Molekularbiologie. Methoden. Dr. Thomas Seehaus

Transkript

1 Molekularbiologie Methoden Dr. Thomas Seehaus

2 Aufgabe Isolation des hypothetischen Gens KRYP1 aus Zucchini Seite 2

3 DNA-Extraktion aus Geweben Vorüberlegungen für einen Versuch mit Haushaltsmitteln Jede Zelle enthält im Zellkern DNA (Desoxyribonukleinsäure). Dazu kommen Proteine, Fette, Kohlenhydrate, Ionen. Um die DNA freisetzen zu können, müssen zunächst die Zellwand, Zellmembran und die Kernmembran zerstört werden. Zellwände werden mechanisch und/oder enzymatisch geöffnet. - Glasbeads, Mörsern, kalt, flüssiger Stickstoff oder Trockeneis - Enzyme Da die Membranen aus amphiphilen Molekülen aufgebaut sind, können sie mit Detergentien (in herkömmlichen Spülmitteln) aufgelöst werden. Fette werden ebenfalls im Detergenz gelöst. Die in den Spülmitteln enthaltenen Enzyme (Proteasen) zerstören außerdem begleitende Eiweiße (Proteine, u. a. DNasen!). Aufreinigung der DNA durch Ethanol-Fällung (Dehydratation der DNA => fällt aus, Kohlenhydrate und Ionen bleiben gelöst) Seite 3

4 Besonderheiten bei RNA-Extraktion RNA ist sehr viel schwieriger zu isolieren als DNA - Cytoplasma enthält sehr viele RNasen (RNA abbauende Enzyme, u. a. zur Regulation der Proteinsynthese!) - RNasen müssen inhibiert oder deaktiviert werden (Proteasen, RNaseInhibitoren, Phenol) - auf der Haut sind viele RNasen vorhanden! - Handschuhe tragen, Gerätschaften und Lösungen sterilisieren! RNA-Moleküle sind kleiner als DNA-Moleküle - Ethanol-Fällung ist daher weniger effizient - Ethanol muss sehr kalt sein (-20 C) - zur Unterstützung höherer Salzgehalt Seite 4

5 DNA-Isolierung aus Zucchini Material/Geräte: - Zucchini, (Kartoffel)reibe, Teesieb, Thermometer, 100 ml Messzylinder, zwei 100 ml Bechergläser, ein 250 ml Becherglas (niedrige Form), 60 C warmes Wasser, Spülmittel (das Proteasen enthält!), Kochsalz, Brennspiritus, Eiswürfel, evtl. kleine Styroporbox Vorbereitungen: - 20 ml Brennspiritus (oder 96 % Ethanol) eine Stunde vor dem Versuch ins Kühlfach (ca. -20 C) legen. Zum Transport auf Eis (in einer kleinen Styroporbox) legen. - Wasser (60 C) bereitstellen (z. B. in einem Babyflaschenwärmer) - Spülmittel-/Salz-Lösung zur Extraktion: 50 ml Wasser mit 5 ml Spülmittel (mit Proteasen) und 1 g Kochsalz gut mischen. Seite 5

6 DNA-Isolierung aus Zucchini - Durchführung Man reibt ein Zucchini-Stück und füllt einen Esslöffel in ein 100 ml Becherglas - Durch das Reiben wird das Pflanzengewebe zerkleinert und die Zellwände teilweise aufgebrochen und gibt 25 ml der Spülmittel-/Salz-Lösung hinzu - Das Spülmittel enthält Detergentien, die aufgrund ihrer chemischen Struktur Lipide in Lösung bringen. Salze verstärken den Effekt Seite 6

7 DNA-Isolierung aus Zucchini - Durchführung Das Becherglas für 15 Minuten in ein 60 C warmes Wasserbad stellen. Sehr gut geeignet sind dafür (gebrauchte) Babyflaschenwärmer. (Kann man bei ebay ersteigern!) - Die höhere Temperatur beschleunigt die Freisetzung der DNA und zerstört DNAsen (Enzyme, die DNA zersetzen.) In Eiswasser abkühlen. - Abkühlen verhindert DNA-Zerfall Den Zucchini-Brei durch ein Teesieb passieren. Dazu das Teesieb auf ein 250 ml Becherglas (niedrige Form) legen und mit einem Teelöffel durch das Netz streichen. Seite 7

