Analyse der Low-Density-Lipoproteine (LDL) Kann die LFE die UZ-Fraktionierung von LDL ersetzen?

Transkript

1 1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Klinische Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Analyse der Low-Density-Lipoproteine (LDL) Kann die LFE die UZ-Fraktionierung von LDL ersetzen? Ein Methodenvergleich INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität zu Freiburg i. Br. vorgelegt 2005 von Ingrid Knothe, geb. Döring aus Erfurt (Thüringen)

2 2 Dekan 1. Gutachter: 2. Gutachter: Jahr der Promotion: Prof. Christoph Peters Prof. Heinrich Wieland PD Dr. Manfred Baumstark 2005 Ein Teil dieser Arbeit wurde auf dem 12. Atherosklerose-Symposium in Erfurt am 20. bis 21. Juni 2003 als Poster vorgestellt.

3 3 Meinem Mann und meinen Kindern Reinhard, Dagmar und Angelika gewidmet.

4 4 Um eine Arbeit wie die vorliegende zu erstellen, bedarf es eines Umfeldes, das eine Beschäftigung mit dem Thema, die Durchführung der praktischen Tätigkeiten im Labor und das Zusammenschreiben der Ergebnisse ermöglicht. Dieses Umfeld für mich bereit gestellt zu haben, dafür möchte ich mich sehr herzlich bedanken bei Herrn Professor Dr. med. Heinrich Wieland, für die Überlassung des Themas und der großzügigen Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Arbeitsmittel, meinem Mann, für Anregungen und Kommentare in allen Phasen der Arbeit und für die kritische Durchsicht des Manuskripts, meinem Sohn Reinhard, der mir half, eines der größten Abenteuer unserer Zeit zu bewältigen, die in der Drohung eines abstürzenden Computers oder verschwundenen Textund Bilddateien bestehen. Mit seiner Hilfe gelang es, die verschiedenen verwendeten Betriebssysteme, Programme und Dateiformate soweit zu besiegen, d.h. kompatibel aufeinander abzustimmen, dass ein einheitliches Ganzes entstehen konnte, Frau Brigitte Kreisel, die vom ersten Tage unserer harmonischen Zusammenarbeit mit intensiven Arbeitseinsatz an dem Gelingen der Arbeit beteiligt war, insbesondere bei der Erarbeitung der Herstellung sauberer LFE-Gele. Herrn PD Dr. med. Karl Winkler, für die stets freundliche Unterstützung und hilfreichen Diskussionen zum Thema Lipidforschung, Frau Isolde Friedrich und Frau Nülüfer Ödünc, von denen ich eine immer entgegenkommende und unterstützende Hilfe erfahren habe. Sie haben für alle verwendeten Seren die LDL-Subfraktionen durch die UZ-Analyse erstellt und die Apo B-100- und Cholesterin-Messwerte geliefert, auf denen der Methodenvergleich basiert, Herrn Professor Dr. med. Wofgang Kreisel, Herrn Professor Dr. med Matthias Nauck, Herrn PD Dr. med. Karl Winkler, Frau Dr. Tatjana Stojankovic und Herrn Günter Schäfer, die mir durch zahlreiche Blutspende-Aktionen Material zur Evaluation der LFE-Methode zur Verfügung gestellt haben Mein ganz besonderer Dank gilt den Mitarbeitern des Zentrallabors der Universität Freiburg für die offene, stets freundliche Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbereitschaft bei der Überwindung größerer und kleinerer Probleme, die beim Arbeiten im Labor auftreten können.

5 5 Zusammenfassung Koronare Herzkrankheit und Schlaganfall sind die fatalen Endpunkte der Atherosklerose. Unter den Risikofaktoren nehmen vor allem Cholesterin und Neutralfette transportierende Lipoproteine eine herausragende Stellung ein. Lipoproteine können in Fraktionen und Subfraktionen getrennt werden. In vielen epidemiologischen Studien war gezeigt worden, dass von den Low-Density-Lipoproteinen (LDL) besonders die Subfraktionen mit kleinen, dichten Partikeln mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen assoziiert sind. Um diese besonders atherogenen LDL-Partikel diagnostisch zu erfassen, ist eine Auftrennung in LDL-Subfraktionen erforderlich. Hierzu dient die analytische Ultrazentrifuge (UZ) als das (zeitaufwendige) Standardverfahren. In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit eine vergleichbare Auftrennung der LDL aus dem Serum durch eine Gradientengel-Elektrophorese (LFE) möglich ist. Mittels der LFE werden die Lipoproteine durch die kleinen Unterschiede ihrer Wanderungsgeschwindigkeiten auf dem Gradientengel der Grösse nach getrennt. Entsprechend den Fraktionen LDL1 bis LDL6 zunehmender Dichte aus der UZ-Analyse wurden die LDL-Fraktionen in der LFE ebenfalls in sechs Subfraktionen unterteilt. Da die Unterschiede der Rs-Werte innerhalb der LDL-Fraktion zwischen LDL1 und LDL6 klein sind, ist es notwendig, einen Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6 jeweils rechts und links vom Patientenserum aufzutragen. Die Zuordnung der LDL-Hauptfraktion für das Serum erfolgte anhand seines Rs-Wertes relativ zu den gemittelten Rs-Werten für die UZ-Standard-Banden der benachbarten Spuren. Die densitometrische Bestimmung der Rs-Werte wurde mittels des Software-Programms Scan-Pack 3.0 vorgenommen. Von 82 Patientenseren wurden die jeweils mit UZ und mit LFE bestimmten LDLSubfraktionen miteinander verglichen. Als Bezugsgrössen zur Ermittlung der UZ-LDLHauptfraktionen dienten dabei die fraktionsweise gemessenen ApoB- und Chol-Werte. Bei 28 Seren ergab sich in den UZ-Subfraktionen keine Hauptfraktion, sondern eine annähernde Gleichverteilung der Messparameter. Eine Zuordnung entfiel daher für diese Seren. Als UZHauptfraktion wurden dann nur solche Proben mit ApoB- bzw. Chol-Werten 23%, 25% bzw. 27% zugelassen. Bei einem cut-off von 23% ApoB wurde für 56% der Proben eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der LFE gefunden, bei 25% stimmten 61% überein und bei 27% wiesen 64% eine gleiche Zuordnung hinsichtlich der markanten LDLSubfraktionen auf. Die gleichartige Auswertung anhand der Chol-Werte zeigte den gleichen Trend, die Übereinstimmung beider Verfahren war aber etwas geringer. Wertet man nach einem Modus aus, bei dem LDL1 und LDL2 zu einer Fraktion weniger atherogener Partikel, LDL3 und LDL4 als Zwischenfraktion und schließlich LDL5 und LDL6 als hochatherogene Subfraktion jeweils zusammengezogen bei einem cut-off von 33% ApoB zum Vergleich mit den LDL-Fraktionen der LFE gebracht werden, resultiert eine Äquivalenz von 72% der Subfraktionen. Die LFE ermöglicht es, bei sorgfältiger Arbeitsweise aus nativen Seren ein Lipidprofil durch Aufspaltung in die VLDL, IDL sowie die LDL- und HDL-Subfraktionen zu erstellen. Darüber hinaus ermöglicht die LFE auch die Detektion und (halbquantitative) Bestimmung von Banden, die vor LDL1 und hinter LDL6 auftreten und in der UZ zum Teil mit diesen zusammen bestimmt werden. Hier liefert die LFE verglichen mit der UZ zusätzliche wertvolle Informationen.

6 6 Inhaltsverzeichnis Einleitung Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels Resorption von Nahrungslipiden Lipide im wässrigen Milieu Entstehung von Lipoproteinen in Darm und Leber Primäre Hypertriglyceridämien (Zusammenfassung) Sekundäre Hyperlipoproteinämien Atherogenese Dyslipidämie - einer der wichtigsten Risikofaktoren für KHK und Schlaganfall Gesamt-Cholesterinwert nicht ausreichend für die Risikoabschätzung einer KHK ALP - der atherogene Lipoproteinphänotyp LDL-Subfraktionen Atherogenität der kleinen, dichten LDL-Partikel Auftrennung der LDL in Subklassen durch UZ Aufspaltung der Lipoproteine mittels der LFE Vergleich UZ mit LFE Praktischer Teil Geräte und Reagenzien Durchführung der Lipoprotein-FraktionierungsElektrophorese Auswertung nach der Mittelwertmethode UZ-Standard für die LFE Voraussetzungen Methodenvergleich Auswerteverfahren Diskussion Fazit und Ausblick Anhang Gel L Gel Gel 132/ Gel Gel Gel UZ-Analyse für 82 Seren Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis

7 7 Einleitung Müssen Herz-Kreislauf-Erkrankungen die Geißel des einundzwanzigsten Jahrhunderts bleiben? Fast die Hälfte aller Todesfälle in Deutschland sind durch Krankheiten des Herz-Kreislauf-Systems bedingt. Dabei kommt den atherosklerotischen Erkrankungen ein besonderes Gewicht zu. Auch weltweit sind Atherosklerose-assoziierte Erkrankungen die Todesursache Nummer eins, die Atherosklerose ist weltweit für mehr als 28% der Todesfälle verantwortlich. Bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen besteht jederzeit die Gefahr, dass wichtige Körperregionen nicht mehr ausreichend mit Blut versorgt werden. Ursache hierfür sind durch atherosklerotische Plaquebildung krankhaft veränderte Blutgefäße. Durch Einengung, Verschluss oder Plaqueruptur und Thrombose resultiert eine Minderversorgung vor allem von Herz, Gehirn und Beinen mit Sauerstoff. Koronare Herzkrankheit, Schlaganfall und periphere arterielle Verschlusskrankheit sind die fatalen Endpunkte der Atherosklerose. Unter den Risikofaktoren dieser sich über Jahre und Jahrzehnte hinweg entwickelnden chronisch entzündlichen Erkrankung Übergewicht, Diabetes, Rauchen, Hypertonie, fortgeschrittenes Alter nehmen vor allem bestimmte Cholesterin und Neutralfette transportierende Lipoproteine eine herausragende Stellung ein. Ihre qualitative und quantitative Bestimmung stellt einen Risikoprädiktor für Atherosklerose dar. Die Rolle der Hypercholesterinämie als wichtiger Risikofaktor der koronaren Herzkrankheit ist seit langem unbestritten. Nachdem zunächst nur zwischen guten High-Density-Lipoproteinen (HDL) und bösen Low-DensityLipoproteinen (LDL) unterschieden wurde, konnte in vielen epidemiologischen Studien gezeigt werden, dass von den LDL-Partikeln besonders die kleinen, dichten Subfrakionen mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf Erkrankungen assoziiert sind. Um diese besonders atherogenen LDL-Partikel

8 8 diagnostisch zu erfassen, ist eine Auftrennung in LDL-Subfraktionen erforderlich. Hierzu dient die Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (UZ) als Standardverfahren. Diesem zeitaufwendigen Verfahren wird in der vorliegenden Arbeit die Gradienten-Polyacrylamidgel-Lipoprotein-Fraktionierungselektrophorese (LFE) gegenübergestellt. Es wurde untersucht, inwieweit eine Auftrennung der LDL aus dem nativen Serum durch die LFE mit vergleichbarem Ergebnis möglich ist. Bevor die LFE genauer beschrieben, ihre Evaluation dargestellt, und sie auf ihre zusätzlichen diagnostischen Möglichkeiten hin untersucht wird, ist es notwendig, kurz auf die Rolle der verschiedenen Lipoproteine im Stoffwechsel des gesunden Organismus und auf Abweichungen im Krankheitsfall einzugehen.

9 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 9 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 1.1 Resorption von Nahrungslipiden Lipide sind lebensnotwendig. Sie dienen der Energiespeicherung (Triacylglycerine) und dem Aufbau von Membranen (Phosphoglyceride, Sphingolipide, Cholesterin) ebenso wie der Signalvermittlung (Steroidhormone der Nebennierenrinde und der Gonaden, Gewebshormone, Prostaglandine und Leukotriene) und dem Stoffwechsel (Vitamine E, D, K, A und Gallensäuren). Die mit der Nahrung zugeführten Lipide, d.h. im wesentlichentriglyceride (Fette), Cholesterin, die fettlöslichen Vitamine E, D, K, A, sind große, nicht zur Micellenbildung befähigte Moleküle von geringer Wasserlöslichkeit. Triacylglycerine alleine sind, da alle drei Hydroxylgruppen verestert sind, nicht in der Lage, an wässrigen Grenzflächen geordnete Strukturen auszubilden. Aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften müssen sie daher zunächst resorptionsfähig gemacht werden. Dies geschieht durch teilweise Verseifung im Magen durch die Einwirkung der Magenlipase und im Duodenum durch die triacylglycerinspezifische Pankreaslipase. Die dabei vor allem gebildeten β-monoacylglycerine weisen im Gegensatz zu den Triacylglycerinen hydrophobe und hydrophile Eigenschaften auf, wodurch unter der Einwirkung von Gallensäuren in relativ hoher Konzentration im intestinalen Lumen des Darmes die Bildung von Micellen ermöglicht wird. In den gebildeten Micellen können weitere Lipide (Cholesterin, freie Fettsäuren, fettlösliche Vitamine) eingeschlossen sein. 1.2 Lipide im wässrigen Milieu Lipoproteine und Apolipoproteine Nach Aufnahme der micellär gelösten Lipide in die Mucosazelle der Duodenalschleimhaut erfolgt ihr Umbau in eine im wässrigen Medium der Lymphe

10 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 10 Tabelle 1: Lipoproteinklassen (modifiziert nach März,W., Wieland, H.[38]) Fraktion Dichte Größe [g/cm3] [nm] TG CE Kern IDL ? LDL Lp(a) ? HDL HDL dto Chylomikronen VLDL <0.95 Zusammensetzung [%] FC PL Protein Hülle und des Blutplasmas transportable Form. Erst wenn sie an spezifische Proteine, sogenannte Apolipoproteine gebunden und mit einer hydrophilen Hülle versehen sind, sind sie als Lipid-Proteinkomplex (Lipoproteine) einem gerichteten und regelbaren Transport im wässrigen Milieu angepasst. Apolipoproteine stabilisieren die Struktur der Partikel, regulieren durch Wechselwirkung mit Zelloberflächenrezeptoren und Enzymen den Stoffwechsel der Lipoproteine und wirken durch Enzymmodulation auf den Umbau von Lipoproteinen ein. Lipoproteine erweisen sich als eine heterogene Mischung von Partikeln unterschiedlicher Größe, Dichte, Zusammensetzung und Funktion. Aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften lässt sich die große Anzahl der Lipoproteine in vier verschiedene Hauptklassen einteilen: Chylomikronen, VLDL-, LDL- und HDL-Partikel (siehe Tabelle 1 und Abbildung 1). Die einzelnen Klassen enthalten Triglyceride (TG), Cholesterinester (CE), freies Cholesterin (FC), Phospholipide (PL) und Proteine in unterschiedlichen Anteilen. Dabei tauschen sie sowohl Lipid- als auch Proteinanteile untereinander aus, so dass sie einer ständigen Strukturmodifikation im Plasma unterliegen. Während die meisten Lipoproteinpartikel mehr als ein Apolipoprotein aufweisen, besitzen die LDL als einziges Apolipoprotein jeweils ein Apo B-100-Molekül pro

11 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 11 LDL-Partikel. Vorkommen und Funktion der jeweiligen strukturgebenden Apolipoproteine sind in Tabelle 2 wiedergegeben Struktur der Lipoproteine Allen Lipoproteinen gemeinsam ist eine Struktur aus einem kugelförmigen, lipophilen Kern und einer amphiphilen Hülle. Der Kern ist ein Flüssigkeitströpfchen, bestehend vor allem aus Triacylglycerinen und Cholesterinestern. Die Hülle ist eine monomolekulare Schicht aus amphiphilen Phospholipiden mit unverestertem Cholesterin zur Stabilisierung, die polare Gruppe jeweils außen, und darin eingelagert eine Proteinkette, das Apolipoprotein. Damit entspricht die Hülle der Lipoproteine im Aufbau der Hälfte der Lipiddoppelschicht einer Zellmembran. Die Cholesterinester im Kern können die Hülle nur mit Hilfe von Transferproteinen passieren und damit das Lipoprotein verlassen. Die Apolipoproteine nehmen erst in Gegenwart von Phosphoglyceriden ihre endgültige räumliche Konformation an, indem sie sich als amphiphile Helices und Faltblätter organisieren. Sie lagern sich mit der einen Hälfte ihrer Oberfläche, an der sich überwiegend hydrophobe Aminosäureseitenketten befinden, dem Kern auf und treten mit der anderen Seite, die überwiegend hydrophile Aminosäureseitenketten aufweist, mit dem sie umgebenden wässrigen Millieu in Wechselwirkung. Dabei winden sich die jeweiligen Apolipoproteine mit ihren amphiphilen β-faltblattstrukturen und amphiphilen α-helicalen Anteilen um den Lipidkern herum (siehe Abbildung 2). Entsprechend diesem Modell ist das Verhältnis der Bestandteile abhängig von der Größe der Teilchen. Da die Oberfläche einer Kugel mit r2, das Volumen aber mit r3 wächst und die Hülle stets eine monomolekulare Schicht darstellt, ist der Prozentanteil an Protein und polaren Verbindungen umso größer, je kleiner die Teilchen. Weil Proteine eine größere Dichte aufweisen als Lipide, sind die kleinen Teilchen dichter, d.h. spezifisch schwerer als die großen. Innerhalb der Hauptklassen, z.b. innerhalb der LDL, kann man weitere Subfraktionen unterscheiden. Eine wichtige Frage ist dabei,

12 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 12 Abbildung 1: Lipoproteinklassen nach unterschiedlicher Partikelgröße und Partikeldichte aufgetragen. ob die Dichte- und Größenvariation der Teilchen ein Kontinuum darstellt, d.h. ob die Hülle ein Netz darstellt, das mehr oder weniger gefüllt sein kann, oder ob es zu einer Quantisierung der physikalischen Eigenschaften kommt. Auf diesen Punkt wird noch ausführlicher eingegangen werden müssen (Kap. 1.9). Ein weiteres wichtiges Lipoprotein ist Lp(a). Es wird bei der UZ- und bei der LFE-Analyse bei den LDL mitgemessen. Lp(a) besteht aus einem Molekül LDL und einem als Apo(a) bezeichneten Protein, das über eine oder mehrere Disulfidbrücken an das Apo B-100 gebunden ist. Im Gegensatz zu Apo B-100 ist Apo(a) hydrophil wegen seines hohen Kohlenhydratanteils von mehr als 54% des Molekulargewichtes. Wie Plasminogen, t-pa (tissue Plasminogen Activator) und andere Proteine des Fibrinolyse- und Gerinnungssystems weist es charakteristische Kringeldomänen auf. Die Besonderheit von Apo(a) besteht darin, dass Isoformen mit um ein Vielfaches differierenden Molekulargewichten gebildet werden, die aus sich wiederholenden identischen Kringeln resultie-

13 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 13 Tabelle 2: Apolipoproteine (nach [49]) Apolipo- VorMolekularproteine kommen gewicht x 103 Syntheseort Serumkonzentration (mg/dl) Funktion A-I HDL, Chylo 28,3 Darm, Leber Cofaktor der Lecithin-CholesterinAcyltransferase; Strukturprotein von HDL A-II HDL, VLDL 17 Darm, Leber Strukturprotein von HDL A-IV Chylo 48 Darm 15 Unbekannt B-100 LDL, VLDL 549 Leber Strukturprotein von LDL Intrazellulärer Aufbau oder transzellulärer Transport von VLDL; Rezeptorinteraktion (LDL) mit Apoprotein B, E-Rezeptorzellen B-48 Chylo 265 Darm, Leber? Intrazellulärer Aufbau oder transzellulärer Transport von Chylomikronen und VLDL; Rezeptorinteraktion mit Apoprotein B, ERezeptorzellen C-I Chylo, VLDL, HDL 6,5 Leber 4-8 Unbekannt C-II dito 8,8 Leber 3-8 Cofaktor der Fettgewebslipoproteinlipase C-III dito 8,9 Leber 8-15 Remnant-Aufnahme in der Leber D HDL 20? 10 Unbekannt; möglicherweise Rolle in LCAT-Reaktion und Cholesterinester-Stoffwechsel E Chylo, VLDL, HDL 34 Leber 3-5 Rezeptorinteraktion mit Apo B, ERezeptorzellen und mit hepatischem Apo E-Rezeptor: Inhibitor der Fettgewebslipase? ren (individuell konstant 5-28). Diese Eigenart weist Plasminogen, mit dem die größte sequentielle und damit auch strukturelle Ähnlichkeit besteht, nicht auf. Außerdem kann Apo(a) nicht wie Plasminogen zu einer aktiven Stufe hydrolysiert werden. Lp(a) ist atherogen und potentiell auch thrombogen. Daher erklärt sich, warum Patienten mit koronarer Herzkrankheit höhere Lp(a)-Werte aufweisen als Patienten ohne diese Erkrankung.

