Antibiotika-Resistenzgene als Marker in gentechnisch veränderten Pflanzen

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1 Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz : Springer-Verlag 1999 Leitthema Antibiotikaresistenz P. Brandt Zentrum Gentechnologie, Robert Koch-Institut, Berlin Antibiotika-Resistenzgene als Marker in gentechnisch veränderten Pflanzen Zusammenfassung Antibiotika-Resistenzgene bakteriellen Ursprungs können bei Transformationsexperimenten mit Pflanzen als Marker-Gene benutzt werden, um bereits in einem sehr frühen Stadium die erfolgreiche Transformation nachzuweisen.von den rund 1300 Freisetzungsvorhaben in der EU seit 1991 waren rund 800 Projekte mit transgenen Pflanzen, die Antibiotika-Resistenzgene enthielten. Neben amp, kan und hph wurde hauptsächlich nptii als Marker-Gen verwendet.von den 14 transgenen Pflanzen, deren Inverkehrbringen EU-weit genehmigt worden ist, enthalten sieben keine Antibiotika-Resistenzgene, fünf das nptii und zwei das amp (bzw. einen Teil davon). Die Wahrscheinlichkeit der Übertragung von Antibiotika-Resistenzgenen aus dem transgenen Pflanzenmaterial auf Mikroorganismen wird als sehr gering eingestuft, ist jedoch nicht gänzlich auszuschließen. Inwieweit sich aus einer solchen Übertragung eine veränderte Situation in Bezug auf die Verbreitung des jeweiligen Antibiotika-Resistenzgens herleiten läßt, ist vor dem Hintergrund seines heutigen natürlichen Auftretens sowie in Bezug auf den therapeutischen Einsatz der relevanten Antibiotika zu erwägen. Bei Verwendung von nptii, amp, kan oder hph als Marker-Gene in transgenen Pflanzen ist nicht davon auszugehen, daß sich diese Antibiotika-Resistenzen weiter ausbreiten und damit ein zusätzliches Gefährdungspotential für Mensch oder Tier darstellen. In einem Ausblick werden drei alternative Transformationsmethoden ohne den Einsatz von Antibiotika-Resistenzgenen kurz erläutert. In der traditionellen Pflanzenzüchtung werden Pflanzen aufgrund von besonderen, ohne wesentliche Hilfsmittel erkennbaren Eigenschaften ausgewählt, von denen man aus Erfahrung weiß, daß sie mit anderen, mehr auf die Nutzung durch den Menschen orientierten Merkmalen gekoppelt sind. Derartige phänotypische Marker dienen der schnellen und effektiven Selektion von Nachkommen. Analog werden für die Transformation von Pflanzen die dazu verwendeten DNA-Konstrukte in etlichen Fällen zusätzlich mit Marker-Genen gekoppelt, um nach dem eigentlichen Transformationsexperiment diejenigen Pflanzenzellen sicher und schnell identifizieren zu können, in deren Genom das eingebrachte DNA-Konstrukt erfolgreich inseriert worden ist. Ist dem jeweiligen Marker-Gen ein prokaryotischer Promoter vorgeschaltet, so kann sich die Marker-gestützte Selektion auf mit dem- selben DNA-Konstrukt transformierte Bakterien (z.b. E. coli und Agrobacterium tumefaciens) beschränken, die zur Vorbereitung des eigentlichen Transformationsexperiments mit den Pflanzenzellen benötigt werden 1.Aus den erfolgreich transformierten Pflanzenzellen werden vollständig entwickelte Pflanzen regeneriert. Als Marker-Gene sind Antibiotika- Resistenzgene bakteriellen Ursprungs gebräuchlich. Es ist leicht einzusehen, daß durch ihren Einsatz der experimentelle Zugang geschaffen wird, um bereits in einem sehr frühen Stadium die erfolgreiche Transformation durch das selektierbare Merkmal Antibiotika-Resistenz nachweisen zu können. Andererseits hat die Verwendung von Antibiotika-Resistenzgenen als Marker in transgenen Pflanzen auch erheblich dazu beigetragen, eine öffentliche Diskussion 1 Auf die Frage der Spezifität von prokaryotischen bzw. eukaryotischen Promotoren kann hier nicht eingegangen werden. Es sei aber in diesem Zusammenhang auf die Publikation von [1] hingewiesen. Prof. Dr. Dr. Brandt Zentrum Gentechnologie, Robert Koch-Institut, Wollankstraße 15 17, D Berlin und Institut für Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie, Königin-Luise-Straße 12 16, D Berlin Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz

2 Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz : Springer-Verlag 1999 P. Brandt Antibioticresistance genes as marker genes in transgenic plants Summary Antibiotic resistance genes of bacterial origin can be used as marker genes for transformation experiments with plants in order to detect positive transformants at a very early stage. Since 1991 about 1300 deliberate releases of transgenic plants were performed in the EU, 800 thereof with antibiotic resistance genes. Beside amp, kan and hph mainly nptii was the marker gene of choice. 14 transgenic plants have been approved for placing on the market within the EU member states.thereof seven transgenic plants do not contain antibiotic resistance genes, five transgenic plants have incorporated nptii and two transgenic plants have incorporated amp (in one case a diminished part of amp only). The possibility for the transfer of antibiotic resistance genes from transgenic plants to microorganisms has been estimated to be very low, but cannot be excluded.whether such gene transfer can substantially increase the dissemination of the antibiotic resistance gene in question has to be considered in relation to its natural dissemination and its therapeutical use. It cannot be expected that the use of nptii, amp, kan or hph as marker genes in transgenic plants will increase the dissemination of these antibiotic resistance genes and will pose an additional risk potential. In an outlook three transformation methods without using antibiotic resistance genes are described. Leitthema Antibiotikaresistenz sich aufgrund der verschiedenen Laufzeiten der einzelnen Freisetzungsvorhaben nicht ermessen, ob es in diesen acht Jahren möglicherweise eine zeitliche Präferenz für diese vier Antibiotika-Resistenzgene gegeben hat und ob ihre Anwendung als Marker-Gene quantitativ unverändert anhält. Bezieht man die verschiedenen Laufzeiten der einzelnen Freisetzungsvorhaben mit ein, indem man die Optionen auf Freisetzungsexperimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen pro Jahr aufsummiert (eine Option bedeutet ein Freisetzungsexperiment während einer Vegetationsperiode), so wird deutlich, daß der Schwerpunkt der Optionen auf Freisetzungsexperimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen, welche amp als Marker- Gen enthielten, in den Jahren 1994 und 1995 lag und daß die wenigen Optionen auf Freisetzungsexperimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen, die kan als Marker-Gen enthalten, sich auf die Jahre 1996 bis 2000 erstrecken (Abb. 1). Ein völlig anderes Bild zeigt sich für die Freisetzungsexperimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen, die nptii als Marker-Gen enthalten (Abb. 2). Die Anzahl der Optionen auf Freisetzungsexperimente mit derartigen transgenen Pflanzen nimmt von 1992 bis 1997 nahezu gleichmäßig zu. Im Verhältnis zur Anzahl der Optionen aller Freisetzungsexperimente ergibt sich interessanterweise, daß der Anteil an transgenen Pflanzen ohne Antibiotika-Resiüber die Frage zu entfachen, ob diese Antibiotika-Resistenzgene zum Beispiel beim Verrotten der transgenen Pflanzen im Boden oder beim Verzehr von Lebensmitteln, die aus