8 DNA-Isolierung aus Zucchini - Durchführung Einen Teil (ca. 1 Teelöffel) des Breis in ein kleines Becherglas o. ä. füllen und ganz vorsichtig mit tiefgekühlten (möglichst aus der Kühltruhe) Alkohol überschichten. Dazu den Alkohol langsam seitlich hinein fließen lassen. Besser geht es mit einer Pipette. - DNA (und RNA) sind in Ethanol bei niedriger Temperatur unlöslich und fallen daher leicht aus. Die DNA wird oberhalb des Breis als weißgelbe Flocken/Klümpchen sichtbar. Durch Abgießen oder Herausfischen kann man die DNA in ein Röhrchen mit Alkohol überführen. Seite 8

9 DNA-Isolierung: Quellen Trolldenier, G.: Isolierung der Erbsubstanz aus Zucchini - die DNA-Küche (Industrieverband Agrar) Empfohlen wird auch die DNA-Extraktion aus anderen pflanzlichen Geweben, z. B. Tomaten, Kiwi, Zwiebeln usw. Interessant bleibt auch die früher häufig vorgeschlagene Extraktion aus tierischem Material z. B. Kalbsbries. Seite 9

10 Pufferlösung zur Aufbewahrung von DNA Tris-Puffer (EDTA-Tris-Acetat, ph 7.75) 10 mm (12,12 g) Tris-(hydroxy-methyl)-aminomethan 1 mm (0,74 g) Na2-EDTA (Dinatrium-Ethylendiamin-tetraacetat) mit destilliertem Wasser auf 900 ml aufgefüllt ph-wert mit 2 M Essigsäure auf 7,75 einstellen mit destilliertem Wasser auf 1000 ml Endvolumen auffüllen Aufbewahrung von DNA-Proben - in TE-Puffer bei -20 C - alternativ gefällt unter Ethanol - lyophilisiert EDTA: Komplexbildner TRIS: ph-puffer Seite 10

11 Nachweis von DNA Feulgen Nuklealreaktion (Robert J. W. F., , physiol. Chemiker, Gießen) mittels Photometrie quantitativ faßbare Färbung der DNA, der Zellkerne, Chromosomen, Plastiden, Bakterien u. Viren nach (mild-)saurer hydrolytischer Abspaltung der Purinbasen erfolgt die Umsetzung der zurückbleibenden Desoxyribose (mit freier Aldehydgruppe an C1) mit Schiff-Reagens (fuchsinschweflige Säure; 1 Std.) zu rotviolettem Farbstoff Seite 11

12 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen UV-Spektrophotometrie Nukleinsäuren besitzen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm optische Dichte (OD260) von 1 entspricht einer Konzentration von 50 μg dsdna/ml, 35 μg RNA/ml oder 33 μg ssdna/ml. Es wird in der Regel eine 200 fache Verdünnung der Lösung in einem Endvolumen von 200 μl hergestellt und photometrisch in einer Quarzküvette gegen Wasser vermessen. Die Reinheit der DNA-Lösung kann durch das Erstellen eines Absorptionsspektrums beurteilt werden, das bei 260 nm ein Absorptionsmaximum aufweisen sollte. Verunreinigung mit Protein lassen sich durch hohe Absorption bei 280 nm identifizieren. Charakteristisch für eine saubere DNA-Lösung ist ein Wert des Quotienten 260nm/280nm nahe 2. Seite 12

13 Übersicht Enzyme für die Molekularbiologie Nukleasen - Unspezifische Nukleasen (Endo- und Exonukleasen, Dnase, RNase) - Spezifische Endonukleasen (Restriktions-Endonukleasen) Ligasen Polymerasen - DNA-abhängige DNA-Polymerasen (Replikation) - RNA-abhängige DNA-Polymerasen (Reverse Transkription) - DNA-abhängige RNA-Polymerasen (Transkription) Kinasen Phosphatasen Seite 13

