Unklare Leukozytosen bei Erwachsenen und Kindern Diagnostische Abklärung: Leukämie oder Epiphänomen
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1 Unklare Leukozytosen bei Erwachsenen und Kindern Diagnostische Abklärung: Leukämie oder Epiphänomen Urs Wehrli: Kunst aufräumen
2 Persistierende Leukozytose Klinische Fragestellung: Persistierende Leukozytose? 1. Schritt: Pappenheim-Ausstrich peripheres Blut Mikroskopie/Differentialblutbild: vermehrt Lymphozyten vermehrt Granulozyten vermehrt Monozyten vermehrt Eosinophile vermehrt Basophile
3 Lymphozytose Labor: FACS Mikroskopie B- oder T-Zellen vermehrt atypische Antigenkonstellation atypische Zellen Klinik Lymphknotenvergrößerung? Milzvergrößerung?
4 B-CLL
5 B-CLL: FACS
6 Persistierende Lymphozytose Immunphänotypisierung: CD5+, CD10+, CD19+, CD20+, CD22+, CD23+, CD38+, µ, k, l < 5000 Lymphozyten/µl MBL MBL > 5000 Lymphozyten/µl B-CLL CLL Risikofaktoren: 17p- (3-5%) umfassender: TP53 mut (5-10%) 11q22-q23 (10%) ATM mut (15%) ( bp (!!) schwer zu untersuchen) NOTCH1 mut (10%) SF3B1 mut (5%) Fehlende somatische Hypermutation
7 Knochenmark Pathogenese der B-CLL Keimzentrum Follikelmantel folliculäre dendritische Zelle Centrocyt Immunoblast T-Helfer Zelle Centroblast Memory - Zelle Naive B-Zelle
8 B-CLL Survival bezogen auf VH-Mutation Status - Bis zu 30% der Patienten haben stereotype Immunglobulin-Gene BCR/Antigen Interaktion treibt Überleben und/oder Proliferation der CLL-Zellen Das fragliche Antigen ist wahrscheinlich ein Autoantigen
9 Risikofaktoren CLL TP53 mut* ATM mut* NOTCH1 mut SF3B1 mut BIRC3 mut Diagnose 5-10% 10-25% 10% 5% 0,1% therapiepflichtig 10% 10-25% 10-15% 15%? chemorefraktär 40-50% 20-35% 15-20% 15% 25% Richter Syndrom 50-60% 10% 30-40% 5% 0% Foa et al. Haematologica 2013, adapted * Sowohl Deletionen (17p bzw. 11q) als auch Punktmutationen
10 IGHV-U und IGHV-M Stilgenbauer et al., Blood 2014
11 Notch1 Funktion Jagged Notch1 Abbau des intrazellulären Notch1 durchs Proteasom Abspaltung der intrazellulären Notch1 Domäne Mutationen in Notch1 verhindern dessen Degradation durch das Proteasom NFkB Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB Es kommt zur Akkumulation von aktiviertem Notch1 und damit zur konstitutiven Zellproliferation Proliferation
12 Prognostisch relevante Mutationen: NOTCH1 Rossi et al., Blood 2012
13 Persistierende Granulozytose 1. Schritt: Entzündliche/reaktive Erkrankung ausschließen 2. Schritt: Medikamenten-Reaktion ausschließen (z.b. Corticoide) 3. Schritt: Hämatologische Neoplasie CMPN?