transgenen Pflanzen hergestellt worden sind, von Bakterien des Bodens bzw. des Magen-Darm- Traktes aufgenommen werden können (Horizontaler Gentransfer) und ob daraus ein Risiko für Mensch und Tier abzuleiten ist [2, 3, 4]. Welche Antibiotika-Resistenzgene werden als Marker- Gene in transgenen Pflanzen verwendet? Bevor man über ein solches Risiko diskutiert oder seine Möglichkeit erwägt, sollte zunächst festgestellt werden, um welche Antibiotika-Resistenzgene es sich bei den Marker-Genen, die bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, handelt. Seit 1991 sind rund 1300 Freisetzungsvorhaben mit gentechnisch veränderten Pflanzen im Bereich der EU-Mitgliedstaaten gemeldet worden (Stand: November 1998). Davon enthielten die gentechnisch veränderten Pflanzen von mehr als 850 Freisetzungsvorhaben nptii als Marker-Gen; bei weiteren 17 Freisetzungsvorhaben wurde amp, bei weiteren 5 kan und bei 1 hph verwendet. An der bloßen Anzahl der Freisetzungsvorhaben mit gentechnisch veränderten Pflanzen von 1991 bis 1998 läßt Abb. 1 Anzahl der Optionen auf Freisetzungsexperimente mit transgenen Pflanzen, die als Marker-Gen amp bzw. kan enthalten, in dem Zeitraum von 1991 bis (Stand: Oktober 1998; Quelle: http.fb5.rki.de) Jahr en kan amp 52 Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 1 99

3 Abb. 2 Anzahl aller Optionen auf Freisetzungsexperimente mit transgenen Pflanzen (schwarze Säulen) sowie der Optionen auf Freisetzungsexperimente mit transgenen Pflanzen, die als Marker-Gen nptii enthalten (weiße Säulen), in dem Zeitraum von 1991 bis (Stand: Oktober 1998; Quelle: http.fb5.rki.de) Jahr stenzgene in dem Zeitraum von 1991 bis 1994 auf etwa 40 % ansteigt und über die folgenden Jahre bis 1998 auch dabei verbleibt (Abb. 3). Die bislang vorliegenden Optionen auf Freisetzungsexperimente bis zum Jahr 2006 sprechen nicht gegen diesen bisherigen Trend. Für den Bereich der EU-Mitgliedstaaten sind bislang dreizehn Genehmigungen für das Inverkehrbringen von gentechnisch veränderten Pflanzen ausgesprochen worden, von denen sieben keine Antibiotika-Resistenzgene, fünf das nptii und zwei das amp (bzw. Teile davon) enthalten (Tabelle 1). Herkunft, Verbreitung und medizinische Relevanz der nptii-, amp-, kan- und hph-gene Es wird immer wieder befürchtet, daß über die aus den transgenen Pflanzen hergestellten Lebensmittel, welche Antibiotika-Resistenzgene enthalten, diese auch auf human-pathogene Bakterien übergehen und damit die therapeuti- sche Anwendung der relevanten Antibiotika in der Humanmedizin wirkungslos machen könnten. Diese verallgemeinernde Befürchtung wird durch eine Untersuchung der WHO [5, 6] dahingehend relativiert, daß im Falle von nptii, kan und hph auf den eingeschränkten medizinischen Anwendungsbereich der entsprechenden Antibiotika hingewiesen wird (Tabelle 2). Im Folgenden wird eine kurze Beschreibung der vier Antibiotika-Resistenzgene amp, nptii, kan und hph gegeben, Abb. 3 Prozentualer Anteil der Optionen auf Freisetzungsexperimente mit transgenen Pflanzen ohne Antibiotika-Resistenzgenen an der Gesamtmenge an Optionen auf Freisetzungsexperimente mit transgenen Pflanzen für den Zeitraum von 1991 bis (Stand: Oktober 1998; Quelle: http.fb5.rki.de) Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz

4 Leitthema Antibiotikaresistenz Tabelle 1 Produkte aus dem Bereich der Grünen Gentechnik, für die ein Inverkehrbringen in der Europäischen Union genehmigt wurde Antragsteller Pflanze Gentechnische Beantragt/ Antibiotika-Resistenzgen Veränderung Genehmigt als Marker (ARG) Seita Tabak HT 1993/1994 kein ARG Plant Genetic Systems Raps* MS, HT 1994/1996 nptii Novartis Mais IR, HT 1994/1997 amp Bejo Zaden BV Radicchio MS 1994/1996 nptii Monsanto Soja HT 1994/1996 kein ARG Plant Genetic (a) Raps* MS, HT 1995/1997 nptii Systems (b) Raps* MS, HT 1995/1997 nptii AgrEvo Raps HT 1995/1998 nptii AgrEvo Mais HT 1995/1998 amp (nv) Monsanto Mais IR 1995/1998 kein ARG Northrup Mais IR 1996/1998 kein ARG Florigene Nelke** VB 1996/1998 kein ARG Florigene Nelke VL 1997/1998 kein ARG Florigene Nelke** VB 1997/1998 kein ARG * bzw. **=transgene Pflanzen, die aus verschiedenen Transformationsexperimenten hervorgegangen sind und deren Inverkehrbringen daher auch separat beantragt und genehmigt wurde amp=ampicillin-resistenzgen; nptii=resistenz gegen Antibiotika der Neomycin-Gruppe; nv=nicht vollständig; HT=Herbizid-Toleranz; IR=Insekten-Resistenz; MS=Männliche Sterilität; VB=Veränderung der Blütenfarbe; VL=Verlängerung der Haltbarkeit als Schnittblume. (Stand: Oktober 1998; Quelle: soweit sie für die oben angesprochene Befürchtung von Belang ist: Das amp-gen Das amp-gen stammt aus dem Transposon Tn3 [7]. Mit amp (synonym zu bla (TEM-1) ) wird das Gen für die TEM- 1 β-laktamase bezeichnet [8], die eine Resistenz gegen Ampicillin vermittelt. TEM-1 ist die am weitesten verbreitete β-laktamase. Etwa die Hälfte der klinischen E.coli-Isolate besitzen gegenwärtig eine Ampicillin-Resistenz. Diese ist zu etwa 90% durch den β-laktamasetyp TEM1 bedingt [9]. TEM-1 zeigt gegenüber neueren Cephalosporinen eine sehr geringe Aktivität und ist durch β- Laktamase-Hemmer wie Clavulansäure oder Tazobactam inhibierbar [8]. Der Gebrauch von Ampicillin ohne geeignete β-laktamase-hemmer ist nur noch bei vorhergehender Resistenztestung angebracht. Trotzdem wird Ampicillin nicht nur bei Infektionen durch Enterokokken, sondern auch bei Infektionen durch Haemophilus influenzae weiterhin als Mittel der Wahl betrachtet. Das nptli-gen Das nptii-gen stammt aus dem Transposon Tn5 [10] und kodiert für eine Neomycin-Phosphotransferase. Die Neomycin-Phosphotransferase ist eine Aminoglykosid-3 -Phosphotransferase des Typs II (APH(3 )II), welche die ATPabhängige Phosphorylierung der 3 -Hydroxyl-Gruppe des Aminohexose-Rings bestimmter Aminoglykosid-Antibiotika katalysiert und sie damit inaktiviert. Das Enzym zeichnet sich durch eine hohe Substratspezifität aus [11]. Zu den Substraten der APH(3 ) II-Enzyme zählen die Antibiotika Kanamycin 2,Neomycin, Geneticin, Butirosin, Gentamicin A und B sowie Paromomycin. Das in der Humanmedizin therapeutisch bedeutsame Gentamicin und sonstige Aminoglycoside und Aminocyclitole gehören nicht zum Substratspektrum der APH(3 )-II-Enzyme [12, 13, 14]. Das kan-gen Das kan-gen stammt aus dem Transposon Tn5 [15] und kodiert für eine Phosphotransferase, die Kanamycin durch Phosphorylierung der 3 -Hydroxylgruppe inaktiviert. Die fast ubiquitäre Verbreitung einer Kanamycin-Resistenz sei hier exemplarisch durch die Ergebnisse einer Untersuchung belegt [16], der zufolge ein Großteil der aus Ackerböden isolier- und kultivierbaren Mikroorganismen resistent gegen Kanamycin ist (Tabelle 3). Allerdings haben jüngere Untersuchungen gezeigt, daß nicht in jedem Fall allein von dem phänotypischen Befund auf den Genotyp geschlossen werden darf [17]. 2 Siehe auch den Hinweis über die Verbreitung von Kanamycin-Resistenzen in Mikroorganismen des Bodens [16, 17] im nächsten Abschnitt über die Eigenschaften des kan-gens. 54 Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 1 99