14 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 14 Abbildung 2: Struktur eines LDL-Lipoproteins (schematisch, modifiziert nach Segrest 2001 [59]). Links im Querschnitt: im Kern Triacylglycerine und Cholesterinester. Rechts in der Aufsicht: Apo B-100 mit α-helicalen und β-faltblatteinheiten windet sich um den Kern, dazwischen Phospholipide und freies Cholesterin. 1.3 Entstehung von Lipoproteinen in Darm und Leber Exogener Stoffwechsel (Darm-Peripherie-Leber) - Chylomikronen, Chylomikronen-Remnants Nach der Resorption der Nahrungslipide erfolgt in den Enterozyten des Darmes die Biosynthese von Chylomikron-Vesikeln. Im glatten endoplasmatischen Retikulum der Mukosazellen kommt es zur Wiederveresterung der freien Fettsäuren und der Mono- und Diacylglycerine zu Triacylglycerinen, zur Bildung von Cholesterinestern und zur Synthese von Phospholipiden. Diese Syntheseprodukte werden durch das Triglycerid-Transfer-Protein zum rauhen endoplasmatischen Retikulum transportiert. Hier erfolgt dann ihre Assemblierung mit dem Apolipoprotein B-48, wodurch zunächst kleine, unreife Chylomikron-Vesikel entstehen. Durch Aufnahme von Phosphoglyceriden, Cho-

15 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 15 Abbildung 3: Exogener und endogener Stoffwechsel der Lipide (nach [38]). lesterinestern und der Apolipoproteine A-I und A-II erfahren sie einen Reifungsprozess und gelangen schließlich in die Verpackungszentrale der Zelle, den Golgi-Apparat, wo sie in Sekretgranula gespeichert werden. Die Chylomikronen werden unter Einschaltung des mikrotubulären Systems durch Exocytose in den Extracellularraum freigesetzt. Sie sammeln sich in den intestinalen Lymphgängen und gelangen via Ductus thoracicus in die Blutbahn. Chylomikronen stellen die Transportform der mit der Nahrung aufgenommenen Triacylglycerine in Lymphe und Blut dar. Ihr Metabolismus entspricht dem exogenen Fettstoffwechselweg (siehe Abbildung 3). Ihr strukturgebendes Apolipoprotein B-48 ist praktisch unlöslich im wässrigen Milieu und wird nicht mit anderen Lipoproteinen ausgetauscht im Unterschied zu den weiteren Transportproteinen der Chylomikronen Apo A-I, A-II, Apo C und Apo E. Diese sind in freier Form wasserlöslich und werden zwischen den verschiedenen Lipoproteinen ausgetauscht.

16 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 16 Liegt eine Störung der Apo B-Biosynthese vor oder eine Mutation im Bereich des Triacylglycerin-Transferproteins, so können Apo B enthaltende Lipoproteine nur vermindert freigesetzt werden. Für Triacylglycerine stehen dann Transportproteine nicht in adäquater Menge zur Verfügung. Als Ausdruck der Verminderung bzw. des Fehlens von Chylomikronen, VLDL und LDL findet sich bei den Patienten eine ausgeprägte Erhöhung des Triacylglyceringehaltes der Darmmukosa und der Leber. Eine derartige Hypolipoproteinämie ist relativ selten, beruht zumeist auf genetischen Defekten und gehört damit den primären Lipoprotein-Stoffwechselstörungen an. Diese Patienten haben ein niedriges Risiko für Atherosklerose und kardiovaskuläre Ereignisse, jedoch ein erhöhtes für Karzinome und Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes und der Lungen. Sobald Chylomikronen im Blut erscheinen, verändern sie ihre Oberfläche. Durch Wechselwirkung der Chylomikronen, insbesondere mit der HDL2Fraktion, kommt es zum Austausch von Apolipoproteinen der Typen C und E. Das Apolipoprotein C-II wird benötigt als Cofaktor der Lipoproteinlipase (LPL). Dieses Enzym wird überwiegend von Fettgewebe und Skelettmuskulatur synthetisiert und sezerniert. Nach Dimerisierung und Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane erlangt es seine Aktivität auf der Außenseite der Plasmamembran vieler Zellen des extrahepatischen Gewebes, besonders der Endothelzellen der Blutkapillaren (siehe Abbildung 3, exogener Lipidstoffwechsel). Hier spaltet dieses Enzym die in Lipoproteinen transportierten Triacylglycerine zu Fettsäuren und Glycerin. Diese Spaltung ist notwendig, da ungespaltene Triacylglycerine wegen ihrer geringen Polarität nicht oder nur im geringen Umfang von Zellen aufgenommen werden können. Weisen Patienten bei regulärer Resorption der zugeführten Nahrungsfette und regulärer Chylomikronenbildung durch die Darmmucosa eine verminderte Lipoproteinlipaseaktivität auf, können die Chylomikronen nicht rasch genug verwertet werden. Die Ursache für die unzureichende Aktivität der Lipoproteinlipase kann ein genetisch bedingter Enzymangel mit autosomal rezessiven

17 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 17 Erbgang, eine Unterfunktion des Enzyms oder eine zu geringe Konzentration an Apo C-II sein. Die resultierende Chylomikronämie ist charakterisiert durch das Auftreten von Chylomikronen im Nüchternplasma, d.h. 10 bis 12 Stunden nach der letzten Nahrungszufuhr. Der Triacylglyceringehalt des Serums ist stark erhöht, kann bis zu 1000 mg/dl, in extremen Fällen auch 4000 mg/dl und mehr erreichen, bei zumeist nur moderat gesteigerter Cholesterinkonzentration. Der Nachweis dieser Fettstoffwechselstörung ist sehr einfach zu führen durch Stehenlassen des trüben, lipämischen Serums, wodurch sich eine dicke Fettschicht an der Oberfläche absetzt. Nach Fredrickson wird diese durch Lipoproteinlipasedefizienz oder Apo C-II-Defizienz verursachte Chylomikronämie als Hyperlipoproteinämie Typ I bezeichnet. Entscheidend für einen Therapieerfolg bei dieser Entgleisung des Lipidstoffwechsels ist eine Reduktion der Fettzufuhr auf 3 g/tag und die Bevorzugung der ohne Einbau in Chylomikronen direkt an das Pfortaderblut abgegebenen Fettsäuren kurzer und mittlerer Kettenlänge in der Nahrung. Die unter der Einwirkung einer Lipoproteinlipase ausreichender Aktivität abgespaltenen Fettsäuren sind in der extrazellulären Flüssigkeit überwiegend an Albumin gebunden. Sie werden von den extrahepatischen Geweben sowohl durch freie Diffusion durch die Lipiddoppelschicht als auch durch carrier-vermittelten Transport über das Fatty Acid Transport Protein (FATP) aufgenommen. In manchen Geweben erfolgt auch eine Konzentrierung von Fettsäuren durch Bindung an das Membranprotein CD 36. Intrazellulär werden die Fettsäuren durch die Acyl-CoA-Thiokinase (LACS) in Acyl-CoA umgewandelt und als solche dem Diffusionsgleichgewicht entzogen. Die jeweilige Stoffwechsellage bestimmt das Schicksal der in die Zelle aufgenommenen Fettsäuren. Sie werden entweder dem oxidativen Stoffwechselweg zur Deckung des Energiebedarfs zugeführt oder über Lipogenese als Energiespeicher genutzt. Das abgegebene Glycerin wird von der Leber über Glykolyse oder Gluconeogenese verwertet.

18 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 18 Beim Abbau der Chylomikronen im extrahepatischen Gewebe kommt es zu einem Verlust von 70% bis 90% der Triacylglycerine. Außerdem werden Apolipoprotein A und Cholesterin auf HDL-Vorstufen, sogenannte discoidale HDL, übertragen, wodurch die HDL3-Fraktion entsteht. Übrig bleibt der als Remnant bezeichnete Chylomikronenrest, der in der Leber abgebaut wird (siehe Abbildung 3, exogener Lipidstoffwechsel) Endogener Stoffwechsel (Leber-Peripherie-Leber) - VLDL, IDL, LDL, VLDL-Remnants Außer den bei der Resorption von Nahrungslipiden entstehenden Chylomikronen und den beim extrahepatischen Abbau entstehenden Chylomikronen-Remnants gehören zu den im Blutplasma transportierten triglyceridreichen Lipoproteinen die VLDL (Very-Low-Density-Lipoprotein) und die aus ihnen entstehenden IDL (Intermediate-Density-Lipoprotein). Ihre Aufgabe ist es, im Hungerzustand über den endogenen Stoffwechselweg (siehe Abbildung 3) periphere Gewebe mit Triglyceriden als Substrat der Energiegewinnung und mit Cholesterin zu versorgen. Im Unterschied zu den Chylomikronen werden die VLDL-Partikel in der Leber synthetisiert. Dabei gleichen sich Synthese und Assemblierung von VLDL und Chylomikronen. Im glatten endoplasmatischen Retikulum der Hepatozyten werden die Lipide synthetisiert, die dann durch Lipidtransferproteine zum rauhen endoplasmatischen Retikulum gelangen und dort mit dem Apolipoprotein B-100 assoziiert werden. Die Übertragung von Lipiden auf Apo B wird durch ein mikrosomales Triglycerid-Transferprotein katalysiert. Nach erfolgter Reifung der VLDL im Golgi-Apparat (Modifizierung des Proteinanteils des Apo B und Einbau von Phospholipiden in die VLDL) werden diese triacylglycerinreichen Lipoproteine in sekretorischen Vesikeln konzentriert und via Verschmelzung mit der Zellmembran in den Dissespalt sezerniert. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der freigesetzten VLDL sind abhängig von der vorherrschenden Stoffwechsellage. Die jeweilige Triglyceridsekretion in der Leber bestimmt die Beladung der sezernierten VLDL mit Lipiden. Ist die Menge an bereitgestellten Triacylglycerin

19 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 19 hoch, so entstehen große, lipidreiche VLDL1. Steht weniger Triglycerid zur Verfügung, so werden kleinere, dichte VLDL2 sezerniert. Ist das Angebot an Triglyceriden extrem gering, so können neben IDL auch LDL die Leberzelle verlassen. Die VLDL transportieren endogen synthetisiertes Triacylglycerin von der Leber zum Kapillarendothel und zum extrahepatischen Gewebe. Im Blutplasma kommt es zur Wechselwirkung der reifen VLDL mit HDL, mit der Folge einer Formveränderung und Anreicherung der VLDL-Partikel mit den Apolipoproteinen E, C-I und vor allem C-II. Insbesondere durch den Gehalt an CII, dem Cofaktor der am Kapillarendothel vorhandenen Lipoproteinlipase, werden die VLDL unter weiterer Form- und Dichteveränderung abgebaut. Dabei hydrolysiert die Lipoproteinlipase etwa 90% der Triglyceride aus den VLDL. Außerdem erfolgt ein Rücktransfer der meisten Apo C-Proteine und von freiem Cholesterin in der HDL-Fraktion. Am Kapillarendothel entstehen dadurch die an Apo E und Cholesterinester reichen VLDL-Remnants. Ein Teil dieser VLDL-Remnants wird über den Apo E-Rezeptor in die Leber aufgenommen, der andere Teil wird unter Verlust des größten Teiles von Apo C und Apo E (wobei wiederum HDL-Partikel eine Rolle spielen) über Zwischenstufen intermediärer Dichte, der IDL, in LDL-Partikel umgewandelt. Die Umwandlung der IDL in LDL-Partikel wird durch die hepatische Triglyceridlipase (HTGL) bewirkt. Nur etwa 10% der großen, triglyceridreichen VLDL1 werden durch Delipidierung in LDL umgesetzt, bei der kleineren, dichten VLDL2 wird dagegen mehr als die Hälfte zu LDL metabolisiert. Die entstehenden LDL-Partikel, die von allen Plasmalipoproteinen den höchsten Gehalt an Cholesterin und Cholesterinestern aufweisen (beim Gesunden transportieren die LDL mehr als zwei Drittel des Plasma-Cholesterins), werden über den LDL-Rezeptor sowohl von Leber- als auch von peripheren Gewebszellen aufgenommen. Der LDL-Rezeptor ist ein aus fünf Domänen mit insgesamt 839 Aminosäuren bestehendes spezifisches, in der Plasmamembran der Zielzelle gelegenes Membranprotein. An seinem N-terminalen Ende

20 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 20 befindet sich die extrazellulär gelegene Ligandenbindungsdomäne. Diese umfasst 292 Aminosäuren und enthält die Ligandenbindungsstelle für Apo B-100 und Apo E. Die Bindung der cholesterinreichen LDL (die LDL enthalten als einziges Protein Apo B-100) an die LDL-Rezeptoren der Leber (diese leistet den größten Beitrag zum rezeptorvermittelten Katabolismus der LDL) und der extrahepatischen Zielzelle löst die Aufnahme der Partikel in die Zelle durch Endozytose aus. Die inkorporierten LDL-Partikel werden lysosomal abgebaut, wobei Apo B-100 proteolytisch gespalten wird und die Cholesterinester durch eine lysosomale saure Lipase hydrolysiert werden. Das intrazellulär von den Lysosomen freigesetzte Cholesterin erfüllt wichtige Funktionen. Einerseits findet es als Ausgangsstoff für die Synthese von Gallensäuren, Steroidhormonen und Vitamin D und andererseits als Membranbestandteil Verwendung. Cholesterin lagert sich dabei so zwischen die Alkanketten der Fettsäurereste tierischer Membranen, dass seine Hydroxylgruppe in Richtung der hydrophilen Kopfgruppen der Phospholipide organisiert ist. Die Einlagerung dieses starren Moleküls unterstützt die hydrophoben Wechselwirkungen in der Alkanphase und stabilisiert in entscheidender Weise die biologischen Membranen. Das lysosomal freigesetzte Cholesterin reguliert seine eigene Biosynthese, indem es an den Membranen des endoplasmatischen Reticulums zwei Enzyme beeinflusst. Ein hoher intrazellulärer Cholesterinspiegel reduziert die Transcription des Gens der Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (diese HMG-CoA-Reduktase ist das Enzym des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes der Cholesterinsynthese) und unterdrückt damit die Cholesterinbiosynthese. Ausserdem wird die Acyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) aktiviert, was zur Veresterung des Cholesterins und seiner Speicherung in Lipidtropfen der Zelle führt. Der Gehalt der Zielzelle an freiem Cholesterin reguliert auch die Aktivität des LDL-Rezeptors und bestimmt die Geschwindigkeit des LDL-Katabolismus. Ist viel freies Cholesterin vorhanden, werden Synthese und Expression der LDL-Rezeptoren vermindert, ist wenig freies Cholesterin in der Zelle

21 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 21 vorhanden, wird die Aktivität der LDL-Rezeptoren erhöht. Auf diese Weise hilft der LDL-Rezeptor, eine Überschwemmung der Zellen mit Cholesterin zu verhindern. Über das freie intrazelluläre Cholesterin ist der LDL-Abbau via LDL-Rezeptor reguliert (etwa 75% des LDL-Katabolismus geschieht über Rezeptor-vermittelte Aufnahme), während der alternative Scavenger-Rezeptor der Makrophagen nicht reguliert ist. Darüberhinaus können ab einer bestimmten LDL-Konzentration Aufnahme und Abbau der LDL nicht mehr gesteigert werden, weil alle Rezeptoren gesättigt sind. Dagegen ist der ScavengerRezeptor nicht saturierbar, und es kann beim alternativen Scavenger-Weg zur Überschwemmung der Makrophagen und damit zur Bildung der gefährlichen Schaumzellen kommen, die bei der Atherogenese eine wichtige Rolle spielen. Zum Krankheitsbild der Hyperlipoproteinämie Typ IIa (Hypercholesterinämie nach Fredrickson) kommt es, wenn ein Funktionsdefekt des LDL-Rezeptors vorliegt. Vier Klassen von Genmutationen, die das Krankheitsbild verursachen, sind für homozygote Patienten definiert. (Frequenz: 1 zu 1 Mio.). Am häufigsten tritt ein LDL-Rezeptormangel auf. In anderen Fällen unterbleibt nach Synthese des Rezeptors dessen posttranslatorische Prozessierung und Glycosylierung, so dass sein Einbau in die Membran nicht erfolgen kann. Mitunter liegt auch ein mutationsbedingter Defekt der Bindungsstelle für LDL vor, oder ein defekter Rezeptorteil am C-terminalen Ende verhindert die Assoziation mit Clathrin und damit die Bildung der für die Rezeptorinternalisierung essentiellen coated pits. Unabhängig von ihrer Genese führen alle Rezeptordefekte zur Hemmung der LDL-Aufnahme und damit zur Erhöhung des LDL- bzw. Cholesterinspiegels im Serum. In extrahepatischen Geweben entfällt daher wegen der konsekutiv intrazellulär geringen Konzentration an freiem Cholesterin die Hemmung der HMG-CoA-Reductase und es kommt zur überschüssigen Cholesterin-Biosynthese. Der Verlust der regulierenden Wirkung der rezeptorvermittelten Aufnahme der cholesterinreichen LDLPartikel in die Zelle extrahepatischer Gewebe führt zur Erhöhung der Cholesterinkonzentration im Serum. Wegen der positiven Korrelation

22 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 22 zwischen der Höhe des Cholesterinspiegels und der Entwicklung einer Atherosklerose mit hohem Risiko eines koronaren oder cerebralen Infarktgeschehens ist bei der Behandlung der Hyperlipoproteinämie II eine Senkung des Cholesterinspiegels geboten. Die familiäre Hypercholesterinämie heterocygoter Patienten kommt mit einer Häufigkeit von 1:500 vor und macht etwa 5% der Patienten unter 60 Jahren mit Myokardinfakt aus. Das Behandlungsprinzip besteht in der Gabe von Hemmstoffen der HMG-CoA-Reduktase. Diese als Statine bezeichneten Medikamente leiten sich von den Pilzmetaboliten Compactin und Mevalonin ab. Sie besitzen einen zur Mevalonatstruktur homologen Anteil und inhibieren kompetitiv das Enzym des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes der Biosynthese von Isoprenderivaten und Cholesterin. Außerdem führen sie zu einer gesteigerten Synthese von LDL-Rezeptoren. Da bei Homozygoten beide Allele des LDL-Rezeptorgens defekt sind, ist eine Behandlung mit Statinen bei diesen Patienten nicht ausreichend. Bei Homozygotie sucht man eine Senkung der hohen LDL-Konzentration des Plasmas durch eine regelmäßig durchgeführte Apherese (z.b. HELP; Heparininduzierte extrakorporale LDL-Präzipitation [4] [58]) zu erreichen. Gleichzeitig wird eine Erniedrigung des Cholesterinspiegels im Plasma durch Cholestyramin und Nicotinsäure angestrebt. Diese nicht resorbierbaren Ionenaustauscher binden Gallensäuren und verhindern deren Rückresorption im Ileum und damit den Rücktransport via Pfortadersystem zur Leber. Durch die Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren vermindert sich die Gallensäurenkonzentration in der Leber, wodurch die Cholesterinbiosynthese in der Leber stimuliert wird. Da es gleichzeitig zu einer beschleunigten Umwandlung des gebildeten Cholesterins in Gallensäuren kommt, wird des Therapieziel einer Senkung des Cholesterinspiegels im Blut erreicht. Der regulative Effekt der Gallensäuren auf die Cholesterinsynthese wird auch durch den gegenteiligen Effekt belegt, nämlich der Hemmung der Cholesterinsynthese durch orale Zufuhr von freien und konjugierten Gallensäuren in hoher Konzentration.

