Aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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1 Aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration mittels Refraktometrie, Kolostrometrie und ELISA-Technik sowie Untersuchung weiterer Inhaltsstoffe im Stutenkolostrum INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Ralf Georg Markus aus Quakenbrück Hannover 2005

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr., Dr. h.c. W. Leibold Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juni 2005 Diese Arbeit wurde durch Mittel der Gesellschaft der Freunde der Tierärztlichen Hochschule Hannover e. V. gefördert.

3 meinen Eltern und Hilke

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht Anatomie Immunglobuline Immunglobuline des Pferdes IgG IgM IgA IgE IgD Immunglobulinvorkommen im Kolostrum Passiver Immunitätstransfer Fehlerhafter passiver Transfer (FPT) IgG-Bestimmungsmethoden Spezifische IgG-Bestimmungsmethoden Unspezifische Bestimmungsmethoden Hauptinhaltsstoffe des Kolostrums Eiweiß Laktose Fett Harnstoff Mastitis der Stute Somatische Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt Somatische Zellen und Analytik NAGase-Aktivität Chloridgehalt 31 3 Material und Methode Material Stutenkontingent 32

6 Inhaltsverzeichnis Haltung Fütterung Impf- und Entwurmungsprogramm Abfohlmanagement nmaterial Blutserumgewinnung Kolostrumgewinnung Methoden Untersuchungen im Gestütslabor Refraktometrie Dichtebestimmung mittels Aräometer Untersuchungen in der IVD GmbH Bestimmung von Antikörperkonzentrationen im Kolostrum und Serum mittels ELISA Direkter Sandwich-ELISA zur Bestimmung von IgG in equinem Serum und Kolostrum Vorversuche Herstellung der IgG-ELISA-Testplatten Durchführung des IgG-ELISA ELISA-Auswertung Untersuchungen im Regionallabor Milchinhaltsstoffbestimmung Bestimmung der somatischen Zellen Chemisch-physikalische Untersuchungen Dichtebestimmung mittels Wägung Bestimmung der NAGase-Aktivität Chloridbestimmung Statistische Auswertung 58 4 Ergebnisse Beschreibung des Untersuchungsmaterials Vergleich von rechter und linker Euterhälfte 60

7 Inhaltsverzeichnis 4.3 Kolostrumvolumen IgG im Kolostrum und Blutserum IgG-Konzentration im Kolostrum Gesamt-IgG-Menge im Kolostrum Korrelation von IgG-Konzentration und Gesamt-IgG-Menge im Kolostrum Beziehungen zwischen IgG-Konzentration im Blutserum und im Kolostrum Vergleich zwischen Feldmethoden und ELISA-Verfahren zur Bestimmung der kolostralen IgG-Konzentration Eiweiß, Laktose, Fett und Harnstoff im Kolostrum Eiweißgehalt differenziert nach Stutengruppen Laktosegehalt differenziert nach Stutengruppen Fettgehalt differenziert nach Stutengruppen Harnstoffgehalt differenziert nach Stutengruppen Somatische Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt Gehalt somatischer Zellen im Kolostrum NAGase-Aktivität im Kolostrum NAGase-Aktivität im Blutserum Chloridgehalt im Kolostrum Chloridgehalt im Serum Diskussion Intention der Untersuchung Stutenkontingent und nmaterial Analytik Ergebnisse Vergleich von rechter und linker Euterhälfte IgG im Stutenkolostrum Methodenvergleich Inhaltsstoffe im Kolostrum Eiweiß, Laktose, Fett und Harnstoff 102

8 Inhaltsverzeichnis Gehalt somatischer Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt Schlussfolgerungen Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Tabellen Analysenvorschriften 134

9 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis: Abb. 1: Sagittalschnitt durch das Euter der Stute (halbschematisch) 3 Abb. 2: Immunglobulinstruktur und Aufbau der verschiedenen Immunglobulinklassen 5 Abb. 3: Digital Hand-held Pocket Refractometer PAL-1, Fa. ATAGO CO, LTD, Tokyo, Japan, abgebildet mit einer 1 - Münze und zwei Streichhölzern 37 Abb. 4: Warzenaräometer abgebildet mit einer 1 - Münze und zwei Streichhölzern 39 Abb. 5: Warzenaräometer in dem mit Milch gefüllten Standzylinder 39 Abb. 6: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards und eines Stutenblutserums (Stute der Gruppe I) 46 Abb. 7: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards und der Kolostrumproben einer Stute (Stutengruppe II) für vier Melkzeiten (0 h, 3 h, 6 h, 12 h p.p.) 46 Abb. 8: Korrelation und Regression der NAGase-Aktivität zwischen rechter und linker Euterhälfte 61 Abb. 9: Mittleres Kolostrumvolumen und Standardabweichung beider Euterhälften der drei ersten Stunden p.p. getrennt nach Stutengruppen 62 Abb. 10: Mittleres Kolostrumvolumen und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 63 Abb. 11: Verlauf der mittleren IgG-Konzentration im Kolostrum der drei Stutengruppen 65 Abb. 12: Mittlere Gesamt-IgG-Menge und Standardabweichung beider Euterhälften der drei ersten Stunden p.p. getrennt nach Stutengruppen 66 Abb. 13: Mittlere Gesamt-IgG-Menge und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 67 Abb. 14: Korrelation und Regression zwischen IgG-Konzentration im Blutserum und kolostraler IgG-Konzentration unmittelbar p.p. 69

10 Abbildungsverzeichnis Abb. 15: Korrelation und Regression zwischen IgG-Konzentration im Blutserum und kolostraler Gesamt-IgG-Menge der drei ersten Stunden p.p. 70 Abb. 16: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Refraktometrieergebnissen im Gesamtmaterial 73 Abb. 17: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Dichteergebnissen (K) im Gesamtmaterial 73 Abb. 18: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Dichteergebnissen (W) im Gesamtmaterial 74 Abb. 19: Mittlerer Gehalt an Eiweiß, Laktose, Fett und Harnstoff im Kolostrum der ersten zwölf Stunden p.p. 76 Abb. 20: Mittlerer Eiweißgehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 78 Abb. 21: Mittlerer Laktosegehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 80 Abb. 22: Mittlerer Fettgehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 81 Abb. 23: Mittlerer Harnstoffgehalt und Standardabweichung im Kolostrum beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 83 Abb. 24: Mittlerer Gehalt somatischer Zellen (log SCC), Chloridionen und NAGase-Aktivität im Stutenkolostrum der ersten zwölf Stunden p.p. 84 Abb. 25: Mittelwert (log x a ) der logarithmierten Einzelwerte (log x) und Standardabweichungen (± SD) somatischer Zellen [SCC/ml] im Stutenkolostrum beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 85 Abb. 26: Mittlere NAGase-Aktivität und Standardabweichung im Stutenkolostrum beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 87 Abb. 27: Mittlerer Chloridgehalt und Standardabweichung im Stutenkolostrum beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 89

