaren Ressourcen essentiell erfolgskritisch. Die Schwierigkeit ergibt sich hierbei aus der enormen genetischen Diversität der Metagenom-DNA hinsichtlich Transkriptions- Translations-Kontrollelementen, Genstruktur posttranslationalen Modifikationen Adressierungen bis hin Kennziffer 17 LW Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

14 lift to the max The new autoflex TOF/TOF enables high throughput routine protein identification by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting, immediately followed by more detailed protein characterization using MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry on the same sample. Comprehensive MS/MS information is available from minute sample amounts within a few seconds. autoflex TOF/TOF incorporates our patented AnchorChip technology, which provides homogeneous, exactly-positioned samples on the MALDI target for robust and fast automation, as well as a sensitivity boost by an order of magnitude. The autoflex TOF/TOF: High Productivity and Efficiency. Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry Bruker Daltonik GmbH Bremen, Germany sales@bdal.de Bruker Daltonics Inc. Billerica, USA ms-sales@bdal.com

15 B L I T Z L I C H T Bacillus subtilis, Streptomyces lividans Mycobacterium smegmatis mehr Wirtsorganismen zum funktionellen Erschließen des Metagenoms zur Verfügung. Neben laufenden Arbeiten zur Erweiterung des Systems mit Pseudomonas stutzeri gelang es in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christa Schleper an der TU Darmstadt, das hyperthermophile Archaeon Sulfolobus solfataricus erstmals zur heterologen Genexpression zu nutzen 6. Mit dem Ziel der Implementierung dieser Wirtsorganismen in das plil EX-System steht ein System zur Verfügung, welches mit Vertretern der Gram-positiven Gram-negativen Mikroorganismen, solchen mit hohen oder niedrigen GC-Gehalt sogar Archaea der genetischen Diversität des Metagenoms gerecht wird (Abb. 3). Eine in E. coli erstellte Master-Metagenombank wird durch Einbringen wirtsspezifischer Sequenzelemente als Metagenombank für den gewünschten Sekärwirt gespiegelt in nachgeschalteten Screening-Kampagnen die gesuchte enzymatische Aktivität oder Wirkung von Metaboliten funktionell identifiziert. Metagenomics neue Möglichkeiten für die Weiße Biotechnologie Die Weiße Biotechnologie erlebt derzeit einen bemerkenswerten Aufschwung: Allein in der chemischen Industrie verdoppelte sich in jüngerer Zeit die Anzahl der enzymatischen Abb. 2: Expressionsscreening nach neuen Enzymen. Der bevorzugte Weg, in Metagenombanken nach neuen Enzymen zu suchen, ist der Nachweis exprimierter Aktivität. Die Abbildung zeigt gerastert auf einer Agarplatte angezogene Metagenomklone (E. coli), die hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht wurden, ein lipidartiges Substrat (Tributyrin) abzubauen. Zwei Klone mit Lipase/Esterase-Aktivität fallen durch Substratabbauhöfe um die Kolonien auf. Die Sequenzanalyse der in ihnen klonierten metagenomischen DNA ergab, daß es sich um Gene bislang unbekannter Lipasen handelte. Produktionsverfahren auf derzeit mehr als Eine weitere Beschleunigung der Etablierung biotechnologischer Prozesse ergibt sich aus dem erweiterten Zugriff der Verfügbarkeit von neuartigen Enzymen Biokatalysatoren aus dem Metagenom. Durch Aktivitäts-basiertes Screening funktionelle Expression von Metagenom-Ressourcen ist es mittlerweile möglich, umfassende Sammlungen von hochdiversen hinsichtlich ihrer enzymatischen Eigenschaften stark unterschiedlichen Biokatalysatoren in Form von sogenannten Enzym-Banken vorzuhalten, die zum Teil mehrere Hert Enzyme umfassen. In diesen ist es möglich, innerhalb weniger Wochen Kandidatenenzyme zu identifizieren, die den Prozeßanforderungen, wie Substratspezifität, Enantioselektivität oder Stabilitätsanforderungen, entsprechen Grlage einer weitergehenden Prozeßentwicklung sein können. Von dem Erschließen von Naturstoffen niedermolekularen Metaboliten der nicht-kultivierbaren Biodiversität mit der Möglichkeit der funktionellen Expression wird ebenfalls ein Schub für die Beschreibung