23 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels Rücktransport peripher synthetisierten Cholesterins - HDL und seine Unterformen Cholesterin kann zwar von allen Zellen gebildet, aber nicht von allen Zellen verstoffwechselt werden. Überschüssiges Cholesterin wird nur mit dem Stuhl (in Form von Gallensäuren, ca. 0,5 g/tag) und über abgeschilferte Hautzellen (ca. 0,1 g/tag) ausgeschieden. Cholesterin muss daher von den peripheren Zellen zu seinem Hauptverwendungs- und Ausscheidungsort, der Leber, transportiert werden. Der reverse Transport von Cholesterin aus extrahepatischen Geweben zur Leber stellt die Hauptaufgabe der HDL dar. Reife HDLPartikel entstehen aus nascenter, sogenannter discoider HDL. Diese VorläuferHDL wird aus lipidfreiem Apo A-1 oder lipidarmem Prä-β1-HDL von den Hepatozyten und den Epithelzellen des Dünndarms produziert oder entsteht bei der Lipolyse von VLDL und Chylomikronen und durch Interkonversion der lipidreichen α-hdl3 und α-hdl2. So weisen die beim Abbau von Chylomikronen im Darm und der Leber entstehenden HDL-Vorstufen einen hohen Gehalt an Apo A-I auf. Über dieses Lipoprotein sind sie befähigt, das von der Leber synthetisierte und sezernierte Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) zu binden. Dieses Enzym setzt Cholesterin und Phosphatidylcholin zu Cholesterinester und Lysophosphatidylcholin um. Während Cholesterinester in den apolaren Kern wandert, wird von der Oberfläche der micellaren HDL-Partikel das Lysophosphatidyl abgespalten. Dadurch ist HDL in der Lage, Cholesterin aus den Membranen extrahepatischer Gewebe auf seiner Oberfläche einzulagern. Die entstandenen HDL-Partikel transportieren das extrahepatische Cholesterin zur Leber und den steroidogenen Zellen. Der insbesondere in Hepatozyten und steroidhormonproduzierenden Zellen exprimierte Scavenger-Rezeptor B1 (SRB1) bewirkt durch Bindung der HDL deren Aufnahme in die Zellen. Das internalisierte Cholesterin wird in den Hepatozyten der Umwandlung zu Gallensäuren und der Ausscheidung zugeführt. Da, wie bereits erwähnt, nur Leber-

24 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 24 zellen und steroidhormonproduzierende Zellen Cholesterin verstoffwechseln können, erlangt der reverse Cholesterintransport insbesondere für die Zellen Bedeutung, die, wie Makrophagen, eine Akkumulation von Cholesterin nicht regulativ begrenzen können. Da die Lipidanreicherung in Makrophagen eine entscheidende Rolle für die Pathogenese der Atherosklerose spielt, kommt dem reversen Cholesterintranport durch HDL eine entscheidende antiatherogene Funktion zu. Finden sich bei Patienten extrem niedrige Plasmaspiegel an HDL und Cholesterin, so liegt der Verdacht einer Tangier-Erkrankung nahe. Bei dieser Hypo-α-Lipoproteinämie liegt eine Mutation des ABC-1-Transporters vor. Die HDL-Vorstufen können dann nicht mit Cholesterin beladen werden, und es kommt zu Cholesterinablagerungen in den Zellen des reticuloendothelialen Systems (RES). Nicht bei allen Patienten ist ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen nachweisbar.

25 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 25 Tabelle 3: Klassifizierung der Hyperlipidämien nach dem Phänotyp (nach [49]) Phänotyp I Chylomikronämie Chylo VLDL IDL LDL Chol TG Aspekt aufrahmend, Unterstand klar ++ IIa normal normal klar Hypercholesterinämie IIb kombinierte Hypercholesterinämie III Dysbetalipoproteinämie + IV Hypertriglyceridämie V Hypertriglyceridämie ++ normal oder trüb trüb normal oder trüb ( ) aufrahmend, Unterstand trüb 1.4 Primäre Hypertriglyceridämien (Zusammenfassung) Nach Fredrickson lassen sich aufgrund des Erscheinungsbildes sechs Typen von primären Hyperlipoproteinämien unterscheiden (siehe Tabelle 3). Diese Einteilung beruht auf der Vermehrung von Chylomikronen, VLDL oder LDL und stellt eine rein phänotypische Formenbeschreibung dar. Der tatsächlichen metabolischen Erkrankung oder dem Vererbungsmodus genügt diese Einteilung nicht. Obwohl Lipoproteine dynamische Strukturen sind, die ineinander übergehen können und im Gleichgewicht miteinander stehen, lassen sich Krankheitsbilder definieren, bei denen häufig nur ein Lipoproteintyp gegenüber der Norm eine erhöhte Konzentration aufweist. Eine Zuordnung zu bestimmten Apolipoproteindefekten ist zumindest teilweise möglich, wenn es sich um genetisch fixierte Defekte handelt.

26 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 26 Tabelle 4: Genetische/metabolische Einteilung und Ursachen der primären Hyperlipidämien (nach [49]) Hyperlipidämie Phänotyp Koronares Risiko gewöhnliche (polygene) Hypercholesterinämie IIa + Familiäre kombinierte Hyperlipidämie IIa, IIb, IV ++ Familiäre Hypercholesterinämie IIa, IIb ++++ Remnant Hyperlipidämie / Dysbetalipoproteinämie III +++? Familiäre Hypertriglyceridämie IV, V? ++ Chylomikronämiesyndrom I,V PankreatitisRisiko +++ Ursache Metabolische Erscheinungsform multiple genetische und Umwelteinflüsse LDL-Überproduktion und verminderter LDLKatabolismus unbekannt Überproduktion von Apo B-100, VLDL und/oder LDL verschiedene Mutationen, die zu einer beeinträchtigten Rezeptor-Funktion führen beeinträchtigter LDL-Katabolismus, LDLÜberproduktion Zusammenwirken von nicht funktionellen Apo E-Isoformen (E-2) und genetischer oder erworbener Störung des VLDL/LDL Metabolismus beeinträchtigte Konversion von VLDL zu LDL, Überproduktion von IDL unbekannt VLDL-Überproduktion und/oder verminderter VLDLKatabolismus LipoproteinLipase- oder Apo C-II-Defizienz beeinträchtigter ChylomikronenAbbau

27 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 27 Zusammengefasst betreffen die primären Hyper- bzw. Dyslipidämien Mutationen in den Genen - der Apolipoproteine - der Assemblierung von Lipoproteinen - von lipolytischen Enzymen, sowie von - Rezeptoren, die für die Lipoproteinaufnahme benötigt werden. Die Klassifizierung der primären Hyperlipoproteinämien nach gene- tisch/metabolischen Gesichtspunkten, von der European Atherosclerosis Society vorgeschlagen, ist in Tabelle 4 wiedergegeben. Dabei sind die Hyperlipidämien nach abnehmender Prävalenz geordnet. 1.5 Sekundäre Hyperlipoproteinämien Die Diagnose einer primären Hyperlipoproteinämie kann nur dann gestellt werden, wenn eine sekundäre Hyperlipoproteinämie ausgeschlossen ist. Erworbene, d.h. sekundäre Hyperlipoproteinämien sind sehr viel häufiger und können die verschiedensten Ursachen haben. Bei bestimmten Krankheitsbildern wie Diabetes mellitus, Adipositas, Verschlussikterus, nephrotisches Syndrom, Gicht, Pankreatitis, Alkoholismus und Hypothyreose und während der Gravidität entstehen Hyperlipoproteinämien. Am häufigsten handelt es sich dabei um eine Hyperlipoproteinämie des Typs IV, häufig auch des Typs II. Nur bei dem heute sehr seltenen unbehandelten Diabetes mellitus Typ 1 findet sich eine Hyperlipoproteinämie des Typ I. Beim Verschlussikterus und der Hyperthyreose lassen sich darüber hinaus atypische Lipoproteine nachweisen. 1.6 Atherogenese Gegenwärtig wird die Annahme vertreten, dass bei Patienten mit sekundärer Hyperlipoproteinämie eine genetische Disposition zu erhöhten LDL-Konzentrationen und damit zu Hypercholesterinämie besteht, die jedoch durch zusätzliche exogene Faktoren wie Übergewicht, Bewegungsmangel oder/und Rauchen verstärkt wird. Es ist heute allgemein akzeptiert, dass Störungen des

28 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 28 Fettstoffwechsels, Dyslipidämien, insbesondere mit Hypercholesterinämie, das Risiko für Atherosklerose und schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie koronare Herzerkrankung, Herzinfarkt oder Schlaganfall eklatant steigern. Die PROCAM-Studie (eine prospektive epidemiologische Studie, die in Deutschland durchgeführt wurde) und ähnliche Studien zeigen, dass die Kumulation von Risikofaktoren einen multiplikativen Effekt auf das Atherothromboserisiko hat. Durch diese Studien wurde die Assoziation zwischen Serumcholesterinwert, Atherogenese und dem Risiko für kardiovaskuläre Krankheit und Koronartod sowohl bei jungen Männern und Frauen als auch bei älteren Personen festgestellt Definition der Atherogenese nach WHO In der Allgemeinen Pathologie ist Atherosklerose der Überbegriff für Arteriosklerose (Arterien betroffen), Arteriolosklerose (Wandveränderungen der Endaufzweigung der Arterien vor ihrem Übergang in Kapillaren, bevorzugt in Milz, Pankreas, Nebennieren, Gehirn und Nieren), Kapillarosklerose (homogene Wandverdickung der Kapillaren bei Diabetes mellitus und Phenazetinabusus) und kalzifizierende Mediasklerose (Mönckeberg-Sklerose, spangenförmige Verkalkung der Media, vorwiegend in den mittelkalibrigen Arterien vom muskulären Typ). Die Atherosklerose wird von der WHO wie folgt definiert: Variable Kombination von Intimaveränderungen der Arterien, die aus einer fokalen Anhäufung von Lipiden, komplexen Kohlenhydraten, Blut und Blutprodukten, fibrösem Gewebe und Kalkablagerungen bestehen und mit Mediaveränderungen einhergehen. Häufig wird, besonders im deutschen Schrifttum, die Arteriosklerose als Überbegriff verwendet, obwohl diese nur einen Teilabschnitt des Kreislaufs, die Arterien, berücksichtigt. Frühester Manifestationsort der Arteriosklerose ist in der Regel der Bauchabschnitt der Aorta, besonders im Bereich der Bifurkation und der Gefäßabgänge.

29 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 29 Allgemein treten atherosklerotische Veränderungen besonders häufig im Halsbereich im poximalen Abschnitt der A. carotis interna, an der Hirnbasis an den Karotiden, den Aa. vertebrales und der A. basilaris und als Koronararteriensklerose auf. Bei den Extremitäten sind meist die Beine stärker atherosklerotisch verändert als die Arme. Myokardinfarkt, Apoplex und periphere arterielle Verschlusskrankheit sind die gemeinsame Endstrecke einer zugrunde liegenden Gefäßerkrankung, der Atherothrombose. Dabei beeinflussen die klassischen Gefäßrisikofaktoren die Manifestationen der Atherothrombose unterschiedlich. Bei der Pathogenese des Schlaganfalls hat der Bluthochdruck einen relativ hohen Stellenwert. Dagegen nimmt eine Dyslipidämie mit Hypercholesterinämie einen größeren Einfluss auf die Entstehung einer koronaren Herzkrankheit Atherogenese als multifaktorielles Geschehen Vor wenigen Jahren noch verglich man atherosklerotische Gefäße mit verkalkten Wasserschläuchen, bei denen sich mit Fett beladenes Material innen an der Gefäßwand aufbaue, verkalke und den Blutstrom vermindere, bis dieser schließlich zum Versiegen komme. Nach neueren Erkenntnissen der Atheroskleroseforschung haben Arterienwände nur wenig mit passiven, starren Röhren gemein. Vielmehr sind es die lebenden, interaktiven Zellen der Gefäßwände, die beim Entstehen und Wachsen der atherosklerotischen Ablagerungen mitwirken. Nach heutigem Kenntnisstand spielen bei der Genese der Atherothrombose von Anfang an Entzündungsvorgänge eine entscheidende Rolle und entzündliche Vorgänge stecken hinter allen Phasen der Atherothrombose, von der ersten Schädigung des Endothels, der Enstehung einer Plaque über ihr Wachstum bis zu deren Aufplatzen Endotheliale Dysfunktion Das Gefäßendothel kleidet als einzellige athrombogene Schicht die Blutgefäße aus und bildet eine Barriere zwischen dem zirkulierenden Blut und der

30 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 30 Gefäßwand. Die bereits erwähnten Faktoren (fortgeschrittene Alterung, Bluthochdruck, Diabetes mellitus, Übergewicht, Cholesterin, Rauchen, Homocystein) sowie andere, bislang nicht identifizierte Faktoren können das Gefäßendothel schädigen, und es kommt zur Dysfunktion dieses Organs. Die endotheliale Dysfunktion bleibt meist umbemerkt, da sie keine Schmerzen verursacht. Aber sie stellt das erste Stadium der Atherogenese dar, noch vor Entstehung der atherosklerotischen Läsion. Folge der Endothelschädigung ist eine erhöhte Permeabilität des Endothels für Lipoproteine und andere im Plasma zirkulierende Stoffe. Zunächst reichern sich LDL-Partikel in der Intima der Gefäßwand an, die im engsten Kontakt zum Blutstrom steht. Bei normalen LDL-Konzentrationen im Blut wandern die Partikel frei in die Innenschicht ein und wieder heraus. Bei einem Überschuss an LDL-Partikeln im Blutstrom können sie dort jedoch steckenbleiben. Gleichzeitig unterliegen ihre Lipid- und Proteinkomponenten Oxidations- bzw. Glykosylierungsprozessen. Diese Veränderungen aktivieren Endothelzellen, auf ihrer der Blutseite zugewandten Zelloberfläche vermehrt Adhäsionsmoleküle, v.a. Selektine, zu exprimieren. Diese vermitteln zunächst den temporären, lockeren Kontakt von Monozyten und T-Lymphozyten mit dem Endothel. Durch eine weitere Gruppe von Haftmolekülen, den sogenannten Cellular Adhesion Molecules (CAMs), kommt es zur festen Anheftung dieser Zellen an die Gefäßwand [36]. Auch erhöhte Scherkräfte können zu einer gesteigerten Bildung von Adhäsionsmolekülen führen und darüber hinaus die Bildung von endothelialem NO (Stickstoffmonoxid) verringern. Die Verminderung der NO-abhängigen Vasodilatation ist sowohl bei Patienten mit Hypercholesterinämie als auch mit Hypertonie bereits frühzeitig nachweisbar [28], [73]. Ohne ausreichende Mengen dieses Mediators kann das Endothel seine gefäßrelaxierende und antiatherosklerotische Wirkung nicht oder nur unzureichend vermitteln. Stimuli wie Acetylcholin, Serotonin, Histamin, Thrombin ebenso wie Bradykinin und Katecholamine aktivieren die endotheliale NO-Synthase (enos). In Anwesenheit von Calcium und

31 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 31 Calmodulin bildet dieses Enzym aus der Aminosäure L-Arginin unter Entstehung von NO L-Citrullin. NO ist ein sehr kleines, lipophiles Molekül und kann daher direkt aus den Endothelzellen in die darunter liegenden glatten Muskelzellen diffundieren. Intrazellulär stimuliert NO die lösliche Guanylatcyclase zur Bildung von cyclischem Guanosinmonophosphat (cgmp). Dieses bewirkt die Relaxierung der glatten Muskelzellen, hemmt deren Proliferation und wirkt der Aggregation von Blutplättchen entgegen. Außerdem entfaltet NO direkte cgmp-unabhängige antiatherosklerotische Wirkungen: es hemmt die Oxidation von LDL sowie die Expression von Adhäsionsmolekülen, die für das Anheften von Blutzellen wie z.b. den Monozyten an das Endothel notwendig sind. Ist daher die erzeugte oder verfügbare Menge an NO erniedrigt, so ist dies ein eindeutiges molekulares Zeichen einer Dysfunktion des Endothels. Der Grundstein einer späteren Gefäßläsion wird also durch die endotheliale Dysfunktion vor der Formation atherosklerotischer Plaques und der klinischen Manifestation der Atherosklerose gelegt. Schädigungen des Endothels führen zu einer erhöhten Endotheldurchlässigkeit für Plasmabestandteile (u.a. Lipoproteine) und zur Anlagerung von Thrombozytenaggregaten und Monozyten am Endothel Eine lokale Entzündungsreaktion als Teilaspekt der Atherogenese Die Rolle der LDL bei der Atherogenese Im weiteren Verlauf der Atherogenese dringen vor allem Monozyten und in geringerem Ausmaß T-Lymphozyten zwischen den Endothelzellen hindurch in die Innenschicht des Gefäßes ein. Dies wird durch eine andere Gruppe von Molekülen vermittelt, zu denen z.b. das Chemokin Monocyten-Chemoattractant-Protein-1 (MCP-1) gehört. [20]. Die eingewanderten Monozyten teilen sich und differenzieren zu reifen Makrophagen. Diese besitzen nur wenige Rezeptoren für native LDL. Aus heutiger Sicht muss eine Modifikation der LDL eintreten, um Makrophagen durch Akkumulation von LDL-Lipiden

32 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 32 in die charakteristischen Zellen der atherosklerotischen Plaque, den Schaumzellen, zu transformieren. Über den (nicht regulierbaren und nicht saturierbaren) Scavenger -Rezeptor der Makrophagen werden die in der Intima angehäuften, durch Oxidation [62], Glykosylierung und enzymatischen Um- und Abbau (durch Protease und Cholesterinesterase entsteht enzymatisch modifizierte LDL (E-LDL) [9]) stark veränderten LDL-Partikel aufgenommen und phagozytiert. Während Fettsäuren leicht abgebaut werden, reichert sich das Cholesterin intrazellulär an. Zusammen mit den T-Lymphozyten bilden diese lipidbeladenen Makrophagen in der Gefäßwandung Lipidstreifen (Lipidläsionen, fatty streaks ), d.h. Vorläufer der später komplexer zusammengesetzten Plaques. Im Rahmen des Differenzierungsprozesses werden von den Schaumzellen und T-Lymphozyten proinflammatorische Zytokine und Chemokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukine (IL), Wachstumsfaktoren und andere Mediatoren freigesetzt. Diese eher schleichende, leichte Entzündung führt zu einem völligen Umbau der Arterienwand. Durch die inflammatorische Umgebung werden die glatten Muskelzellen in der Mittelschicht der Gefäßwand, der Media, aktiviert. Sie wandern aus der Media in die entstehende intimale Läsion ein, vermehren sich dort durch Teilung und produzieren Bausteine der Matrix, darunter das Faserprotein Kollagen und Proteoglykane. Auf dem Fettstreifen bildet sich so eine faserige Kappe, die aus eingewanderten glatten Muskelzellen und extrazellulärer Matrix besteht. Diese fibröse Deckschicht trennt das zirkulierende Blut und die atherosklerotische Plaque voneinander. Nach und nach kommt es unter der Faserkappe, innerhalb der Plaque, zu charakteristischen Veränderungen. Zu Schaumzellen transformierte Makrophagen und T-Lmphozyten, Bindegewebe-Fasern und Cholesterin akkumulieren in der wachsenden Läsion. Weitere Lipidaufnahme und Nekrose von Schaumzellen führen zur Bildung eines nekrotischen Kerns in der Läsion. An solchen fortgeschrittenen Läsionen strömt das Blut oft über Jahrzehnte relativ ungehindert vorbei, denn atherosklerotische Plaques können lange wenig in das Gefäß hinein expandieren, weil sich das Gefäß kompen-