14 Isolierte DNA handlich machen Unsere isolierte DNA besteht idealerweise aus Zucchini-Chromatiden (Länge mehrere cm/dm pro Molekül!) - DNA-Moleküle können brechen/zerreißen - gesuchtes Gen irgendwo auf den Chromatiden versteckt - übliche Trennmethoden mit so langen DNAMolekülen überfordert Aufgabe: - reproduzierbare Zerlegung der DNA in handliche Fragmente Welche Methoden stehen zur Verfügung? Seite 14

15 Unspezifische Nukleasen Exonuclease III Exonuklease - dsdna mit einem Einzelstrangbruch - mit blunt ends - 3 recessed ends Nuklease Bal 31 (Alteromonas expejiana) - dsdna => 3 - und 5 -Exonuklease - ssdna => Endonuklease - Ca-abhängige Reaktionen, Stop durch EDTA - Gezielte Verkürzung von DNA Nuklease S1 (Aspergillus oryzae) - ssdna => Endonuclease (ph<4,5 / T<20 C!) - Abbau ungepaarter Bereiche in DNA-RNAHybriden (cdna-synthese) Seite 15

16 Unspezifische Nukleasen DNase I (Rinder-Pankreas) - dsdna und ssdna, zufälliges Schneiden beider Stränge - Entfernen von DNA, Einführen statistischer Schnittstellen in einzelne Stränge - Enzym besitzt 3 verschiedene Aktivitäten, die in gentechnischen Experimenten unterschiedlich genutzt werden können Polymerase-Aktivität : freie 3 OH-Enden, freie Nukleotide, Mg2+ als Kofaktor, Einzelstrangmatritze Exonuklease-Aktivität: Abbau von DNA im Doppelstrang (Reparatur) Exonuklease-Aktivität: Korrekturlesen (in Gegenwart von dntp s gehemmt) - Polymerase-und Exonuklease-Aktivitäten liegen im intakten Enzym im Gleichgewicht vor - Polymerasefunktion kann durch Salzkonzentration und die Konzentration freier Nukleotide erhöht werden Seite 16

17 λ-phagen infizieren E. coli unterschiedlich effizient! Paar von Enzymen schützt Bakterien Methylase markiert eigene DNA an spezifischen Stellen Endonuklease schneidet DNA an den spezifischen Stellen, wenn diese nicht methyliert sind => fremde DNA wird abgebaut! Seite 17

18 Spezifische Nukleasen (Restriktionsenzyme) Quelle: Bakterien - Restriktion: Immunität gegen Phagen, Schutz vor fremder DNA - Schutz der eigenen DNA durch spezifische Methylierungsmuster Als Werkzeuge interessant: - Typ II Endonukleasen (sequenzspezifische Bindung und Hydrolyse) Erkennungssequenzen: - Palindrome / Nicht-Palindrome Basenpaare (4-, 5-, 6-, 8- cutter) Isochizomere: Gleiche ES, gleiche Schnittstelle Neochizomere: Gleiche ES, andere Schnittstelle Schnitt-Frequenzen (statistisch!): - 4-cutter = 1/256 bp, 6-cutter = 1/4096 bp, 8-cutter = 1/65536 bp Entstehende Fragmente: 5 -Phosphat, 3 -OH Seite 18

19 Restriktions-Enzyme Typ I: Schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin. Typ II: Schneidet die DNA innerhalb der Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP und hat keine Methyltransferase-Aktivität. Typ III: Schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin. Beispiele für Typ II: Seite 19

20 Restriktion genomischer DNA vollständige Restriktion mit einer Restriktionsendonuklease vollständige Restriktion mit zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen partielle Restriktion mit einer Restriktionsendonuklease Seite 20