5 Tabelle 2 Beispiele für bakterielle Antibiotika-Resistenzgene, die häufig als Marker-Gene in gentechnisch veränderten Organismen verwendet werden (verändert nach [4]; aus [5]) Marker-Gen Herkunft Antibiotikum Verwendung Kanamycin-Resistenz Escherichia coli Kanamycin Begrenzter Einsatz in der Humanmedizin Paromomycin Geneticin Hygromycin-Resistenz Streptomyces hygroscopicus Hygromycin Nur Einsatz in der Veterinärmedizin Streptomycin- Escherichia coli Streptomycin Begrenzter Einsatz in der Humanmedizin Spectinomycin-Resistenz Spectinomycin Gentamicin-Resistenz Escherichia coli Gentamicin Einsatz in der Humanmedizin Phleomycin-Resistenz Streptoalloteichus Phleomycin Begrenzter Einsatz in der Tumortherapie hindustanus Bleomycin Das hph-gen Das hph-gen kodiert für eine Hygromycin-Phosphotransferase. Diese inaktiviert spezifisch das Antibiotikum Hygromycin durch Phosphorylierung [18]. Andere Aminoglycosid-Aminocyclitol- Antibiotika wie Kanamycin oder Geneticin werden nicht umgesetzt. Hygromycin wird in der Humanmedizin nicht verwendet. Können die Marker-Gene auf Bakterien übertragen werden? Es ist seit langem bekannt, daß opportunistische pathogene Bodenbakterien Resistenz(en) gegen Antibiotika erwerben können [12,20].Jedoch ist es bislang nicht gelungen, diesen Resistenz-Erwerb auf einen Horizontalen Gentransfer zurückzuführen [20, 21]. Die Wahrscheinlichkeit eines Horizontalen Gentransfers von Pflanzenmaterial auf Mikroorganismen wird als sehr gering eingestuft [22], ist jedoch nicht gänzlich auszuschließen. Der Erfolg eines solchen Transfers, zum Beispiel im Tierpansen, im Magen- Darm-Trakt von Säugetieren, in Silagen oder im Boden, würde von einer geordneten Abfolge von Einzelschritten abhängen [22]: Entlassung des Marker-Gens zusammen mit ori (origin of replication) in intakter Form aus der Pflanzenzelle Aufnahme durch kompetente Bakterien Ringschluß des DNA-Fragments in der Bakterienzelle zu einem funktionsfähigen plasmidartigen Replikon Erfolgreiche Expression des übertragenen Marker-Gens Tabelle 3 Kultivierbare Mikroorganismen aus Bodenproben Kultivierungsart Ort der Probenahme Nährstoffreich Nährstoffreich/Kan Nährstoffarm Nährstoffarm/Kan Köln Braunschweig (Rübenfeld) Braunschweig (Kartoffelfeld) Braunschweig (Getreidefeld) Braunschweig (Maisfeld) Angaben in CFU/g Bodengewicht (CFU=colony forming units); Kan=Kanamycin-haltiges Medium (verändert nach [13]) Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz

6 Das gemeinsame Eintreffen dieser jeweils als sehr selten eingeschätzten Ereignisse macht einen häufigen Gentransfer der oben genannten Marker- Gene von Pflanzen auf Bakterien sehr unwahrscheinlich. Nach Berechnungen vonschlüter et al. [23] liegt die Wahrscheinlichkeit für eine derartige Übertragung bei 2.0 x Es muß davon ausgegangen werden, daß eine Übertragung von Antibiotika-Resistenzgenen zwischen Bakterien mit höherer Wahrscheinlichkeit erfolgt als eine Übertragung von transgenem Pflanzenmaterial auf Bakterien [16, 20]. Wenn eine derartige Übertragung von Marker-Genen dennoch eintreten würde, müßte man dies vor dem Hintergrund des heutigen natürlichen Auftretens der oben genannten Antibiotika- Resistenzen in Bakterien bewerten.ausgehend von der Tatsache der schon sehr weiten Verbreitung von amp, nptii und kan ist die Wahrscheinlichkeit als unbedeutend gering einzuschätzen, daß sich durch ihre Verwendung als Marker-Gene in transgenen Pflanzen die entsprechenden Antibiotika-Resistenzen weiter ausbreiten und damit ein zusätzliches Gefährdungspotential für Mensch oder Tier darstellen. Es ist außerdem zu berücksichtigen, daß durch den vermehrten und sorglosen Einsatz von Antibiotika zunehmend Antibiotika-Resistenzen auftreten und daß auch ohne