bioaktiver Substanzen für die pharmazeutische kosmetische Industrie ausgehen. Die Suche nach dem idealen Biokatalysator Während bislang die eingeschränkte Verfügbarkeit von interessanten Enzymen Biokatalysatoren aus einer nur in geringem Umfang zugänglichen Biodiversität den Einsatz in biotechnologischen Prozessen erschwerte ein suboptimales Prozeß-Design mit suboptimalen Biokatalysatoren die Folge war, verspricht die Metagenomtechnologie in Kombination mit den modifizierenden Werkzeugen der molekularen in vitro-evolution wesentlich besser an Prozeßbedingungen angepaßte Enzyme zu finden maßzuschneidern 8. Literatur Abb. 3: Heterologe Genepression metagenomischer DNA in diversen Wirtsorganismen. Der aufgr seiner genetischen Transformationseffizienz bevorzugte Primärwirt für die Anlage von Metagenombanken Escherichia coli weist zum Teil Defizite in der Erkennung heterologer Genregulationselemente somit der Expression metagenomischer DNA unbekannter Herkunft auf. Dieses Problem wird mit der wirtspezifischen Umformatierung (Konversion) in E. coli erzeugter Primärbanken (LILEX System) gelöst. Genomische DNA aus kultivierten oder nicht-kultivierten Mikroorganismen (Metagenom) kann somit entweder direkt in E. coli, oder nach Integration wirtsspezifischer Sequenzelemente (Konversion) Transfer in die Endwirte Bacillus, Streptomyces, Mycobacterium, Pseudomonas oder Sulfolobus hinsichtlich einer Expression gescreent werden. [1] R.I. Amann et al., Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation, Microbiol. Rev. 59, (1995) [2] M.R. Rondon et al. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms, Appl. Environ. Microbiol. 66 (6), (2000) [3] P. Lorenz, et al., Screening for novel enzymes for biocatalytic processes: accessing the metagenome as a resource of novel functional sequence space, Curr. Opin. Biotechnol. 13, (2002) [4] P. Lorenz et al., The Impact of Non-cultivated Biodiversity on Enzyme Discovery and Evolution, Biocatal. Biotransform. 21 (2), (2003 ) [5] J. C. Venter et al., Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea, Science (2004) [6] M. Jonuscheit et al,. A reporter gene system for the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus based on a selectable and integrative shuttle vector, Mol. Microbiol 48, (5), (2003) [7] A.J. Straathof et al, The production of fine chemicals by biotransformations, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (6), (2002) [8] S.G.Burton et al., The search for the ideal biocatalyst, Nature Biotechnol. 20 (1), (2002) Korrespondenzadresse BRAIN Aktiengesellschaft Darmstädterstr. 34, D Zwingenberg Tel.: +49-(0) Fax: +49-(0) info@brain-biotech.de Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

16 B L I T Z L I C H T Molekulare Diagnostik DNA-Chips für Forschung Diagnostik an klinisch relevanten Mikroorganismen Dr. Holger Eickhoff, Scienion AG, Berlin, Als Resultat weltweiter Forschungsaktivitäten sind heute mittlerweile die kompletten Genomsequenzen von einigen hert Bakterien sowie von vielen Chromosomen einfacher eukaryotischer Organismen ermittelt 1. Ein Großteil dieser Sequenzdaten liegt öffentlich zugänglich vor, wobei eine Vielzahl der Genome zwar sequenziert, aber nicht vollständig annotiert ist. Die Verfügbarkeit einer ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzinformation sowie die Weiterentwicklung von molekularen Techniken eröffnen neue Wege zur Beantwortung zentraler biologischer medizinischer Fragestellungen. In der Mikrobiologie beispielsweise zeigt der zunehmende Einsatz von modernen Methoden wie der DNA-Chip-Technologie kontinuierliche Fortschritte, insbesondere bei der Erforschung Diagnostik von Pathogenen. Vergleichende Genomanalysen verschiedener Organismen verdeutlichen, daß auch innerhalb einer bakteriellen Spezies signifikante Unterschiede hinsichtlich der Genomgröße -organisation bestehen 2. Solche Untersuchungen können mit Microarrays durchgeführt werden ermöglichen so die Identifizierung bislang unbekannter Gene sowie te zielgerichtete Therapien bakterieller Infektionen zu entwickeln. Resistente Erreger