21 Auftrennen von DNA-Fragmenten Agarose-Gel zur Trennung verschieden langer DNA-Fragmente Trennende Kraft: elektrische Spannung negativ geladene DNA wandert von der Anode zur Kathode poröse Gelstruktur setzt der Wanderung der Fragmente Widerstand entgegen je kleiner die Fragmente sind, desto schneller wandern sie Seite 21

22 Wiedergewinnung von DNA aus Agarose-Gel Achtung: UV-Licht schädigt die Augen! Ethidium Bromid interkaliert in dsdna Nachweis der DNA durch Fluororeszenz Gelstückchen können ausgeschnitten und die DNA eluiert werden Wiedergewinnung der DNA durch Ethanolfällung Seite 22

23 Verbinden von DNA-Fragmenten kompatible Enden von RestriktionsFragmente hybridisieren miteinander dsdna wird gebildet DNA-Ligase schließt Lücken im ZuckerPhosphat-Rückgrad der DNA Doppelhelix aus zwei verschiedenen DNAs hergestellt Seite 23

24 DNA-Ligasen Verknüpfung des 3 -OH eines DNA-Fragments mit dem 5 -Phosphat eines anderen benötigt ATP Häufigste: T4-Ligase Komplementäre sticky ends - Raumtemperatur - Reaktionszeit einige Stunden Blunt ends - 10 C oder Kühlschrank - Reaktionszeit über Nacht - Effizienz gering, da keine stabilisierenden Wasserstoffbrücken zwischen den zu verbindenden DNA-Fragmenten Seite 24

25 Ligation verschiedener Restriktionsfragmente Seite 25

26 Ligationsstrategien Seite 26

27 Plasmide ringförmige, extrachromosomal lokalisierte DNA-Moleküle, die in den meisten gram-positiven und gram-negativen Bakterien, in einigen Hefen, aber nicht in höheren Eukaryoten vorkommen wurden Anfang der 50-er Jahre durch das Auftreten und die schnelle Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzen entdeckt verschaffen den Wirtszellen in entsprechender Umgebung (Anwesenheit des Antibiotikums) einen Wachstumsvorteil Unterscheidung von konjugativen (F-Plasmid) und nicht-konjugativen Plasmiden konjugative Plasmide können durch Transfer von einer Donorzelle in eine Rezipientenzelle übertragen werden (Konjugation) Verwendung von nicht-konjugativen Plasmiden in der Gentechnik (biologische Sicherheit) Seite 27

28 Eigenschaften von Vektoren Replikationsursprung - Voraussetzung für die Replikation selektierbare Marker - Nachweis der Anwesenheit des Plasmids in Bakterienzellen - Antibiotikaresistenz - auxotrophe Marker Restriktionsschnittstellen - nur je eine für verschiedene RestriktionsEndonukleasen, jedoch innerhalb der Marker, zur Linearisierung geringe Größe idealerweise bekannte DNA-Sequenz Seite 28

29 Verknüpfung von DNA-Fragmenten T4 Ligase als meist genutztes Enzym für die Verknüpfungsreaktion Abhängigkeit der Verknüpfungsreaktion von der Konzentration der DNAFragmente Bevorzugung von inter- oder intramolekularer Reaktion ist von der DNAKonzentration und der Fragmentgröße abhängig konstante DNA-Konzentration Größe des DNA-Fragmentes Neigung zur intramolekularen Reaktion konstante DNA-Fragmentlänge DNA-Konzentration Neigung zur intramolekularen Reaktion hohe DNA-Konzentrationen Bevorzugung intermolekularer Reaktion bei Klonierungsexperimenten ist bevorzugt eine bimolekulare Reaktion erwünscht Seite 29

30 optimale Konzentrationen für bimolekulare Reaktion Seite 30

31 Prinzip der DNA-Klonierung Linearisierung des Vektors und der Fremd-DNA mit gleicher oder kompatibler Restriktions-endonuklease Mischen der beiden DNAs in optimaler Konzentration Ligierung mit T4-DNALigase Transformation in kompatible Wirtszellen (meist E.coli) Seite 31