Gentechnik beim Verzehr von Obst und Gemüse eine Vielzahl an Antibiotika-resistenten Mikroorganismen täglich aufgenommen werden, ohne daß bislang aus Erfahrung negative Auswirkungen festgestellt oder bekannt geworden sind. Leitthema Antibiotikaresistenz Ausblick Unabhängig von der Frage, ob mit der Verwendung von Antibiotika-Resistenzen als Marker-Gene Risiken für Mensch und Tier verbunden sein können, sei darauf hingewiesen, daß in den letzten Jahren Verfahren entwickelt worden sind, welche die Etablierung transgener Pflanzen ohne Marker-Gene grundsätzlich möglich machen. Es ist aber auch durchaus möglich, daß im konkreten Einzelfall aufgrund der Eigenschaften der Kulturpflanze, die transformiert werden soll, diese Methoden nicht einsetzbar sind. Beispielhaft soll hier auf drei dieser Verfahren kurz eingegangen werden: 1. In dem von Yoder und Goldsbrough 1994 beschriebenen Verfahren [24] wird das Marker-Gen aus dem Genom der transformierten Pflanzenzelle wieder entfernt, nachdem die Transformation mittels des Markers bestätigt worden ist. Dazu bedient man sich des Enzyms Cre aus dem Bakteriophagen P1. Cre katalysiert einen Rekombinationsvorgang, bei dem DNA- Fragmente zwischen zwei spezifischen Erkennungssequenzen von 34 bp ausgeschnitten werden. Um dieses System zu nutzen, müssen die Pflanzenzellen mit zwei Klonierungsvektoren transformiert werden, wobei der eine ein Konstrukt aus dem eigentlichen Zielgen sowie dem Marker-Gen ist, das von den Cre-Erkennungssequenzen eingerahmt wird, und der zweite das Cre-Gen enthält. Nach der Transformation führt die Expression von Cre dazu, daß das Marker-Gen aus der Pflanzen-DNA wieder ausgeschnitten wird. Nach Regeneration zur vollständigen Pflanze sind aus den Nachkommen diejenigen auszuwählen, die aufgrund der zufälligen Chromosomensegregation das Cre-Gen nicht mehr enthalten. 2. Eine japanische Arbeitsgruppe hat 1997 ein Selektionsverfahren mit Hilfe des Isopentenyltransferase-Gens ipt innerhalb des transposablen Elementes Ac vorgestellt [25], das im Ergebnis zu ipt-freien transgenen Pflanzen führt. 3. Joersbo und Okkels entwickelten 1996 ein Positives Selektionsverfahren [26], das auf der Insertion des Gens für die β-glucuronidase (GUS) aus E. coli in das pflanzliche Genom beruht. In erfolgreich damit transformierten Pflanzenzellen hydrolysiert die GUS zugegebenes Benzyladenin zu Cytokinin, von dem die Regeneration zu vollständigen transgenen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen abhängt. Literatur 1. Lewin A, Jacob D, Freytag B, Appel B (1998) Gene expression in bacteria directed by plant-specific regulatory sequences. Transgenic Res 7: Brandt P (1995) Transgene Pflanzen. Herstellung, Anwendung, Risken und Richtlinien. Birkhäuser-Verlag, Basel, S Brandt P (1998) Begleitforschung zu Freisetzungsexperimenten mit gentechnisch veränderten Pflanzen:»nice to know«oder»need to know«? Bundesgesundhbl 12: Sandermann H, Rosenbrock H, Ernst D (1997) Horizontaler Gentransfer bei Herbizidresistenz? Der Einfluß der Genstabilität und Selektionsdruck. In: Brandt P (Hrsg) Zukunft der Gentechnik. Birkhäuser-Verlag, Basel, S Health aspects of marker genes in genetically modified plants. (1993) Report of the WHO workshop WHO/FNU/FOS/93.6; S Brandt P (1997) Gentechnik in der Lebensmittelherstellung. In: Brandt P (Hrsg) Zukunft der Gentechnik. Birkhäuser-Verlag, Basel, S Heffron F (1983) Tn3 and its relatives. In: Shapiro JA (Hrsg) Mobile genetic elements. Acad Press, New York, S Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 1 99

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