Einfluss des Spenderalters auf das Transplantatüberleben im Keratoplastik-Modell an der Ratte

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1 Aus der Universitäts-Augenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Einfluss des Spenderalters auf das Transplantatüberleben im Keratoplastik-Modell an der Ratte INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2009 von Isabel Theresia Gross geboren in Freiburg im Breisgau

2 Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters 1.Gutachter: Prof. Dr. Thomas Reinhard 2.Gutachter: Prof. Dr. Bernd Heimrich Jahr der Promotion:

3 1 EINLEITUNG DIE KORNEA DIE KERATOPLASTIK Historische Entwicklung der Keratoplastik Techniken der Keratoplastik Indikationen zur Keratoplastik Keratoplastik bei Säuglingen Risikofaktoren für die Transplantatabstoßung nach einer Keratoplastik GRUNDLAGEN ZUR TRANSPLANTATABSTOßUNG Immunologische Grundlagen Unspezifisches und spezifisches Immunsystem Major Histocompatibility Complex (MHC) Professionelle antigenpräsentierende Zellen Natürliche Killerzellen Aktivierung des spezifischen Immunsystems Immunsystem der Neugeborenen Immunologie des Auges Histokompatibilität und HLA-Matching des Auges Immunzellen der Kornea Immunprivileg des Auges Immunprivileg der Kornea Anterior Chamber Associated Immune Deviation (ACAID) Transplantationsimmunologie Abstoßungsreaktion nach perforierender Keratoplastik im Erwachsenenalter Abstoßungsreaktion nach perforierender Keratoplastik im Säuglings - und Kindesalter FRAGESTELLUNG MATERIAL UND METHODEN VERSUCHSGRUPPEN HORNHAUTTRANSPLANTATION Operationsvorbereitung und Narkoseeinleitung Transplantation Klinische Beurteilung des Transplantats Kriterien für das Versuchsende: IMMUNHISTOCHEMIE Anfertigung der Kryoschnitte Immunhistochemische Färbung Positivkontrolle Histologische Beurteilung Statistische Auswertung

4 3 ERGEBNISSE KLINISCHE BEGUTACHTUNG DER TRANSPLANTATÜBERLEBENSZEIT BEGUTACHTUNG DES VERLAUFS VON OPAZITÄT, ÖDEM UND VASKULARISATION Opazität Ödem Vaskularisation IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER ZELLINFILTRATION Gesamtzellinfiltration T-Helferzellen (CD4 + Zellen) T-Killerzellen (CD8 + Zellen) IL-2 Rezeptor exprimierende Zellen (CD25 + Zellen) Natürliche Killerzellen (CD Zellen) Makrophagen (CD163 + Zellen) Dendritische Zellen DISKUSSION DISKUSSION DER ERGEBNISSE Bedeutung des Spenderalters bei adulten und infantilen Ratten Mögliche Ursachen für das verlängerte Transplantatüberleben Histologische Ergebnisse Gesamtzellinfiltration T-Helferzellen (CD4 + T-Zellen) T-Killerzellen (CD8 + Zellen) IL-2 Rezeptor exprimierende Zellen (CD25 + Zellen) Natürliche Killerzellen (CD161 + Zellen) Makrophagen (CD163 + Zellen) Dendritische Zellen (Ox-62) Klinischer Verlauf Opazität Ödem Vaskularisation ZUSAMMENFASSUNG ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE LITERATURVERZEICHNIS ANHANG HERSTELLERVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS LEBENSLAUF DANKSAGUNG VERÖFFENTLICHUNGEN

5 EINLEITUNG 1 EINLEITUNG 1.1 Die Kornea Die Kornea bildet gemeinsam mit der Sklera die Hülle des Auges. Die Grenzschicht zwischen Kornea und Sklera ist der Limbus corneae. Die Hornhaut ist durchsichtig und hat bei Erwachsenen einen Durchmesser von 10 bis 12 mm. Bei Neugeborenen beträgt er 9,0 bis 10,5 mm (Blomdahl 1979). Zentral ist sie im Mittel 0,52 mm und peripher 0,65 mm dick. Die Kornea ist nicht vaskularisiert und wird über die Flüssigkeit der Vorderkammer und über den Tränenfilm mit Nährstoffen versorgt. Abb.1: Schematisierter histologischer Aufbau der Kornea Histologisch kann man folgende Schichten unterscheiden: a) mehrschichtig unverhorntes Plattenepithel: b) Lamina limitans anterior (Bowmann-Membran): c) Stroma d) Descemet-Membran e) Hornhautendothel Das einschichtige Hornhautendothel auf der Innenseite der Hornhaut dient der Abdichtung der Hornhaut gegenüber dem Vorderkammerwasser. Es pumpt eingedrungene Flüssigkeit zurück, um die Durchsichtigkeit der Kornea zu gewährleisten. Das Hornhautendothel kann im Gegensatz zum Epithel nicht wesentlich regenerieren. 5

6 EINLEITUNG 1.2 Die Keratoplastik Historische Entwicklung der Keratoplastik Bereits die Ägypter beschäftigten sich 1500 v. Chr. mit der Möglichkeit, an der Kornea zu operieren. Zur Zeit des Hippokrates um 400 v. Chr. wurde besonders die Anatomie des Auges weiter erforscht. Es sind Aufzeichnungen aus der Zeit der Römer überliefert, in denen Galen (131 bis 200 n. Chr.) Ideen zur Wiederherstellung der Transparenz eingetrübter Korneae dokumentierte. Aus der Zeit des Mittelalters sind wenige Fortschritte auf dem Gebiet der Hornhautoperationen überliefert (Casey 1984). In Tab.1 ist die weitere geschichtliche Entwicklung der Keratoplastik von 1789 bis 1906 dargestellt Zur Zeit der Französischen Revolution schlug Guillaume Pellier de Quengsy vor, eingetrübte Hornhaut durch ein durchsichtiges Material zu ersetzen (Chirila and Hicks 1999) Erasmus Darwin hatte sieben Jahre später möglicherweise als erster die Idee, die Kornea mit Hilfe eines Weizenhalmes oder einer Rabenfeder auszuschneiden, als Transplantat zu verwenden und einzunähen (Darwin 1796) Nach einer Idee von K. Himly, die trübe Hornhaut eines Tieres durch die Hornhaut eines Spendertiers zu ersetzen, führte Reisinger erste Keratoplastiken am Kaninchen-Modell durch (Reisinger 1824) Kissam transplantierte die Hornhaut eines Schweins in das Auge eines Menschen (Kissam 1844) Von Hippel führte eine erfolgreiche heterologe Keratoplastik mit einem sprungfederbetriebenen Trepan durch (von Hippel 1888) Edward Konrad Zirm führte die erste erfolgreiche homologe perforierende Keratoplastik beim Menschen durch (Zirm 1906). Tab.1: Historische Entwicklung der Keratoplastik 1789 bis 1906 n. Chr. In der weiteren Entwicklung der Keratoplastik setzten sich aufgrund von neuen Erkenntnissen weitere Standards durch, die den Erfolg der Transplantationen wesentlich verbesserten. So wurden Risikofaktoren definiert (Stanka 1927), das Operationsinstrumentarium verbessert und sowohl Nahtmaterial als auch Nahttechnik ausgefeilt (Harms 1953). Des Weiteren wurden nach dem zweiten Weltkrieg Antibiotika und Steroide eingesetzt. Das Einrichten von Hornhautbanken nach der Gründung der Eye Bank Association of America im Jahre