14 Granulozytose Mikroskop: 1. Linksverschiebung, Atypien 2. Monozyten auch vermehrt wenn ja: evtl. FACS CD56-Expression 3. Basophile vermehrt (> 200/µl) bcr-abl PCR Zytogenetik nicht (mehr) nötig wenn bcr-abl negativ: SRSF2, TET2 V.a. acml, CNL, CMMl Jak2: auch bei moderater Thrombozytose 4. bei Atypien: SRSF2, CSF3R, TET2
15 BCR-ABL Translokation (CML) Bruchpunkte BCR Nachweis: FISH Exon1 Exon13 Exon BCR Chromosom 22 Exon1 3 mögliche Fusionen Exon13 Exon14 ABL Chromosom 9 Nachweis: PCR Abl WT e1 e13 e14
16 SRSF2 Ex1 Ex2 3 UTR 2 Exons. HotSpot Mutation ( ) in Exon 1 (Pro95). Selten auch Insertionen, Deletionen oder Duplikationen in Exon 1 Wildtyp for p.pro95leu for C T Mutationen an Position P95 Wildtyp CCC p.pro95leu CTC p.pro95his CAC p.pro95arg CGC p.pro95ser TCC p.pro95thr ACC p.pro95ala GCC häufig selten
17 TET2 Gen Funktion Mutationshäufigkeit [%] Prognose TET2 epigenetische DNA- Modifikation CMML: acml: 40 CNL: 21 ET: PMF: PV: Bedeutung als prognostischer Marker ist kontrovers diskutiert Ex3 Ex4 Ex5 Ex6 Ex7 Ex8 Ex9 Ex10 Ex11 3 UTR 11 Exons (insgesamt ~ 6000 bp) Inaktivierende Mutationen in neun Exons (3-11) NGS
18 Granulozytose (+/- Thrombozythämie) ähnliches Vorgehen: Jak2 und bcr-abl (PCR) wenn negativ, aber persistierende Granulozytose nicht aufgeben! evtl. erneut Morphologie, dann: SRSF2, TET2, CSF3R
19 Persistierende Thrombozythämie (> /µl) 1. Schritt: Differentialblutbild: besteht Basophilie? besteht Monozytose? 2. Schritt: Klinik: Splenomegalie? Juckreiz? Berührungsüberempfindlichkeit, Kleidung? Duschen? Erytheme? Rezidivierende Thrombembolien in der Anamnese?
20 Persistierende Thrombozythämie (> /µl) 3. Schritt: Molekulargenetik: Jak2 (ca. 50 %) CALR (ca. 40 %) MPL (ca. 5 %) [TET2 (ca. 2 %)] Merke: Fast alle Thrombozythämien sind molekular zu charakterisieren!
21 Thrombozythämie ET: PMF: Jak2, CALR, MPL Jak2, CALR, MPL PV: Jak2 Exon 14, evtl. Exon 12 CML: CMML: acml: bcr-abl SRSF2, TET2, FACS (CD56) SRSF2, TET2, CSF3R
22 Persistierende Thrombozythämie 1. JAK2 PV ET PMF RARS-T CMML-T 2. CALR ET PMF 3. MPL ET PMF 4. BCR-ABL CML 5. TET2 PV ET PMF RARS-T CMML-T
23 Polyglobulie Bei Männern Bei Frauen (unter 50 J) Hb > 18 g/l Hb > 15 g/l Bei Frauen (über 50 J - Menopause) Hb > 16 g/l Bitte angeben, ob Aderlass vorgenommen wurde! Jak2 (Exon 14, Mutation V617F) wenn negativ: Exon 12 sequenzieren (Hb meist über 18 g/l!) wenn beides negativ: Hereditäre Polyglobulie? evtl. EPO-R sequenzieren!
24 Monozytose (> 1.000/µl) Klinik: Besteht eine Splenomegalie? Ultraschall! Hautinfiltrate (rötlich livide, teils erhaben, können jahrelang bestehen!) Mikroskop: Monozytenvermehrung? Atypien der Granulozyten Thrombozythämie? FACS: atypische CD56 Expression auf Monozyten? Antigenverluste für CD11c oder CD14 Molekulargenetik: SRSF2 ca. 40 % TET2 ca % ca. 10 % - momentan nicht diagnostizierbar, molekulargenetisches Substrat unbekannt!
25 Monozytose (evtl. mit Splenomegalie) Immunphänotypisierung Monozyten CD SRSF2, TET2 CMML Immunphänotypisierung Lymphatische Zellen CD11c+, CD25-, CD BRAF V600E negativ Haarzell-Leukämie Variante
26 Persistierende Eosinophilie 1. Ausschluss Parasitose (Exposition?) 2. Ausschluss allergischer/hypergischer Syndrome: Churg Strauss hyper IgE Syndrom IL-5 Hyprämie 3. Ausschluss maligner hämatologischer Neoplasie mit sekundärer Eosinophilie häufig M. Hodgkin T-Zell-Lymphom systemische Mastozytose Langerhanszell-Histiozytose TCR Kit 816V BRAF V600E
27 Persistierende Eosinophilie seltener CML bcr-abl CMML TET2, SRSF2 acml SRSF2, TET2 AML M4eo t16;16 ; inv.16 noch seltener bei PV, ET, PMF 4. Molekulare Diagnostik zum Nachweis PDGFRA PDGFRB FGFR1
28 Persistierende Eosinophilie Klinik: Hautinfiltrate? Splenomegalie? Knochenherde? Dermographismus? Hepatomegalie? LK-Vergrößerungen? Anamnese: Exposition? Besserung in der Klinik? Bei Knocheninfiltration in der Bildgebung: möglichst Herd punktieren! (Trepanat) Peripheres Blut: meist nicht weiterführend KM-Punktion: Mastzellen vermehrt? Mastzellen in Herden, evtl. degranuliert? Langerhanszell-Granulome? Links verschobene Eosinophilie mit Atypien? Reifungsarchitektur gestört?