im Visier Alternative in PROTEOMELAB FROM TISSUES TO TARGETS der Proteomanalytik Identify Isolate Fractionate Characterize Evaluate Diagnose ProteomeLab PF2D Proteinfraktionierung mit zweidimensionaler Chromatographie Intakte Proteine in flüssiger Phase Differential Display zum Auffinden von Target Proteinen Ideal für Biomarker Kein Spot Picking oder Anfärben der Proteine wie bei Gelen Abb. 1: Verteilung der open reading frames (ORFs) des annotierten Staphylococcus aureus-n315- Stammes in 50 Bp-Inkrementen. Die durchschnittliche Länge der insgesamt ORFs beträgt 907 bp, etwa 100 ORFs sind kürzer als 200 bp. In den vergangenen Jahren haben Infektionen mit multiresistenten, schwer behandelbaren Infektionserregern beängstigend zugenomeine Zuordnung von Pathotyp-spezifischen Gengruppen, was zur Entwicklung Verbesserung von Therapie- Präventionsmöglichkeiten beiträgt. Momentan noch überwiegend in der Forschung eingesetzt, kann die DNA-Chip-Technologie in der molekularen Pathologie neue Ansätze für Epidemiologie, Diagnostik Risk Assessment liefern. Insbesondere können mit Chiptechnologien Analysen der genomweiten Regulation bakterieller Gene durchgeführt werden. Dies ist von besonderem medizinischen Interesse im Hinblick auf Antibiotikaresistenzen, um in Zukunft verbessermen. Insbesondere multiresistente Gram-positive Keime, wie Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE) sind zu Problemkeimen im neuem Jahrtausend geworden breiten sich stark aus. Besonders fatal ist die Resistenz gegen Methicillin (= Oxacillin), die auf einer Veränderung des Penicillin-Bindeproteins II beruht. Diese Mutation bedingt nicht nur eine Resistenz gegen die üblichen Staphylokokken-Penicilline wie Flucloxacil- Kennziffer 18 LW 05 Beckman Coulter GmbH Europark Fichtenhain B13, Krefeld Telefon: /33 3-5, FAX: / bioresearch.de@beckman.com LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/ Die ProteomeLab PA800 Proteincharakterisierung Qualitätskontrolle Isoelektrische Fokussierung SDS PAGE zur Bestimmung der molaren Masse Glykoprotein Mapping IgG Heteregonität von Antikörpern

17 B L I T Z L I C H T lin oder Oxacillin, sondern gegen sämtliche Beta-Lactam-Antibiotika (Cephalosporine, Penicilline plus Betalactamase-Inhibitoren, Carbapeneme). Zur Therapie bleiben oft nur Glykopeptide wie Vancomycin oder Teicoplanin übrig. In den USA treten seit kurzem Stämme auf, die auch gegen diese Antibiotika nicht mehr empfindlich sind (VRSA = Vancomycin-resistente Staph. aureus; VISA = Vancomycin-intermediäre Staph. aureus) (www. cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5126a1. htm). Staphylococcus aureus-bakterien verursachen eine Vielzahl verschiedener Infektionen bei Menschen stellen insbesondere durch die zunehmenden Antibiotikaresisten- Abb. 2: S. aureus-full genome-microarray nach Kontrollhybridisierung. Die auf dem Microarray befindlichen Kontrollen, die sich in jedem Spottingblock befinden, erlauben eine präzise Normierung Auswertung. zen ein gravierendes Problem in Krankenhäusern, ein hohes Gesheitsrisiko für (geschwächte) Patienten einen beträchtlichen Kostenfaktor für das Gesheitswesen dar. Es besteht ein klarer Bedarf, die molekularen Ursachen für die Pathogenizität dieser Keime, die teilweise vollkommen unauffällig auf der Haut von vielen Patienten leben, zu verstehen eine zielgerichtete Diagnostik zu entwickeln. Basierend auf der Genomsequenz von Staphylococcus aureus N315 ( nih.gov/taxonomy/browser/wwwtax.cgi? id=158879) auf anderen öffentlich verfügbaren Sequenzen hat Scienion im Rahmen des PathoGenoMik-Netzwerkes 3 in Zusammenarbeit mit der Universität Würzburg einen full genome-array für diese Spezies entwikkelt produziert. Dabei wurde auf die vorhandene, öffentliche Annotierung aufgesetzt. In anderen Fällen hat Scienion auch schon vollständige, aber nur in der Rohsequenz vorliegende Genome in Zusammenarbeit mit dem Max-Planck-Institut für molekulare Genetik (Berlin) komplett annotiert. Basierend auf der Annotation wurden genspezifische Primersets für die einzelnen Gene so designt, daß durch Amplifikation genomischer