11 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis: Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der equinen Immunglobuline 6 Tab. 2: Angaben zum IgG-Gehalt im Kolostrum von Stuten 12 Tab. 3: Korrelation zwischen Kolostrometrie- und RIDT-Methode im Kolostrum für IgG-Konzentrationen 22 Tab. 4: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe im Kolostrum verschiedener Tierarten 24 Tab. 5: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe in reifer Milch verschiedener Tierarten 24 Tab. 6: nentnahmeplan 34 Tab. 7: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die Refraktometrie in Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 38 Tab. 8: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die Dichtebestimmung in Stutenmischmilchen mittels Kolostrometer für drei Zeitpunkte p.p. 40 Tab. 9: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei gleichzeitiger Einpunktmessung im Duplikat und Titration der 48 Tab. 10: Arithmetische Mittelwerte ( a), Standardabweichungen (SD), binomische Gleichungen und Korrelationskoeffizienten (r) zwischen Ergebnissen der Einpunktmessung und dem Titrationsverfahren für Blutserum- und Kolostrumproben 49 Tab. 11: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei Einpunktmessung im Duplikat 50 Tab. 12: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten die Wägung von ermittelten Dichten Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 54 Tab. 13: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die NAGase-Aktivitäts-Bestimmung in Stutenmischmilchen für fünf Zeitpunkte p.p. 56

12 Tabellenverzeichnis Tab. 14: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die Chloridbestimmung in Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 57 Tab. 15: p-werte zur Darstellung der Signifikanzen 58 Tab. 16: nmaterial und Gruppengrößen für die Kolostrumuntersuchungen 59 Tab. 17: Vergleich der Mittelwertberechnungen von rechter und linker Euterhälfte 60 Tab. 18: Vergleich der Signifikanzniveaus auf Basis der Kolostralvolumina zwischen Stutengruppen und Melkzeiten 64 Tab. 19: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der IgG-Konzentrationen [mg/ml] im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 65 Tab. 20: Vergleich der Signifikanzniveaus zwischen Stutengruppen und Melkzeiten auf Basis der IgG-Mengen im Stutenkolostrum 68 Tab. 21: Korrelation zwischen den Ergebnissen von ELISA und Feldmethoden getrennt nach Stutengruppen 71 Tab. 22: Regressionsgleichungen zwischen den ELISA- und Refraktometrie- bzw. Kolostrometrie- bzw. Wägungsergebnissen aufgeteilt nach Stutengruppen (I, II, III) 72 Tab. 23: Regressionsgleichungen zwischen ELISA- und Refraktometrie- bzw. Kolostrometrie- bzw. Wägungsergebnissen im Gesamtmaterial unter Berücksichtigung der Standardfehler (± S) 75 Tab. 24: Korrelation zwischen Milchinhaltsstoffen und mittels ELISA bestimmten kolostralen IgG-Konzentrationen (Mittelwerte beider Euterhälften) 77 Tab. 25 Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Eiweißgehalte [%] im Kolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 78 Tab. 26: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Laktosegehalte [%] im Kolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 79 Tab. 27: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Fettgehalte [%] im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 81

13 Tabellenverzeichnis Tab. 28: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Harnstoffgehalte [mg/l] differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 82 Tab. 29: Arithmetisches Mittel (log a) der logarithmierten Einzelwerte (log x) und Standardabweichungen (SD) somatischer Zellen [SCC/ml] differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 85 Tab. 30: Geometrische Mittelwerte ( g ) somatischer Zellen x 10 3 [SCC/ml] (entlogarithmiert) im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 86 Tab. 31: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) kolostraler NAGase- Aktivitäten [nmol min -1 ml -1 ] im Kolostrum differenziert nach Stuten- Gruppen und Entnahmezeitpunkten 87 Tab. 32: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) kolostraler Chloridgehalte [mmol/l] differenziert nach Stutengruppen und Entnahmezeitpunkten 88 Tab. 33: Vergleich der Signifikanzniveaus zwischen Stutengruppen und Melkzeiten für den Parameter Chlorid im Kolostrum 90 Tab. 34: Mittlerer IgG-Gehalt [%] vom mittleren Gesamteiweißgehalt [%] im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 103 Tab. 35: Mittelwerte somatischer Zellen [SCC/ml] im Kolostrum von Stuten 105 Tab. 36: Inhaltsstoffe (arithmetische bzw. geometrische Mittelwerte) im Kolostrum eutergesunder Stuten differenziert nach Melkzeiten 111 Tab. 37: Components (arithmetic and geometric means) in the total colostrum of the healthy mares collected at different times p.p. 114 Tab. 38: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) des Brechungsindex [%] von Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 132 Tab. 39: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Dichte (K) [g/ml] von Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 132 Tab. 40: Mittelwerte ( a) und Standardabweichungen (SD) der Dichte (W) [g/ml] von Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 133

14 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis: C Grad Celsius µ mikro Ag Antigen Ak Antikörper B Bestimmtheitsmaß bzw. beziehungsweise ca. circa cm 3 Kubikzentimeter D Dichte [g/ml] Dichte (K) mittels Kolostrometrie ermittelte Dichte Dichte (W) mittels Wägung ermittelte Dichte dl Deziliter DNS Desoxyribonukleinsäure EHV equines Herpes Virus ELISA Enzym linked immunosorbent assay (Enzym gekoppelter Immunoadsorbtionstest) EU ELISA Unit Fa. Firma FPT Failure of passive transfer (fehlerhafter passiver Transfer) g Gramm GCT Glutaraldehyde-coagulation-test (Glutaraldehyd-Koagulationstest) h hora (Stunde) Ig Immunglobulin IgA, IgD, IgE, IgG Immunglobulin A, -D, -E, -G IVD GmbH Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik mit beschränkter Haftung K Kolostrometrie kda Kilodalton kg Kilogramm

15 Abkürzungsverzeichnis LAT Latexagglutinationstest l Liter log Logarithmus zur Basis 10 log a Mittelwert der logarithmierten Werte m Masse M Molar max. maximal mg Milligramm MG Molekulargewicht min Minute ml Milliliter mmol Millimol MTP Mikrotiterplatte n Anzahl NAGase N-Acetyl-β-D-glucosaminidase ng Nanogramm nm Nanometer nmol Nanomol OD optische Dichte p pico p.p. post partum r Korrelationskoeffizient RER raues endoplasmatisches Retikulum RIDT Radialer Immuno-Diffusions-Test RPM rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) s. siehe SCC somatic cell count (Anzahl somatischer Zellen) S.I. Système International d Unités (Internationales Einheitensystem) s.o. siehe oben s.u. siehe unten SD Standardabweichung

16 Abkürzungsverzeichnis TBST TMB V VK a tris buffered saline with TWEEN 20 (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN 20 -Zusatz) Tetramethylbenzidin-Substratpuffer Volumen Variationskoeffizient Mittelwert arithmetischer Mittelwert g geometischer Mittelwert, entspricht log a xg Faktor der Normfallbeschleunigung (9,80665 m/s 2 ) ZST Zinksulfat-Trübungstest