33 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 33 satorisch erweitert. Außerdem dehnt sich eine ruhende atherosklerotische Plaque bei ihrem Wachstum durch Remodellingvorgänge zunächst ablumial in der Gefäßwand aus, wodurch das Lumen nur gering eingeengt wird. Kommt es dennoch zur Stenose des Blutkanals und kann sich z.b. eine verengte Herzarterie nicht mehr genügend erweitern, wird das zu versorgende Gewebe nicht ausreichend durchblutet. Erste Anzeichen einer Angina pectoris spüren Betroffene meist bei körperlicher Anstrengung. Klinisch manifest wird eine Stenose in der Regel erst ab einem Stenosegrad von etwa 50%, und sie wird auch erst in diesem Stadium angiographisch sichtbar. Mechanische Verfahren, von der Aufweitung verengter Arterien bis hin zum operativen Bypass, können zwar die Symptome einer Angina pectoris oft lindern, aber einen späteren Herzinfarkt trotzdem häufig nicht verhindern. Auch gehen nur etwa 15% aller Herzattacken oder ischämische Schlaganfälle auf das Konto einer Plaque zurück, deren Größe allein schon die Blutzufuhr fast völlig abschneidet. Ein ischämischer Infarkt droht vor allem dann, wenn die faserige Kappe aufbricht. Die Gefahr einer solchen Ruptur wächst umso mehr, je dünner die Faserkappe einer Plaque ist und je mehr Lipidmasse und Makrophagen sich angesammelt haben Die fortgeschrittene atherosklerotische Läsion Zur Ausbildung einer instabilen Plaque trägt wiederum eine Entzündungsreaktion bei. Dabei wird von aktivierten T-Lymphozyten aus der Plaque Interferon-α freigesetzt, das die Bildung extrazellulärer Matrix durch glatte Muskelzellen hemmt [2]. Gleichzeitig schütten Makrophagen und Schaumzellen Matrixmetalloproteasen aus, die Kollagen abauen. Die verminderte Bildung von neuem, frischem Kollagen und der vermehrte Abbau der extrazellulären Matrix führt zur Ausdünnung der Fibrinkappe und behindert deren Reparatur. Unter dem Einfluß von Scherkräften können sich Fissuren in der Deckschicht bilden oder es kann zur Plaqueruptur kommen. Sickert Blut durch die feinen Risse in den Lipidkern der Plaque ein, bzw. werden der thrombogene Lipidkern und

34 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 34 Kollagen in der Gefäßwand freigelegt, so führt die Aktivierung des Hämostasesystems zur okkludierenden oder nicht okkludierenden Thrombusbildung [35]. An der Aktivierung der Gerinnungskaskade sind maßgeblich wiederum TLymphozyten in der Plaque beteiligt. Sie veranlassen Makrophagen und Schaumzellen dazu, reichlich Gewebefaktor (tissue factor, TF) zu exprimieren, einen sehr potenten Auslöser der plasmatischen Gerinnungskaskade [75]. Die ulzerierte Plaque mit teilweiser Entleerung des atheromatösen Inhaltes und die aufgesetzten Thromben können sich klinisch als instabile Angina pectoris oder als ischämischer Infarkt manifestieren, bzw. durch das Ablösen von thrombotischem Material embolisch bedingte ischämische Krankheitsbilder verursachen. Wird ein Gerinnsel noch rechtzeitig auf natürlichem Weg oder mit Hilfe von Medikamenten beseitigt, kann ein Heilungsprozess einsetzen, der die Kappe wieder herstellt, bei dem sich aber die Plaque infolge der Bildung von Narbengewebe weiter vergrößert. Durch sich bildende und sich wieder auflösende Gerinnsel können Plaques unter Zurücklassung von Narben in Schüben wachsen. Die eigentliche Gefahr liegt nicht nur in der Größe und der Ausdehnung einer das Gefäß einengenden Plaque, sondern auch in dem hohen Risiko, dass diese jederzeit aufreißen kann Risikofaktoren der Atherogenese als Teil eines systemischen Entzündungsgeschehens Atherosklerose ist einerseits durch ein entzündliches Geschehen in der Gefäßwand und andererseits durch eine systemische niedriggradige inflammatorische Antwort charakterisiert. Die genannten Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen wirken als proinflammatorische Stimuli und passen sich zwanglos in die Inflammationshypothese der Atherogenese ein [37]. So ist beim Diabetes mellitus die Glucosekonzentration im Blut erhöht, was die Glykosylierung von Proteinen begünstigt und die entzündungsfördernden Eigenschaften von LDL in die Höhe treibt. Das Myokardrisiko ist daher beim Dia-

35 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 35 betiker gegenüber dem Nichtdiabetiker verdoppelt, das Risiko einer Gangrän der unteren Extremität verzehnfacht. HDL-Partikel transportieren neben Cholesterin auch Enzyme, die oxidierte Lipide abbauen. Dieser entzündungshemmende Effekt der HDL-Partikel trägt möglicherweise auch dazu bei, dass ein niedriger HDL-Cholesterinwert mit einem erhöhtem kardiovaskulärem Risiko einhergeht, Die Bedeutung des Zigarettenrauchens für die Entstehung einer Atherosklerose ist statistisch eindeutig gesichert, insbesondere für die Koronarsklerose. Dabei kann das schädigende Agens an zahlreichen Stellen ansetzen: Störung der Myokardfunktion, Vasokonstriktion und Hypertonie, Vermehrung des Plasmafibrinogens und der weißen Blutzellen, Ungleichgewicht zwischen Prostazyklin und Thromboxan A2 mit Erhöhung der Thromboseneigung sowie Aktivierung der Thrombozyten. Vor allem aber fördert Rauchen die Bildung reaktionsstarker Oxidantien. Das Rauchen leistet damit der Oxidation von LDL-Bestandteilen und dem Endothelschaden mit Permeabilitätserhöhung Vorschub. Bei einer Hypertonie kommt es unabhängig von ihrer Genese zu einer verstärkten Endothelbelastung, die sich nicht nur in den großen, sondern auch in den kleinen Arterien bemerkbar macht. Außerdem fördert eine erhöhte Aktivität des Hormons Angiotensin II, das für viele Fälle von Bluthochdruck mitverantwortlich ist, Entzündungsprozesse. Darauf weist die günstige Wirkung der ACE-Hemmung auf inflammatorische Marker und proinflammatorische Zytokine (wie z.b. Interleukin-6) hin, die bei der Entstehung atherosklerotischer Gefäßläsionen wie auch bei den Vorgängen, die zur Plaqueruptur führen, eine wichtige Rolle spielen. Eine Adipositas begünstigt das Entstehen von sekundärer Hypertriglyceridämie und Hypercholesterinämie, von arterieller Hypertonie sowie die Manifestation eines latenten Diabetes mellitus Typ 2 und damit auch die Ausbil-

36 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 36 dung einer Atherosklerose. Ab einem Körpermassenindex (BMI1) von 35 bis 40 kg/m2 sind kardiale Morbidität und Mortalität sehr stark erhöht Hoch sensitives CRP - ein unabhängiger Marker der Atherothrombose Unterstützung erfährt die Inflammationshypothese der Atherogenese vor allem durch den Nachweis von diversen Entzündungsmarkern (Zell-Adhäsionsmolekülen, Zytokinen) und von C-reaktivem Protein (CRP) in humanen atherosklerotischen Läsionen [44], [70]. Außerdem konnte in mehreren prospektiven Studien der Zusammenhang zwischen systemisch messbaren Inflammationsmarkern wie Adhäsionsmolekülen (ICAM-1, VCAM-1, E-Selectin), Zytokinen (IL-6, TNF-α) sowie verschiedenen Akute-Phase-Proteinen, wie zum Beispiel des mittels hochsensitiver Assays bestimmbaren C-reaktiven Proteins, und konsekutiven kardiovaskulären Endpunkten gezeigt werden [10]. Die Nachweisgrenze herkömmlicher Verfahren zur Bestimmung der CRPKonzentration, im Rahmen der Infektionsdiagnostik eine Akute-Phase-Reaktion zu erfassen (3-5 mg/l), reicht nicht aus, um CRP-Konzentrationen, die für die Entwicklung einer Atherosklerose relevant sind, zu bestimmen. Für die kardiovaskuläre Risikostratifizierung sind sogenannte high sensitivity CRP (hscrp)-assays mit einer Nachweisgrenze unter 0,3 mg/l erforderlich [29], [50]. Als Akute-Phase-Protein reagiert CRP, das primär in der Leber gebildet wird, auf inflammatorische Stimuli (über IL-6 wird die Akute-Phase-Reaktion in der Leber stimuliert). Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass CRP möglicherweise auch in der atherosklerotischen Plaque gebildet wird und dort 1 BMI = Gewicht in kg geteilt durch das Quadrat der Körpergrösse in m. Bei Erwachsenen sind Änderungen der Körpermasse hauptsächlich durch Änderungen der Fettmasse bedingt. Die Fettmasse wird als relativer Anteil an der Körpermasse indirekt geschätzt. Erwachsene mit einem BMI im Bereich zwischen 18.5 und 24.9 gelten als normalgewichtig, mit höheren Werten als übergewichtig. Der Schwellenwert für Adipositas ist willkürlich und unterschiedlich festgelegt, meist bei einem BMI von 28 bis 30 kg/m2.

37 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 37 atherogene Effekte entfaltet [78]. CRP findet sich mit enzymatisch modifizierter LDL (E-LDL) und dem terminalen Komplementkomplex C5b-9 in der arteriellen Gefäßwand kolokalisiert [69] und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen [1]. Rezeptorvermittelt und auch durch Induktion von MCP-1 lockt CRP Monozyten an [43]. Es opsoniert LDL und stimuliert die Aufnahme von nativem LDL duch Makrophagen [79]. Darüberhinaus fördert CRP durch die Stimulation von Gewebefaktor (TF) in Monozyten die Thrombusbildung [12] und aktiviert das Komplementsystem [63], [40]. Unter der Vorstellung einer Stimulation von Chemotaxie und LDL-Aufnahme durch Makrophagen sind damit potentiell kausale Effekte des CRP bei der Atherothrombogenese möglich. Unbestritten ist der Zusammenhang zwischen der CRP-Konzentration im Serum (oder Plasma) und den chronisch entzündlichen Prozessen in der atherosklerotischen Läsion, daher wird seine Rolle als Surrogatmarker für die Zytokin-vermittelte inflammatorische Reaktion derzeit als gesichert angesehen. Nach Ausschluss konkurrierende Ursachen (akute Infektionen, chronisch entzündliche Erkrankungen anderer Genese) ist bei wiederholt gemessenen erhöhten Werten (größer 0,3 mg/dl) im Abstand von 2-3 Wochen) die ermittelte CRP-Konzentration für die Risikostratifizierung hinsichtlich eines erhöhten kardiovaskulären Risikos verwertbar [26]. Hochrangig prädiktiv für ein zukünftiges ischämisches Infarktereignis ist jedoch erst die gemeinsame Bewertung eines erhöhten Gesamtcholesterin/HDL-Cholesterin-Quotienten und durch wiederholte Messungen bestätigte hohe hscrp-werte [48]. 1.7 Dyslipidämie - einer der wichtigsten Risikofaktoren für KHK und Schlaganfall Unter den Faktoren des multifaktoriellen Geschehens der Atherothrombogenese nehmen vor allem die Cholesterin und Neutralfette transportierenden Lipoproteine eine herausragende Stellung ein. Ihre qualitative und quantitative

38 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 38 Bestimmung gestattet es, sie als Risikoprädiktoren für die Atherogenese heranzuziehen. Eine Risikofaktoren-Analyse, die es erlaubt, die Wahrscheinlichkeit für eine Erkrankung im Einzelfall abzuschätzen, schließt die Diagnostik auf Hyper- und Dyslipoproteinämien ein. Dyslipidämien können über Jahrzehnte inapparent verlaufen. Klinische Symptome machen sich bis zu einem fortgeschrittenem Stadium kaum bemerkbar und sind zudem wenig charakteristisch. Hinweise geben das Auftreten von Xanthelasmen, Xanthomen (charakteristisch für den Typ IIa der Hyperlipoproteinämien und für die Cholesterinspeicherkrankheit), Arcus lipoides, Lipaemia retinalis, Gelenkbeschwerden (Präzipitation von Cholesterinkristallen in der Synovialflüssigkeit) oder abdominellen Beschwerden (bei Chylomikronämie). Eine frühzeitige Erfassung von Fettstoffwechselstörungen kann nur mit Hilfe von Laboruntersuchungen erfolgen. Die großen Studien aus der jüngsten Vergangenheit (z.b. 4S-Studie, WOSCOP-Studie, CARE-Studie) haben die Bedeutung der Senkung eines erhöhten Cholesterin-Plamaspiegels sowohl für die primäre als auch für die sekundäre Prävention belegt [8], [13], [47], [55], [54], [60], [74]. Ein eindeutiger Risikoschwellenwert für das Gesamtcholesterin (oder für Triglyceride), bei dessen Überschreiten therapeutische Maßnahmen angezeigt wären, lässt sich nicht scharf definieren. Vielmehr nimmt das Risiko mit steigender Cholesterinkonzentration zu, ab ca. 190 mg/dl (5,0 mmol/l) zunächst mäßig, ab ca. 250 mg/dl (6,5 mmol/l) stärker. Basierend auf diesen Daten wurden Interventionsgrenzen für Cholesterin von verschiedenen nationalen und internationalen Gremien festgelegt. Diese werden jeweils dem aktuellen Kenntnis- und Forschungsstand angepasst. 1.8 Gesamt-Cholesterinwert nicht ausreichend für die Risikoabschätzung einer KHK Die ausschließliche Bestimmung des Gesamt-Cholesterins reicht jedoch wegen der unterschiedlichen Atherogenität der einzelnen Lipoproteinklassen

39 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 39 zur Beurteilung des vaskulären Risikos nicht aus. So ist eine Cholesterinerhöhung aufgrund eines erhöhten HDL-Cholesterins nicht mit einem erhöhten atherogenen Risiko assoziiert. Aussagekräftiger als die Gesamt-Cholesterinkonzentration ist das Verhältnis Gesamt-Cholesterin/HDL-Cholesterin bzw. der sogenannte atherogene Index, der Quotient aus LDL-Cholesterin/HDL-Cholesterin. Gegenwärtig wird ein LDL-Cholesterin/HDL-Cholesterin-Quotient kleiner 5,0 als wenig risikobehaftet, ein Wert größer 6,5 als therapiebedürftig angesehen. LDL-Cholesterin lässt sich mit ausreichender Genauigkeit nach der Friedewald-Formel abschätzen: LDLCholesterin= GesamtCholesterin HDLCholesterin Triglyceridkonzentration 5 Dabei ist vorausgesetzt: Die Triglyceridkonzentration ist nicht höher als 400 mg/dl (4,52 mmol/l), der Patient war zum Zeitpunkt der Blutabnahme nüchtern und weist keine Hyperlipoproteinämie vom Typ III auf. 1.9 ALP - der atherogene Lipoproteinphänotyp Beim Gesunden transportiert die LDL-Fraktion mehr als zwei Drittel des Cholesterins im Plasma. Man nahm zunächst an, dass LDL monodispers sei, d.h. dass sich diese Fraktion aus gleichartig aufgebauten Partikeln mit nur geringen Größenabweichungen zusammensetzt. Dafür sprach auch, dass die LDL-Partikel stets das gleiche Protein enthalten, Apo B-100, das aus 4536 Aminosäuren aufgebaut ist. Der durchschnittliche Partikeldurchmesser wurde mit 20 nm angenommen, dem eine Dichte von 1,041 g/ml entsprach. Bei Patienten mit Hypertriglyceridämie wurde zum ersten Mal beobachtet, dass auch LDL ein Gemisch strukturell und metabolisch unterschiedlicher Partikel darstellt. Die grundlegende Arbeit von Krauss und Burke [31] wies unter Verwendung der hochauflösenden Gelelektrophorese für verschiedene Individuen differierende LDL-Spezies nach. Es sind verschiedene Methoden entwickelt worden, die LDL aufgrund der Dichte (Dichte-Gradientenzen-

40 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 40 trifugation) oder der Größe (Gradienten-Gelelektrophorese) aufzutrennen. Dabei werden zwischen 3 und 5 [65], [19] oder nach Baumstark et al. 6 Subfraktionen [6] unterschieden. In vielen epidemiologischen Studien konnte gezeigt werden, dass unabhängig von der totalen LDL-Cholesterinkonzentration besonders die kleinen, dichten LDL-Subfraktionen (sogenannter LDLPhänotyp B) mit einem drei- bis siebenfach höheren Risiko für Herz- und Kreislauf-Erkrankungen assoziiert sind. Diese kleinen LDL-Partikel gehören zu dem sogenannten atherogenen Lipoproteinphänotyp (ALP) [5]. Dieses Dyslipoproteinprofil umfasst außerdem eine hohe Konzentration an VLDL (Triglyceriden) und an IDL sowie eine niedrige Konzentration an HDLCholesterin. Bestimmte metabolische Stoffwechselsituationen werden durch den atherogenen Lipoproteinphänotyp charakterisiert wie z.b. Insulinresistenz, Typ-2Diabetes (gestörte Glucosetoleranz), metabolisches Syndrom und die sogenannte familiäre kombinierte Hyperlipoproteinämie (Typ IIb nach Fredrickson, einer häufigen und sehr atherogenen Störung des Lipoproteinstoffwechsels, bei der die VLDL- und die LDL-Produktion erhöht ist. (siehe Tabelle 3 auf Seite 25) Die Rolle der Triacylglycerinkonzentration, von HTLG und CEPT für die Ausbildung des LDL-Phänotyps B Nach Packard et al. [42] fördern Triacylglycerinkonzentrationen oberhalb einer Schwellenwertkonzentration >120 mg/dl (1.5 mmol/l) die Bildung von kleinen, dichten LDL-Partikeln. Man schätzt, dass die Plasmatriglyceridkonzentration etwa zu 50% die LDL-Partikelgröße beeinflusst [66], [7]. Bei Patienten mit Hypertriglyceridämie werden in der Leber vorwiegend die großen, triglyceridreichen VLDL1 gebildet, die bei gestörter Clearence mit verlängerter Verweildauer im Plasma akkumulieren. Steigt die Serum-Triacylkonzentration von 0.5 auf 1.5 mmol/l, bleibt also unter dem cutt-off, so nimmt die totale Konzentration an LDL-Partikeln auch zu, aber es handelt sich dabei überwiegend um weniger atherogene Teilchen mittlerer Größe. Wird dagegen der