DNA sehr spezifische DNA-Fängerson- den auf den Microarray aufgebracht werden konnten. Die hergestellten Fängersonden wurden vor der Immobilisierung auf dem Array vollständig sequenziert konzentrationsnormalisiert. Die so hergestellten full genome-arrays wurden werden von den im PathoGeno- Mik-Netzwerk beteiligten Forschergruppen (AG Hacker/Ziebuhr, Universität Würzburg, AG Götz/Rosenstein, Universität Tübingen, AG Peters/v Eiff/Becker, Universität Münster, AG Bierbaum, Universität Bonn, AG Hecker/ Engelmann, Universität Greifswald) mit Erfolg eingesetzt. Basierend auf den Ergebnissen der genomweiten Untersuchungen verschiedener Staphylococcus-Spezies werden so neue Markersets für die Diagnostik Virulenzanalyse pathogener Keime etabliert. Im Rahmen dieser Arbeiten werden die bakterielle Genomorganisation, die Verbreitung von Virulenz-assoziierten Genen sowie deren Funktion Expression bei S. aureus verwandten Keimen untersucht. Als ein Modellorganismus dient der Stamm S. aureus N315. Von der Forschung zur molekularen Routine-Diagnostik Noch klafft zwischen den in der Grlagenforschung eingesetzten full genome-arrays der molekularen Diagnostik eine erhebliche Lücke, insbesondere was die Preise die momentan noch sehr komplexe Auswertung der verwendeten Arrays angeht. Eine mögliche Reduktion der Fängersondenzahl kann dabei ein zentraler Bestandteil für eine Lösung dieser Probleme sein, da so die Auswertung vereinfacht die Herstellungskosten erheblich gesenkt werden können. Die Herstellung dieser spezifischen Subsets kann aus den full genome-array-daten erfolgen, die in einem bestimmten experimentellen Zusammenhang, beispielsweise Screeningexperimenten zu Antibiotikaresistenzen, erzeugt wurden. In nahezu allen beobachteten Fällen lassen sich so pathway- oder applikationsspezifische Arrays aus einigen Dutzend bis wenigen 100 verschiedenen Fängersonden herstellen. Scienion hat in Zusammenarbeit mit Greiner BioOne ( eine Plattform entwickelt, die es erlaubt, bis zu 12 solcher applikationsspezifischen Arrays auf einem Plastikobjektträger aufzubringen. Mit der Verwendung der HTA-Plattform wird bei gleicher Empfindlichkeit der Durchsatz applikationsspezifischer Chips drastisch erhöht, ohne daß der Preis um den Faktor 12 in die Höhe schnellt. Abschied von Breitbandantibiotika Übergeordnetes Ziel der aktuellen Forschungsarbeiten ist die Entwicklung von Microarrays für den Einsatz in diagnostischen Labors, um die zielgerichtete Therapie mit spezifischen Antibiotika zu ermöglichen Abb. 3: Vier PCR-Fragmente aus dem Staphylococcus aureus-full genome array, die in einem kompartimentierten HTA-Träger immobilisiert wurden. Jedes Kompartiment trägt dabei ein 3 x 3 Spot großen Subarray pro PCR- Fängersonde. In den links gezeigten Experimenten werden alle nach der Chipherstellung detektierbaren Spots gezeigt, während in der rechten Reihe die Inkubation der vier Kompartimente mit vier verschiedenen komplementären Sonden gezeigt ist. Das Experiment zeigt deutlich spezifische Hybridisierungen keine Cross-Reaktionen an. damit die Verwendung von Breitbandantibiotika einzuschränken, die Resistenzbildungen begünstigen. Das Verfahren der Chipentwicklung ist nicht nur für Staphylokokken, sondern für eine Vielzahl von Keimen anwendbar, die derzeit ebenfalls erforscht werden. Notwendiges Erfolgskriterium bei der Entwicklung solcher spezifischer Diagnosechips ist die enge Verzahnung zwischen Forschung, Klinik industriellen Plattformtechnologie-Anbietern, die die effektive Umsetzung in marktfähige Produkte gewährleistet. Literatur [1] [2] Herron-Olson L, Freeman J, Zhang Q, Retzel EF, Kapur V., MGView: an alignment and visualization tool to enhance gap closure of microbial genomes, Nucleic Acids Res Sep 1;31(17):e106. [3] pathogenomikwuerzburg.html Korrespondenzadresse Dr. Holger Eickhoff Scienion AG Volmerstr. 7b D Berlin info@scienion.de, Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