7 EINLEITUNG trug wesentlich zu einer Verbesserung des Erfolgs von Hornhauttransplantationen bei (Chu 2000). Die immunologisch induzierte Abstoßungsreaktion wurde schließlich von Edward Maumenee als limitierend identifiziert (Smiddy et al. 1986) und von Khodadoust tierexperimentell beschrieben (Khodadoust and Silverstein 1969). Durch Immunsuppressiva und Steroide konnte die Abstoßungsreaktion jedoch eingedämmt werden. Die Erforschung der immunologischen Transplantat-Abstoßung und die Entwicklung neuer immunsuppressiver Medikamente zur Optimierung des Erfolgs der perforierenden Keratoplastik halten bis in die heutige Zeit an Techniken der Keratoplastik Bei der Keratoplastik wird ein Teil der eigenen Hornhaut durch eine Spenderhornhaut ersetzt. Hierbei kommen verschiedene Techniken zum Einsatz. Perforierende Keratoplastik: Bei der perforierenden Keratoplastik werden alle Schichten der Kornea durchtrennt und ersetzt. Lamelläre Keratoplastik: Bei der lamellären Keratoplastik werden einzelne Schichten der Hornhaut ersetzt. Diese Operation ist technisch schwieriger und wird derzeit noch seltener eingesetzt als die perforierende Keratoplastik. Lamelläre Keratoplastik mit Femtosekundenlaser: Diese ermöglicht eine individuellere und präzisere Schnittführung beim Ausschneiden der Hornhaut (Holzer 2007) Indikationen zur Keratoplastik Die Gewichtung der verschiedenen Indikationen ist in den Zentren unterschiedlich. In einer britischen Studie, in der Fälle aus der Corneoplastic Unit und Eye Bank eingeschlossen wurden, stellt die Rekeratoplastik die häufigste Indikation dar (siehe Abb.2). Als nächstes ist der Keratokonus zu nennen, gefolgt von der Fuchsschen Endotheldystrophie. Die bullöse Keratopathie, die virale Keratitis und verschiedene Dystrophien stellen einen weiteren Anteil der Indikationen zur Keratoplastik dar (Al-Yousuf et al. 2004). 7

8 EINLEITUNG Abb.2: Darstellung der häufigsten Indikationen zur Keratoplastik nach Al-Yousuf 2004 Diese sechs Indikationen repräsentieren 82,3% der Indikationen zur Keratoplastik. Verletzungen, interstitielle Keratitis und ulzerierende Keratitis stellen den größten Teil der Gruppe der restlichen Indikationen dar. Weiterhin zeigt sich auch eine Verschiebung der Indikationen innerhalb der Zentren über die Jahre hinweg (Cosar et al. 2002) Keratoplastik bei Säuglingen Eine Keratoplastik ist bei Kindern indiziert, bei denen eine unilaterale oder bilaterale korneale Opazität vorliegt, um eine normale Entwicklung des Sehvermögens zu ermöglichen. Besteht eine angeborene korneale Trübung, sollte einerseits eine Keratoplastik in den ersten drei Lebensmonaten angestrebt werden, um einer späteren Amblyopie vorzubeugen. Andererseits stellt die Keratoplastik bei Kindern meist chirurgisch eine große Herausforderung dar, was für eine Verschiebung der Operation vor dem ersten Lebensjahr spricht. Sehr wichtig ist die enge Zusammenarbeit mit den Eltern, da die Keratoplastik eine sehr gute Compliance hinsichtlich der Kontroll-Untersuchungen, der Einnahme von Medikamenten und der postoperativen Pflege bedarf. Erschwerend kommt hinzu, dass bei Säuglingen Äußerungen zur Sehschärfe meist nicht oder nur eingeschränkt möglich sind. Weitere Herausforderungen stellen anatomische und immunologische Besonderheiten des kindlichen Auges dar. Als wichtigste Indikationen zur Keratoplastik bei Kindern sind zu nennen: Fehlbildungen des vorderen Abschnitts (Peterssche Anomalie, Sklerokornea, anteriores Staphylom, infantiles Glaukom), korneale Dystrophien (kongenitale hereditäre endotheliale Dystrophie, posteriore polymorphe Dystrophie, kongenitale hereditäre stromale Dystrophie), erworbene infektiöse 8

9 EINLEITUNG Keratitis (durch Viren, Bakterien, Parasiten), intrauterine infektiöse Keratitis (durch Treponema pallidum, Rubella, Herpes Simplex Virus) und Traumata. Als Komplikationen können bei der pädiatrischen Keratoplastik eine Abstoßungsreaktion (42%), eine Infektion (27%), ein sekundäres Glaukom (13%), korneale Ulzera (6%), Retinaablösungen (3%) oder eine Phthisis (4-13%) auftreten (Chan 2008) Risikofaktoren für die Transplantatabstoßung nach einer Keratoplastik Man teilt die Risikofaktoren für eine Transplantatabstoßung in zwei Gruppen ein: die Standard-Keratoplastik und die Hochrisiko-Keratoplastik. Bei Standard-Keratoplastiken erreicht man ohne Anwendung systemischer Immunsuppressiva eine 5-Jahres Transplantat- Überlebenszeit von über 90%. Bei Hochrisiko-Keratoplastiken überleben hingegen je nach Indikation 0-80% der Transplantate 5 Jahre lang (Reinhard et al. 2004). Die unten stehende Übersicht veranschaulicht die Kriterien, die zu einer Hochrisiko-Keratoplastik führen. Gruppe 1: Postoperativ erhöhtes Risiko für Immunreaktionen als einziger Risikofaktor a) Rekeratoplastiken b) À chaud -Keratoplastiken c) Limbusnahe Transplantation d) Vaskularisationen in 3 oder 4 Quadranten Gruppe 2: Postoperativ erhöhtes Risiko für Immunreaktionen und Epithelheilungsstörungen a) Endogenes Ekzem b) Limbusstammzellinsuffizienz bei: Verätzung/Verbrennung Primäres/sekundäres Pemphigoid Lyell-Syndrom Kongenitale Aniridie Sklerokornea c) Weitere Erkrankungen chronische Blepharokeratokonjunktivitis Zoster Keratitis Keratopathia e Lagophthalmo Neuroparalytische Keratopathie Xerophthalmie 9