41 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 41 Schwellenwert überschritten, erfährt die Gesamtkonzentration an LDL-Partikeln keine Veränderung, aber das Größenprofil verschiebt sich zugunsten der hoch atherogenen kleinen, dichten LDL. So steigt z.b. während der Gravidität die Triglyceridkonzentration von < 87,5 mg/dl (<1,0 mmol/l)) oft auf >175 mg/dl (>2,0 mmol/l). Entsprechend lassen sich in der frühen Schwangerschaft kaum, mit Überschreiten des cut-off aber ein deutlicher Anstieg der Konzentration an kleinen, dichten LDL-Partikeln nachweisen [57]. Es konnte darüberhinaus gezeigt werden, dass LDLPartikel, die sich von der kleineren, dichten VLDL2 ableiten, nur eine Lebensdauer von ca. zwei Tagen aufweisen, LDL-Partikel, die durch Lipolyse der großen VLDL1 entstehen, aber eine verlängerte Lebensdauer von etwa fünf Tagen besitzen. Diese langsam metabolisierten LDL-Partikel werden dem Remodelling durch CETP (Cholesteryl Ester Transfer Protein) unterworfen. Das Enzym erleichtert den Heteroaustausch von Triacylglycerin gegen Cholesterinester. Bei einer hohen Konzentration an VLDL1 ändert sich damit die Zusammensetzung der LDL-Partikel, ihr relativer Gehalt an Triglyceriden steigt, ihr relativer Cholesteringehalt sinkt dagegen. Durch den Transfer der Triacylglyceride aus VLDL1 in die LDL-Partikel werden diese zu einem geeigneten Substrat für die HTGL (Hepatische Triglyceridlipase). Die Hydrolyse des Kernlipids Triacylglycerin und des Oberflächenlipids (HTGL wirkt auch als Phospholipase) führt zur Entstehung der kleinen und relativ triacylglycerinarmen, aber relativ proteinreichen LDL höherer Dichte [32], [16] (siehe Abbildung 1 auf Seite 12). Nach Watson et al. [72] korrelliert bei Männern die Bildung von kleinen, dichten LDL positiv mit der Aktivität der HTGL. Die geringere Prävalenz zur Ausbildung eines LDL-Musters B bei prämenopausalen Frauen erklären die Autoren mit den inhibitorischen Effekten von Östrogen auf die Enzymexpression. Diesen Erkenntnissen entsprechend ist der Gehalt an Triglyceriden ebenfalls als unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung einer Atherothrombose

42 1 Grundlegende Aspekte des Lipidstoffwechsels 42 zu betrachten. Serumtriglyceridkonzentrationen unter 175 mg/dl (2,0 mmol/l) gelten als ideal, solche zwischen 175 mg/dl und 490 mg/dl (2,0 und 5,6 mmol/l) als erhöht und solche über 490 mg/dl (5,6 mmol/l) als stark erhöht und, falls größer als 1750 mg/dl (20 mmol/l), als zusätzlich mit einem Risiko für Pankreatitis behaftet [49]. Nach diesem metabolischen Modell sind die entscheidenden Faktoren für das Auftreten des LDL-Phänotyps B eine hohe Konzentration an Triacylglycerinen, große, triacylglycerinreiche VLDL (VLDL1) und hohe Enzymaktivtäten an HTGL und CETP Genetische Faktoren für den LDL-Phänotyp B Die Verteilung der LDL-Subfraktionen wird auch durch genetische Faktoren mitbestimmt. Die Heridität für Varianten der am Lipoprotein-Stoffwechsel beteiligten Proteine, die möglicherweise zur Entstehung eines atherogenen Lipoproteinphänotypes beitragen, wird auf 35% bis 45% geschätzt [41]. Assoziationen mit Polymorphismen an verschiedenen genetischen Loci der LPL, HTGL, LDL-R und im Genkomplex für die Apolipoproteine A-I, C-III und A-IV sind noch in der Diskussion.

43 2 LDL-Subfraktionen 43 2 LDL-Subfraktionen 2.1 Atherogenität der kleinen, dichten LDL-Partikel Das Risiko für eine KHK ist nicht nur an die Gesamtkonzentration der LDL-Partikel, sondern vor allem an die qualitative Verteilung ihrer Subfraktionen geknüpft. Die besonders hohe Atherogenität der kleinen, dichten LDL resultiert aus ihren biologischen Eigenschaften. Sie werden nur langsam katabolisiert und ihre Bindungsfähigkeit an den LDL-Rezeptor ist geringer als die der größeren Subfraktionen [41]. Beides führt, wie bereits erwähnt, zu einer verlängerten Verweildauer in der Zirkulation. Sie besitzen eine hohe Affinität zu Bindegewebsstrukturen und haben, da sie nur langsam aus dem Plasma entfernt werden, ausreichend Gelegenheit, an Proteoglykane auf der Oberfläche von Gefäßendothelien zu binden und die Gefäßwand zu penetrieren [3]. Möglicherweise ist für die Inhibierung des rezeptorvermittelten Katabolismus und der akzellerierten Proteoglykanbindung eine Konformationsänderung des Trägerproteins Apo B in den kleinen, dichten LDL verantwortlich [61]. Darüberhinaus weisen die kleinen Subfraktionen eine erhöhte Oxidierbarkeit auf. In atherosklerotischen Läsionen ist eine Oxidation von LDL, evtl. katalysiert durch Metallionen, denkbar. Fettsäureoxidation führt zu strukturellen Veränderungen des Apo B-100-Proteins. Die durch das Auftreten freier Radikale verursachte Spaltung von Peptidbindungen könnte zur Fragmentierung des Apolipoprotein B führen, was die Bildung kleiner, oxidierter LDL erklären könnte. Ob oxidierte LDL (mit sehr kurzer Halbwertszeit) auch außerhalb atherosklerotischer Läsionen in der Zirkulation auftreten, ist Gegenstand der aktuellen Diskussion, wie insgesamt die klinische Wertigkeit dieser besonders kleinen, oxidierten LDL-Partikel gegenwärtig noch nicht abgeklärt ist.

44 2 LDL-Subfraktionen 44 Tabelle 5: Lipidfraktionen (Dichteklassen) nach Havel et al. (1955) Lipidfraktion (Dichteklasse) Dichte [kg/l] VLDL ρ < 1,006 IDL 1,006 < ρ < 1,019 LDL 1,019 < ρ < 1,063 HDL 1,063 < ρ < 1, Auftrennung der LDL in Subklassen durch UZ Um die besonders atherogenen LDL-Partikel diagnostisch zu erfassen, ist eine quantitative Bestimmung der LDL-Subfraktionen erforderlich. Die wechselnden Protein- und Lipidanteile in den verschiedenen Lipoproteinfraktionen bedingen Dichteunterschiede, die eine analytische Fraktionierung der Lipoproteine mit der Ultrazentrifuge ermöglichen. Das Verfahren der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (UZ) zur Subfraktionierung der LDL gilt als das Standardverfahren. Zur Auftrennung der Lipoproteine mittels des UZ-Verfahrens waren diese zunächst präparativ nach der Methode von Havel et al. (1955) vorgereinigt und die in Tabelle 5 angegebenen Dichteklassen erhalten worden (vergleiche Tabelle 1 auf Seite 10). Tabelle 6: LDL-Subfraktionen nach Baumstark et al. LDL-Subfraktion (Dichteklasse) Dichte [kg/l] LDL-1 ρ < 1,031 LDL-2 1,031 < ρ < 1,034 LDL-3 1,034 < ρ < 1,037 LDL-4 1,037 < ρ < 1,040 LDL-5 1,040 < ρ < 1,044 LDL-6 ρ < 1,044

45 2 LDL-Subfraktionen 45 Die LDL-Fraktion aus diesem Arbeitsgang wurde nach Einstellung mittels NaBr auf eine Dichte von kg/l durch Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (nach der Methode von Baumstark et al. 1990) aufgespalten. Dabei befinden sich die Lipoproteine in einem Lösungsmedium, dessen Dichte die der LDL-Partikel übersteigt. Unter dem Einfluss großer Zentrifugalkräfte ( g) bildet NaBr trotz der Diffusion einen kontinuierlichen Dichtegradienten. Im Gleichgewicht, das erst nach 18 Stunden erreicht wird, hat sich im Röhrchen ein stabiler Dichtegradient aus NaBr gebildet. Die in der NaBrLösung enthaltenen LDL-Partikel flotieren gleichzeitig entsprechend ihrer Dichte auf, d.h. die einzelnen Partikel bleiben stationär, wenn ihre Dichte der der NaBr-Lösung gleicht. Bei dieser Gleichgewichtszentrifugation werden nach Baumstark et al. 6 Subfraktionen LDL1 bis LDL6 mit den in Tabelle 6 angegebenen Dichten unterschieden. Mittels eines Präzisionsrefraktometers kann am reinem Salzgradienten die Dichte der einzelnen Fraktionen bestimmt werden. Die Konzentrationen dieser Subfraktionen im Gesamtserum wurden quantifiziert durch die Messung von Apo B-100 und des Gesamtcholesterins (freies Cholesterin und Cholesterinester) in den jeweiligen Subfraktionen. Da LDL (ebenso die VLDL und IDL) jeweils nur ein Molekül Apo B-100 besitzen, entspricht die gemessene Konzentration an Apo B-100 der Anzahl an Lipoproteinpartikeln in der jeweiligen Dichtefraktion. Die Messungen erfolgten turbidimetrisch für Apo B-100 (Rolf Greiner Biochemikalien, Deutschland) auf dem Olympus AU 640, enzymatisch für das Gesamtcholesterin mit der CHOD-PAP-Methode (Wako Chemicals, Japan). 2.3 Aufspaltung der Lipoproteine mittels der LFE Das wichtigste Charakteristikum der einzelnen Lipoproteinklassen sind die Unterschiede in Dichte und Größe der Lipoproteinpartikel und ihre differente Proteinzusammensetzung (siehe Tabelle 1 auf Seite 10 und Abbildung 1 auf Seite 12).

46 2 LDL-Subfraktionen 46 In dieser Arbeit wurde eine Auftrennung der LDL-Lipoproteinfraktionen aus dem nativen Serum mittels der Polyacrylamidgel-Lipoprotein-Fraktionierungs-Elektrophorese (LFE) vorgenommen. Bei der LFE sind die globulären Lipoproteine im humanen Serum oder Plasma gleichzeitig einem elektrischen Feld und einem Größengradienten in einem Polyacrylamidgel ausgesetzt. Die Wanderungsfähigkeit der bei einem bestimmten ph-wert gleichartig geladenen Partikel im elektrischen Feld und ihre Größenunterschiede werden bei diesem Elektrophoreseverfahren für ihre Trennung ausgenutzt. Durch die Anwendung eines Acrylamid-Konzentrationsgradienten bei der Polymerisation von Acrylamid und N,N -Methylen-bisacrylamid können Gele hergestellt werden, deren Poren in Laufrichtung der Substanzgemische kontinuierlich kleiner werden. Wenn die Poren im Gel einen kleineren Durchmesser als die Partikel besitzen, können diese unabhängig von ihrer Ladung und der angelegten Feldstärke nicht in das Gel eindringen. Ist die angelegte Spannung hoch genug, so werden die elektrisch geladenen Partikel an den kleiner werdenden Poren fokussiert und es können scharfe Zonen gebildet werden. Am schnellsten wandert bei dieser absteigenden Elektrophorese Albumin. Seine immer gut sichtbare Bande liegt der Anode am nächsten (siehe Abbildung 4). Während Chylomikronen als größte der komplex aufgebauten Partikel nicht in das Polyacrylamidgel eindringen können und keine elektrophoretische Mobilität besitzen, können die drei wichtigsten Lipoproteinklassen, VLDL (prä-β -Globulinfraktion), LDL (β Globulinfraktion) und HDL (α-globulinfraktion) als gut abgegrenzte Fraktionen erkannt werden. Die HDL zeigt ihrer geringen Partikelgröße entsprechend die höchste relative elektrophoretische Mobilität. Sie befinden sich daher im unteren Drittel des Gels. Wesentlich langsamer wandern die Banden der LDLFraktion, die in der oberen Hälfte des Gels zu finden sind. Die geringste Wanderungstendenz zeigen die VLDL-Partikel. Ihr Bereich lässt sich gut von eventuell vorhandenen Chylomikronen abgrenzen, die an der Auftragsstelle als angefärbte Bande zu erkennen sind. Zwischen der LDL-Region und der VLDLRegion lässt sich gegebenfalls eine Bande beobachten, die als IDL bezeichnet

47 2 LDL-Subfraktionen 47 Abbildung 4: Aufspaltungsschema einer Lipoprotein-Fraktionierungs-Elektrophorese (LFE). wird. Nach der Auftrennung der Lipoproteinfraktionen wird das Gel mit dem lipophilen Farbstoff Sudan-Schwarz B angefärbt. Die überschüssige Farbe wird anschließend durch Auswaschen mit verdünnter Essigsäure entfernt. Nach dem Einscannen des Gels wurden die Lipoproteinbanden mit dem Programm ScanPack 3.0, Version 4.79 ausgewertet. Zur Analyse von Bandenmustern (d.h. der Anordnung von Banden einer Probe in einer Spur) eignet sich der auf ein schnell laufendes Teilchen (hier Albumin) normierte Wert, die relative Mobilität Rs. Der Rs-Wert entspricht dem in der Chromatographie üblichen Rs-Wert, mit dem Unterschied, dass im Nenner nicht die Entfernung Start - Front steht, sondern die Entfernung vom Start zu einer Pseudofront in der Größenordnung von Albumin. In der Proteinelektrophorese wird der Start als Rs-Wert 0 und die Front als 1 definiert. Sie stellen somit Spuranfang und Spurende dar. Die relative Mobilität der einzelnen Banden einer Spur wurde damit durch den Vergleich der Wanderungstendenz der Lipoproteinpartikel mit der Wanderungstendenz einer Pseudofront (per definitionem gleich eins) ermittelt: Rs= Entfernung Start bis Substanz Entfernung Start bis Pseudofront

48 2 LDL-Subfraktionen 48 Da es sich bei dem Rs-Wert um eine Relativgröße handelt, kann er zur Zuordnung der Spuren einer Bande von Lipoproteinpartikeln im direkten Vergleich auf dem Schichtgel benutzt werden. Eine Spur auf dem Gel ist in der hier verwendeten eindimensionalen Auswertung der Auswertebereich, auf den ein Auswerte-Algorithmus angewendet wird. Durch diesen wird die Bildvorlage in ein digitales Grauwertemuster umgesetzt. Die Qualität der Bildaufnahme ist gegeben durch die Anzahl der Bildpunkte (Pixel) und die Anzahl der möglichen Grauwerte. Die Gesamtheit der Pixel und der ihnen zugeordneten Grauwerte ergibt die Bilddatei (Bitmap), die von ScanPack 3.0 erstellt wird. Es wurden 256 Graustufen vorgegeben, d.h. der Messbereich wird bei der Digitalisierung einer Bildvorlage in 256 gleiche Helligkeitsstufen von Weiß (= 100% Reflexion) bis Schwarz (der Graustufenwert 255 ist als schwarz definiert) eingeteilt. Der Messwert stellt also eine Absorption bzw. Streuung dar. Die einzelnen Bitmaps, bzw. die einzelnen Spuren dieser Bildvorlagen, werden in Densitogramme umgesetzt, die graphisch die Messwerte repräsentieren. Als Densitogramm wird die graphische Darstellung der gemessenen Graustufen entlang einer Meßspur bezeichnet. Innerhalb einer Spurbegrenzung wurden über die Breite der Spur für jede Pixelreihe der Mittelwert der Graustufen bestimmt und dieser Wert als Funktion der relativen Laufstrecke (d.h. der Mobilität) in das Densitogramm eingetragen. Zur Analyse der erhaltenen Densitogramme wurden die Peakflächen integriert (eine Peakfläche ist die Fläche zwischen Densitogramm-Kurve und Basislinie und zwischen den Senkrechten durch Peakanfang und Peakende; der Peak repräsentiert eine Bande) und die Rs-Werte der Peakmaxima festgelegt. Der Rs-Wert, d.h. die relative Mobilität, charakterisiert eine Probe eindeutig und gestattet, Ähnlichkeiten zu anderen Proben zu visualisieren und zu berechnen. Das beschriebene Verfahren, über Grauabstufungs- und Rs-Wert-Bestimmung eine Probe zu charakterisieren, macht deutlich, warum externe, durch einen nachlässigen Färbe- bzw. Entfärbevorgang auf dem Gel auftretende

49 2 LDL-Subfraktionen 49 Farbpartikel die Auswertung stören. Deshalb wurde bei der Evaluation der Methode der Sauberkeit der Gele große Aufmerksamkeit gewidmet, um sicher zu stellen, dass ausschließlich die angefärbten LDL-Partikel zur Auswertung kamen. Die auf dem Gradientengel der Größe nach aufgetrennten LDL-Partikel wurden in sechs Subfraktionen unterteilt. Diese Anzahl ist willkürlich und nahm sich die Einteilung in sechs Dichtefraktionen nach Baumstark et al. zum Vorbild, um die jeweilige LDL-Hauptfraktion eines Serums, die aus den beiden unterschiedlichen Trennverfahren resultiert, zum Vergleich bringen zu können. 2.4 Vergleich UZ mit LFE Bei den LDL-Subfraktionen sind die Größe und die Dichte der Teilchen einander umgekehrt proportional (siehe Abbildung 1 auf Seite 12). Eine Erklärung hierfür geht aus dem in Kapittel diskutierten Strukturmodell (siehe Abbildung 2 auf Seite 14) hervor. Einen Beleg hierfür liefert Gel 186, bei dem mit Hilfe der UZ aufgetrennte LDL-Subfraktionen einzeln in Spuren nebeneinander aufgetragen der LFE unterworfen wurden, wobei sich eine treppenförmige Andordnung jeweils scharfer Banden ergab (siehe Abbildung 5 auf Seite 50 und Abbildung 6 auf Seite 51). Das bedeutet, dass die Auftrennung der LDL in der UZ nach Dichte und in der LFE nach Größe die gleiche Reihenfolge der Subfraktionen ergibt, in denen dann auch jeweils die gleichen Teilchen enthalten sind. Die Unabhängigkeit der Mobilität von der Ionenstärke, die hierzu notwendig ist, wurde überprüft (siehe Kapitel 3.5 auf Seite 65). Damit sind die wesentlichen Voraussetzungen und Grundlagen des Methodenvergleichs sichergestellt.

50 2 LDL-Subfraktionen Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 1 UZ-LDL1-Dichtefraktion 2 UZ-LDL2-Dichtefraktion 3 UZ-LDL3-Dichtefraktion 4 UZ-LDL4-Dichtefraktion 5 UZ-LDL5-Dichtefraktion 6 UZ-LDL6-Dichtefraktion 7 und 8 1 Teil UZ-LDL1-Dichtefraktion + 2 Teile UZ-LDL6-Dichtefraktionen gepoolt 9 UZ-LDL1-Dichtefraktion 10 UZ-LDL6-Dichtefraktion Abbildung 5: Gel 186 mit Auftragungsschema. Dargestellt sind die UZ-Fraktionen UZ-LDL1 bis UZ-LDL6 eines Patientenserums nebeneinander.

51 2 LDL-Subfraktionen LDL LDL LDL LDL LDL LDL Abbildung 6: Gel 186: Ermittlung der Rs-Werte für die UZ-LDL1 (oben) bis LDL6 (unten) -Subfraktionen mittels ScanPack 3.0. Hier ist deutlich die reziproke Proportionalität von LDL-Partikelgröße und Laufstrecke auf dem Gel zu erkennen.

52 3 Praktischer Teil 52 3 Praktischer Teil 3.1 Geräte und Reagenzien Es wurde der LFS LIPOGEL ASSAY KIT von Zaxis Inc. verwendet, bestehend aus: LFE-Lipoprotein-Fraktionierung-Gel, LFE Bottom-Trennkammer-Puffer, LFE Top-Trennkammer-Puffer, LFE-Färbelösung, LFE-Entfärbelösung, LFE-Farbzusatz. LFE-Elektrophorese-Apparatur Zur Anwendung kam die Vertikalelektrophorese mit Flachgelen. Das untere Elektrophoresegefäß stellt gleichzeitig das untere Pufferreservoir dar und nimmt den LFE-Bottom-Trennkammer-Puffer auf. Die obere Elektrophoresekammer enthält LFE-Top-Trennkammer-Puffer. Dieser ist elektrisch vom unteren Pufferreservoir isoliert. In die obere Elektrophoresekammer werden die Gele in Halterungen eingesetzt. LFE-Bottom-Trennkammer-Puffer Zusammensetzung: Tris 0,09 M; Borsäure 0,08 M; Na2EDTA 0,003 M; Natriumazid 0,05 g/l; ph 8,3. Dieser Puffer kann bei Raumtemperatur gelagert und zweimal benutzt werden. LFE-Top-Trennkammer-Puffer Zusammensetzung: Tris 0,09 M; Borsäure 0,04 M; Na2EDTA 0,003 M; Natriumazid 0,05 g/l; ph 8,7. Die Aufbewahrung des Puffers erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur. Der Puffer sollte aber nur einmal benutzt werden. Stromversorgungsgerät Ein Gleichstromversorgungsgerät, das Spannungen bis 500 Volt und Stromstärken bis 400 ma erzeugen kann, ist ausreichend.