18 B L I T Z L I C H T Wirkstoff-Entwicklung sirna Entwicklung einer neuen Klasse von Therapeutika Dr. Roland Kreutzer, Dr. Matthias John, Dr. Stefan Limmer Dr. Hans-Peter Vornlocher, Alnylam Europe AG, Kulmbach Die RNA-Interferenz ist für die Postgenomics zum wichtigsten Hilfsmittel bei der Analyse von Genfunktionen geworden. Methoden zum gene silencing mit Hilfe von sirnas oder auf Vektoren basierenden Verfahren sind einfach anzuwenden äußerst effizient, auch bei Säugerzellen. Die sirnas haben darüber hinaus das Potential, in naher Zukunft eine neue Klasse von Therapeutika hervorzubringen. Im Vergleich zu ihrer Verwendung als Tool ist es jedoch unvergleichlich aufwendiger, aus diesen Molekülen Medikamente zu entwickeln. Neueste in vivo-ergebnisse sind sehr ermutigend zeigen, daß auf dem Gebiet der sirna-wirkstoffentwicklung erhebliche Fortschritte gemacht wurden. Die Herausforderung hierbei ist, aus natürlicherweise vorkommenden Molekülen wirksame, stabile gleichzeitig sichere Therapeutika zu entwickeln. Key Words: RNA-Interferenz, RNAi, sirna, Therapeutika Die RNA-Interferenz (RNAi) als bis dahin nicht bekanntes biologisches Prinzip wurde 1998 entdeckt 1. Bei der RNAi vermitteln doppelsträngige RNA-Moleküle, die aus zwei Oligonukleotiden mit einer Kettenlänge von jeweils Nukleotiden (short interfering RNAs, sirnas) bestehen, einen höchst effizienten enzymatischen zellulären Prozeß. Dieser führt spezifisch zum Zerschneiden der mrna, deren Sequenz komplementär zum Antisense-Strang der sirna ist. Seit der Entdeckung der RNAi ist ihre gezielte Anwendung als Werkzeug zur Identifizierung von Genfunktionen der Validierung von therapeutisch interessanten Genen zu einer Erfolgsgeschichte geworden. Die RNAi hat weltweit in den biologischen Labors Einzug gehalten sich damit als eines der wichtigsten Werkzeuge der Molekular- Zellbiologie etabliert 2. Mit Hilfe der RNAi ist es möglich, einzelne Gene sowie ganze genetische Netzwerke mit höherem Durchsatz als zuvor zu analysieren. Neben Analysen in Modellorganismen können in humanen Zellkultursystemen sirnas sowie auch Vektor-codierte short hairpin RNAs (shrnas) eingesetzt werden. Unter Verwendung von sirna-bibliotheken wurden bereits die Funktionen tausender menschlicher Gene untersucht 3 solche identifiziert, die mit Krankheiten wie etwa Krebs assoziiert sind. Die vergleichsweise unkomplizierte Verwendung von sirnas legt es nahe, noch einen Schritt weiterzugehen ihr Potential für therapeutische Zwecke zu erken. Die Firmen Alnylam Pharmaceuticals Inc., Alnylam Europe AG haben es sich zum Ziel gesetzt, das biologische Prinzip der RNAi für die Entwicklung neuartiger Therapeutika auf Basis von sirnas einzusetzen. Nach dem Erfolg der gentechnisch hergestellten therapeutischen Proteine den therapeutischen Antikörpern könnte die sirna zur nächsten großen Therapeutika-Plattform aufsteigen. Auf dieser Grlage könnten Medikamenten- Abb. 1: Relative Inhibition der Expression eines endogenen Zielgens bei Transfektion von HeLa- Zellen mit sirnas unterschiedlicher Sequenz. Durch eine Auswahl geeigneter Sequenzen kann die Effizienz erheblich gesteigert werden. Bei drei der gezeigten sirnas reicht bereits eine Konzentration von 6 nm zur maximalen Inhibition der Expression des Zielgens aus. Kandidaten entwickelt werden, die gezielt die Expression krankheitsassoziierter Gene inhibieren somit wesentlich spezifischer als herkömmliche Mittel wirken. Wahrscheinlich können mit der sirna auch sogenannte Targets ansprochen werden, die mit bisher bekannten Therapieansätzen nicht adressierbar sind (non-druggable targets). sirna: Vom biologischen Molekül zum Arzneimittel Es ist relativ einfach, unter Beachtung weniger Kriterien bei der Sequenzauswahl, geeignete sirnas für die Genanalyse zu identifizieren herzustellen. Weitaus anspruchsvoller ist die Entwicklung eines sirna-wirkstoffes, für den nicht nur die Effizienz bei der Inhibition der Genexpression maßgeblich ist, sondern vor allem Kriterien wie Sicherheit, Stabilität Bioverfügbarkeit im Vordergr stehen. Sicherheit Die Sicherheit ist von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung eines Medikaments. Für die sirna-technologie ist es hilfreich, daß bereits Erfahrungen mit verwandten