17 Einleitung 1. Einleitung In Deutschland besitzen Pferde als Sport- und Liebhabertiere einen hohen Stellenwert. Von den Tierhaltern wird daher eine umfassende und intensive veterinärmedizinische Betreuung gefordert. Bereits die Überwachung der neonatalen Gesundheit und Vitalität spielt in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle. Das Stutenkolostrum nimmt vor diesem Hintergrund eine Schlüsselstellung ein, weil es mit seinem hohen Gehalt an Antikörpern gegen spezifische Krankheitserreger und einer Reihe unspezifisch wirksamer Abwehrsubstanzen die passive Immunisierung des Neugeborenen garantiert (DUFFUS und O`BRIEN 1990). Antikörper werden vom mütterlichen Organismus in der Auseinandersetzung mit vielen in seiner Umwelt vorkommenden Mikroorganismen und weiteren Noxen gebildet. Diese Antikörper sind somit geeignet, das neugeborene Fohlen, das mit seiner Geburt von einem praktisch keimfreien in ein keimhaltiges Milieu wechselt, gegen die Erreger seiner neuen Umgebung zu schützen. Eine nicht ausreichende Immunitätsübertragung von der Stute auf ihr Fohlen wird als fehlerhafter passiver Transfer (FPT) bezeichnet, welcher ohne tierärztliche Intervention schwer verlaufende Infektionen mit häufig letalem Ausgang zur Folge haben kann (STONEHAM et al. 1991). Mehr als die Hälfte der Fälle von FPT sind dabei auf einen zu geringen kolostralen Antikörpergehalt zurückzuführen (CRAWFORD et al. 1977). Die qualitative Bewertung eines Kolostrums erfolgt in diesem Zusammenhang anhand der enthaltenen Antikörperkonzentrationen. Dabei wird in den allermeisten Fällen die Konzentration von Immunglobulinen der Klasse G bestimmt, da diese im Vergleich zu IgM und IgA sowohl quantitativ als auch funktionell dominieren (EISENHAUER 1981, KÄHN 1991a, TYLER-McGOWAN et al. 1997). Als Schwerpunkt dieser Arbeit sollen für ein großes Gestüt mit etwa 2000 Pferden zwei auf der Stallgasse einsetzbare physikalische Methoden (Refraktometrie, Aräometrie) zur Abschätzung der kolostralen IgG-Konzentration mit einer nur im Laboratorium durchzuführenden immunologischen Methode (ELISA) verglichen und der Verlauf der kolostralen IgG-Konzentration in den ersten zwölf Stunden post partum (p.p.) untersucht werden. 1

18 Einleitung Aufgrund der herausragenden alimentären Funktion des Kolostrums (MEYER und KAMPHUES 1990) werden neben dem kolostralen Gesamtvolumen der ersten drei Stunden p.p. die Hauptinhaltsstoffe Eiweiß, Fett, Laktose und Harnstoff innerhalb der ersten 12 Stunden p.p. ausgewertet. Zur Charakterisierung der Eutergesundheit werden neben der klinischen Untersuchung zusätzlich die entzündungsrelevanten Parameter Gehalt somatischer Zellen, NAGase- Aktivität und Chloridgehalt (SCHÜTTEL 1999) berücksichtigt. Insgesamt stand ein Abfohlungszeitraum von ca. zwei Monaten zur nnahme zur Verfügung. Dabei sollten insgesamt 36 Stuten, eingeteilt in drei Paritätsgruppen, innerhalb der ersten 12 Stunden p.p. fünfmal gemolken werden. 2

19 Literaturteil 2. Literaturübersicht 2.1 Anatomie Die Milchdrüse der Stute zählt zu den sekundären Geschlechtsorganen. Sie entsteht aus der Epidermis und stellt eine modifizierte Schweißdrüse dar (ZEROBIN 1987, SCHNOOR 1996, Abb. 1). Abb. 1: Sagittalschnitt durch das Euter der Stute (halbschematisch) 1: Mündung des cranialen Zitzenkanals 2: Mündung des caudalen Zitzenkanals 3: Zitzenteil der cranialen Zisterne 4: Zitzenteil der caudalen Zisterne 5: Drüsenteil der cranialen Zisterne 6: Drüsenteil der caudalen Zisterne 7: Milchgänge 8: Drüsenparenchym (aus: WENDT et al. 1994) Die equine Milchdrüse besteht aus je einem rechten und einem linken in der Leiste gelegenen abgeflachten, halbkugeligen Drüsenkörper, welcher mit einer seitlich komprimierten, stumpfkegelförmigen Zitze ausgestattet ist. Jede Euterhälfte besteht aus einem Mammarkomplex mit zwei (selten drei) getrennten Hohlraumsystemen, von denen das 3

20 Literaturteil craniale das größere ist. Somit weist das Stuteneuter regulär vier Hohlraumsysteme auf (HABERMEHL 1996). Die Euterhälften werden durch einen Sulcus intermammarius voneinander getrennt. In der Regel ist die fein behaarte Euterhaut schwarz pigmentiert und enthält eine Vielzahl von apokrinen Schlauchdrüsen, deren schwarzgraues, schmieriges Sekret, die die Entstehung eines Intertrigos verhindert. Die milchsezernierenden, alveolären Drüsenendstücke vereinigen sich zu Drüsenausführungsgängen und münden schließlich in größeren Milchgängen. Letztere, als Ductus lactiferi bezeichnet, sind mit Myoepithelien ausgestattet und treten in die Sinus lactiferi genannte Milchzisterne ein, welche sich aus einem Drüsen- und einem Papillenteil zusammensetzt (MICHEL 1994). Auf der Zitzenspitze befinden sich in flachen Vertiefungen saggital hintereinander zwei (selten drei) Strichkanalöffnungen, sogenannte Ostia papillaria, durch die die Milch die Milchzisterne verlassen kann. Als anatomische Besonderheit lässt sich am Stuteneuter im Gegensatz zu anderen Tierarten an der Zitzenöffnung kein Musculus sphincter papillae nachweisen (HABERMEHL 1996). 2.2 Immunglobuline Immunglobuline, auch als Antikörper bezeichnet, sind komplexe Glykoproteine und bilden die humorale Komponente der adaptiven Immunität des Säugetierorganismus. Sie werden ausschließlich von Zellen der B-Lymphozytenreihe synthetisiert und sezerniert und können im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten (Speichel, Schweiß, Milch), sowie auf Schleimhautepithelien des Darm- und Respirationstraktes nachgewiesen werden. Aufgrund ihrer spezifischen Bindung an Antigene können mittels verschiedener Mechanismen, z.b. durch Aktivierung des Komplementsystems und phagozytierender Zellen, diese antigentragenden Strukturen unschädlich gemacht werden. Auf diese Weise verteidigen sie den Körper gegen zahlreiche pathogene Noxen und erfüllen somit wichtige Funktionen im Rahmen der Immunabwehr. Daneben spielen sie auch bei regulatorischen Mechanismen der Immunantwort (Feedback-Mechanismen) eine entscheidende Rolle (TIZARD 2004). 4

21 Literaturteil Der prinzipielle Aufbau funktionsfähiger Immunglobuline besteht aus zwei identischen schweren H-Ketten und zwei identischen leichten L-Ketten, die über Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden und stabilisiert werden (Abb. 2). Das Molekulargewicht (MG) der schweren Ketten beträgt etwa Dalton und das der leichten ca Dalton. Durch das Enzym Papain kann das Antikörpermolekül proteolytisch in drei Teile gespalten werden. Es entstehen zwei identische Fragmente mit antigenbindenden Eigenschaften (Fab-Fragmente; fragment antigen binding) und ein kristallisierbares, nicht antigenbindendes Fragment (Fc-Fragment; fragment crystallizable). Letzteres ist für die Sekundärfunktionen des Antikörpermoleküls verantwortlich, die Fab-Fragmente binden Antigen (JANEWAY und TRAVERS 2002a). Abb. 2: Immunglobulinstruktur und Aufbau der verschiedenen Immunglobulinklassen, aus: Microsoft Encarta Enzyklopädie Microsoft Corporation 5