53 3 Praktischer Teil 53 LFE-Lipoprotein-Fraktionierungs-Gele Gradientengele sind im Handel erhältlich. Hier kam das fertige Schichtgel von Zaxis Inc., bei dem die Gelschicht zwischen zwei Glasplatten fixiert ist, zur Anwendung. Von großem Vorteil bei Verwendung derartiger Flachgele sind die identischen Elektrophoresebedingungen für jede der nebeneinander aufgetragenen Proben und die gute Vergleichsmöglichkeit der aufgetrennten Banden. Zusammensetzung: Acrylamid/Bisacrylamid 30:1,9% (w/v); Tris 0,9 M; Borsäure 0,08 M; Na2EDTA 0,003 M; Natriumazid 0,05 g/l. Die Gele müssen waagerecht bei 2 C 8 C aufbewahrt werden und sollten nicht eingefroren werden. Ihre kurze Haltbarkeit (wenige Wochen) begrenzt ihrer Verwendungsfähigkeit. Deshalb kann es von Vorteil sein, derartige Gradientengele mit kontinuierlich kleiner werdenden Poren bei Bedarf in Eigenarbeit zu formen und mittels eines Gradientenmischers den Acrylamid-Konzentrationsgradienten der Polymerisationslösung herzustellen. Hierzu findet sich entsprechende Literatur [46]. LFE-Färbelösung Zusammensetzung: Ethanol 30% (v/v), Essigsäure 10% (v/v), SudanSchwarz B 0,1% (w/v). Die Färbelösung wird bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt aufbewahrt. LFE-Entfärbelösung Zusammensetzung: Ethanol 5% (v/v), Essigsäure 10% (v/v). Auch die Entfärbelösung wird bei Raumtemperatur aufbewahrt. LFE-Farbzusatz Zusammensetzung: Bromphenolblau 0,2% (w/v); Rohrzucker 40% (w/v). Die Lagerung des Farbzusatzes erfolgt lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Fixier- und Aufbewahrungslösung Essigsäure 2% (v/v).

54 3 Praktischer Teil 54 Probenvorbereitung und Probenlagerung Für die Lipoprotein-Fraktionierungs-Elektrophorese waren native Patientenseren oder EDTA-Plasmen und auf -20 C eingefrorene und wieder aufgetaute Seren verwendet worden. UZ-LDL 1 / UZ-LDL 6- Standard Die UZ-Standardproben waren durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zunächst des Serums einer einzelnen Person, später der von vier gesunden Personen gepoolten Seren gewonnen worden. 3.2 Durchführung der Lipoprotein-FraktionierungsElektrophorese Die nachfolgende Arbeitsanleitung zur Durchführung der Lipidfraktionierungselektrophorese sichert ein optimales Ergebnis. Probenvorbereitung 90 µl des Probenmaterials (Serum oder EDTA-Plasma aus frisch gewonnenen Proben von Nüchternblut oder aufgetaute Proben (nach vorheriger Aufbewahrung bei -20 C) werden mit 10 µl LFE-Farbzusatz gründlich gemischt (z.b. mittels Vortex) Vorbereitung der Gelkassetten Die Gelkassetten werden nach dem Auspacken und vor dem Formen von Probentaschen zum Entfernen der Flüssigkeit von den Auftragsstellen auf den Kopf gestellt. Der Probenauftragskamm wird zwischen den beiden Glasplatten der GelKassette über seine ganze Breite und genau parallel zur Gelkante so weit eingeschoben, bis er 1 bis 2 mm in die Geloberfläche eindringt und oberhalb des Geles eine Proben-Tasche von etwa 10 mm Tiefe (die so geformte Tasche fasst ca. 30 µl) für die Aufnahme des Probenmaterials entsteht. Das in den Kammern zwischen den Stegen des Auftragskammes aufgewölbte Gel stellt die Auftragsstelle für das Untersuchungsmaterial dar.

55 3 Praktischer Teil 55 Die Gelkassette wird mit dem korrekt plazierten Probenkamm ca. 1 cm durch die Dichtungsmanschette des oberen Puffertanks in Richtung von oben nach unten geschoben. Füllen und Zusammensetzen der Trennkammer-Tanks Nach dem Füllen des unteren Trennkammer-Tanks mit LFE-BottomTrennkammer-Puffer wird der obere Trennkammertank mit der Gel-Kassette und dem Probenkamm in den unteren eingesetzt. Ohne die Position des Probenkamms zu verändern, wird dieser soweit durch die Dichtungsmanschette geschoben, bis das Gel noch etwa 3 mm aus der Manschette herausragt, der Probenkamm also am oberen Trennkammer-Tank sichtbar bleibt. Der obere Trennkammer-Tank wird mit LFE-Top-Trennkammerpuffer gefüllt, das Kammersystem abgedeckt und mit der Spannungsversorgung entsprechend der vorgegebenen Farbmarkierung verbunden. Vorelektrophorese Zur Equilibrierung des Gels, d.h. zum Aufbau eines optimalen ph-gradienten im Gel, wird eine Vorelektrophorese mit einer Spannung von 100 V für 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Probenauftrag Nach der Vorelektrophorese werden die Taschen des Probenkammes mit Top-Trennkammer-Puffer mittels einer Mikropipette sorgfältig gespült und Luftblasen entfernt, ohne dabei die Geloberfläche zu verletzen. Die vorbereiteten, mit LFE-Farbzusatz gefärbten Proben werden vorsichtig unter Vermeidung erneuter Luftblasenbildung oder Verletzung des Gels gleichmäßig über die gesamte Breite der Probenkamm-Tasche mit einer Mikropipette verteilt, 4 µl für die Patientenproben, 6 µl für den UZ-LDL1/LDL6Standard. Die verschlossenen Trennkammern wurden in eine mit Eis gefüllte Styroporkiste gestellt und im Kühlraum (bei 4 C Außentemperatur) an die Spannungsversorgung angeschlossen.

56 3 Praktischer Teil 56 Elektrophorese bei 900 Vhr Die Elektrophorese wurde bei 50 V in 18 h bei einer konstanten Temperatur von 4 C durchgeführt. Färben des Gels Nach beendeter Elektrophorese und Trennung der Elektrophoresekammer von der Spannungsversorgung wird aus dem abgehobenen oberen Trennkammertank der Top-Trennkammer-Puffer entfernt und die Gelkassette vollständig nach unten durch die Dichtungsmanschette des Trennkammertanks gezogen. Die Gelkassette wird nach dem Aufschneiden des Klebebandes aufgeklappt. Sollte sich die obere Glasplatte nicht leicht vom Gel lösen, so kann die Kassette in eine mit etwas Top-Trennkammer-Puffer gefüllte Schale gelegt und die obere Glasplatte entfernt werden. Die untere Glasplatte mit dem Gel wird in ein mit 50 ml LFE-Färbelösung gefüllten Färbebehälter gegeben. Unter leichtem Schwenken des Behälters hebt sich das Gel von der zu entfernenden Unterlage. Die Färbung des Gels erfolgt über mehrere Stunden oder über Nacht, wobei das Gel etwas in Bewegung gehalten werden muss. Entfärben des Gels Die Färbelösung wird entfernt und ein erster Entfärbevorgang für 45 Minuten in 50 ml LFE-Entfärbelösung unter leichtem Schütteln durchgeführt. Mit 50 ml frischer Entfärbelösung wird der Vorgang wiederholt, der zweite Entfärbedurchgang jedoch über einen Zeitraum von zwei Stunden. Das Gel wird vor der densitometrischen Auswertung mindestens 30 Minuten in 2-prozentiger Essigsäure fixiert. In dieser Fixierlösung kann das Gel ohne Beeinträchtigung des Messergebnisses bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden. Scannen des Gels und densitometrische Auswertung der Lipoproteinbanden Das Gel wird vorsichtig zwischen zwei Klarsichtfolien fixiert (ohne es dabei zu verziehen) und mittels eines Flachbettscanners (EPSON GT 9500)

57 3 Praktischer Teil 57 eingelesen. Die densitometrische Auswertung erfolgte mit ScanPacK 3.0, Version 4.79 (Biometra biomedizinische Analytik GmbH) mit einer Auflösung von 400 dpi 64 µm (Einstellungen: Sensitivity: 10, Width: 10, Height: 15, Threshold: 5). Die Qualität der Scan-und Auswerteergebnisse werden auch durch die Einstellung der Parameter Brightness und Contrast beeinflusst. Diese Einstellungen sind von der Qualität der einzelnen Elektrophoreseergebnisse und der jeweiligen Färbung abhängig, sodass eine Optimierung nur durch Versuch und Irrtum für jedes Gel einzeln erfolgen kann. Es soll noch einmal darauf hingewiesen werden, dass unabhängig von den äußeren Bedingungen bei der Durchführung der Elektrophorese mit äußerster Sorgfalt vorgegangen werden muss, besonders bei der Formung der Probentaschen mit dem parallel zum Gel zu führenden Probenkamm, bei der diffizilen Säuberung der Probentaschen und vor allem beim gleichmäßigen Pipettieren von Serumproben und Standard in die Probentaschen. Erst dann sind ein gleichmäßiger Stromfluss und damit sauber und scharf getrennte Lipoproteinbanden möglich. 3.3 Auswertung nach der Mittelwertmethode Anhand der Abbildung 7 wird exemplarisch für ein Patientenserum gezeigt, wie bei der Auswertung der Banden und deren Zuordnung zu einer LDL-Hauptfraktion vorgegangen wurde. Da die Unterschiede der Rs-Werte innerhalb der LDL-Fraktion zwischen LDL1 und LDL6 klein sind, ist es notwendig, einen Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6 jeweils rechts und links vom Patienten-Vollserum aufzutragen (Spuren 1, 3, 5, 7, 9 und 10). Auf den Standard wird in Kapitel 3.4, Seite 62, eingegangen. Die Lauffront wurde entweder für ein Gel nur einmal festgelegt (Orientierung an Albumin) oder für die Spur eines Serums und seine unmittelbaren Nachbarspuren jeweils neu definiert. Die Zuordnung der LDL-Hauptfraktion für die Patientenseren ( Spuren 2, 4, 6 und 8) wurde anhand ihrer Rs-Werte relativ zu den gemittelten RsWerten der UZ-Standard-Banden der benachbarten Spuren vorgenommen.

58 3 Praktischer Teil 58 Dazu wurde zunächst der Mittelwert für die UZ-Standard-Fraktionen LDL1 und LDL6 berechnet: [Rs-UZ-LDL1]n = ([Rs-UZ-LDL1]n-1 + [Rs-UZ-LDL1]n+1)/2 [Rs-UZ-LDL6]n = ([Rs-UZ-LDL6]n-1 + [Rs-UZ-LDL6]n+1)/2 Es wurde die Arbeitshypothese zugrunde gelegt, nach der sich die LDLHauptfraktion eines nativen Patientenserums innerhalb eines Bereiches befindet, der der Differenz [ΔRs]n = [Rs-UZ-LDL6]n [Rs-UZ-LDL1]n entspricht. Dieser Bereich wurde in sechs gleiche Unterbereiche aufgeteilt [ΔRs/5] und die Zwischenfraktionen besimmt: [Rs-UZ-LDL1]n [Rs-LDL2]n = [ Rs-UZ-LDL1]n+ 1[ΔRs/5] [Rs-LDL3]n = [ Rs-UZ-LDL1]n+ 2[ΔRs/5] [Rs-LDL4]n = [ Rs-UZ-LDL1]n+ 3[ΔRs/5] [Rs-LDL5]n = [ Rs-UZ-LDL1]n+ 4[ΔRs/5] [Rs-UZ-LDL6]n. Zu dieser Vorgehensweise berechtigt die Vorstellung, dass sich die Größe der LDL-Partikel hauptsächlich durch Verlust an Cholesterinester und Triacylglycerin aus dem Teilchenkern kontinuierlich ändert (siehe Struktur und Zusammensetzung der LDL-Partikel, Seite 12). Die zahlenmässige Angabe getrennter Subfrakionen unterliegt daher der Willkür des Bearbeiters, bzw. wird durch die Sensitivität des Fraktionierungsverfahrens besimmt. Anhand der gemessenen Rs-Werte der Hauptpeaks der Patientenseren wurde eine Zuordnung der beobachteten Subfraktionen zu den berechneten Größenbereichen vorgenommen. Für die Patientenseren auf den Spuren 2, 4, 6 und 8 auf dem Gel L013 ergaben sich nach dieser Vorgehensweise die in Tabelle 7 wiedergegebenen LDL-Subtypen (s. Abbildungen 7 bis 11).

59 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Albumin Spur 1, 3, 5, 7, 9, 10 Standard aus UZ-LDL 1- und UZ-LDL 6-Dichtefraktionen 2 natives Patientenserum I 4 natives Patientenserum II 6 natives Patientenserum III 8 natives Patientenserum IV Abbildung 7: Gel L013: Auftragsschema: Vier verschiedene native Patientenseren (Spuren 2, 4, 6, 8) jeweils aufgetragen zwischen Standard aus LDL1 und LDL6 (Spuren 1, 3, 5, 7, 9, 10) Tabelle 7: Gel L013: Auswertung: Mittels der errechneten Rs-Werte der hypothetischen Zwischenfraktionen werden die Rs-Werte der LDL-Fraktion des Patientenserums einer LDL-Hauptfraktion zugeordnet. Berechnung siehe Anhang 6.1, Seite 110. Patientenserum I Rs-Wert gerechnet I II III IV 0,4973 0,5096 0,5099 0,4919 Rs-Wert gemessen 0,4660 0,4950 0,5100 0,5080 0,4900 Zuordnung IDL? LDL3 LDL4 LDL4 LDL4

60 3 Praktischer Teil Spur Spur Spur Abbildung 8: Gel L013: Zuordnung der LDL-Hauptfraktion des Patientenserums I (Spur 2) durch Einordnen zwischen benachbarten Banden des UZ-LDL1/LDL6Standards (Spuren 1 und 3) Spur Spur Spur Abbildung 9: Gel L013: Zuordnung der LDL-Hauptfraktion des Patientenserums II (Spur 4) durch Einordnen zwischen benachbarten Banden des UZ-LDL1/LDL6Standards (Spuren 3 und 5)

61 3 Praktischer Teil Spur Spur Spur Abbildung 10: Gel L013: Zuordnung der LDL-Hauptfraktion des Patientenserums III (Spur 6) durch Einordnen zwischen benachbarten Banden des UZ-LDL1/LDL6Standards (Spuren 5 und 7) Spur Spur Spur Abbildung 11: Gel L013: Zuordnung der LDL-Hauptfraktion des Patientenserums IV (Spur 8) durch Einordnen zwischen benachbarten Banden des UZ-LDL1/LDL6Standards (Spuren 7 und 9)

62 3 Praktischer Teil UZ-Standard für die LFE Eine wesentliche Voraussetzung und Grundlage des Verfahrens, Subfraktionen aus der UZ als Standard für die zu untersuchenden Seren zu verwenden, war die Beobachtung, dass die UZ-LDL1 bis UZ-LDL6-Dichtefraktionen auf dem Gel treppenförmig in Banden entsprechend ihrer abnehmenden Größe dargestellt werden konnten (siehe Abbildung 5 auf Seite 50 und Abbildung 6 auf Seite 51). Dies veranschaulicht deutlich die reziproke Proportionalität zwischen Partikelgröße und Laufstrecke bzw. Rs-Werte für die UZ-Subfraktionen LDL1 bis LDL6. Da die Rs-Werte, zwischen denen die LDL-Hauptfraktion eines Patientenserums eingeordnet wird, sich nur wenig unterscheiden, können Veränderungen durch Verzerrungen des relativ weichen Gels stark ins Gewicht fallen. Deshalb wurde ein aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6 gepoolter Standard jeweils rechts und links vom Patientenserum aufgetragen. Zunächst wurde getestet, ob der bei Auftrag derselben UZ-Fraktion in benachbarten Spuren auf dem Gel nebeneinander gemessene Rs-Wert der Bande einer mittleren Spur mit den gemittelten Rs-Werten der jeweiligen Nachbarspuren übereinstimmt. So wurden z.b. die Rs-Werte der UZ-LDL1 und UZ-LDL6Fraktionen der Spur 2 auf dem Gel 167 (siehe Abbildung 13) aus den RsWerten derselben Fraktionen der Spuren 1 und 3 berechnet. In gleicher Weise wurde mit den Rs-Werten der nachfolgenden Spuren verfahren. Es zeigte sich, dass die gemessenen Rs-Werte reproduzierbar mit dem Mittelwert der RsWerte der Nachbarspuren übereinstimmten und somit Verzerrungen des Gels ausgeglichen werden konnten (siehe Tabelle 9). Die Proben der Spuren 3 bis 10 in der Abbildung 13 wurden im weiteren Verlauf als Standard für die Positionen der LDL1- und LDL6-Subfraktionen verwendet. Variation der Auftragsvolumina zwischen 6 µl und 10 µl für die Proben in den einzelnen Spuren erbrachte keine Verbesserung der Trennschärfe der Banden auf dem Gel. Deshalb wurde das materialsparende Auftragsvolumen von 6 µl für den Standard beibehalten.

63 3 Praktischer Teil Abbildung 12: Gepoolte Fraktionen UZ-LDL1 und UZ-LDL6, siehe Spuren 7 und 8 von Gel 186 (Abbildung 5 auf Seite 50). Die Aufarbeitung eines LDL1/LDL6-Standards mittels UZ ist nicht unproblematisch. Während für die UZ-LDL6-Fraktion immer scharfe Peaks in der densitometrischen Auswertung erhalten werden konnten, zeigte sich die UZ-LDL1-Fraktion häufig als breite Bande auf dem Gel und wies anstelle eines scharfen Peaks ein Plateau auf (siehe Abbildung 5, Gel 186, Spuren 1, 7, 8, 9; Abbildung 12, Spuren 1 und 2). Aufgrund der Unschärfe der Rs-Werte für die LDL1-Fraktion, die möglicherweise Anteile von IDL enthalten, fanden derartige Proben keine Anwendung als Standard.

64 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 1 und 2 Auftragsvolumen Standard 1 aus UZ1-LDL1 und UZ1-6 µl LDL6-Dichtefraktion 3 Standard 2 aus UZ2-LDL1 und UZ2-6 µl 4 LDL6-Dichtefraktion 7 µl 5 8 µl 6 9 µl 7 10 µl 8 9 µl 9 8 µl 10 7 µl Abbildung 13: Gel 167: Auftrag von Standards in Spuren nebeneinander zur Berechnung der jeweiligen Rs-Werte aus den Rs-Werten der benachbarten Spuren nach der Mittelwertmethode.