Wirkstoffen, wie den Antisense-Oligonukleotiden oder Ribozymen vorliegen, bei denen unerwünschte Nebenwirkungen bei Verwendung bestimmter chemischer Modifikationen auftraten. Aufgr der intrinsisch höheren Stabilität der doppelsträngigen sirnas im Vergleich zu einzelsträngigen Antisense-Oligonukleotiden kann bei sirnas solche nachteiligen Modifikationen auf ein Minimum reduziert oder ganz auf sie verzichtet werden. Es wurde berichtet, daß einzelne sirnas nicht nur die Expression des gewünschten Zielgens, sondern auch die anderer Gene beeinflussen 4. Die Bedeutung solcher Off-Target-Effekte für die Entwicklung von sirna- Medikamenten ist jedoch noch unklar, zumal sie nicht bei allen sirnas zu beobachten sind. Auch die unerwünschte Induktion der zellulären Interferon-Antwort durch sirnas wurde beschrieben 5. Es hat sich jedoch gezeigt, daß solche möglicherweise negativen Wirkungen durch ein Sequenz- Screening der sirna vermieden werden können. Ebenso unklar sind die Implikationen jüngster Berichte, daß sirnas die Methylierung von DNA vermitteln daher auch auf Ebene der Transkription in die Genexpression eingreifen können 6,7. Möglicherweise läßt sich ein solcher Mechanismus, sofern sich dieser bestätigen läßt, sogar im positiven Sinne ausnutzen, um mit sirnas beispielsweise bei Tumorerkrankungen auch über einen zweiten Weg in die Genexpression einzugreifen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß es derzeit keine Wirkstoffe gibt, die spezifi- LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/

19 B L I T Z L I C H T scher die Genexpression bestimmter Zielgene hemmen als die sirna. Durch ein Screening können kaum oder nicht toxische Varianten identifiziert werden. Identifizierung einer Lead-Substanz Um bereits bei der Auswahl der sirna-zielsequenz zu einer Target-mRNA eine Vorauswahl über möglichst effiziente zugleich stabile Wirstoffkandidaten zu erhalten, kommen Bioinformatik-Programme zum Einsatz, deren Algorithmen ständig den neuesten Erkenntnissen angepaßt werden. Durch geschickte Sequenzauswahl ist es uns darüber hinaus gelungen, sirnas zu identifizieren, die ohne Verlust der Effizienz in humanem Serum wesentlich stabiler gegenüber enzymatischem Abbau sind. In einem darauffolgenden Selektionsschritt werden aus einem Pool von chemisch synthetisierten vorausgewählten sirnas möglichst effiziente Moleküle durch in vitro- Aktivitätsbestimmung identifiziert. So können sirnas erhalten werden, die in Zellkultur eine um Größenordnungen verbesserte Inhibition der Expression des Zielgens errei- Abb. 2: Denaturierende Gelelektrophorese zur Auftrennung verschiedener sirnas nach Inkubation in humanem Serum. Minimale chemische Modifikationen der sirna reichen aus, um wesentlich stabilere sirna-moleküle mit nach 4 Sten (h) intakten Strängen zu erhalten. chen einen IC 50 im niedrigen nanomolaren Bereich aufweisen (Abb. 1). Um die sirna weiter zu stabilisieren, wird eine möglichst geringe Zahl chemischer Modifikationen an ausgewählten Positionen vorgenommen, wodurch die sirna weiter vor nukleolytischem Abbau geschützt wird. Auf diese Weise konnten wir in humanem Serum deutlich stabilere sirna erhalten (Abb. 2). Bei jeder Modifikation der sirna gilt es jedoch immer, mögliche toxische Nebenwirkungen bestimmter chemischer Gruppen im Auge zu behalten zu vermeiden. Aufgr des beachtlichen Know-hows, das bei sirna-design Screening zur Anwendung kommt, sind die Zeiträume bis zur Bereitstellung einer Lead-Substanz bei der sirna wesentlich kürzer als bei allen anderen bisherigen Drug Development-Technologien. sirna-delivery Eine der großen Herausforderungen für die sirna-technologie ist das Drug Delivery der sirna. Es ist bekannt, daß die sirna, wenn einmal ins Cytoplasma der Zielzelle gelangt, äußert effizient die Genexpression hemmt. Deshalb wird an Möglichkeiten gearbeitet, die sirna in möglichst hoher Konzentration in das Zielorgan zu bringen dort die Aufnahme in die Zielzellen zu verbessern. Dies kann prinzipiell durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden zum einen durch chemische Modifikation oder