22 Literaturteil Immunglobuline des Pferdes An den schweren und leichten Ketten der Immunglobuline können variable und konstante Domänen unterschieden werden. Aufgrund unterschiedlicher Antigenität der konstanten Domäne der schweren Ketten werden die Immunglobuline in die fünf Klassen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterteilt. Bei den Immunglobulinklassen IgG und IgA werden weiterhin verschiedene Subklassen unterschieden (JANEWAY und TRAVERS 2002a). Eine aktuelle Einteilung der equinen Immunglobuline wurde auf dem 6. Internationalen Veterinary Immunology Symposium in Uppsala, Schweden 2001 präsentiert (Tab. 1). Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der equinen Immunglobuline (aus WEGE 2004) Alte Nomenklatur IgM IgGa IgG(T) IgGb IgE IgA Neue Nomenklatur IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG5 IgG6 IgE IgA Statt in Klassen und Subklassen kann aufgrund funktioneller und serologischer Parameter auch eine Einteilung in verschiedene Immunglobulin-Isotypen erfolgen. Allotypen hingegen kommen nur bei einzelnen Individuen einer Spezies vor und werden durch alternative Formen (allelische Polymorphismen) codiert. Weiterhin existieren sogenannte Idiotypen, dabei handelt es sich um individualspezifische Epitope in den variablen Domänen, insbesondere in den hypervariablen Regionen, des Immunglobulinmoleküls. Idiotypen entstehen durch eine individuelle Rekombination der variablen Gensegmente eines einzelnen B-Zellklones und kommen somit nur auf von diesem Klon gebildeten Antikörpern vor (JANEWAY und TRAVERS 2002c). 6

23 Literaturteil IgG Immunglobuline der Klasse G werden von ausdifferenzierten B-Lymphozyten (Plasmazellen) der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks synthetisiert und sezerniert. Mit einer Halbwertzeit von ca. 18 bis 23 Tagen stellen sie die haltbarste Antikörperfraktion dar (TRAUTWEIN 1990) und weisen im Blutserum mit ca. 10 bis 15 mg/ml die höchsten Gehalte von allen Immunglobulinen auf (TIZARD 2004). Auch im equinen Kolostrum stellen sie die quantitativ dominierende Immunglobulinfraktion dar (MACDOUGALL 1975). Wegen ihres geringen Molekulargewichtes von Dalton können Immunglobuline der Klasse G im Verlauf einer Immunreaktion leicht in die extravasalen Räume hinübertreten. Zwar stellt die differenzierte Betrachtung der equinen IgG-Isotypen seit langem einen Schwerpunkt der veterinärimmunologischen Forschung dar (ROCKEY et al. 1964, ROCKEY 1967, McGUIRE et al. 1972), jedoch war der Kenntnisstand über die Verhältnisse bei Pferden im Vergleich zu dem bei Mäusen oder Menschen bis vor wenigen Jahren noch recht unvollständig. Bekannt ist, dass die verschiedenen IgG-Isotypen entsprechende Effektorfunktionen bei den antikörpervermittelten Abwehrvorgängen des Körpers vermitteln. Hierzu zählen im Wesentlichen die Opsonierung von Pathogenen für die Aufnahme durch Phagozyten, die Neutralisation von Toxinen, die Sensibilisierung von Mastzellen und die Aktivierung von B-Lymphozyten zur Antikörperproduktion (RAVETCH und KINET 1991). Wie beim Menschen durch die Isotypen IgG1 und IgG3 (DILLMANN et al. 1995) kann auch beim Pferd durch einige IgG-Isotypen eine Aktivierung des Komplementsystems erfolgen. So wiesen McGUIRE et al. (1973) eine Aktivierung durch die damals als IgGa, IgGb, IgM und IgG(B), nicht aber durch die als IgGc und IgG(T) bezeichneten Isotypen nach. Diese Aktivierung kann zur Lysis der Zielzelle oder zur Erleichterung der Phagozytose des Antigens führen. Das Komplementsystems vermag ebenfalls die Beseitigung von Viren und Immunkomplexe zu ermöglichen, indem Komplementprotein an die Oberflächen dieser Bestandteile anlagert und sie somit für eine Phagozytose im Retikuloendothelialen System erkennbar macht (TIZARD 2004). Einige Spaltprodukte des Komplementsystems (C3a, C4a u. C5a) bewirken als biologisch hoch aktive Substanzen Entzündungsreaktionen (Kontraktion glatter Muskulatur, Vasodilatation 7

24 Literaturteil u. Chemotaxis) und werden daher als Anaphylatoxine bezeichnet (FRANK u. FRIES 1991). Funktionelle Unterschiede zwischen den verschiedenen equinen IgG-Isotypen wurden ebenfalls von SHEORAN u. HOLMES (1996) demonstriert, indem sie für die verschiedenen Isotypen unterschiedliche Affinitäten zu bakteriellen Zellwandbestandteilen nachwiesen. So binden IgGa, IgGb, IgGc und IgG(T) sehr stark an Protein G (Zellwandbestandteil von Streptokokken der Lancefield-Gruppe G und C), jedoch lediglich IgGa an Protein A (Zellwandbestandteil von Staphylococcus aureus). Besonders wichtig für die Ausübung von Sekundärfunktionen der IgG-Isotypen ist ihre Fähigkeit zur Bindung an Fc-Rezeptoren. So können Immunglobuline der Klasse G über ihre Fc-Region mit phagozytierenden Zellen des Immunsystems (neutrophile u. eosinophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, Natural Killer (NK)-Zellen) interagieren. Der Nachweis isotypspezifischer Affinitätsunterschiede hinsichtlich verschiedener Fc-Rezeptoren wurde für die Spezies Mensch im Gegensatz zum Pferd bereits erbracht (VAN DE WINKEL u. CAPEL, 1993). Nach Vergleich der Aminosäuresequenzen von IgG-Isotypen bei Mensch und Pferd kann vermutet werden, dass beim Pferd nur IgG1, IgG3 und IgG6 an Fcγ Rezeptoren binden können und somit wichtige Aufgaben in der Immunantwort erfüllen (WAGNER et al. 2002b). Die verschiedenen IgG-Isotypen dienen weiterhin der gegenseitigen Regulation, da sie über negative Rückkopplungsmechanismen (Feedback-Mechanismen) die fortgesetzte Expression von Antikörpern inhibieren. Eine große Anzahl löslicher Immunglobuline führt zu einer ausgeprägten Abdeckung der Antigenepitope und verhindert somit die weitere Bindung dieser Epitope an B-Zellrezeptoren. Diese Zellen stellen daraufhin die erneute Produktion entsprechender Antikörper ein. In den letzten Jahren wurden mit der erfolgreichen Charakterisierung von Genen, die die Verschiedenartigkeit der equinen IgG-Isotypen bedingen (WAGNER et al u. 2002a u. 2002b u. 2003) und der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen einzelne IgG- Isotypen (WAGNER et al u. 2003, SHEORAN et al. 1998, SUGIURA et al. 1998, WEGE et al. 2003, WEGE 2004) große Fortschritte auf dem Gebiet der equinen Isotypen- Charakterisierung erzielt, die zukünftig diesbezüglich eine genauere funktionelle Beschreibung der einzelnen Isotypen erwarten lassen 8