65 3 Praktischer Teil 65 Tabelle 8: Gel 167: Ergebnisse: Reproduzierbare Übereinstimmung von berechneten und gemessenen Rs-Werten nach der Mittelwertmethode. Berechnung siehe Anhang 6.2 auf Seite 110. Spur Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen Zuordnung Spur Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen Zuordnung ,6100 0,6035 0,5930 0,5855 0,5815 0,5705 0,6120 0,5990 0,5950 0,5870 0,5760 0,5700 LDL1 LDL1 LDL1 LDL1 LDL1 LDL ,6500 0,6465 0,6405 0,6325 0,6275 0,6170 0,6540 0,6470 0,6390 0,6340 0,6260 0,6210 LDL6 LDL6 LDL6 LDL6 LDL6 LDL6 Auf Gel 132/134 (Abbildung 14 auf Seite 67) sind exemplarisch ein aus vier Patientenseren gepooltes Serum und seine UZ-LDL-Dichtefraktionen in abnehmender Größe zwischen dem UZ-LDL1- und UZ-LDL6-Standard dargestellt. Anhand der Rs-Werte wurde eine Zuordnung der Subfraktionen nach der in Abschnitt 3.3 (Seite 57) vorgestellten Mittelwertmethode vorgenommen. Es konnte für dieses und für andere Seren eine vollständige Übereinstimmung der Zuordnung von UZ- und LFE-Subfraktionen gefunden werden (siehe Tabellen 9 und 10 auf Seite 68 und Anhang 6.3 auf Seite 111). 3.5 Voraussetzungen Im weiteren Verlauf waren verschiedene Versuche durchgeführt worden, die einerseits noch einmal die Identität der LDL-Subfraktionen aus der UZAnalyse mit den entsprechenden auf dem LFE-Gel dargestellten Subfraktionen bestätigen sollten und andererseits die Praktikabilität der LFE-Methode für Routine- und Forschungsaufgaben zur Lipiddiagnostik sicherstellen sollten.

66 3 Praktischer Teil 66 Sowohl die verwendeten Standardfraktionen UZ-LDL1 und UZ-LDL6 als auch die Dichtefraktionen von gepoolten und von Einzelseren haben durch ihre Aufarbeitung für die UZ-Analyse eine Veränderung erfahren. Um zu prüfen, inwieweit Matrixeinflüsse bei der Auftrennung der LDL-Fraktionen von nativen Seren auf dem LFE-Gel eine Rolle spielen, wurden Seren gemischt, von denen aus der UZ-Analyse und der LFE-Analyse bekannt war, dass sie bestimmte LDL-Hauptfraktionen aufweisen. Es gelang, auf dem LFE-Gel reproduzierbar eine Aufspaltung der gepoolten Seren in Banden entsprechend den eingesetzten LDL-Bestandteilen im Größenbereich der verwendeten UZ-LDLStandardfraktionen (siehe Abbildungen 15, 16, 17, 18 und 19 auf den Seiten 69 und 70) zu erhalten.

67 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur Laufrichtung Auftragsstelle Abbildung 14: Gel 132 (oben): Färbelösung ungereinigt (siehe Seite 82) und Gel 134 (unten): Färbelösung teilweise gereinigt (siehe Seite 82).

68 3 Praktischer Teil 68 Tabelle 9: Gel 132 / 134: Auftragsschema Spur 1, 2, 4, 6, 8, 10, Standard aus UZ-LDL1- und UZ-LDL6-Dichtefraktionen 11, 12, 14, 16, 18, 20 3 Aus vier nativen Patientenseren gepooltes Serum 5 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL1 des Poolserums 7 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL2 des Poolserums 9 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL3 des Poolserums 13 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL4 des Poolserums 15 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL5 des Poolserums 17 Zugehörige UZ-Dichtefraktion LDL6 des Poolserums 2 Teile UZ-LDL1-Dichtefraktion des Poolserums Teil UZ-LDL6-Dichtefraktion des Poolserums Tabelle 10: Gel 132/134: Ergebnisse und Zuordnung: Die nach der Mittelwertmethode aus den Rs-Werten der jeweils benachbarten UZ-Standards berechneten RsWerte des Poolserums stimmen hinsichtlich ihrer Zuordnung mit den UZ-DichteFraktionen überein. Berechnung siehe Anhang 6.3 auf Seite 111. Spur Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen Zuordung Spur Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen Zuordung ,4455 0,4050 0,3940 0,3771 0,4480 0,4050 0,3940 0,3740 LDL6 LDL1 LDL2 LDL ,7231 0,7404 0,7495 0,7065 0,7465 0,7220 0,7390 0,7500 0,7100 0,7500 LDL4 LDL5 LDL6 LDL1 LDL6

69 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 1, 3, 5, 7, 9, 10 Standard aus UZ-LDL1- und UZ-LDL6-Dichtefraktionen 2 Teile natives Serum 6099 (mit überwiegend LDL1-Anteilen) Teil natives Serum 5664 (mit überwiegend LDL6-Anteilen) 2 Teile natives Serum 5664 (mit überwiegend LDL6-Anteilen) Teil natives Serum 1001 (mit überwiegend LDL4-Anteilen) 1½ Teile natives Serums 1002 (mit überwiegend LDL3-Anteilen) Teil natives Serums 5664 (mit überwiegend LDL6-Anteilen) 1 Teile natives Serum 6517 (mit überwiegend LDL1-Anteilen) Teil natives Serum 5664 (mit überwiegend LDL6-Anteilen) Abbildung 15: Gel 179: Versuch zur Aufspaltung in Subfraktionen aus nativen, gepoolten Seren.

70 3 Praktischer Teil Abbildung 16: Gel 179, Spur Abbildung 17: Gel 179, Spur Abbildung 18: Gel 179, Spur Abbildung 19: Gel 179, Spur 8

71 3 Praktischer Teil 71 Auf eine weitgehende Unabhängigkeit von Matrixeinflüssen auf die RsWerte konnte aus der Übereinstimmung der Bandenpositionen für das Nativserum, das gegen NaBr dialysierte und auf eine Dichte von 1,063 kg/l eingestellte Serum mit der dazugehörigen in gleichen Anteilen UZ-LDL1 bis UZLDL6 gepoolten Summenfraktion 6 n=1 UZ LDL n geschlossen werden. Die Abbildungen 20 und 21 zeigen, dass insbesondere die Charakteristik der für die Bestimmung der Rs-Werte entscheidenden Form der Banden bei der densitometrischen Auswertung erhalten bleibt. Bei der Dialyse gegen NaBr waren die Nativseren vor dem Aufbringen auf dem LFE-Gel einer analogen Behandlung unterzogen worden, wie sie auch die LDL-Subfraktionen vor der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation erfahren hatten. Es sollte geprüft werden, inwieweit die Ionenstärke des UZ-Standards und die Ionenstärke des dialysierten Serums die elektrophoretische Mobilität gegenüber dem unbehandelten Serum verändert. Wäre die Elektrolytkonzentration zu gering, so leiteten die Proteine selbst einen Teil des Stromes, was zu breiten, diffusen Zonen geringer Auflösung führen würde. Bei zu hoher Elektrolytkonzentration nähme andererseits die Stromstärke zu und die Spannung ab, was zu einer Erwärmung (Beeinflussung von Proteinveränderungen und Diffusionsgeschwindigkeiten) mit der Folge von veränderten Wanderungstendenzen der Substanzen führen würde. Eine reale Vergleichbarkeit von Standardspuren und Patientenspuren wäre dann nicht gewährleistet. Es zeigte sich, dass der Vergleich von errechneten und gemessenen Rs-Werten für jeweils gleiche Seren, nativ und dialysiert, eine gleiche Zuordnung für die Subfraktionen erbrachte (siehe als Beispiel Abbildungen 22 und 23). Die Ionenstärke des eingesetzten Puffers lässt demnach die durch die verschiedenen Behandlungsweisen bedingten Elektrolytkonzentrationen der verwendeten Seren und UZ-Fraktionen nicht zum Tragen kommen. Die Orientierung der Rs-Werte der Patientenseren an den Rs-Werten der als Standard eingesetzten UZ-Fraktionen ist damit gerechtfertigt.

72 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 9, 10 Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6-Dichte- fraktionen 6 Serum 1001 nativ 7 Serum 1001 gegen NaBr dialysiert 8 6 UZ LDL n n=1 von Serum 1001 Abbildung 20: Ausschnitt aus Gel 163 (links oben) und daraus Spuren 6 (Mitte), 7 (Mitte unten), 8 (unten) mit Spurendiagrammen

73 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Spur 9, 10 Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6-Dichte- Auftragsstelle fraktionen 6 Serum 1002 nativ 7 Serum1002 gegen NaBr dialysiert 8 6 UZ LDL n n=1 von Serum 1002 Abbildung 21: Ausschnitt aus Gel 165 (links oben) und daraus Spuren 6 (Mitte), 7 (Mitte unten), 8 (unten) mit Spurendiagrammen

74 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 1, 3, 5 Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6-Dichtefraktionen 2/6 Serum 1003 nativ / Serum 1004 nativ 4/8 Serum 1003 dialysiert / Serum 1004 dialysiert Abbildung 22: Gel 177: Einfluss der Ionenstärke auf die Rs-Werte. Tabelle 11: Gel 177: Ergebnisse und Zuordnung. Berechnung siehe Anhang 6.4 auf Seite 112. Spur Rs-Wert gerechnet 0,4557 0,4582 0,4765 0,4725 Rs-Wert gemessen 0,4590 0,4590 0,4760 0,4710 Zuordung LDL4 LDL4 LDL6 LDL6

75 3 Praktischer Teil Abbildung 23: Gel 177: Spuren 1 bis 5 (von oben bis unten): Auswertung mittels ScanPacK 3.0 gibt für natives und gegen NaBr dialysiertes Serum die gleiche LDLHauptfraktion.

76 3 Praktischer Teil 76 Der Einfluss der Ionenstärke auf die Schärfe der Banden der LDL-Subfraktionen war zusätzlich für verschiedene Poolseren (zusammengesetzt aus Patientenseren, die überwiegend LDL1- und solchen, die überwiegend LDL6Subfraktionen enthielten) durch verschiedene Ansätze untersucht worden. So wurden zum Beispiel 3 µl eines Poolserums mit jeweils 3 µl einer Stammlösung (1 Mol NaBr und 1 Mol NaCl) versetzt und dabei deren Konzentration einer geometrischen Reihe folgend (1, ½, ¼, ⅛, 1/16) variiert (Gesamtvolumen eines jeden Auftrags: 6 µl). Es konnte in diesem und ähnlichen Experimenten keine Veränderung des Aufspaltungsmusters oder der Rs-Werte für die jeweiligen Banden beobachtet werden. In einem weiteren Versuch wurde untersucht, wie sich bei einem gleichbleibenden Auftragsvolumen von 4 µl je Ansatz verschiedene Verdünnungsmedien auf die Fokussierung der Bande auf dem Gel auswirken. Dazu wurden folgende Ansätze auf dem Gel aufgetragen: 3 µl Poolserum µl Glycerin, variiert 5%, 10% und 15% 3 µl Poolserum µl Lipid Deficient Serum (LDS) 3 µl Poolserum µl NaCl, 0,9% 2 µl Poolserum µl Glycerin, variiert 5%, 10% und 15% 2 µl Poolserum µl Lipid Deficient Serum (LDS) 2 µl Poolserum µl NaCl, 0,9% 1 µl Poolserum µl Glycerin, variiert 5%, 10% und 15% 1 µl Poolserum µl Lipid Deficient Serum (LDS) 1 µl Poolserum µl NaCl, 0,9%. Weder die Zugabe von Glycerin (erhöht die Dichte des aufgetragenen Materials) noch die Verdünnung des Serums mit LDS oder physiologischer Kochsalzlösung führten zu einer verbesserten Fokussierung der Banden auf dem

77 3 Praktischer Teil 77 Gel. Für die meisten Seren erwies sich ein Auftragsvolumen von 4 µl als optimal. Sollte zur Vermeidung von Materialüberlagerung ein Verdünnen des Serums notwendig sein, so kann das in einfacher Weise mit 0,9 prozentiger Kochsalzlösung geschehen. Da der UZ-LDL1 und UZ-LDL6-Standard bereits in verdünnter Form zum Auftragen kommt, sollte hier das Auftragsvolumen von 6 µl nicht unterschritten werden. Eine entscheidende Auswirkung auf die Bandenfokussierung und auf die Bandenform (weitgehende Vermeidung des unerwünschten Smile-Effektes) hatte die Temperatur, bei der die Elektrophorese durchgeführt wurde. Schärfe der Banden und Diffusion (Brownsche Molekularbewegung) sind reziprok zueinander. Die Bandenfokussierung konnte dadurch verbessert werden, dass die Elektrophorese nicht mehr bei Raumtemperatur, sondern im Kühlraum (bei 4 C) durchgeführt wurde. Dennoch wurde während der Elektrophorese eine Temperaturerhöhung von 4 C auf 9 C beobachtet. Um die Diffusion des Materials weiter einzuschränken, wurden die Elektrophoresegeräte während des Betriebes im Kühlraum zusätzlich in Eis gestellt. Auf diese Weise konnte eine konstante Temperatur von 4 C während der Elektrophorese aufrecht erhalten werden. Auch hinsichtlich der Elektrophoresedauer und der Spannung für die Vorelektrophorese zur Kalibrierung und der Elektrophorese zur Auftrennung wurden Versuche zur Optimierung durchgeführt. Hier erwiesen sich die Angaben des Herstellers (Vorelektrophorese: bei 100 V für 10 min; Elektrophorese: 900 Vh: bei 50 V für 18 h) als günstig und wurden beibehalten. Sowohl im Routinelabor als auch für Forschungszwecke ist es häufig notwendig, Patientenproben einzufrieren. Deshalb wurde der Frage nachgegangen, ob das zwischenzeitliche Einfrieren und Auftauen von Proben zu Veränderungen der Lipoproteine und damit der Laufeigenschaften auf dem Gel führen. Die Abbildungen 24 und 25 zeigen ein Patientenserum, das zwei Subfraktionen im IDL-LDL-Bereich aufweist. Für dieses und andere vergleichbare Seren stimmten die berechneten mit den gemessen Rs-Werten des Hauptpeaks für die native und die eingefrorene Probe gut überein.

78 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 3 Patientenserum 1005 nativ 4 bis 6 Patientenserum 1005 zwischenzeitlich auf -20 C gefroren 7 und 8 Patientenserum 1005 nativ Abbildung 24: Gel 189: Gegenüberstellung von nativen und gefrorenen Patientenseren. Tabelle 12: Gel 189: Ergebnisse und Zuordnung. Berechnung siehe Anhang 6.5 auf Seite 113. Spur 3 Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen 0, ,4665 0,4640 0,4620 0,4530 0,4405 0,4660 0,4690 0,4620 0,4550 0, ,4260

79 3 Praktischer Teil Abbildung 25: Gel 189: Spuren 3 bis 8 (von oben nach unten): Auswertung mit ScanPacK 3.0. Außerdem konnten, wie die Abbildungen 26 und 27 und die Tabelle 13 ausweisen, keine Unterschiede zwischen den Eigenschaften von nativen EDTA-Plasma und nativen Serum gefunden werden. Damit stehen beide Materialien einer Probe für eine Lipoprotein-Diagnostik mit der LFE zur Verfügung.

80 3 Praktischer Teil Spur Laufrichtung Auftragsstelle Spur 1 bis 3 Patientenplasma 1004 nativ 4 bis 6 Patientenserum 1004 nativ 7 bis 9 Patientenplasma 1004 nativ Abbildung 26: Gel 188: Gegenüberstellung von nativen Plasma und nativen Serum. Tabelle 13: Gel 188: Ergebnisse. Berechnung siehe Anhang 6.6 auf Seite 113. Spur Rs-Wert gerechnet Rs-Wert gemessen ,4730 0,4750 0,4785 0,4790 0,4815 0,4730 0,4750 0,4730 0,4750 0,4840 0,4830 0,4790

81 3 Praktischer Teil Abbildung 27: Gel 188: Auswertung der Spuren 3 bis 8 (von oben nach unten) mit ScanPacK 3.0.

82 3 Praktischer Teil 82 Als ein großes Problem erwies sich das Anfärben der Banden auf dem Gel. Wurde den Anweisungen des Herstellers Folge geleistet, so störten regelmäßig Farbüberlagerungen der Lipidbanden und über das Gel verteilte Farbpartikel die densitometrische Auswertung der Peaks. Es wurden deshalb zahlreiche Versuche zur Verbesserung der Färbung durchgeführt. Maßnahme Ergebnis Färbelösung eine Stunde gerührt Weiterhin unerwünschte Farbpartikel auf dem Gel verteilt (siehe Gel 132, Abbildung 14, Seite 67). Färbelösung dekantiert und eine Stunde gerührt. Weniger und kleinere Farbpartikel auf dem Gel (siehe Gel 134, Abbildung 14, Seite 67). Filtration der Färbelösung mittels Faltenfilter. Färbelösung zentrifugiert (3000 U/min) und mit Faltenfilter filtriert. Nach einstündigem Rühren der Färbelösung diese mittels Faltenfilter filtriert. Durch das Filtrieren gelang zwar die Entfernung der großen, störenden Farbpartikel, die Intensität der Bandenfärbung wurde aber zu stark vermindert. Färbelösung eine Stunde gerührt und anschließend mit Mikrofilter 0,20 µm gefiltert. Dauer der Färbung auf die Hälfte (ca. Störende Farbpartikel und unzurei9 Stunden) reduziert. chendes Anfärben der Banden. Färbelösung 1:2 verdünnt mit einer Mischung von 30% Ethanol und 10% Essigsäure in Wasser. Vor Verwendung mindestens 30 Minuten gerührt und zur Entfernung von (eventuell noch vorhandenen) Farbpartikeln dekantiert; Färbevorgang über Nacht (18 Stunden). Keine störenden Farbpartikel auf dem Gel, Lipidbanden färben sich ohne Farbüberlagerungen, sparsamer Verbrauch der kommerziellen Färbelösung. Weitere Versuche erbrachten, dass zur qualitativen Orientierung über das Aufspaltungsmuster eine Schnellfärbung in nur vier Stunden möglich ist, ebenso wie das Nachfärben eines bereits farbfixierten Gels.