10 EINLEITUNG Gruppe 3: Postoperativ erhöhtes Risiko für Immunreaktionen und infektiöse Rezidive a) Herpes Simplex Virus Keratitis b) Amöbenkeratitis Gruppe 4: Glaukomaugen (z.b. bullöse Degenerationen bei Buphthalmus oder Winkelblockglaukomen) Gruppe 5: Postoperativ erhöhtes Risiko für Immunreaktionen und besondere Probleme (z.b. alle Hornhauttrübungsformen im Säuglings und Kindesalter) 1.3 Grundlagen zur Transplantatabstoßung Immunologische Grundlagen Unspezifisches und spezifisches Immunsystem Das Immunsystem ist die Antwort des Organismus auf potentiell pathogene Substanzen oder Prozesse. Wenn ein Fremdorganismus die natürlichen Barrieren des Körpers überwindet und in den Organismus invadiert, wird die unspezifische Immunabwehr aktiviert. Das angeborene bzw. unspezifische Immunsystem erfordert keine Erfahrungen mit Antigenen (Ag) und ist direkt nach der Geburt verfügbar. Hierbei findet eine Unterscheidung zwischen körpereigen und körperfremd statt, ohne dass der Erreger identifiziert wird. Man kann humorale und zelluläre Bestandteile unterscheiden. Zu den humoralen Bestandteilen des unspezifischen Immunsystems gehören das Komplementsystem, Interferone, Akut-Phase Proteine, Lysozym und andere lösliche Faktoren, die bei den komplexen Abwehrvorgängen mitwirken. Zu den zellulären Bestandteilen zählen Phagozyten (Makrophagen, Granulozyten), dendritische Zellen (DC), Epithelzellen und natürliche Killerzellen (NK). Das erworbene bzw. spezifische Immunsystem reagiert langsamer als die angeborene Abwehr. Es erkennt spezifische Strukturen des Pathogens, kann gezielte zelluläre Abwehrmechanismen aktivieren und Antikörper (AK) bilden. Ein immunologisches Gedächtnis wird ausgebildet und der Organismus kann bei einem etwaigen zweiten Kontakt schneller reagieren. Zu den Zellen der spezifischen Immunantwort gehören die B-Lymphozyten und die T-Lymphozyten. Sie erkennen über einen Rezeptor Antigene und generieren daraufhin eine spezifische Abwehr. B-Zellen werden zur Bildung von spezifischen Antikörpern stimuliert und initiieren damit die humorale Immunantwort auf dieses spezifische Antigen. T-Zellen sind darauf spezialisiert, zellgebundene Peptide zu erkennen und eine zelluläre Immunantwort auszulösen. B-Zellen und T-Zellen stehen sowohl über Zellkontakte als auch über lösliche Mediatoren in Kontakt miteinander und beeinflussen sich gegenseitig. Zwischen den 10

11 EINLEITUNG spezifischen und den unspezifischen immunologischen Mechanismen bestehen zahlreiche Wechselwirkungen Major Histocompatibility Complex (MHC) Der Major Histocompatibility Complex (deutsch: Haupthistokompatiblitätskomplex) wird beim Menschen auch als Human Leukocyte Antigen (HLA) bezeichnet. Es ist daher unwahrscheinlich, dass zwei Individuen identische MHC Moleküle aufweisen, mit Ausnahme von eineiigen Zwillingen. MHC Moleküle werden in Klasse I Moleküle (MHC-I) und Klasse II Moleküle (MHC-II) unterteilt (Tab.2). MHC-I Moleküle definieren körpereigene Zellen im Unterschied zu körperfremden Zellen, wohingegen über MHC-II Moleküle spezifisch das Immunsystem aktiviert wird. MHC-I Moleküle Alle kernhaltigen Zellen und Thrombozyten tragen MHC-I Moleküle an ihrer Zelloberfläche und präsentieren darüber Proteinfragmente, die im eigenen Zytosol synthetisiert wurden. Die Präsentation von fremden Peptiden auf MHC-I Molekülen macht die Zellen für CD8 + (Cluster of Differentiation 8 positive) T-Zellen angreifbar. Diese binden nach Aktivierung mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) am Protein-MHC-I Komplex. Dadurch treten Effektormechanismen zytotoxischer T-Zellen in Kraft und die gebundene Zielzelle wird lysiert. CD8 + Zellen eines Individuums können lediglich mit den MHC-I Molekül tragenden Zielzellen desselben Organismus interagieren. Dieses Phänomen nennt sich MHC-Restriktion und es wurde erstmals von Zinkernagel und Doherty beschrieben (Zinkernagel 1974). MHC-II Moleküle Auf antigenpräsentierenden Zellen (APC) sind MHC-II Moleküle vorhanden. Darüber können aufgenommene Proteinfragmente dem Immunsystem präsentiert werden und T-Helferzellen werden aktiviert. Die Präsentation von fremden Peptiden an MHC-II Molekülen von APC führt dazu, dass CD4 + Zellen spezifisch aktiviert werden. Es kommt je nach Zelltyp zur Ausschüttung einer Vielzahl von Mediatoren. Tab. 2: Darstellung von MHC-I Molekülen und MHC-II Molekülen 11

12 EINLEITUNG Professionelle antigenpräsentierende Zellen Professionelle antigenpräsentierende Zellen unterscheiden sich von anderen Immunzellen, da sie an Ihrer Oberfläche MHC-II Moleküle tragen. Sie nehmen Antigene auf und präsentieren diese auf MHC-II Molekülen. Dadurch stimulieren sie T-Effektor Zellen, wodurch eine spezifische Immunantwort initiiert wird. Zu den APC gehören dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen (Tab.3). Dendritische Zellen Dendritische Zellen können Antigene besonders effektiv präsentieren und sind die stärksten Stimulatoren der T-Zell- Interaktion. Bei starkem Antigenkontakt und der damit verbundenen erhöhten Expression von MHC-II Molekülen gehen sie in den antigenpräsentierenden Zustand über und migrieren in lymphatische Organe. Dort präsentieren sie die Antigene über MHC-II Moleküle den CD4 + Zellen, welche weitere Immuneffekte vermitteln. Makrophagen Makrophagen kommen in den meisten Geweben des Körpers und im Blut vor. Sie phagozytieren Erreger und präsentieren deren Antigene. Des Weiteren nehmen sie rezeptorvermittelt Fremdpeptide auf und schütten daraufhin Zytokine aus. Daraus resultiert eine Rekrutierung weiterer Makrophagen. Rezeptoren vermitteln zusätzlich die Expression von MHC-II Molekülen, an denen das Fremdantigen den CD4 + Zellen präsentiert wird. B-Zellen B-Zellen kommen im Blut vor und sind im Gegensatz zu den zwei erstgenannten Zellen fähig, spezifisch lösliche Moleküle zu binden. Sie tragen Immunglobulinrezeptoren, mit deren Hilfe sie sehr effektiv Antigene aufnehmen können, die sie dann an ihrer Oberfläche den CD4 + T-Zellen präsentieren. Tab.3: Darstellung antigenpräsentierender Zellen: dendritische Zellen, Makrophagen, B-Zellen 12

13 EINLEITUNG Natürliche Killerzellen Natürliche Killerzellen sind Lymphozyten und gehören zur angeborenen Immunantwort. Im Gegensatz zu T-Zellen unterliegen sie nicht der MHC-Restriktion. Dieses Phänomen wurde von Ljunggren und Kärre 1990 erstmals beschrieben und missing-self -Hypothese genannt (Ljunggren 1990). Natürliche Killerzellen verfügen über aktivierende und inhibierende Rezeptoren. Die inhibitorischen Rezeptoren interagieren mit MHC-I. Wenn kein MHC-I vorhanden ist, entfällt diese Inhibition und die Zelle kann leichter aktiviert werden. Natürliche Killerzellen finden sich bevorzugt in Gewebe, das reich an T-Zellen und APC ist wie zum Beispiel Lymphknoten und Tonsillen (Caligiuri 2008) Aktivierung des spezifischen Immunsystems Antigenpräsentierende Zellen nehmen Fremdpeptide auf, prozessieren und präsentieren diese den Zellen des spezifischen Immunsystems. T-Lymphozyten gehören zur zellulär vermittelten Immunabwehr und sind gegen intrazelluläre Erreger gerichtet. Der T-Zell-Rezeptor ist membranständig und wird im Gegensatz zu Immunglobulinen (Ig) der B-Zellen nicht sezerniert. Er kann sehr kleine Bruchstücke eines Antigens erkennen, wenn diese von antigenpräsentierenden Zellen auf MHC Molekülen präsentiert werden. Der TCR ist mit einer Vielzahl von Korezeptoren assoziiert (siehe Abb.3). Abb.3: Kostimulatorische Oberflächenmoleküle auf T-Zellen (Flint 2004) T-Lymphozyten können in weitere Untergruppen eingeteilt werden, welche in Tab.4 differenzierter dargestellt sind. 13