32 Transformation einige Bakterien besitzen die Eigenschaft DNA aus der Umgebung aufnehmen zu können Labormethoden zur Erhöhung der Aufnahmeeffizenz: Hitzeschock - Bakterienzellen werden mit Calciumchlorid oder effektiver mit Rubidiumchlorid behandelt, so dass zwischen der negativ geladenen DNA und der negativ geladenen Zellmembran weniger abstoßende Kräfte bestehen. Bei einem kurzen Hitzeschock (41 43 C für Sekunden) entstehen Poren in der Membranen, so dass die DNA in die Zellen gelangen kann. Elektroporation - Hierbei werden die Bakterien mit einem elektrischen Schock behandelt ( V für einige Millisekunden), um die Membran zu öffnen. Diese Methode ist effektiver als die chemische Methode Anschließend Kultur unter Selektionsbedingungen Seite 32

33 Selektion der gesuchten Plasmide Mögliche Ligationsergebnisse: 1.Vektor religiert 2.Fremd-DNA religiert 3.Vektor + Fremd-DNA ligiert Gesucht: keine Replikation in Bakterien (ORI fehlt) Bei Klonierung in BamH1-Stelle: - 1. Klone Ampicillin- und Tetrazyklin resistent - 3. Klone nur Ampicillin resistent Identifikation der Klone durch Stempeln auf Ampicillin- und Tetrazyklin-Platten Seite 33

34 Replikaplattierung Seite 34

35 Selektionsbeispiel Seite 35

36 Kinasen / Phosphatasen Kinasen - Anhängen eines Phosphats an 5 -OH einer Nukleinsäure - unter Verbrauch von ATP - Häufigste: T4-Polynucleotidkinase - Anwendung: - Markierung mit radioaktivem 32P - Auffüllen dephosphorylierter 5'-Enden Phosphatasen - Abspalten eines Phosphats vom 5 -Ende einer Nukleinsäure - BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase) - CIP (Calf Intestine Phosphatase) - Anwendung: Verhinderung unerwünschter Ligation Seite 36

37 Verhinderung der Vektor-Religierung Alkalische Phosphatase entfernt 5'-Phosphat linearisierter Vektor kann nicht mehr rezyklisiert werden Bei Hybriden mit Fremd-DNA kann zumindest je Strang eine Lücke geschlossen werden Seite 37

38 Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen Nach der Klonierung unseres Gemisches von DNA-Fragmenten aus Zucchini erhalten wir eine Fülle von Klonen, von denen einige wenige das oder die gesuchten Fragmente enthalten sollten Wie können wir diese identifizieren? einige Möglichkeiten: - Komplementation auxotropher Mutanten (Mangelmutanten) - Fragment muss intaktes Gen enthalten, das auxotrophe Mutation komplementieren kann - Zielorganismus (E.coli) muss Gen des Spenders (Zucchini) verstehen - Vektor muss zur Genexpression (Transkriptions-Signale) fähig sein - Direkte Identifikation durch DNA-DNA-Hybridisierung mit Sonden-DNA - Sequenz muss zumindest teilweise bekannt sein, z. B. Ableitung aus Proteinsequenz, bekannte Sequenz eines nahe verwandten Organismus - Sonde muss markiert sein Seite 38

39 DNA-Polymerasen DNA-Polymerase I aus E. coli (Kornberg-Polymerase) - DNA-Synthese 5 =>3 an DNA-Matrize und Primer Exonuklease Exonuklease - Nick-Translation Klenow-Polymerase - Proteolyse der DNA-Polymerase I - Klenow-Fragment => stark verminderte Exonuklease - Auffüllen von Einzelsträngen, benötigt Primer Thermostabile DNA-Polymerasen - PCR-Enzyme! Seite 39