83 4 Methodenvergleich 83 4 Methodenvergleich 4.1 Auswerteverfahren Wie bereits in Kapitel 2.4 diskutiert, ergibt eine Auftrennung der LDL in der UZ nach Dichte und eine Auftrennung bei der LFE nach Größe die gleiche Reihenfolge der Subfraktionen, in denen damit jeweils auch die gleichen Teilchen enthalten sind. Dies wurde exemplarisch durch die fraktionsweise Wiedergabe der LDL-Subfraktionen auf dem Gel 186 (siehe Abbildung 6 auf Seite 51) und den Gelen 132 und 134 (siehe Abbildung 14 auf Seite 67) demonstriert. Zusätzlich war noch durch einen Methodenvergleich quantitativ zu überprüfen, inwieweit eine Auftrennung der LDL-Hauptklasse in Dichteklassen durch die analytische Ultrazentrifugation der Separation nach Teilchengröße mit Hilfe der Lipoprotein-Frakionierungs-Elektrophorese vergleichbar ist. Hierzu wurden 82 Seren sowohl mit der UZ als auch mit der LFE aufgetrennt, jeweils die Hauptfraktionen bestimmt und auf Übereinstimmung geprüft. Als Bezugsgrößen dienten dabei die fraktionsweise gemessenen Apo B-100- und Cholesterin-Werte, die den ermittelten LFE-Rs-Werten für den LDL-Hauptpeak desselben Serums gegenübergestellt wurden. Bei der LFE konnte in der Mehrzahl der Fälle eine vorherrschende LDL-Subfraktion, mitunter auch weitere Banden geringerer Intensität, gefunden werden. Bei den UZ-Dichtefraktionen waren häufig die für die einzelnen Fraktionen gemessenen Anteile (Apo B-100- bzw. Cholesterin-Werte) sehr ähnlich. Es wurde nach verschiedenen Auswertemodi vorgegangen: Beim Auswerteverfahren 1 wurde die über den LFE-Rs-Wert bestimmte LDL-Hauptfraktion mit der UZ-Dichteklasse mit dem höchsten prozentualen Anteil an Apo B-100 beziehungsweise Cholesterin zum direkten Vergleich gebracht und eine Übereinstimmung des Ergebnisses oder eine entsprechende Abweichung festgestellt. Die Festlegung der UZ-LDL-Haupt-Dichtefraktion erfolgte ungeachtet dessen, dass sich eventuell andere Fraktionen desselben Se-

84 Anzahl derabweichungen Abweichungen Anzahl der 4 Methodenvergleich 84 53,6 % % ,0% 0,0% 0,0% 0,0% ,2% 10 16,7 % % 10,7% ,3% 6,0% 3,6% Abw eichungender derzugeordneten zugeordneten LFE-Fraktionen vonvon UZ-Fraktionen Abweichungen LFE-Fraktionen UZ-Fraktionen Abbildung 28: Auswertemodus 1: Hauptfraktion nach dem höchsten Apo B-100Wert. rums nur um wenige Prozentanteile unterschieden. Wurden LFE-Banden gefunden, die sich vor dem UZ-LDL1-Standard oder hinter dem UZ-LDL6Standard befanden, so wurden diese als übereinstimmend mit der UZ-Fraktion gewertet, wenn es sich bei dieser um eine UZ-LDL1-Fraktion bzw. um eine UZ-LDL6-Fraktion handelte. Nach diesem Auswertemodus resultiert für die 82 Seren (mit 84 Subfraktionen, da zwei Seren mit Doppelfraktionen jeweils gleicher Konzentration zur Auswertung kamen) (siehe Anhang 6.7 auf Seite 114) nur eine Übereinstimmung in den Subfraktionen von 54% (45 absolut) bei Verwendung der Apo B100-Werte (siehe Abbildung 28) bzw. 40% (33 absolut) bei Verwendung der Cholesterinwerte. Vergleicht man die Verteilung der Subfraktionen, so zeigt sich, dass in der UZ-Analyse der Anteil der LDL1-Fraktionen mit 38% bei den Apo B-100Werten bzw. 51% bei den Cholesterinwerten, bei der LFE-Analyse hingegen der Anteil der LDL6-Fraktionen mit 43% sehr hoch ist. Dagegen ist die in beiden Verfahren ermittelte Anzahl der Subfraktionen LDL2 bis LDL5 eher vergleichbar (siehe Abbildungen 29 und 30). Wenn man die Ergebnisse für die LDL1-Subfraktionen einzeln betrachtet, so stimmt die Zuordnung nur in 35%

85 4 Methodenvergleich 85 der Fälle für Apo B-100-Werte (27% für die vergleichbaren Fälle mit Cholesterinwerten) überein und man findet einen weiten Streubereich (siehe Abbildung 31). Diese großen Abweichungen könnten darauf zurückzuführen sein, dass bei den UZ-LDL1-Subfraktionen eventuell ein höherer Anteil an IDL über die Apo B-100-Messung bzw. Cholesterinmessung miterfasst wird, so dass der LDL1-Anteil bei dem UZ-Verfahren zu hoch ausfällt. Wird bei denuz/lfepaaren, die in den LDL1-Subfraktionen nicht übereinstimmen, jeweils der zweithöchste Apo B-100-Wert betrachtet (und damit angenommen, dass für die Fraktion mit dem höchsten Wert ein hoher Anteil an IDL bestimmend ist), so zeigt sich, dass 41% der Paare beim Apo B-100-Wert bzw. 43% beim Cholesterinwert übereinstimmen und dass sich die Streubreite wesentlich vermindert (siehe Abbildung 32). Das Problem eines möglichen IDL-Anteils in den UZ-LDL1-Fraktionen zeigte sich auch bei der Verwendung des UZLDL1/LDL6-Standards für die Gelelektrophorese durch das Auftreten von breiten Banden für die LFE-LDL1-Banden (siehe z.b. Abbildung 12 auf Seite 63).

86 Anzahlder der Subfraktionen Subfraktionen Anzahl 4 Methodenvergleich ,1% 20 1,2% 2,4% 16,7% 17,9% LDL 2 LDL 3 LDL 4 LDL 5 23,8% LDL 1 LDL6 UZ- LDL-Subfraktionen UZ-LDL-Subfraktionen Abbildung 29: Verteilung von 84 UZ-LDL-Subfraktionen (82 Seren), zugeordnet nach dem jeweils höchsten Apo B-100-Wert. 42,9% Anzahl Anzahlder dersubfraktionen Subfraktionen ,1% 20 13,1% 3,6% 6,0% 15,5% v.ldl1/ldl1 LDL 2 LDL 3 LDL 4 LDL 5 LDL6/htLDL6 LFE-LDL-Subfraktionen LFE-LDL-Subfraktionen Anzahlder der Abweichungen Anzahl Abweichungen Abbildung 30: Verteilung von 84 LFE-LDL-Subfraktionen (82 Seren), zugeordent nach dem Rs-Wert. 35,1% ,0% 0,0% 0,0% 0,0% 2,7% ,8% 10,8% 18,9% 13,5% 8,1% Abweichungen der zugeordneten LFE-Subfraktionen von UZ-LDL1-Subfraktionen Abw eichungen der zugeordneten LFE-Subfraktionen von UZ-LDL1-Subfraktionen Abbildung 31: Vergleich der UZ-LDL1-Fraktionen (Apo B-100-Wert) mit LFE-LDL1-Fraktionen.

87 4 Methodenvergleich 87 41% Anzahl derabweichungen Abweichungen Anzahl der 10 4,6% 8 22,7% 31,8% Abweichungen der zugeordneten LFE-Subfraktionen von UZ-Subfraktionen Abweichungen der zugeordneten LFE-Subfraktionen von UZ-Subfraktionen Abbildung 32: Hier wurde bei allen LDL1-Abweichlern" der zweithöchste Apo B-100-Wert zur Bestimmung der Hauptfraktion herangezogen und mit den LFE-Subfraktionen verglichen (s.text). 10 Anzahl der Abweichungen Anzahl der Abweichungen 50% 8 14,3% 6 35,7% Abweichungen der LDL4-LFE-Subfraktionen von LDL4-UZ-Subfraktionen Abw eichungen der LDL4-LFE-Subfraktionen von LDL4-UZ-Subfraktionen Anzahl derabweichungen Abweichungen Anzahl der Abbildung 33: Vergeich der UZ-LDL4-Hauptfraktionen (Apo B-100-Wert) mit LFE-LDL4-Fraktionen. 60% % Abweichungen der LDL5-LFE-Subfraktionen von LDL5-UZ-Subfraktionen Abweichungen der LDL5-LFE-Subfraktionen von LDL5-UZ-Subfraktionen Abbildung 34: Vergleich der UZ-LDL5-Hauptfraktionen (Apo B-100-Wert) mit LFE-Fraktionen.

88 4 Methodenvergleich 88 Anzahl Anzahlder der Abweichungen Abweichungen % Abweichungen der LDL6-LFE-Subfraktionen Abweichungen der LDL6-LFE-Subfraktionen von LDL6-UZ-Subfraktionen +5 von LDL6-UZ-Subfraktionen Abbildung 35: Vergleich der UZ-LDL6-Fraktionen (Apo B-100-Wert) mit LFE-LDL6- (und hinter LDL6-") Fraktionen. Bei den LDL2-Subfraktionen lag nur noch ein UZ-Wert zum Vergleich vor (Abweichung +2) und für die zwei LDL3-Fraktionen stimmten die UZund LFE-Zuordnungen überein. Die Abbildungen 33, 34 und 35 zeigen, dass die Zahl der Abweichungen der Subfraktionenpaare vom LDL4-Bereich (Streuung +1 und +2), über den LDL5-Bereich (Streuung +1) bis zum LDL6Bereich (Streuung 0) abnimmt. Alle UZ-LDL6-Subfraktionen wurden als LFE-LDL6-Subfraktionen wiedergefunden. Der höhere Anteil an LFE-LDL6-Fraktionen gegenüber der UZ-Analyse könnte mit Erkennen von LDL-Partikeln, die kleiner sind als es der UZ-LDL6-Dichtefraktion entspricht, erklärt werden. Welcher Natur diese sehr kleinen Partikel ( hinter LDL6 ) sind (sehr kleine, oxidierte LDL-Partikel, fragmentierte LDL, strukturell verändertes Apo B-100?) ist gegenwärtig rein spekulativ. Bei der Durchführung des beschriebenen Auswerteverfahrens 1 stellte sich das Problem, dass häufig mehrere UZ-Subfraktionen mit annähernd gleich großem Apo B-100- (bzw. Cholesterin-)Wert vorhanden waren, so dass eine Hauptfraktion nicht eindeutig angegeben werden konnte. Diese Fälle wurden bei einem zweiten Auswerteverfahren ausgeschlossen, indem eine Schwelle

89 4 Methodenvergleich 89 Anzahl der [%] Anzahl derabweichungen Abweichungen [%] % ,4 16,4 9,1 10,9 5,45 1, ,5 9,3 4,7 16,3 7 2, ,9 8,3 2,8 16,7 5,6 2,78 25% 27% 0 Abweichungen derder zugeordneten UZ-Fraktionen Abw eichungen zugeordnetenlfe-fraktionen LFE-Fraktionen vonvon UZ-Fraktionen Abbildung 36: Auwertemodus 2: UZ-Hauptfraktionen zugeordnet nach Apo B-100Wert 23%, 25% und 27%. von 23% (oder 25%, beziehungsweise 27%) Apo B-100 bzw. Cholesterin eingeführt wurde. 28 Seren beim Apo B-Wert bzw. 20 Seren beim CholesterinWert erfüllten die Schwellen-Bedingung von 23% nicht. Die verbleibenden 54 Seren (55 Subfraktionen) beim Apo B-Wert bzw. 62 Seren für Cholesterin wiesen eine Übereinstimmung der UZ-Subfraktionen mit den LFE-Pendants in 56% der Fälle (Apo B) und 47% (Cholesterin) auf. Auch für dieses Auswerteverfahren 2 unterstreicht die Analyse der Verteilungen der einzelnen Subfraktionen und ihrer Streubreite die ungünstige Auswirkung der großen Zahl an UZ-LDL1-Fraktionen auf das Vergleichsergebnis. Erhöht man, um eine sichere LDL-Hauptfraktion herauszufinden, den cut-off auf 25% bzw. 27% Apo B-100 (beziehungsweise Cholesterin), so resultiert eine Übereinstimmung mit den LFE-Fraktionen von 61% bzw. 64% (siehe Abbildung 36), (jeweils 53% für Cholesterin). Es erwies sich als nicht sinnvoll, den Schwellenwert bei den UZ-LDL-Fraktionen noch höher anzusetzen, da nur noch LDL1

90 4 Methodenvergleich Anzahl UZ-LDLAnzahl derderuz-ldlsubfraktionen Subfraktionen % 0% 0% 0% LDL2 LDL3 LDL4 11% 39% LDL1 LDL5 LDL6 UZ-LDL-Subfraktionen(Hauptfraktionen (Hauptfraktionen mit UZ-LDL-Subfraktionen mit Apo ApoB-100 B-100=> 27%) 27%) Abbildung 37: Verteilung der UZ-Hauptfraktionen mit dem Schwellenwert für Apo B %. (50%), LDL5 (11%) und LDL6 (39%) zu Vergleichszwecken mit den LFESubfraktionen zur Verfügung standen (siehe Abbildung 37). Bei dem dritten Auswerteverfahren wurden die LDL-Subfraktionen nur in drei Bereiche, d.h. in große, mittlere und kleine Partikel eingeteilt. Die LDL1und LDL2-Subfraktionen wurden als weniger atherogene Partikel zu einer Kategorie I zusammengefasst, die LDL3 und LDL4 als Zwischenfraktionen zu einer Kategorie II und schließlich LDL5 und LDL6 als hochatherogene Subfraktionen zu einer Kategorie III. Die UZ-Kategorien mit dem höchsten Gehalt an Apo B-100 (bzw. Cholesterin) wurden mit den LFE-Kategorien zum Vergleich gebracht. Danach resultiert eine Äquivalenz von 72% beim Apo B100-Wert (siehe Abbildung 38). 23 Wertepaare weichen voneinander ab, davon 16 (70%) von der Kategorie I (mit zu hoch gewichtetem LDL1?). Die Einteilung der LDL-Fraktionen in drei Kategorien verbessert zwar die zahlenmäßige Übereinstimmung der LFE-Ergebnisse mit den UZ-Werten, jedoch unter Inkaufnahme eines Verlustes an Information. Legt man die für jede Fraktion gemessenen Cholesterinwerte bei der Bestimmung der Hauptfraktion der UZ-Subfraktionen zugrunde und führt eine gleichartige Auswertung hinsichtlich der Übereinstimmung von UZ- und LFEAnalyse durch, so zeigt sich grundsätzlich der gleiche Trend, die prozentual er-

91 4 Methodenvergleich 72,3% 80 Anzahl der Anzahl derabweichungen Abweichgn ,41% 16,9 % 8,4% I 0 +I +II Abw eichg der LFE-Subfraktionen von UZ -Sum menfraktionen Abweichung der LFE-Kategorien von UZ-Kategorien Abbildung 38: Auswertemodus 3: LDL-Subfraktionen der Kategorie I (LDL1 + LDL2), der Kategorie II (LDL3 + LDL4) und der Kategorie III (LDL5 + LDL6), zugeordnet nach dem jeweils höchsten Apo B100-Wert versus LFE-Subfraktionen der jeweils gleichen Kategorien. fasste Übereinstimmung beider Verfahren ist jedoch etwas geringer. Das überrascht nicht, da es in Abhängigkeit vom Vorliegen einer Hypertriglyceridämie (d.h. großer, triacylglycerinreicher VLDL1) zur Bildung von LDL-Partikeln kommt, deren lange Verweildauer in der Zirkulation einem Austausch von Cholesterinester gegen Triacylglycerin Vorschub leistet. Das Ausmaß der enzymatischen Lipolyse hängt dann von der Aktivität der hepatischen Lipase ab. Dieses intravaskuläre remodelling führt zu LDL-Partikeln mit unterschiedlichem Cholesteringehalt, wohingegen sich die Zahl der Apo B-100-Moleküle (ein Apo B-100 pro LDL-Partikel) nicht ändert. Deshalb korrespondiert der gemessene Apo B-100-Wert besser mit der Angabe einer Konzentration für die einzelnen LDL-Subfraktionen. Es soll noch erwähnt werden, dass eine visuelle Zuordnung der LDL-Subfraktionen durch einfachen Vergleich der jeweiligen Bandenposition relativ zu den UZ-LDL1/LDL6-Standardbanden ein ähnliches Ergebnis erbrachte wie die Auswertung der densitometrisch ermittelten Rs-Werte. Dies setzt allerdings eine gewisse Erfahrung des Betrachters voraus.

92 4 Methodenvergleich Diskussion Die LFE ermöglicht es unter geringem Personalaufwand zeit- und kostengünstiger als die UZ und (bei sorgfältiger Arbeitsweise) mit vergleichbarer Genauigkeit wie diese, aus nativem oder eingefrorenem Serum (siehe Abbildungen 24 und 25) ein Lipidprofil durch Aufspaltung in VLDL, IDL sowie in LDL- und HDL-Subfraktionen zu erstellen. Feine Unterschiede in der Relativlage der Patientenbande zu den benachbarten Standardbanden lassen sich rasch auf dem Gel oder dem Scan-Ausdruck visualisieren (siehe Abbildungen 39 bis 42). Durch die Erstellung einer Lipidspur für einen Patienten kann gleichzeitig der Nachweis einer Hyperchylomikronämie (auffällig intensive Färbung an der Auftragsstelle für ein Serum nach Nahrungskarenz), ein hoher Anteil an VLDL, der Nachweis von kleinen, dichten LDL-Partikeln und der Anteil der HDL-Fraktion erfasst werden. Der relative Beitrag jeder dieser Variablen ist für die Charakterisierung des Lipidphänotyps wichtig und für die Bestimmung des individuellen KHK-Risikos nützlich. Für eine Überprüfung des Erfolges einer medikamentösen oder konventionellen Intervention kann die Messung einer Senkung der LDL-Cholesterinkonzentration ergänzt werden durch die Beobachtung von Veränderungen des LDL-Partikelspektrums von kleinen, dichten zugunsten größerer, weniger dichter LDL-Partikel als der entscheidende Prädiktor für die Regression einer KHK und FCHL (familiäre kombinierte Hyperlipidämie). Außerdem sollte durch das LFE-Verfahren ohne zusätzlichen Aufwand eine halbquantitative Abschätzung des Verhältnisses von LDL- zur HDLFraktion im Nativserum des Patienten möglich sein. Gel 026 (siehe Abbildung 40) zeigt das Serum eines Patienten mit LDL-HDL-Anteilen von etwa gleicher Intensität. Auf einfache Weise lässt sich hier der Erfolg einer Behandlung zur HDL-Erhöhung (durch Änderung des Lebensstils oder durch Medikamente) bei Patienten mit entsprechenden metabolischen Störungen erfassen.

93 4 Methodenvergleich 93 Darüber hinaus ermöglicht die LFE auch die Detektion und halbquantitative Bestimmung von Fraktionen, die vor LDL1 bzw. hinter LDL6 auftreten und in der UZ zum Teil mit diesen zusammen bestimmt werden (siehe Abbildungen 41 und 42). Der Vorteil der Lipoproteinelektrophorese auf Polyacrylamid-Gradientengel gegenüber der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugationstechnik besteht darin, dass neben Chylomikronen vor allem auch abnorme Lipoproteine durch ihre kleinen Unterschiede in den Wanderungsstrecken gut auf dem Gel sichtbar sind und erkannt werden können. Die aufgrund eines veränderten Lipid/Proteinverhältnisses veränderte Dichte pathologischer Seren führt häufig zu einer Missdeutung hinsichtlich der Zuordnung zu den Dichteklassen und birgt damit die Gefahr von Fehlinterpretationen. Hier liefert die LFE verglichen mit der UZ zusätzliche wertvolle Informationen, da in pathologischen Seren häufig ein gegenüber Seren von Gesunden verändertes Lipid/Protein-Verhältnis vorliegt [30]. Präzision und Sensitivität der Zuordnung von LDL-Subfraktionen nach der LFE-Methode ließen sich verbessern, wenn man statt eines LDL1/LDL6Standards aus der UZ-Analyse und statt einer Pseudofront auf anfärbbare (und damit densitometrisch auswertbare) standardisierte Partikel einheitlicher, definierter Größe zurückgreifen könnte (wie sie von einigen Firmen kommerziell angeboten werden). Der Größenbereich könnte dabei enger und schärfer gefasst werden als bei der hier zugrunde gelegten Bezugsstrecke (Auftragsstelle bis Pseudofront in der Größenordnung von Albumin). Ein solches Vorgehen würde zu einer Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Rs-Werte führen. Grundsätzlich ist denkbar, das vorgestellte Auswerteverfahren auch auf die Zuordnung von HDL-Subfraktionen auszudehnen. Der UZ-LDL1/LDL6Standard wäre dann um UZ-HDL-Subfraktionen zu erweitern oder anfärbbare Kügelchen geeigneter Größe als Standard einzusetzen.

94 4 Methodenvergleich Spur Laufrichtung Auftragsstelle Abbildung 39: Gel L027: Vier verschiedene Patientenseren (Spuren 2, 4, 6 und 8) und Standard (Spuren 1, 3, 5, 7, 9, 10) rasche visuelle Kontrolle der LDL-Subfraktionen und des LDL/HDL-Verhältnisses möglich LDL HDL Abbildung 40: Ausschnitt aus Gel 026: Eine halbquantitative Abschätzung des Verhältnisses der LDL/HDL-Subfrakionen ist möglich. 1.20

95 4 Methodenvergleich VLDL Abbildung 41: Ausschnitt aus Gel L011: Patientenserum mit reichlich Triglycerid, markanten VLDL/LDL Subfrakionen LDL IDL Abbildung 42: Ausschnitt aus Gel L043: Patientenserum mit markanten IDL/LDLSubfrakionen.