Konjugation der sirna selbst, zum anderen durch eine geeignete Formulierung. Um der sirna den Durchtritt durch die Zellmembran zu erleichtern, ist es vorteilhaft, die sirna mit lipophilen Gruppen zu versehen. Wie in Abbildung 3 gezeigt, konnten wir die pharmakokinetischen Eigenschaften einer sirna durch Modifikation mit einer solchen lipophilen Gruppe deutlich verbessern. So modifizierte sirnas waren auch nach 24 Sten in vivo im Blut einer Ratte noch intakt nachweisbar konnten in Gewebeproben noch 24 Sten nach Verabreichung nachgewiesen werden. Es stehen darüber hinaus eine Reihe weiterer chemischer Gruppen zur Verfügung, die potentiell zu einer Verbesserung der Bioverfügbarkeit von sirnas führen deren Einsetzbarkeit derzeit analysiert wird. Auch eine gezielte Adressierung bestimmter Zelltypen ist prinzipiell erreichbar. Alternativ dazu existieren eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Formulierung von sirnas, um diese besser zum Wirkort in die Zellen zu transportieren. Ein verbessertes sirna-delivery ließ sich beispielsweise mit kationischen Liposomen, Polyethylenimin oder Atelocollagen 8 erreichen. Erfolge in Tierversuchen Daß sich die hohen Erwartungen, die man in die sirna-technologie als neue Therapeutikaplattform setzt, auch in vivo erfüllen lassen, zeigen ermutigende Ergebnisse einer Reihe von Arbeitsgruppen in Tiermodellen. Die Erkung einer therapeutischen Verwendung der sirna in den verschiedensten Indikationsfeldern demonstriert sehr deutlich, daß es sich bei dieser Technologie um eine Plattform mit äußerst breiten Anwendungsmöglichkeiten handelt. Es seien hier nur einige publizierte Beispiele für erfolgreiche in vivo-anwendungen von sirnas angeführt, bei denen die sirna entweder systemisch oder lokal direkt ins Zielorgan appliziert wurde. So wurde das Wachstum von Fibrosarcomen in einem Maus-Tumormodell durch systemische Applikation von sirna gegen VEGF über einen Zeitraum von 16 Tagen bei einer Dosis von ca. 120 µg/ kg x d um 66% reduziert 9. In einem Influenza-Virusmodell konnte der Virustiter durch einmalige Gabe von sirna (ca. 2-5mg/kg, formuliert mit Polyethylenimin) gegen konservierte Regionen von Virusgenen deutlich gesenkt werden 10. Eine bis zu 1000fache Reduktion des Virustiters konnte erreicht werden, unabhängig davon, ob die sirna vor oder nach der Infektion mit dem Virus appliziert wurde. Das Experiment demonstriert, daß sich die sirna prinzipiell sowohl präventiv als auch kurativ einsetzen läßt. In einem Lungen-Modellsystem konnte durch einmalige Gabe von 60 µg unformulierter sirna eine spezifische Reduktion der Hämoxygenase-1 erreicht werden, die an der Entstehung von akutem Lungenversagen nach Verletzung oder Transplantation beteiligt ist 11. Besonders interessant ist hierbei die auch für den Patienten vorteilhafte, erfolgreich eingesetzte intranasale Verabreichung. In einer weiteren Arbeit wurde gezeigt, daß durch direkte, intrathekale Applikation von sirna, die gegen den Kationenkanal P2X 3 gerichtet war, die Schmerzempfindlichkeit von Ratten deutlich verringert werden konnte 12. Darüber hinaus mehren sich die Publikationen über gelungene Anwendungen der sirna in zahlreichen anderen Krankheits Tiermodellen. Unser Verständnis der sirna hinsichtlich ihrer Verwendung als Medikament muß sicher noch weiter vertieft Jahrgang Nr. 5/2004 LABORWELT

20 B L I T Z L I C H T Abb. 3: Durch das Anbringen einer lipophilen chemischen Gruppe an die sirna wird deren Verweildauer im Blut verlängert damit die Möglichkeit zur Anreicherung im Gewebe erhöht. Radioaktive, unmodifizierte sirna ist nur bis zu einer Ste (h) in vivo in Rattenplasma detektierbar (oben), während sirna mit einer lipohilen Gruppe noch nach 12 Sten im Plasma detektierbar ist (unten). werden, besonders im Hinblick auf ihre grlegenden pharmakokinetischen pharmakodynamischen Eigenschaften, ein effektives Delivery sowie die Vermeidung potentieller toxischer Effekte. Die jüngsten in vivo-erfolge bei der Weiterentwicklung dieser Technologie hin zu Therapeutika erfüllen oder übertreffen jedoch bisher die hohen Erwartungen an sirna