14 EINLEITUNG Zytotoxische T- Zytotoxische T-Lymphozyten tragen als Oberflächenmolekül CD8 und Lymphozyten werden auch T-Killerzellen genannt. Sie binden an MHC-I Molekül assoziierte Antigene. Durch CD8 wird die TCR-MHC-I Bindung verstärkt. Zytotoxische T-Lymphozyten können dadurch infizierte oder entartete körpereigene Zellen zerstören oder deren Apoptose induzieren. T-Helferzellen T-Helferzellen tragen als Zelloberflächenmolekül CD4. Sie binden über den TCR an MHC-II Molekülen von APC. Eine Besonderheit der T- Helferzellen ist, dass sie über Makrophagen und B-Zellen sowohl auf das unspezifische, als auch das spezifische Immunsystem einwirken. Man teilt über die von ihnen sezernierten Zytokine in Untergruppen ein. Th1-Zellen Th1-Zellen (T-Helferzellen Klasse 1) sezernieren besonders Interferon-γ (IFN-γ), Interleukin-12 (IL-12) und TNF-α. IL-12-vermittelt aktivieren sie Makrophagen, die wiederum ihrerseits über die Ausschüttung von IL- 12 die Th1-Zellen stimulieren, woraus eine Rekrutierung von Makrophagen resultiert. Th2-Zellen Th2-Zellen (T-Helferzellen Klasse 2) sezernieren vermehrt IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und Tumornekrosefaktor-β (TNF-β). Dort stimulieren sie besonders B-Zellen und setzen die humorale Immunantwort in Gang. Regulatorische Regulatorische T-Zellen (Treg) hemmen das Immunsystem und T-Zellen verhindern somit eine unkontrollierte Immunreaktion. Über die Ausschüttung verschiedener Zytokine kann eine weitere Unterteilung in CD4 + CD25 + Treg, Tr1-Zellen, Th3-Zellen, NKT-Zellen und CD8 + regulatorische Zellen vorgenommen werden. Tab.4: Darstellung von Untergruppen der T-Lymphozyten Immunsystem der Neugeborenen Während der Schwangerschaft ist es erforderlich, dass das mütterliche Immunsystem unterdrückt wird, da dieses sonst den sich entwickelten Fetus als allogenes Transplantat wahrnehmen und vernichten würde über eine Th-1 gesteuerte Immunreaktion. Deshalb werden während der Schwangerschaft von der Plazenta Faktoren produziert, welche eine Th- 2 gewichtete Immunantwort seitens der Mutter bewirken und somit eine Abstoßung des Feten verhindern (Morein 2007). Auch beim Feten ist die Immunantwort auf Th-2 polarisiert und es gibt wenige Th-1 Zellen und auch wenige zytotoxische T-Zellen (Morein 2002). Da der neugeborene Organismus noch keinen Kontakt zu Antigenen hatte, ist auch die 14

15 EINLEITUNG antigenspezifische T- und B-Zellantwort niedriger als im Immunsystem eines Erwachsenen. Sowohl T-Helferzellen, als auch zytotoxische T-Zellen sind in ihrer Aktivität gemindert und die Produktion von Zytokinen ist eingeschränkt. Auch die Aktivität von Monozyten, Natürlichen Killerzellen und des Komplementsystems liegt unter dem Aktivitätsniveau des Immunsystems eines Erwachsenen. Dendritische Zellen der Nabelschnur scheinen weniger effizient zu sein als dendritische Zellen eines Erwachsenen. HLA-Moleküle sind verringert exprimiert (Kovarik 1998) Immunologie des Auges Histokompatibilität und HLA-Matching des Auges Im Bereich der Kornea werden weniger Histokompatibilitätsantigene exprimiert als an anderen Regionen des Körpers. MHC-I Moleküle finden sich hauptsächlich im kornealen Epithel und in Keratozyten des Stromas. Im Endothel kann man beim Erwachsenen fast keine MHC-I tragenden Zellen finden und bei Kindern in geringer Anzahl. Die MHC-I Molekül- Konzentration nimmt von peripher nach zentral ab (Abb.4). Abb.4: Schematische Darstellung der Verteilung von MHC-I tragenden Zellen der adulten und infantilen Kornea Es wurde lange Zeit kontrovers diskutiert, ob eine Übereinstimung der Histokompatibilitätsantigene (HLA-Matching) eine Verlängerung der Zeit des Transplantatüberlebens bewirken könnte (Beekhuis et al. 1991, Batchelor et al. 1976, Fink et al. 1994). In aktuellen Studien konnte nun unter Berücksichtigung dieser Kriterien mehrfach der positive Einfluss des HLA-Matchings gezeigt werden. (Khaireddin 2003, Reinhard et al. 2003, 2004). Bei der kornealen Transplantation im Tiermodell scheint jedoch mehr als das HLA-Matching die Übereinstimmung von Minor-Histokompatibilitätsantigenen im Vordergrund zu stehen. Wenn Transplantate inkompatible Minor- 15

16 EINLEITUNG Histokompatibilitätsantigene tragen, werden sie eher abgestoßen als Transplantate, die inkompatible Major Histokompatibilitätsantigene tragen (Sonoda and Streilein 1992). Sowohl bei Niedrigrisiko-Keratoplastiken als auch bei Hochrisiko-Keratoplastiken scheinen die Minor-Histokompatibilitätsantigene im Vergleich zu MHC Molekülen eine relevantere Rolle in der Abstoßungsreaktion zu spielen. Das könnte damit im Zusammenhang stehen, dass in der Kornea durch das äußerst geringe Vorkommen von MHC Molekülen verhältnismäßig viele Minor-Histokompatibilitätsantigene vorhanden sind, die zu einer Abstoßungsreaktion führen (Sano et al. 1996) Immunzellen der Kornea Die meisten dendritischen Zellen sind in der epithelialen Kornea zu finden und nur vereinzelte im Stroma. In peripheren Bereichen der Kornea findet man beim Menschen den größten Anteil der DCs. Im kornealen Zentrum hingegen finden sich nur sehr vereinzelte (Yamagami et al. 2005). Wenn jedoch beispielsweise im Rahmen einer Infektion Interleukin- 1 ausgeschüttet wird, werden dendritische Zellen dadurch stimuliert und migrieren in die zentrale Region der Kornea (Niederkorn 1995). Makrophagen kommen vermehrt im Limbus-Stroma vor. Besonders viele Makrophagen befinden sich in allen Schichten des peripheren Stromas, sowie vereinzelt in anterioren Schichten des zentralen Stromas und im Epithel (Yamagami et al. 2005). MHC-II tragende Zellen kommen im Bereich der zentralen Kornea bei Erwachsenen kaum vor. Anders jedoch ist es bei Kindern, die auch in zentralen Bereichen der Kornea MHC-II exprimieren. Einige MHC-II tragende dendritische Zellen finden sich im Bereich des Limbus im Epithel und Stroma und in der Basalschicht konjunktivalen Epithels (Chandler 1985, Whitsett and Stulting 1984, Streilein 2003). MHC-II Moleküle können durch Interferon-γ in kornealen Endothelzellen und in kornealen Stromazellen induziert werden (Young et al. 1985). Wenn im Rahmen einer Transplantation oder einer Entzündung Interferon-γ ausgeschüttet wird, können demnach mehr antigenpräsentierende Zellen rekrutiert werden und eine Transplantatabstoßung wird beschleunigt. B-Lymphozyten kommen in der Kornea normalerweise nicht vor. Bei Entzündungen oder starker Vaskularisation können sich jedoch vereinzelt B-Zellen in der Kornea finden. CD4 + und CD8 + Zellen kommen nur in entzündeter Hornhaut vor. Dann befinden sie sich in der gut vaskularisierten limbischen Region, im oberen Stroma oder im Epithel. Im Zentrum, das insgesamt sehr arm an Immunzellen ist, finden sich selten T-Lymphozyten (Vantrappen et al. 1985). 16