40 nick translation A) DNase I erzeugt Einzelstrang-Brüche (nicks) indem sie die PhosphodiesterBindungen (p) spaltet. Dabei entsteht eine 5'-Phosphat-Gruppe und ein 3'-HydroxylEnde. Zugabe von E. coli DNA Polymerase I liefert zwei Enzymaktivitäten: i. 5' 3' Exonuclease entfernt vom freien 5'-Ende sequentiell Nukleotide in 5' 3' Richtung ii. DNA Polymerase baut von der freien 3'Hydroxyl Gruppe in 5' 3' Richtung neue Nukleotide ein und füllt die, durch Exonuklease erzeugte, Lücke wieder auf (translation) B) Random primed labeling. KlenowPolymerase synthetisiert radioaktiv markierte DNA-Stränge anhand hitzedenaturierter Einzelstrang-Matritzen mit Hexanukleotid Primern mit zufälligen Sequenzen Seite 40

41 End-Markierung von DNA A) Markierung von Oligonukleotiden durch Kinase. Das 5'-terminale Phosphat wird in einer Austauschreaktion durch 32P-markiertes Phosphate aus [ -32P]-ATP ersetzt. Auf gleiche Weise können beide 5'-Enden doppel-strängiger DNA markiert werden. B) Auffüllen überhängender Enden mit KlenowPolymerase. DNA wird mit einer passenden Restriktions Endonuclease gepalten um 5'-Überhänge zu erzeugen. Diese dienen als Primer für Klenow_Polymerase um markierte Nukleotide ein zu bauen. Fragmente, die nur an einem Ende markiert sind, können durch internes Schneiden in einer passenden Restriktionsstelle erzeugt werden, um zwei unterschiedlich große Fragments zu erhalten, die leicht nach der Größe fraktioniert werden können. Seite 41

42 Markierungsmöglichkeiten für DNA radioaktiv: - 32 P ([ -32P]ATP) - 35 S (ersetzt O- in [ -P]ATP) - Nachweis durch Autoradiographie (Schwärzung eine Films durch radioaktive Substanzen) nicht radioaktiv - Fluoreszierende Gruppe - anitgene Gruppe (Digoxigenin, Nachweis mit anti-digoxigeninantikörper, der an Reportermolekül gekoppelt ist, das wiederum Farbreaktion auslöst) -... Seite 42

43 Hybridisierung Seite 43

44 Hybridisierung und Renaturierung Seite 44

45 Southern Transfer Seite 45

46 Hybridiserung und Autoradiografie Seite 46

47 Southern - Ergebnisse Seite 47

48 RFLPs: Restriction Fragments Length Polymorphisms verschiedene Allele eines Gens können verschiedene Restriktionsmuster produzieren diese Muster sind vererbbar Verwendung: - Genomkartierung Analyse von Varianten Verwandschaftsanalyse DNA-Fingerprinting Seite 48

49 DNA - fingerprinting D2: Tochter aus erster Ehe der Mutter S2: Adoptivsohn DNA des Verdächtigen 1 stimmt mit Sperma-DNA vom Tatort überein boyfriend war nicht beteiligt Seite 49

50 Übersicht Blotting - Methoden Prinzip - Trennung von Makromolekülen durch Elektrophorese - Transfer der Moleküle aus dem Gel auf Nitrozellulosemembran - Nachweis spezifischer Moleküle Southern - Makromoleküle: DNA - Nachweis: Hyridisierung mit markierten Sonden (DNA, Oligonukleotide) Northern - Makromoleküle: RNA - Nachweis: Hyridisierung mit markierten Sonden (DNA, Oligonukleotide) Western - Makromoleküle: Proteine - Nachweise: Antikörper Seite 50

51 Verschiedene Vektortypen Vektor Plasm id Bacteriophage Cosmids BACs (künstliche Bakterienchromosomen) YACS (künstliche Hefechromosomen) Einbaugröße (kb) <10 kb 9-20 kb kb kb kb Cosm ide sind Plasm id-vektoren, die cos-sequenzen (Phage λ) enthalten. Diese sind für die Integration in Phagen notwendig Expressionsvektoren - klonierte DNA soll in Wirtszellen exprimiert werden - Probleme: - Wirtszelle muss DNA-Regulation des Ausgangsorganismus verstehen - gesamte Regulationseinheit muss kloniert sein - Lösung: Klonierung des prozessierten Gens: mrna Seite 51