25 Literaturteil IgM Mit durchschnittlich 1,2 mg/ml ist das IgM als zweithäufigstes Immunglobulin im equinen Blutserum nachzuweisen (McGUIRE et al. 1973). Es wird ebenfalls von Plasmazellen der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks synthetisiert und abgegeben. Auch IgM besteht aus einer Grundeinheit von zwei schweren und zwei leichten Ketten, kann jedoch Multimere bilden. IgM-Moleküle liegen im Serum als Pentamere, manchmal auch als Hexamere vor. Aufgrund dieser Tatsache stellt es mit einem Molekulargewicht von Dalton das schwerste und zugleich größte Immunglobulin dar. Im Verlauf einer Immunantwort steigt die Konzentration von IgM grundsätzlich zuerst an, bleibt aber deutlich unter den erst später nachweisbaren IgG-Mengen (STEVENSON 1999). Aufgrund seiner zehn Antigenbindungsstellen besitzt das IgM-Pentamer eine relativ effektive Bindungsstärke (Avidität), vermutlich um an repetitive Epitope, beispielsweise Polysacchariden bakterieller Zellwände, zu binden und seine agglutinierenden, komplementaktivierenden und zytotoxischen Effektorfunktionen zu erfüllen (TRAUTWEIN 1990, JANEWAY und TRAVERS 2002a) IgA Der Blutserumgehalt von IgA schwankt beim Pferd zwischen 0,6 und 3,5 mg/ml. Es kann weiterhin in relativ hohen Konzentrationen in den seromukösen Körpersekreten nachgewiesen werden, da es außer in den regionalen Körperlymphknoten von in der Submukosa der Körperschleimhäuten gelegenen B-Zellen produziert wird. Im Gegensatz zu Blutserum kommt es in den Oberflächensekreten hauptsächlich als Dimer mit einem Molekulargewicht von Dalton vor (TIZARD 2004). Ein Protein, welches auch von den Epithelzellen des Euters synthetisiert wird und als sekretorische Komponente bezeichnet wird, schützt das mit dem Kolostrum sezernierte IgA (sekretorisches IgA = siga) vor dem proteolytischen Abbau im Verdauungssystem des Fohlens (TRAUTWEIN 1990). Durch die orale Aufnahme von sekretorischem IgA mit dem Kolostrum erfährt das neugeborene Fohlen eine lokale passive Immunität, da das siga sowohl Toxine neutralisiert, als auch an Bakterien und Viren haftet und dadurch deren Bindung an die Schleimhautoberfläche und ihren Eintritt in den Körper verhindert (BACHMANN et al. 1982, HAALIWELL u. GORMAN 1989). 9

26 Literaturteil IgE IgE kommt im Blutserum lediglich in äußerst geringen Konzentrationen vor (< 0,1%), die Halbwertzeit beträgt etwa zwei bis drei Tage. Es besitzt ein Molekulargewicht von Dalton und wird von den Körperoberflächen benachbarten Plasmazellen produziert (SUTER und FEY 1981). IgE spielt eine besondere Rolle in der Abwehr parasitärer Erkrankungen und bei allergisch bedingten Reaktionen vom Typ 1 (HALLIWELL u. GORMAN 1989, TIZARD 2004) IgD Beim Pferd war das Vorkommen der Antikörperklasse IgD bislang nicht bekannt (TIZARD 2004). Vor kurzem jedoch konnte die für das equine IgD codierende Gensequenz und sogar das entsprechende Transkript, nicht jedoch das IgG-Molekül selbst, nachgewiesen werden (WAGNER et al. 2004) Immunglobulinvorkommen im Kolostrum Während der letzten Trächtigkeitswochen kommt es im Hohlraumsystem des Stuteneuters zu einer Konzentrierung von IgG, IgA und IgM (SMITH et al. 1971, JEFFCOTT 1974a). Das sekretorische IgA wird direkt im Euter gebildet. Das im Kolostrum enthaltene IgG und IgM jedoch stammt aus dem maternalen Blutkreislauf (JEFFCOTT 1975), weshalb dem Stutenkolostrum diesbezüglich eher der Charakter eines Transsudates als der eines Sekretes zugewiesen werden sollte (BACHMANN et al. 1982). SMITH et al. (1971) zeigten, dass beim Rind die Bindung von Östrogen und Progesteron aus dem Blutplasma an Rezeptoren der Drüsenmembran eine wichtige Rolle im Konzentrierungsmechanismus der Immunglobuline einnimmt. In Analogie zu den Verhältnissen beim Rind geht THEIN (2003) beim Pferd ebenfalls von einer entscheidende Einflussnahme dieser beiden Hormone aus. Ca. 90% der im equinen Kolostrum vorkommenden Immunglobuline gehören der Klasse des IgG an. In wesentlich geringeren Konzentrationen sind die Immunglobuline der Klassen A und M enthalten (KOHN et al. 1989). Mit dem Übergang vom Kolostrum zur Milch kommt es allerdings zu einer prozentualen Verschiebung der 10

27 Literaturteil Isotypenzusammensetzung, sodass im weiteren Laktationsverlauf IgA zur quantitativ vorherrschenden Immunglobulinfraktion des equinen Eutersekretes wird (TIZARD 2004). Im Kolostrum jedoch kommt den Immunglobulinen der Klasse G nicht nur wegen ihrer mengenmäßigen Dominanz, sondern auch aufgrund ihrer funktionellen Bedeutung für das Immunsystem eine Schlüsselstellung zu. Nach KÄHN (1991a) stellt die Klasse des IgG die meisten antibakteriellen, antiviralen und antitoxischen Antikörper bereit. EISENHAUER (1981) und TYLER-McGOWAN et al. (1997) sehen das IgG als hauptverantwortlich für den Infektionsschutz des Fohlens binnen der ersten zwei Lebensmonate an und beurteilen es daher als die wichtigste Immunglobulinklasse im Kolostrum der Stute. Diese Einschätzung spiegelt sich auch in der klinischen Anwendung kommerziell verfügbarer Testkits (z.b. SNAP Foal IgG Test, Fa. Idexx GmbH, Wörrstadt) zur Kontrolle des IgG- Transfers von der Stute auf das Fohlen wieder (HARPS und KLUG 1995). Bereits 1977 dokumentierten McGUIRE et al. die herausragende klinische Relevanz von Immunglobulin G. In einer umfangreichen Studie an insgesamt 87 Fohlen wurde im postkolostralen Blutserum von 21 Fohlen ein IgG-Gehalt < 4 g/l festgestellt. Im Verlauf der Studie erkrankten insgesamt 10 dieser Fohlen an schwerwiegenden Infektionskrankheiten, die eine veterinärmedizinische Intervention erforderlich machten. Bei den übrigen 66 Fohlen mit IgG-Konzentrationen von > 4 g/l Serum erkrankten lediglich 2 Fohlen, bei denen allerdings aufgrund des milden Krankheitsverlaufes keine Therapie notwendig wurde. Dieser Zusammenhang zwischen dem Mangel an Immunglobulin G und der Inzidenz von neonatalen Infektionserkrankheiten wurde seitdem mehrmalig nachgewiesen (CRAWFORD et al. 1977, BUNTAIN 1981, McCLURE 1981, THEIN et al. 1983, WHITE 1985, GÈNIN und CLÈMENT 1989). Die Untersuchung von Stutenkolostrum hinsichtlich seines Gehaltes an IgG war bereits wiederholt Ziel wissenschaftlicher Untersuchungen. Dabei wurden zum Teil sehr unterschiedliche Durchschnittswerte von 10,8 mg/ml bis 113 mg/ml ermittelt (Tab. 2). 11