17 EINLEITUNG Immunprivileg des Auges Im Auge kann eine Inflammation zu einem starken Visusverlust führen. Geringste Irritationen können eine präzise Bündelung des Lichtes und Projektion auf die Retina erschweren oder unmöglich machen. Des Weiteren sind bestimmte Zellen nicht oder kaum zur Replikation fähig, wie zum Beispiel das korneale Endothel (Matsubara and Tanishima 1983) und bestimmten Retinazellen (So and Aguayo 1985). Das Immunsystem hat sich im Laufe der Evolution so entwickelt, dass das Auge gegen Pathogene ausreichend geschützt ist und gleichzeitig eine destruierende Immunantwort vermieden wird. Diese besondere Immunität findet man nicht nur im Auge, sondern auch in anderen Organen, die eine starke Entzündung nicht gut tolerieren können, da diese zu einem starken Funktionsverlust führen kann. Hierzu gehören das Gehirn, der Uterus einer schwangeren Frau, die Ovarien, die Hoden, die Nebennierenrinde und verschiedene Tumoren (Barker and Billingham 1977) wurde das Immunprivileg des Auges von Sir Peter Medawar beschrieben. Er transplantierte allogen kutanes Gewebe in die Vorderkammer des Auges und ins Gehirn und beobachtete gegenüber einer Transplantation in subkutanes Gewebe ein verlängertes Transplantatüberleben (Medawar 1948) Immunprivileg der Kornea Die Kornea weist anatomische und zellbiologische Besonderheiten auf, die eine Abstoßungsreaktion nach perforierender Keratoplastik erschweren (Niederkorn and Mellon 1996). Durch eine Blut-Augen Schranke, die an fast allen Gefäßen des Auges besteht, können immunkompetente Zellen erschwert zum Ort ihrer Wirkung gelangen. Medawar erkannte, dass die fehlende Drainierung einiger Teile des Auges mit Lymphgefäßen den Kontakt von Immunzellen mit okulären Antigenen erschwert. Die Vorderkammer, der Glaskörper und der subretinale Raum sind nicht an das Lymphsystem angeschlossen, während die Konjunktiva, die Skleren und die Aderhaut mit Lymphgefäßen versorgt sind. Antigene werden somit überwiegend über das Trabekelwerk und den Schlemmschen Kanal ins venöse Blutsystem geleitet und von dort aus zur Milz transportiert, ohne dass in Lymphknoten eine erste Antigenpräsentation stattfinden kann (Cursiefen et al. 2003). In der Kornea gibt es deutlich weniger professionelle antigenpräsentierende Zellen als in anderen Körperregionen. Die Kornea weist besonders im zentralen Anteil MHC-I positive Zellen nur in geringer Anzahl auf und ist beinahe frei von Zellen, die MHC-II Moleküle exprimieren wie Langerhanszellen und Makrophagen (Dana 2004). Fas-Liganden (CD95L) werden auf Parenchymzellen der Kornea exprimiert. Sie interagieren mit Fas-Rezeptoren der 17

18 EINLEITUNG aktivierten T-Zellen und lösen so deren Apoptose aus. Durch die daraus resultierende Reduktion von T-Zellen kann somit eine Immunreaktion abgeschwächt werden (Stuart et al. 1997). Okuläre Zellen tragen Oberflächenproteine, welche eine Aktivierung des Komplementsystems und eine daraus resultierende Zelllyse verhindern (Bora et al. 1993). Das Kammerwasser enthält gelöste Faktoren wie beispielsweise TGF-β2, die hemmend auf die Proliferation von Makrophagen und Lymphozyten wirken und die Aktivierung des Komplementsystems verringern. Des Weiteren hemmen Neuropeptide die Funktion von T- Lymphozyten und Makrophagen (Streilein et al. 2000) Anterior Chamber Associated Immune Deviation (ACAID) Antigene können entgegen ursprünglicher Annahmen über Kammerwasser oder Blut aus dem immunprivilegierten Milieu des Auges austreten und mit T-Zellen in der Milz interagieren. Hierbei wird jedoch eine aberrante Immunreaktion induziert (Streilein et al. 1980). Wenn Antigene in die Vorderkammer oder die Hornhaut gelangen, werden diese von professionellen antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen (Stein-Streilein and Streilein 2002). Daraufhin verlassen die APC die Vorderkammer über das Trabekelwerk und gelangen über das Blutsystem in die Milz. Dort aktivieren sie regulatorische T-Zellen, die ihrerseits T- Helferzellen und zytotoxische T-Zellen hemmen. Somit wird eine immunologische Abstoßungsreaktion über T-Zellen unterdrückt (Yao et al. 1997, Wilbanks and Streilein 1990) Transplantationsimmunologie Es gibt vier verschiedene Möglichkeiten, Gewebe zu transplantieren: autolog, syngen, allogen und xenogen. Bei der autologen Transplantation wird Gewebe innerhalb eines Organismus verpflanzt. Wenn Spender und Empfänger genetisch identische Organismen sind, wie zum Beispiel bei eineiigen Zwillingen, bezeichnet man die Transplantation als syngen. Eine allogene Transplantation ist die Verpflanzung von Gewebe zwischen genetisch unterschiedlichen Organismen. Die letzte Form ist die xenogene Transplantation zwischen Individuen, die unterschiedlichen Spezies angehören. Die autolog und syngen transplantierten Gewebe werden vom Organismus gut toleriert. Allogen oder xenogen transplantiertes Gewebe können eine Abstoßungsreaktion auslösen. Zur Abstoßung tragen die Blutgruppen-Antigene, der Rhesus-Faktor und die MHC Moleküle bei. Bei der Transplantation von Organen, die nicht immunprivilegiert sind, wie das Herz oder die Niere, kommt es nach Einbringung des Transplantates zur Aktivierung von APC, die 18