52 Klonierung von prozessierten Genen: cdna Isolation von mrna - Regulation hat stattgefunden - Splicing hat stattgefunden - endgültige kodierende Sequenz - Polyadenylierung durchgeführt DNA-Synthese - poly-dt als Primer! - Reverse Transkriptase als DNAPolymerase zweite Syntheserunde zur Produktion von dsdna Klonierung der fertigen Gene in Expressionsvektoren Seite 52

53 RNA-abhängige DNA-Polymerasen Reverse Transkriptasen - Umschreibung retrovorale RNA in DNA - Laboranwendung: cdna-synthese aus RNA Enzme: AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus) - RNase H, (DNA-abh. DNA-Pol.) - T = 42 C, niedrigere Prozessivität (1-2 kb) MMLV-RT (Moloney Mouse Leukemia Virus) - geringere RNase H - T = 37 C, höhere Prozessivität (> 2 kb) Modifizierte MMLV-RT (SuperScript etc.) - keine RNase H! - Produktlängen bis 20 kb! Seite 53

54 Primer Oligo-dT-Primer dt - Hybridisierung mit 3 -PolyA-Schwanz der mrna - Möglichkeit der Full-length-cDNA Random-Primer - Statistische Hexamere - Alle Bereiche von mrna und Nicht-mRNA vertreten Spezifische Primer - Bei bekannter Sequenz - Niedrige Ausbeuten Anwendungen: - cdna-banken - RT-PCR Seite 54

55 DNA-abhängige RNA-Polymerasen Enzyme der regulären Transkription Verwendung als Werkzeuge: Polymerasen aus Phagen - SP6-Polymerase - T3-Polymerase - T7-Polymerase Erkennung spezifischer Promotor-Sequenzen RNA-Synthese 3 von diesen Sequenzen Seite 55

56 DNA-Bibliotheken Quelle: - genomische DNA - cdna Ziel: - möglichst jede DNA-Sequenz eines Organismus in Plasmid kloniert (Genomsequenzierung) - möglichst jede mrna eines Organismus als Klon (Physiologie, Zellzyklus, etc) Seite 56

57 Expression humaner Antikörper in Bakterien Klonierung des Vektors psex in E.coli führt zu Produktion veränderter M13-Phagen Ein Teil der Bindeprotein piii trägt eine humane erste Antikörperdomäne mit Antigenbindestelle Seite 57

58 DNA-Bibiliothek in YACs Mit Hilfe dieser Methode können extrem lange DNA-Fragmente bis zu 1 MBb (z. B. zur Erzeugung von Genombibliotheken) kloniert werden Erzeugung langer Fragmente durch partiellen Restriktionsverdau Es können Regulationsmechanismen größerer Geneinheiten untersucht werden Seite 58

59 Expression in Pflanzen Agrobacterium tumefaciens (erzeugt Tumore in den Wirtspflanzen) Bei der Infektion einer Pflanze durch das Bakterium verlässt ein Stück DNA (= T-DNA) mit 30,000 Basenpaaren das Plasmid und integriert sich in die DNA der pflanzlichen Wirtszelle. Die Tumorgene der T- DNA müssen inaktiviert werden Fremdgene müssen an dieselbe Stelle des TiPlasmids integriert werden. Das rekombinante Plasmid mit dem integrierten Gen muß dann wieder in die A. tumefaciens Zelle transferiert werden. Die Bakterienzelle muß nun in das Protoplasma der Pflanzenzelle gebracht werden. Die Wirtspflanzen exprimieren die eingebarchten Gene Seite 59

60 Transgene Pflanzen: einige Beispiele Anti-Matsch-Tomate Transgene Sojapflanzen Polygalacturonase (PG) Resistenz gegen Roundup, Liberty Bt-Mais ( Genmais ) Seite 60