28 Literaturteil Tab. 2: Angaben zum IgG-Gehalt im Kolostrum von Stuten Autor mg/ml Rasse ROUSE und INGRAM ,0 1) Shetland Pony McGUIRE und CRAWFORD ,8 1) Quarter Horse McGUIRE et al ,5 1) Englisches Vollblut NORCROSS ) keine Angaben SHIDELER et al ,8 1) Warmblut Pferd THEIN et al ,7 1) Arabisches Vollblut THEIN et al ,6 1) Warmblut Pferd MASSEY et al ,2 1) diverse Rassen CASH ,0 1) keine Angaben DASCANIO et al ) keine Angaben CHAVATTE et al ,1 1) Kaltblut CHAVATTE et al ,7 1) Warmblut Pferd LUFT ,5 1) diverse Rassen BUSCHMANN ) keine Angaben PEARSON et al ,1 1) Englisches Vollblut PEARSON et al ,9 1) Arabisches Vollblut PERRYMAN ,5 1) Arabisches Vollblut 1) Mittelwert der untersuchten Population, 2) Referenzbereich Die Bewertung der IgG-Gehalte und die sich daraus ergebende Kolostrum-Qualität erfolgt durch die aufgeführten Autoren unterschiedlich. LeBLANC et al. (1992) bezeichnen Kolostrum mit einem IgG-Gehalt von mehr als 50 mg/ml als hochwertig, wohingegen KÄHN (1991b) erst eine Konzentration von mehr als 70 mg/ml als hoch einstuft, aber bereits 30 mg/ml als ausreichend erachtet. Da für den Erfolg des passiven Immunitätstransfer von der Stute auf das Fohlen (KÄHN 1991a: IgG-Gehalt im Fohlenplasma > 8 g/l) letztlich die Aufnahme einer ausreichend großen Menge von Immunglobulinen Voraussetzung ist, beurteilten LAVOIE et al. (1989) neben der kolostralen IgG-Konzentration auch die insgesamt mit der Kolostralmilch bereitgestellte IgG-Menge. So konnten LAVOIE et al. (1989) im Gesamtkolostrum von sechs multiparen Stuten im Alter von 5 bis 13 Jahren in den ersten 20 Stunden p.p. eine mittlere IgG-Menge von 440 g ± 106 g nachweisen 12

29 Literaturteil Passiver Immunitätstransfer Aufgrund der erst langsam anlaufenden Eigensynthese von Immunglobulinen ist das neonatale Säugetier auf die maternale Zufuhr einer ausreichend großen Antikörpermenge angewiesen, um einen baldigen humoralen immunologischen Schutz zu erlangen. Dabei besteht neben der Möglichkeit des diaplazentaren Imports nur noch der Weg der oralen Aufnahme. Ob und in welchem Umfang maternale Immunglobuline bereits intrauterin auf den Fetus übertragen werden können, wird durch den Plazentationstyp der jeweiligen Tierart bestimmt (SCHNORR 1996). Die Plazenta des Pferdes ist eine Placenta epitheliochoriales und weist nach MICHEL (1983) einen sechsschichtigen Aufbau auf: Endothel, Bindegewebe und Epithel der Placenta materna (Uterus), sowie Epithel, Bindegewebe und Endothel der Placenta fetalis (Chorion). Alle Stoffe, die intrauterin vom maternalen in den fetalen Kreislauf übertragen werden sollen, müssen durch diese Schichten der Plazenta hindurchdiffundieren. Stoffe mit großen Molekulargewichten können die Plazenta aufgrund der relativ weiten Diffusionsstrecke nicht durchdringen. Aus diesem Grund findet beim Pferd kein nennenswerter diaplazentarer Immunglobulintransfer statt (JEFFCOTT 1974a u. 1975, GERHARDS 1986, SCHNORR 1996). Nach SAMUEL et al. (1976) und MICHEL (1983) kommt es aber im letzten Drittel der Trächtigkeit bedingt durch die Auflockerung des Chorionepithels und durch den Abbau maternaler Epithelanteile zu einer Verkürzung des Diffusionsweges und damit möglicherweise zu einem geringfügigen Immunglobulintransfer über die Plazenta. Tatsächlich konnten McGUIRE und CRAWFORD (1973) und LUFT (2000) im Gegensatz zu MASSEY et al. (1991) schon vor erster Kolostrumaufnahme geringe Immunglobulinkonzentrationen im Blutserum der neugeborenen Fohlen nachweisen. LUFT (2000) ermittelte für präkolostrale IgG-Konzentrationen im Blutserum von 53 Fohlen durchschnittliche Werte von 0,3 mg/ml. Da der Fetus jedoch selbst ca. ab dem 185. bzw Gestationstag auf einen entsprechenden Reiz hin mit der Bildung von spezifischen Antikörpern reagieren kann (PERRYMAN 1980, BACHMANN et al. 1982, THEIN et al. 1989), ist der Immunglobulinnachweis im Blutserum von Fohlen vor der ersten Kolostrumaufnahme noch kein 13

30 Literaturteil Beweis für deren diaplazentare Übertragung. Quantitativ betrachtet, findet die intrauterine Antikörperproduktion des Fetus nur in einem sehr geringen Umfang statt. Nach THEIN (1989) ist der resultierende Schutz daher nur sehr begrenzt und kaum in der Lage, den neonatalen Organismus adäquat vor auf ihn einwirkenden Noxen zu schützen. Zum Geburtszeitpunkt muss das Fohlen als vollständig immunkompetent betrachtet werden (PERRYMAN 1981, TYLER-McGOWAN et al. 1997, TIZARD 2004). Sein Immunsystem ist zu diesem Zeitpunkt jedoch noch nicht vollständig ausgereift (TYLER- McGOWAN et al. 1997), da nach postnataler Erstexposition eines infektiösen Agents (Primärreaktion) ein Zeitraum von zehn bis 14 Tagen zum Aufbau einer belastbaren humoralen Immunität benötigt wird (PERRYMAN 1981). Wenngleich die Auffassungen über die An- bzw. Abwesenheit von Antikörpern sowie deren Herkunft im Blutserum von Fohlen unmittelbar p.p. divergieren, besteht Einigkeit darüber, dass sich der Neonat unmittelbar p.p. aufgrund einer unzureichenden Versorgung mit Antikörpern in einer inadequaten immunologischen Situation befindet und daher auf den passiven Transfer maternaler Immunglobuline durch die orale Aufnahme mit dem Kolostrum angewiesen ist (BANKS 1982). Neben der kolostralen Konzentration geeigneter Immunglobulin-Isotypen und dem jeweiligen Kolostralvolumen entscheidet auch der Zeitpunkt der Kolostralmilchaufnahme über die Effektivität des humoralen Immuntransfers. Im Verlauf der ersten Stunden p.p. kommt es im Stutenkolostrum, bedingt durch den Saugakt, zu einer stetigen Abnahme der Immunglobulinkonzentration (LAVOIE et al. 1989, MASSEY 1991, WARKO et al. 1993). Bereits nach sechs Stunden p.p. stellten WARKO et al. (1993) einen starken Abfall der IgG-Konzentration im Kolostrum fest. Nach LAVOIE et al. (1989) kommt es acht Stunden p.p. zu einer signifikanten Abnahme der kolostralen IgG-Konzentration. Zwölf bis 15 Stunden p.p. finden sich nur noch 10 bis 20% der ursprünglichen Antikörperkonzentration im Eutersekret der Stute wieder (KÄHN 1991a). MASSEY et al. (1991) konnten mit dem von Ihnen verwendeten Testsystem (RIDT) im Milchdrüsensekret von 18 Stuten nach zwölf Stunden p.p. überhaupt kein IgG mehr nachweisen. Vor diesem Hintergrund ist der Verlust von Kolostralmilch aufgrund praematurer Laktation oder spontaner Milchejektion ein Risikofaktor für den zukünftigen Immunstatus des Fohlens. 14