19 EINLEITUNG ihrerseits T-Zellen aktivieren. Eine immunologische Reaktion auf das Transplantat folgt weitgehend über die Interaktion zytotoxischer T-Zellen mit MHC-I Molekülen. In der Kornea hingegen spielen hauptsächlich T-Helferzellen eine tragende Rolle bei der Transplantatabstoßung (siehe Kap ) Abstoßungsreaktion nach perforierender Keratoplastik im Erwachsenenalter Die Abstoßungsreaktion nach Keratoplastik unterscheidet sich deutlich von Transplantationen anderer solider Organe. Ein Transplantatüberleben von >90% nach einem Jahr ist hier nicht ungewöhnlich (Williams 2007). Die Abstoßungsreaktion nach Keratoplastik erfolgt in zwei eng miteinander verknüpften, aufeinander folgenden Phasen, der afferenten Phase und der efferenten Phase. Die afferente Phase schließt sich direkt an die Transplantation an. Antigenpräsentierende Zellen werden durch fremde MHC-I Moleküle des transplantierten Gewebes stimuliert. Die APC nehmen daraufhin Antigene auf und prozessieren diese. In der efferenten Phase präsentieren die APC über MHC-II Moleküle körperfremde Antigene an CD4 + und CD8 + T- Zellen, die eine immunologische Reaktion verstärken (Panda et al. 2007). Hierbei spielen im Gegensatz zu anderen Transplantationen besonders die CD4 + Zellen eine bedeutende Rolle (Yamada 1999, 2001) Abstoßungsreaktion nach perforierender Keratoplastik im Säuglings - und Kindesalter Wie bereits beschrieben (Kap ) unterscheidet sich das adulte Immunsystem von dem sich in Entwicklung befindenden Immunsystem des Neugeborenen. Die Abstoßungsreaktion nach Keratoplastik bei infantilen Ratten verläuft schneller als in adulten Tieren (Schwartzkopff 2009). Hierbei ist besonders die Rolle der natürlichen Killerzellen hervorzuheben. Diese stellen eine wichtige Komponente der immunologischen Abstoßungsreaktion dar, indem sie Endothelzellen und Keratozyten angreifen (Opremcak et al. 1989). Im Rattenmodell konnte nach Keratoplastik im infantilen kornealen Stroma eine deutlich höhere Konzentration an NK-Zellen nachgewiesen werden als im adulten. Demnach scheinen bei der Keratoplastik in adulten Ratten an der Abstoßungsreaktion hauptsächlich T- Zellen beteiligt zu sein und in infantilen Ratten NK-Zellen (Mayer et al. 2003). In Versuchen unserer Arbeitsgruppe zeigte sich, dass eine Depletion der NK-Zellen ein verlängertes Transplantatüberleben begünstigt. 19

20 EINLEITUNG 1.4 Fragestellung Vor etwa 100 Jahren wurde die erste erfolgreiche Keratoplastik am Menschen durch Eduard Konrad Zirm durchgeführt (Zirm 1906). Heute wird die Anzahl der jährlich durchgeführten Keratoplastiken weltweit auf Eingriffe geschätzt, von denen mindestens in Amerika, in Europa, in Indien und in Australien durchgeführt werden (Williams 2007). Damit ist die Hornhaut das weltweit am häufigsten transplantierte Gewebe. Die Keratoplastik hat deutlich bessere Transplantatüberlebenszeiten als gut vaskularisierte Organe. Jedoch gibt es zahlreiche Faktoren, die das Transplantatüberleben nach Keratoplastik beeinflussen. In unserer Abteilung wurde bereits gezeigt, dass das Alter des Empfängers bei der Keratoplastik einen Einfluss auf das Transplantatabstoßungsverhalten hat. Infantile Ratten stoßen nach Keratoplastik früher (Tag 9 post operationem) ab als adulte Ratten (Tag 15 post operationem), wenn sie jeweils Transplantate von adulten Tieren erhalten (Schwartzkopff 2009). Ziel dieser Arbeit war nun die Untersuchung des Einflusses des Spenderalters auf das Transplantatüberleben nach Keratoplastik in adulten und infantilen Ratten. 20

21 MATERIAL UND METHODEN 2 MATERIAL UND METHODEN Die vorliegende Arbeit entstand in der Universitäts-Augenklinik Freiburg im Breisgau unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. T. Reinhard. Das Projekt wurde von Herrn Dr. Johannes Schwartzkopff betreut, der auch den operativen Teil der Arbeit leitete und überwachte. Für den tierexperimentellen Anteil der Arbeit wurde der entsprechende Antrag vom Regierungspräsidium Freiburg unter der Registrierungsnummer G05/30 genehmigt. Die Versuche wurden gemäß den Richtlinien des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt. 2.1 Versuchsgruppen Es wurden weibliche Ratten der Stämme Fisher (Rtl-l vl ) und Lewis (Rtl-l le ) verwendet. Diese beiden Stämme sind in Bezug auf ihre Histokompatibilitätseigenschaften genau definiert und unterscheiden sich in ihren Nebenhistokompatibilitätsantigenen. Die adulten Ratten waren zum Zeitpunkt der Operation 10 Wochen alt und wogen g. Die Jungtiere waren 3 Wochen alt und wogen g. Gruppe Spender Empfänger Verwendung Anzahl transplantierter Tiere 1 Fisher (i) Lewis (a) Histologie Tag Fisher (i) Lewis (a) Beobachtung bis zur Abstoßung 10 3 Fisher (i) Lewis (i) Histologie Tag Fisher (i) Lewis (i) Beobachtung bis zur Abstoßung 8 5 Lewis (i) Lewis (i) syngen Histologie Tag Lewis (i) Lewis (a) syngen Histologie Tag 15 3 A Fisher (a) Lewis (a) Histologie Tag 15 6 B Fisher (a) Lewis (i) Histologie Tag 9 6 C Fisher (a) Lewis (a) Beobachtung bis zur Abstoßung 6 D Fisher (a) Lewis (i) Beobachtung bis zur Abstoßung 6 E Lewis (a) Lewis (i) syngen Histologie Tag 9 3 F Lewis (a) Lewis (a) syngen Histologie Tag 15 3 Tab.5: Darstellung der Versuchsgruppen 1-6 und A-F; die Abkürzung (a) steht für adult, die Abkürzung (i) für infantil ; als Spender dienten in Gruppe 1-6 jeweils 3 Wochen alte Ratten: Fisher (i) oder Lewis (i) und in den Gruppen A-F jeweils 10 Wochen alte Ratten: Fisher (a) oder Lewis (a); als Empfänger dienten entweder 3 Wochen alte Lewis-Ratten: Lewis (i) oder 10 Wochen alte Lewis-Ratten: Lewis (a); bei den Versuchsgruppen wurde eine histologische Untersuchung an Tag 9 / 15 durchgeführt oder bis zum Tag der Abstoßung beobachtet 21

22 MATERIAL UND METHODEN In allen Gruppen dienten Fisher-Ratten als Spender und Lewis-Ratten als Empfänger. Eine Ausnahme bildeten die syngenen Kontrollgruppen. Hierbei erhielten Lewis-Ratten Korneae von Lewis-Ratten. Versuchsgruppen Um gebildet, die die Fragestellung zur zu bearbeiten, Verlaufsbeobachtung, der wurden verschiedene immunhistologischen Untersuchungen und der Kontrolle dienten (siehe Tab.5). In den Gruppen 1-6 wurden jeweils infantile Spendertiere verwendet (Fisher (i) für allogene Transplantationen, Lewis (i) für syngene Transplantationen). In Versuchen unserer Arbeitsgruppe wurden für die Gruppen AF jeweils adulte Spendertiere (Fisher (a) für allogene Transplantationen, Lewis (a) für syngene Transplantationen) verwendet, auf welche ich in dieser Arbeit Bezug nehme. 2.2 Hornhauttransplantation Operationsvorbereitung und Narkoseeinleitung Um die Iris vor Synechien und Verletzungen zu schützen, wurden die Tiere vor dem Eingriff mit Tropicamid und Phenylephrin Augentropfen alle 10 Minuten vorbehandelt. Dann wurde das Tier mit Hilfe von Isofluran volatil eingeleitet. Die Narkose wurde mit 60 mg/kg Ketamin, 4 mg/kg Xylazin und 0,2 mg/kg Atropin vertieft und supplementiert a Transplantation c b Abb.5: Dargestellt ist der Operationssitus bei einer Keratoplastik a) Injektion von Hyaluronsäure nach Trepanation in die Vorderkammer des Auges eines Spendertiers b) Ausschneiden des Transplantates mit einer Rundschere c) Transplantat wurde mit 8 Einzelknüpfnähten im Auge des Empfängers befestigt Die Ratte wurde auf eine Operationsvorrichtung unter das Operationsmikroskop gelegt. Mit einem 2,5 mm Trepan wurde die Hornhaut zur Markierung mittig antrepaniert, jedoch nicht perforiert. Mit einer Nadel (G27) wurde nun die Vorderkammer eröffnet und der Zugang mit einer Hornhautschere vergrößert. Nun wurde Hyaluronsäure in die Vorderkammer gespritzt, sodass sich die Vorderkammer aufrichtete und das Transplantat sicher mit einer Rundschere herausgeschnitten werden konnte (siehe Abb.5). Mit einer Rundschere wurde nun das Transplantat zunächst 180 ausgeschnitten. Vor dem vollständigen Herauslösen des 22