61 Polymerase Kettenreaktion PCR Seite 61

62 Molekularbiologie Methoden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Dr. Thomas Seehaus

63 Geschichte 1970 Kjell Kleppe: Vermehrung von DNA durch zwei flankierende Primer, wegen fehlender technischer Möglichkeiten geriet die Methode wieder in Vergessenheit 1983 Kary Banks Mullis: erneute Erfindung der PolymeraseKettenreaktion, Idee: künstliche Vervielfältigung von DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe von DNAPolymerase Verbesserung: Verwendung von thermostabilen DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, fehleranfällig -> Mutationen! Pwu-Polymerase aus Pyrococcus woesei, Korrekturmechanismus! Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, ebenfalls Korrekturmechanismus Seite 63

64 PCR in der Praxis Vervielfältigung von kurzen (bis 3000 bp), genau definierten Teilen eines DNA-Stranges Benötigte Komponenten: - Original-DNA - zwei Primer, die den zu vermehrenden Bereich berenzen - thermostabile Polymerase - Nukleotide - Mg2+-Ionen (Kofaktor der Polymerasen) - Pufferlösungen (geeignete chemische Umgebung für Polymerasen) - Thermocycler Seite 64

65 PCR - Beispiel 1,0 µl DNA-Vorlage (100 ng/µl) 2,0 µl pro Primer (10 µm) 1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile Polymerase (1-5 U/µl) 1,0 µl 10 mm Desoxy-Nukleotide (datp, dgtp, dctp, dttp), dntp 5,0 µl 10fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung 38,0 µl H2O ad 50,0 µl Gesamtvolumen Ein 200 µl-reaktionsgefäß mit den 50 µl Gemisch wird in den Thermocycler gestellt. Seite 65

66 Ablaufschema der PCR (1) Schmelzen (Denaturierung) bei ca. 96 C. (2) Anlagerung (Primerhybridisierung) bei ca. 68 C. (3) Verlängerung (Elongation) bei ca. 72 C (P=Polymerase). (4) Der erste Zyklus ist beendet. Seite 66

67 Schritte des PCR-Prozesses Die folgenden Angaben sind als Richtwerte gedacht. Meist muss eine PCR auf die spezifische Reaktion hin optimiert werden. Für eine normale Präparation eines Amplifikats reicht folgendes Programm aber aus: Initialisierung. Das Gemisch wird ca. 2 Minuten lang auf 96 C erhitzt, um sicherzustellen, dass sich die DNA-Doppelstränge getrennt haben. Manche (sogenannte hot start-) Polymerasen müssen auch durch eine noch längere anfängliche Erhitzungs-Phase (bis zu 15 Minuten) erst aktiviert werden. Denaturierung. Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf 96 C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNA während der Zyklen zu zerlegen. Anlagerung (annealing). Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf einer Temperatur halten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt (bzw. der passenden Nukleotide im Primer, wenn durch diesen Mutationen eingeführt werden sollen = site-directed Mutagenesis). Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer u. U. auch an nicht 100%komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten ( Geisterbanden ) führen. Wird die Temperatur zu hoch gewählt, ist die thermische Bewegung der Primer u. U. so gross, dass sie sich nicht richtig anheften können, so dass es zu gar keiner oder nur ineffizienter Produktbildung kommt. Meist liegt die Temperatur bei 55 C bis 65 C. Seite 67

68 Schritte des PCR-Prozesses Verlängerung (elongation). Die Temperatur für ca. 30 Sekunden je 500 Basenpaare auf C (je nach Polymerase) halten. Die Schritte 2-4 werden mal wiederholt. Das Gemisch wird bei 4-8 C aufbewahrt. Man kann die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einleiten, so dass sie über Nacht läuft. Die DNA wird bei 4-8 C nach nur einer Nacht nicht beschädigt. Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNA-Stränge schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden. Das PCR-Produkt in niedriger (Bande 2) und hoher (Bande 3) Konzentration im Vergleich mit der DNA-Leiter (Bande 1) in Agarose-Gel. Seite 68