als neue Produktplattform. Künftige Herausforderungen Nach dem proof-of-concept, daß systemisch verabreichte sirna RNAi induzieren kann, gilt es zu verstehen, wie lange die durch sirna vermittelte Inhibition der Expression in vivo anhält. Weiterhin ist es sowohl unter toxikologischen als auch ökonomischen Gesichtpunkten erstrebenswert, die benötigte sirna-dosis zu reduzieren. Hierbei spielen die Optimierung der Bioverfügbarkeit ein effizientes Delivery eine Schlüsselrolle. Erkenntnisse aus solchen Studien werden die Entwicklung optimaler Applikationsregime für verschiedene potentielle klinische Anwendungen ermöglichen. Abhängig von der behandelten Krankheit dem Zielorgan oder den Zielzellen müssen geeignete, möglichst nicht-invasive Applikationsformen gefen werden. Auf dem Gebiet der RNA-Produktion wurden erhebliche Fortschritte gemacht. Es gibt inzwischen eine Reihe von Auftragsherstellern, die zur Produktion von RNA unter cgpm-bedingungen in der Lage sind die Bereitstellung von größeren Mengen sirna für klinische Studien in kurzer Zeit ermöglichen können. Fazit Schnelle Fortschritte bei der Entwicklung der sirna-technologie haben es ermöglicht, daß bereits heute erste sirna-medikamente kurz vor der klinischen Prüfung stehen. Damit hat sich gezeigt, daß sirna-wirkstoffe wesentlich kürzere Entwicklungszeiten beanspruchen als bisherige Technologien. Zwei Firmen haben kürzlich einen Prüfantrag (Investigational New Drug Application) bei der US-Food and Drug Administration (FDA) für einen sirna-wirkstoff eingereicht. Andere Firmen, darunter Alnylam Pharmaceuticals, streben an, klinische Studien mit einem sirna-wirkstoff bereits 2005 zu starten. Alnylam plant, in einer ersten Studie die direkte, lokale Applikation einer sirna bei der altersbedingten Maculadegeneration zu testen. Anschließend soll die Behandlung von Krankheiten geprüft werden, bei denen die sirna systemisch appliziert wird. Es kann davon ausgegangen werden, daß in der industriellen Forschung Entwicklung weitere aufregende, noch nicht publizierte Resultate vorliegen. Die sirna ist nun ihrer therapeutischen Verwendung einen großen Schritt nähergekommen. Literatur [1] Fire,A., Xu,S., Montgomery,M.K., Kostas,S.A., Driver,S.E., Mello,C.C., Nature 391 (1998) 806. [2] Novina,C.D., Sharp,P.A., Nature 430 (2004) 161. [3] Berns,K., Hijmans,E.M., Mullenders,J., Brummelkamp,T.R., Velds,A., Heimerikx,M., Kerkhoven,R.M., Madiredjo,M., Nijkamp,W., Weigelt,B., Agami,R., Ge,W., Cavet,G., Linsley,P.S., Beijersbergen,R.L., Bernards,R., Nature 428 (2004) 431. [4] Jackson,A.L., Bartz,S.R., Schelter,J., Kobayashi,S.V., Burchard,J., Mao,M., Li,B., Cavet,G., Linsley,P.S., Nat. Biotechnol. 21 (2003) 635. [5] Bridge,A.J., Pebernard,S., Ducraux,A., Nicoulaz,A.-L., Iggo,R., Nat. Genet. 34 (2003) 263. [6] Morris,K.V., Chan,S.W.L., Jacobsen,S.E., Looney,D.J., Science 305 (2004) [7] Kawasaki,H., Taira,K., Nature (2004). [8] Minakuchi,Y., Takeshita,F., Kosaka,N., Sasaki,H., Yamamoto,Y., Kouno,M., Honma,K., Nagahara,S., Hanai,K., Sano,A., Kato,T., Terada,M., Ochiya,T., Nucleic Acids Res. 32 (2004) e109. [9] Filleur,S., Courtin,A., Ait-Si-Ali,S., Guglielmi,J., Merle,C., Harel-Bellan,A., Clezardin,P., Cabon,F., Cancer Res. 63 (2003) [10] Ge,Q., Filip,L., Bai,A., Nguyen,T., Eisen,H.N., Chen,J., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101 (2004) [11] Zhang,X., Shan,P., Jiang,D., Noble,P.W., Abraham,N.G., Kappas,A., Lee,P.J., J. Biol. Chem. 279 (2004) [12] Dorn,G., Patel,S., Wotherspoon,G., Hemmings-Mieszczak,M., Barclay,J., Natt,F.J., Martin,P., Bevan,S., Fox,A., Ganju,P., Wishart,W., Hall,J., Nucleic Acids Res 32 (2004) e49. Korrespondenzadresse Dr. Roland Kreutzer Alnylam Europe AG Fritz-Hornschuch-Str. 9 D Kulmbach Tel.: +49-(0) rkreutzer@alnylam.de Kennziffer 19 LW 05 Warum lange pipettieren... Vivapure C18 Micro spin columns Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie Reproduzierbare Handhabung in der Zentrifuge Schnell einfach Hohe Volumenkapazität Contact Vivascience International Europe USA Web Vorher Nachher info@vivascience.com LABORWELT 5. Jahrgang Nr. 5/