23 MATERIAL UND METHODEN Transplantates wurde eine erste Naht vorgelegt, mit der die Hornhaut später auf der Kornea der Empfänger-Ratte adaptiert wurde. Dann wurde das Transplantat fertig ausgeschnitten und in Medium eingelegt. Ebenso wurde mit dem kontralateralen Auge verfahren. Danach wurde das Tier durch CO 2 - Inhalation euthanasiert. Das Empfängertier wurde identisch wie das Spendertier vorbereitet und narkotisiert. Die zentrale Hornhaut des Empfängertieres wurde mit einem 2,0 mm Trepan antrepaniert und das Transplantat wurde wie oben beschrieben entnommen. Dann wurde die Spenderhornhaut aufgelegt und mit 8 Einzelknüpfnähten befestigt. Um einen Druckanstieg im Auge zu verhindern wurde das Hyaluronat mit 2 ml NaCl 0,9% ausgespült und dann die Vorderkammer durch Einspritzen von Luft gestellt. Hierbei konnte auch die Dichtigkeit des Transplantats festgestellt werden und gegebenenfalls eine weitere Einzelknüpfnaht gesetzt werden. Zuletzt wurde auf das Auge Floxacin- Augensalbe aufgetragen. Das Auge wurde durch eine Einzelknüpfnaht mit einem nicht resorbierbaren Nylon 8,0 Faden verschlossen (Blepharorrhaphie). Des Weiteren wurde Bepanthen Augensalbe auf das vernähte Auge aufgetragen. Die unilaterale Blepharorrhaphie wurde zum Schutz des Auges für drei Tage belassen Klinische Beurteilung des Transplantats Nach drei Tagen wurde die Blepharorrhaphie entfernt. Das Auge wurde gesäubert und durch 2 Personen klinisch beurteilt. Die erhobenen Daten wurden in einem standardisierten Protokoll dokumentiert. Die Transplantatabstoßung wurde anhand der Parameter Opazität, Ödemformation und Vaskularisation alle drei Tage evaluiert und nach einem standardisierten Punkte-System quantifiziert, das in Tab.6 näher dargestellt ist. Score Opazität Ödem Vaskularisation 0 keine Trübung kein Ödem keine Gefäße 1 Iris-Details klar sichtbar Transplantat (TP) leicht erhaben Gefäße erreichen das TP nicht 2 einige Details der Iris nicht sichtbar TP deutlich erhaben Gefäße erreichen das TP peripher 3 Pupille erkennbar, keine Irisstruktur TP massiv erhaben Gefäße kreuzen das Zentrum des TP 4 vollständige Eintrübung Tab.6: Score zur Evaluation der Transplantatabstoßung. Evaluiert wurde die Opazität (Score 1-4), das Ödem (Score 1-3) und die Vaskularisation (Score 1-3) 23

24 MATERIAL UND METHODEN Kriterien für das Versuchsende: Eine Opazitätsstufe von 4 wurde als Abstoßung definiert und bedeutete das Versuchsende für Tiere der Gruppen 2 und 4 (Abb.6). Für alle anderen bildete entweder der 9. oder der 15. postoperative Tag den Tag des Versuchsendes und der Enukleation mit nachfolgender histologischer Untersuchung (siehe Tab.5, Kap. 2.1). Die Tage wurden so gewählt, da in Versuchen unserer Arbeitsgruppe festgestellt wurde, dass dies die durchschnittlichen Abstoßungstage infantiler beziehungsweise adulter Tiere unter Verwendung von Transplantaten adulter Spender sind (Schwartzkopff 2009). Die Bulbi wurden unter Erhaltung des Sehnervs und Entfernung von periokulärem Bindegewebe entnommen. Der Sehnerv wurde mit einem Faden versehen, damit das Auge im Mikrotom exakter ausgerichtet werden konnte. Neben den Augen wurde auch die Milz entnommen und als histologische Kontrolle verwendet. Für die Gefrierschnitt-Histologie wurden die Organe in -70 C kaltem Pentan gefroren, um die Kristallbildung zu vermeiden, die innerhalb der Zellen bei langsamem Einfrieren eintreten würde. Die Bulbi wurden bis zur weiteren Verarbeitung in einem Gefrierschrank bei -80 C aufbewahrt. Abb.6: a) Kornea nach syngener Transplantation an Tag 15 post operationem b) Kornea nach allogener Transplantation eines infantilen Transplantates in die Kornea eines adulten Tieres an Tag 18 post operationem 2.3 Immunhistochemie Anfertigung der Kryoschnitte Die im Gefrierschrank für 3 Tage bei -80 C gelagerten Augen wurden in Tissue-Tec eingebettet und auf einem Gewebehalter fixiert. Bei -25 C wurden die Bulbi im Gefriermikrotom in einer Schichtdicke von 5µm geschnitten und auf silanisierte Objektträger aufgenommen und 12 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Daraufhin wurden sie für 5 Minuten in -20 C kaltem Aceton fixiert, anschließend 5 Stunden luftgetrocknet und bei -20 C bis zur Färbung gelagert. 24