31 Literaturteil Andererseits verringern sich in den ersten Lebensstunden p.p. auch die immunglobulinspezifischen Resorptionseigenschaften der neonatalen Darmschleimhaut. Unter dem Einfluss von Nebennierenhormonen werden die neonatalen Darmzellen binnen 38 Stunden p.p. durch spezialisierte epitheliale Darmzellen ausgewechselt, die dann keine Fähigkeit zur Absorption von Makromolekülen mehr besitzen (JEFFCOTT 1975). Beim Kalb kommt es durch Wegfall von Trypsininhibitoren zeitgleich zum Einsetzen der enzymatischen Verdauung von Immunglobulinen (KIM u. SCHMIDT 1983). Inwieweit dieses Phänomen auch beim Fohlen eine Rolle spielt, ist noch unklar. Die Resorption der Immunglobuline erfolgt durch Pinozytose, ihr Abtransport über das lymphatische System (JEFFCOTT 1974a u. 1975). In Fütterungsversuchen mit spezifischen Immunglobulinen und einem synthetischen Polymer ähnlichen Molekulargewichtes (Iodiniertes Polyvinyl Pyrrolidone, 125 I-PVP K. 60) konnte JEFFCOTT (1974b) nachweisen, dass nach drei Stunden p.p. ein Absorptionsmaximum besteht, wohingegen nach 20 Stunden p.p. die Absorption weniger als 1% beträgt. Nach KÄHN (1991a) erfolgt der Schluss der Darmschranke nach ca. 14 Stunden p.p.. Im Gegensatz zu JEFFCOTT (1975) geht TIZARD (2004) beim Fohlen von einer selektiven Immunglobulinaufnahme aus. Dabei soll bevorzugt IgG und IgM resorbiert werden, wohingegen IgA überwiegend im Intestinum verbleibt. Eine selektive Aufnahme von Immunglobulinen aus dem Darmlumen wird bei zahlreichen Säugetierspezies durch den sogenannten FcRn-Rezeptor vermittelt. Dieser Rezeptor, der in sehr ähnlicher Form auch am Dottersack des Huhnes vorkommt, wurde ebenfalls in der menschlichen Plazenta nachgewiesen und ist dort für den Transfer maternaler Immunglobuline auf den Fötus verantwortlich (JANEWAY und TRAVERS 2002b) Fehlerhafter passiver Transfer (FPT) Eine unzureichende kolostrale IgG-Aufnahme und ein daraus resultierender ungenügender IgG-Gehalt im Blut des Fohlens wird als fehlerhafter passiver Transfer (FPT) bezeichnet (KÄHN 1991a). Man kann dabei zwischen partiellem (IgG-Gehalt im Fohlenplasma < 8 g/l) und vollständigem FPT (IgG-Gehalt im Fohlenplasma < 4 g/l) unterscheiden (TYLER-McGOWAN et al. 1997, CHAFFIN und COHEN 1998). 15

32 Literaturteil Nach KÄHN (1991a) und CHAVATTE-PALMER et al. (2001) kommt es je nach Pferdepopulation und Nachweisgrenze für IgG bei 3 bis 24% aller Fohlen zum Auftreten von FPT. Der FPT wird als die häufigste postnatale Komplikation bei Fohlen überhaupt angesehen (PERRYMAN und CRAWFORD 1979, PERRYMAN und McGUIRE 1980). Das aus dem FPT resultierende neonatale Defizit an maternalen Antikörpern steht dabei im direkten Zusammenhang mit der zu erwartenden Infektionshäufigkeit der betroffenen Fohlen (McGUIRE et al. 1977, CRAWFORD et al. 1977, BUNTAIN 1981, McCLURE 1981, THEIN et al. 1983, WHITE 1985, GÈNIN und CLÈMENT 1989). In einer umfangreichen Studie mit 254 Fohlen konnten GÈNIN und CLEMENT (1989) bei 49% der Tiere mit FPT das Auftreten einer Infektionskrankheit diagnostizieren, die wiederum bei 44% dieser Probanden zum Tode führte. MORRIS et al. (1985), LeBLANC et al. (1992) und WARKO et al. (1993) stellten eine signifikante Korrelation zwischen dem IgG-Gehalt im Kolostrum und dem im Fohlenserum fest. Als wichtige Ursache für das Auftreten von FPT wird neben der verspäteten Kolostrumaufnahme eine unzureichende Kolostrumqualität hinsichtlich des Immunglobulingehaltes angesehen (CRAWFORD et al. 1977, CHAVATTE-PALMER et al. 2001). Schon CRAWFORD et al. (1977) stellten in Ihren Untersuchungen bei mehr als der Hälfte der Fohlen mit diagnostiziertem FPT einen zu geringen Antikörpergehalt im Kolostrum fest IgG-Bestimmungsmethoden Quantitative Bestimmungen des IgG-Gehaltes im equinen Blutserum und Kolostrum können in spezifische und unspezifische Methoden unterteilt werden (KÄHN 1991b) Spezifische IgG-Bestimmungsmethoden Diese Methoden basieren auf einer Antigen-Antikörperreaktion, bei der gegen IgG gerichtete Antikörper eine Bindung mit dem als Antigen fungierenden IgG eingehen. Die Intensität dieser spezifischen Antigen-Antikörperreaktion kann durch labortechnische Hilfsmittel detektiert werden. Für die Analyse von IgG in Blutserum und Kolostrum von Pferden wurden der Radiale Immuno-Diffusions-Test (ROUSE und INGRAM 1970), der Latexagglutinationstest 16