29 Persistierende Eosinophilie Molekulargenetik bei Herden atypischer Mastzellen: Kit Mutation D816V bei dominanter eosinophilen Ausschwemmungen und/oder Atypien der Eos PDGFRA/B-Mutationen FIP1L1 - PDGFRA ETV6 - PDGFRB ZNF198 - FGFR1
30 Leukozytose bei Kindern Vermehrung von Lymphozyten: virale Genese Cave: Vermehrung von kleinen Lymphoblasten : V.a. ALL; unbedingt Immunphänotypisierung!
31 Leukozytose bei Kindern Granulozytose : wahrscheinlich reaktiv persistierend : bcr/abl juvenile CML Monozytose : Immunphänotypisierung : persistierend : wahrscheinlich reaktiv Monos CD56 + juvenile CMML Eosinophilie : persistierend : wahrscheinlich reaktiv Parasiten, Milben!; IgE-Spiegel juvenile Mastozytose Langerhans-Histiozytose Morbus Hodgkin
32 Leukozytose bei Kindern Leitsymptom : Monozytose, Leukozytose Thrombozytopenie, Splenomegalie (+/-) KM-Aspirat, BKT < 20 % Blasten kein Nachweis von t (9;22) Nachweis von t (9;22) > 20 % Blasten juvenile CML V.a. Akute Leukämie Monosomie 7 jcmml assoziierte Mutationen Immunphänotypisierung juvenile CMML somatische RAS-Mut. somatische PTPN11 CBL-Mutation NF1-Mutation Genotypisierung AML juvenile CMML juvenile CMML
33 Fallbericht 1: Geschlecht: weiblich Alter: 72 Material: peripheres Blut Klinische Angabe: seit Jahren Anämie, Thrombozytose Hb 6,6 g/dl HK 35,5 % MCV 103,8 fl MCH 28,1 MCHC 27,0 Thrombo /µl Leukos 8000/µl keine Blasten Klinische Frage: 5q- Syndrom Im KM-Ausstrich Megakaryozyten vermehrt, hypolobuliert
34 Fallbericht 1: Zytogenetisch: unauffälliger Karyotyp, kein 5q- KM-Morphologie: viele Ringsideroblasten (> 30 %) viele (auch kleine) hypolobulierte Megakaryozyten dysplastische Erythrozytopoese mit megaloblastärer Reifungsstörun
35 Fallbericht 1: KM, Pappenheim - kleine Megakaryozyten, hypolobuliert
36 KM, Fe - viele Ringsideroblasten Fallbericht 1:
37 Fallbericht 1: Beckenkammtrepanat - CD71 Immunhistochemie
38 Fallbericht 1: Beckenkammtrepanat CD61 Immunhistochemie
39 Fallbericht 1: Molekulargenetik: SF3B1 Mutation! Exon 14: p.e622d Diagnose: SF3B1-mutierte RARS-T
40 Fallbericht 2: Geschlecht: weiblich Alter: 54 Material: peripheres Blut Klinische Angabe: Lymphozytose, Leukozytose, Thrombozytose
41 Fallbericht 2: FACS und Molekulargenetik FACS: Kein Nachweis einer atypischen B- oder T-Zell-Subpopulation. Keine myeloische Blastenpopulation in der CD45-/SSC-Darstellung. Partielle schwache CD56-Expression auf einzelnen Monozyten. Molekulargenetik: JAK2: Keine V617F-Punktmutation, keine Mutation in Exon 12 CALR: keine Mutation in Exon 9 MPL: keine W515L/K-Mutation SRSF2: keine Mutation in Exon 1
42 Fallbericht 2: Next Generation Sequencing: TET2: keine Mutation in Exon 3 11 CBL: Insertion in Exon 9: p.asp460_glu461insasp (c.1380_1382duptga) Gesicherte Identifikation durch sehr hohe Abdeckung (=Coverage) der Sequenz 759 reads im Bereich der Mutation Wildtypsequenz Insertion (bioinformatisch identifiziert)
43 Fallbericht 2: Validierung durch Sanger-Sequenzierung (Gold-Standard in der Sequenzierung) TGA 3 bp Insertion Diagnose: MPN-U
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