25 MATERIAL UND METHODEN Immunhistochemische Färbung Es wurden 1 ml Rinderblutserum in eine Glasküvette gegeben und 9 ml 1 M Tris-Puffer (ph 7,6) hinzugefügt. Diese Lösung wurde auf einem Vortex-Gerät gemischt und bei den verschiedenen Antikörpern als Verdünnungsmittel verwendet. Als Spüllösung wurde Rinderserum zu 1 Vol.% gelöst in Tris-Puffer verwendet. Die Schnitte wurden über Nacht luftgetrocknet und dann mit einem Fettstift umrandet. Die getrockneten Schnitte wurden in eine Glasküvette gestellt und dann mit 50 mm Tris-Puffer (ph 7,6) und 10 % Rinderserum für 30 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden mit dem ersten Antikörper benetzt, dessen optimale Konzentration in Vorversuchen ermittelt wurde (siehe Tab.7). Antikörper Konzentration Zielstruktur CD 4 1 : 200 T-Helferzellen CD 8 1 : 200 T-Killerzellen CD : 150 Natürliche Killerzellen CD : 30 Makrophagen Ox-62 1 : 100 Dendritische Zellen CD 25 1 : 100 IL-2-Rezeptor α Sekundärantikörper 1 : 300 Primärantikörper Streptavidin AP-Komplex 1 : 200 Sekundärantikörper Tab.7: Optimale Konzentration der Antikörper und Enzyme unter Angabe der jeweiligen Zielstruktur zur Durchführung immunhistochemischer Färbungen Die Antikörper wurden in einem Eppendorf-Gefäß mit dem Gemisch aus Rinderserum und Tris-Puffer verdünnt. Dann wurden 100 µl auf jede Probe gegeben und für 60 Minuten inkubiert, um unspezifische Bindungen zu inhibieren. Daraufhin wurden die Schnitte 5 Minuten abgespült. Die Antikörper wurden mit dem Gemisch aus Rinderserum und Tris- Puffer verdünnt. Dann wurden 100 µl davon auf jede Probe gegeben und für 60 Minuten inkubiert. Darauf folgte ein fünfminütiges Spülen mit der oben beschriebenen Spüllösung. Der zweite Antikörper wurde entsprechend der Tab.7 angesetzt. Auf jede Probe wurden 100 µl des Ansatzes gegeben und die Proben für 45 Minuten inkubiert. Es folgte eine weitere Spülung. Der Streptavidin - Alkalische Phosphatase Komplex wurde verdünnt und je 100 µl auf jede Probe gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten wurden die Schnitte erneut gespült. Nun wurde das Substrat Vector Red Kit auf die Proben gegeben. Hierzu gab man in eine Plastikküvette 5 ml einer Tris-Lösung (ph 8,4) um dann jeweils 2 Tropfen der Reagenzien des Vektor Red Kits hinzuzufügen. Nach jeder Zugabe von 2 Tropfen wurde die 25

26 MATERIAL UND METHODEN Lösung gemischt. Nach 20 minütiger Inkubation wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser abgespült. Die Proben wurden automatisiert mit Hämatoxylin-Eosin gegen gefärbt und eingedeckt Positivkontrolle Als Positivkontrolle wurden Rattenmilzen verwendet und auf gleiche Art und Weise wie die Augen parallel mitbehandelt. Durch die charakteristische Anordnung der Immunzellen in den Milzstrukturen konnte sichergestellt werden, dass die verwendeten Antikörper an die für sie vorgesehenen Zellen banden. CD163+ Zellen banden besonders an Zellen in der roten Pulpa (siehe Abb.7), wobei CD4+ Zellen besonders in der weißen Pulpa detektiert wurden. + Abb.7: Immunhistochemische Färbung der Milz; rot angefärbt sind CD163 Zellen; zu sehen ist die charakteristische Anordnung der Zellen in der roten Pulpa Histologische Beurteilung Die gefärbten Schnitte wurden unter dem Mikroskop mit einer speziellen Digitalkamera in unterschiedlichen Vergrößerungen fotografiert und auf einen Computer übertragen. Als Fotosoftware zur Auszählung der zu untersuchenden angefärbten Zellen wurde AnalySIS 3.2 verwendet. Die Auszählung erfolgte bei 10facher Vergrößerung. Auf einem geeigneten Foto wurde das zentrale Hornhautstroma aufgesucht und drei virtuelle Zählquadrate von jeweils 0,01 mm2 = 10 µm2 aufgelegt. Die immunhistologisch markierten Zellen wurden von zwei Untersuchern ausgezählt. 26

27 MATERIAL UND METHODEN Statistische Auswertung Zur graphischen Darstellung der klinischen Ergebnisse der Verlaufskontrolle wurde Igor Pro 5 angewandt Mit der Statistiksoftware SPSS 11.5 wurden die Boxplot - Darstellungen der Zellinfiltrationen an den Tagen 9 und 15 dargestellt. Die Zeit bis zur Abstoßung wurde nach der Methode von Kaplan und Meier berechnet. Das Transplantatüberleben der unterschiedlichen Behandlungsgruppen konnte so dargestellt und verglichen werden. Die statistische Signifikanz wurde mittels Log-rank-Technik überprüft. Als statistisch signifikanter Unterschied galt ein p-wert von p < 0,05. Die Ergebnisse der klinischen Beurteilung bezüglich der Parameter Opazität, Ödem und Vaskularisation wurden in gefitteten Sinusdiagrammen graphisch dargestellt. Die Zellinfiltrationen der postoperativen Tage 9 und 15 wurden in Liniendiagrammen veranschaulicht. Die Daten wurden in eine Tabellenverarbeitungssoftware übertragen und Mittelwerte bzw. Mediane gebildet sowie der Statistische Fehler (SEM) ausgerechnet. 27

28 ERGEBNISSE 3 ERGEBNISSE 3.1 Klinische Begutachtung der Transplantatüberlebenszeit Für alle Gruppen wurde die mittlere Transplantatüberlebenszeit berechnet. Als Zeitpunkt der Abstoßung wurde der Tag definiert, an dem das Transplantat im Scoring-System für den Parameter Opazität den Wert 4 erreicht hatte, was einer vollständigen Eintrübung entsprach. Tiere, die ein syngenes Transplantat erhalten hatten, stießen innerhalb des Beobachtungszeitraums nicht ab. Adulte Tiere, die ein Hornhauttransplantat von einem infantilen Spender erhielten (Gruppe 2), stießen im Mittel an Tag 18 ab. Eine Abstoßung wurde hier bei allen Tieren der Gruppe 2 bis spätestens zum Tag 24 beobachtet. Infantile Tiere, die ein Hornhauttransplantat von einem infantilen Spender erhielten (Gruppe 4) erreichten im Bebachtungszeitraum keine Abstoßung (siehe Abb.8). Somit zeigte Gruppe 4 gegenüber Gruppe 2 ein statistisch hoch signifikant verlängertes Transplantatüberleben (p<0,001). Abb.8: Kaplan Meier Kurve zur Darstellung des prozentualen Transplantatüberlebens; Gruppe 4: infantiler Spender und infantiler Empfänger (i auf i) und Gruppe 2: infantiler Spender und adulter Empfänger (i auf a); T=Tage nach Transplantation; n=fallzahl 28

29 ERGEBNISSE Wie im Abschnitt 2.1 beschrieben, wurde in Versuchen meiner Arbeitsgruppe das Transplatatüberleben für eine Keratoplastik mit adultem Spender und adultem Empfänger (C) und adultem Spender und infantilem Empfänger (D) mit entsprechenden syngenen Kontrollgruppen (E und F) untersucht. Abb.9: Kaplan Meier Kurve zur Darstellung des prozentualen Transplantatüberlebens; Gruppe 2: infantiler Spender und adulter Empfänger (i auf a), Gruppe C: adulter Spender und adulter Empfänger (a auf a), Gruppe 4: infantiler Spender und infantiler Empfänger (i auf i), Gruppe D: adulter Spender und infantiler Empfänger (a auf i); Vergleich Gruppe 2 und Gruppe C: p=0,020, Vergleich Gruppe 4 und Gruppe D: p<0,001; T=Tage nach Transplantation; n=fallzahl Im Vergleich der Gruppe C (Abstoßung durchschnittlich an Tag 15) mit der Gruppe 2 (Abstoßung durchschnittlich an Tag 18) konnte durch Herabsetzen des Spenderalters ein statistisch signifikant verlängertes Transplantatüberleben festgestellt werden (p=0,020). In jungen Empfängertieren wurde eine Abstoßung durch Herabsetzen des Empfängeralters verhindert (p<0,001) (siehe Abb.9). 29