33 Literaturteil (COWLES et al. 1983) und der Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (LUFT 2000) angewendet. Radialer Immuno-Diffusions-Test (RIDT) Der von ROUSE und INGRAM (1970) zur Bestimmung von IgG in equinen Serum- und Kolostrumproben entwickelte Test wurde aufgrund seiner großen Genauigkeit in zahlreichen Studien als Referenzmethode eingesetzt (EISENHAUER 1981, LEBLANC et al u. 1992, KOHN et al. 1989, LAVOIE et al. 1989, WAELCHLI et al. 1990, MASSEY et al. 1991, WARKO und BOSTEDT 1993, DASCANIO et al. 1995, CHAVATTE et al. 1998). Von WILKINS und DEWAN-MIX (1993) wurde der RIDT als gold standard zur Bestimmung von equinem IgG bezeichnet. Bei diesem Verfahren wird nach MANCINI et al. (1965) zunächst eine Agarplatte mit einer definierten Menge gegen equines IgG gerichteter Antikörper präpariert. In diesen Agar werden Löcher gestanzt, in die die zu untersuchenden Serumproben überführt werden. Binnen 18 bis 24 Stunden (KÄHN 1991b) bilden sich radial der Stanzlöcher aus Antigen-Antikörper-Komplexen bestehende erkennbare Präzipitathöfe. Über den Vergleich der Präzipitatdurchmesser mit denen einer mitgeführten Standardreihe kann eine Quantifizierung des IgG-Gehaltes der erfolgen. Nachteile dieser Labormethode sind die sehr langen Reaktionszeiten, die Empfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen und der relativ geringe ndurchsatz. Nach KÄHN (1991b) erlaubt das Funktionsprinzip des RIDT die Durchführung sehr genauer Messungen. Allerdings können die festgestellten Werte insbesondere bei der Verwendung verschiedener kommerzieller Testkits zum Teil erheblich variieren. Hieraus resultieren Schwierigkeiten beim quantitativen Vergleich von Ergebnissen verschiedener Publikationen. Latexagglutinationstest (LAT) Beim LAT-Verfahren bilden gegen equines IgG gerichtete und an Polystyrene (Latex)- Partikel gebundene Antikörper Komplexe mit dem in der enthaltenen IgG. Die Zeit bis zum Ausfällen dieser Komplexe dient als Größe zur Beurteilung des IgG-Gehaltes in der. Es handelt sich um einen Feldtest für die Stallgasse, dessen Ergebnis bereits nach wenigen Minuten auf die ungefähre IgG-Konzentration der schließen lässt. Die 17

34 Literaturteil Zuverlässigkeit dieser Methode zur Bestimmung von equinem IgG wurde erstmals von COWLES et al. (1983) untersucht und nachgewiesen. Nach GERHARDS (1986) soll durch die Mituntersuchung von Standardseren auch ein quantitatives Ergebnis möglich sein. Prinzipiell ist der LAT jedoch als semiquantitativer Schnelltest konzipiert, dessen Ergebnis lediglich eine grobe Einschätzung der vorliegenden IgG-Verhältnisse gestattet. Neben der Untersuchung von Blut und Serum ist nach einigen Modifikationen auch die Bestimmung von IgG im Kolostrum möglich (THEIN 1989). WAELCHLI et al. (1990) nennt als Hauptkritikpunkte des LAT die relativ hohen Kosten bei der Untersuchung größerer numfänge, sowie die subjektive Einschätzung des jeweiligen Untersuchers beim Ablesen der Ergebnisse. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Erst in den letzten Jahren wurde mit der Entwicklung von ELISA-Systemen moderne Diagnostika zur Evaluierung von IgG-Konzentrationen in Blutserum- und Kolostrumproben von Tieren entwickelt. So etablierten STENGEL (1998) und AMON (1999) entsprechende ELISA-Systeme für die Untersuchung des IgG-Gehaltes in n boviner Herkunft. Für eine quantitative Analyse von IgG im Blutserum und im Kolostrum von Pferden wurde wenig später ein Verfahren von LUFT (2000) vorgestellt. Hingegen kann ein semiquantitativer IgG-Schnelltest auf ELISA-Basis (SNAP Foal IgG Test, Fa. Idexx GmbH, Wörrstadt), der für die Anwendung in Serum-, Plasma- oder Vollblut konzipiert ist, bereits seit einigen Jahren kommerziell erworben werden. Mittlerweile wird die exakte quantitative Bestimmung von equinem IgG in Blutserum- und Kolostrumproben mittels ELISA-Technologie auch als labordiagnostische Dienstleistung angeboten (Fa. Biocheck Labor für Veterinärdiagnostik u. Umwelthygiene GmbH, Leipzig). Bei der ELISA-Labormethode zur Bestimmung von equinem IgG findet das folgende Funktionsprinzip Anwendung. Zunächst wird die Oberfläche einer Mikrotiterplatte (MTP) mit gegen equines IgG gerichteten Antikörpern in einer bestimmten Konzentration als Fänger-Antikörper beschichtet. Das nmaterial wird dann zu den immobilisierten Fänger-Antikörpern in die MTP gegeben, so dass es zur Bildung von Antigen-Antikörper- Komplexen kommt. Anschließend werden enzymmarkierte Sekundärantikörper, die ebenfalls gegen equines IgG gerichtet sind, aufgetragen. Nach dem Abwaschen nicht 18

35 Literaturteil gebundener Sekundärantikörper wird ein zunächst farbloses spezifisches Substrat dazugegeben, das durch eine enzymatische Reaktion in ein farbiges Produkt umgesetzt wird. Die entstandene Färbung kann daraufhin photometrisch als Extinktion gemessen werden. Durch den Vergleich der Ergebnisse mit denen einer mitgeführten Standardreihe erfolgt die Berechnung der IgG-Konzentration von Kolostrum- bzw. Blutserumprobe. Die im Folgenden dargestellten Vorteile des ELISA-Testsystems sollen dessen Eignung für den Einsatz als Standardmethode aufzeigen. Nach CROWTHER (1995) wird das im Labor durchzuführende ELISA-Verfahren als eine relativ schnelle und effiziente Methode beurteilt, die bereits nach ca. vier Stunden zu genauen Ergebnissen führt, welches beim RIDT erst nach 18 bis 24 Stunden möglich ist (KÄHN 1991b). Auf einer Mikrotiterplatte kann im Vergleich zu einer durchschnittlichen Agarplatte ein deutlich größerer numfang bei zugleich reduziertem Reagenzienverbrauch bearbeitet und die Personalkosten durch Automatisierungsprozesse verringert werden. Die Verwendung von Photometern zur Messung der Extinktion (Messung der optischen Dichte) garantiert eine hohe Objektivität, die zusätzlich durch eine PC-gestützte Datenauswertung mit vorgegebenen Validierungskriterien eine gute Reproduzierbarkeit der Methode ergibt. Weiterhin überzeugt der ELISA mit seiner im Vergleich zum RIDT extrem hohen Sensitivität, so dass selbst die Bestimmung von sehr niedrigen Konzentrationen möglich wird Unspezifische IgG-Bestimmungsmethoden Bei den unspezifischen Methoden wird der IgG-Gehalt aus der Messung eines mit dem IgG-Gehalt korrelierenden Parameters abgeleitet. Da etwa 90% aller im equinen Kolostrum anzutreffenden Immunglobuline der Klasse IgG angehören (KOHN et al. 1989), kann vom Gesamtimmunglobulingehalt auf den Anteil der IgG-Fraktion geschlossen werden. Als Methoden zur Bestimmung des Gesamtimmunglobulingehaltes in n equiner Herkunft werden der Zinksulfat-Trübungstest (JEFFCOTT 1974a) und der Glutaraldehyd-Koagulationstest angegeben (JONES und BROOK 1994). Weiterhin werden auch die Refraktometrie (CASH 1995) und die Aräometrie/Kolostrometrie (LeBLANC 1986) zu den unspezifischen Methoden gezählt. Bei diesen physikalischen Methoden werden der Brechungsindex bzw. die Dichte des Kolostrums 19