Untersuchungen zum Quorum Sensing (QS) cyanobakterieller Begleitbakterien und des Cyanobakteriums Stamm Flo 1

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1 Untersuchungen zum Quorum Sensing (QS) cyanobakterieller Begleitbakterien und des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 Diplomarbeit vorgelegt dem Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) an der Universität Bremen von Peter Orszag Mai 2008 Betreuender Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer Zweiter Gutachter: PD Dr. Katarzyna A. Palinska

2 Danksagung Danksagung An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die Bereitstellung meines Arbeitsplatzes sowie die Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei der Anfertigung meiner Diplomarbeit bedanken. Bei Frau PD Dr. Katarzyna A. Palinska möchte ich mich für ihr Interesse und für die Begutachtung meiner Diplomarbeit bedanken. Ein großes Dankeschön gilt Dr. Birgit Heyduck-Söller, die mich hervorragend betreut hat und immer Zeit sowie viel Geduld hatte. Meine ehemaligen und gegenwärtigen Kollegen der Arbeitsgruppe danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre, ihre Unterstützung und stete Hilfsbereitschaft sowie für die Verpflegung durch Kekse und leckere Kuchen. Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich über die gesamte Zeit des Studiums unterstützt haben.

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... i Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle... iii 1. Einleitung Zell-Zell-Kommunikation ( Quorum Sensing ) Quorum Sensing bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer AHL-abhängigen Genregulation bei Gram-negativen Bakterien N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien AHL-Biosensoren Interspezifische Kommunikation bei Bakterien Quorum Quenching (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten Ziel der Arbeit Material und Methoden Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft Verwendete Kulturmedien ASN III/2 -Medium LB(Luria Bertani)-Medium LB(Luria Bertani)-Weichagar Leuchtbakterien-Medium ABG-Medium ABG-Weichagar Pufferlösungen Lagerung der Bakterienstämme Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo und Bo Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASN III/2 -Medium im Dunkeln Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen ph-werten im Dunkeln Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR ph-wert-bestimmung in den Kulturüberständen Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen Chromobacterium violaceum CV Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4)... 24

4 Inhaltsverzeichnis Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo und Bo Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit dem Cyanobakterium Stamm Flo Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo Herstellung zellfreier Kulturüberstände Azidifizierung von Kulturüberständen Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signalmolekülen Visualisierung der DC-Signale Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien Auswertung und Dokumentation der DC-Platten Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis von AHL- Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) Molekularbiologische Untersuchungen Extraktion der chromosomalen DNA Bestimmung der DNA-Konzentration Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrb-gens Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen Herkunft der verwendeten Chemikalien Ergebnisse Verwendete Puffersysteme Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo bei unterschiedlichen ph-werten ph-werte der Zellkulturüberstände Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR ph-werte der Zellkulturüberstände Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026 nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern (2001) Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und Mitarbeitern (2002)... 52

5 Inhaltsverzeichnis 3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die AHL- Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo Einfluss des ph-wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo und Bo sowie dem Cyanobakterium Stamm Flo Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen Extraktion der chromosomalen DNA Amplifikation der 16S-rDNA Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz Amplifikation des gyrb-gens Internal Transcribed Spacer (ITS) Diskussion Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen Verwendete Puffersysteme Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen ph-werten Wachstumsverhalten unter Lichteinfluss Quorum Sensing (QS) bei verschiedenen Gram-negativen Bakterien AHL-Nachweis mit bakteriellen Biosensoren Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien Extraktion und Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen Einfluss des ph-wertes auf die AHL-Signalmoleküle Einfluss der Temperatur auf die AHL-Signalmoleküle Einfluss von Licht und Nährstoffen auf die Produktion von AHL-Signalmolekülen Identifizierung der AHL-Signalmoleküle der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo Molekularbiologie Ausblick Zusammenfassung Anhang Literatur

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AI Autoinducer Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser AHL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e) ASN Artificial Seawater Nutrient Bchl a Bakteriochlorophyll a BLAST basic local alignment search tool Bp Basenpaare CFB Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides DC Dünnschichtchromatographie DNA Desoxyribonukleinsäure dntp Desoxynukleosidtriphosphat et al. et alteri ERG Eppendorfreaktionsgefäß FE Fleischextrakt g Gramm g Erdbeschleunigung GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie GFP Grün fluoreszierendes Protein h Stunde(n) HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS High Performance Liquid Chromatography-Massenspektrometrie HSL(s) Homoserinlacton(e) ITS internal transcribed spacer (interne transkribierte Spacer) Kap. Kapitel l Liter LB Luria Bertani lt. laut M Molar mg Milligramm µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer i

7 Abkürzungsverzeichnis min Minute(n) ml Milliliter mm Millimolar MPI Max Planck-Institut n Anzahl N-Acyl-HSL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e) NCBI National Center for Biotechnology Information NJ Neighbour-Joining NK Negativkontrolle nm Nanometer O.D. optische Dichte p.a. per analyse (zur Analyse) PAR Photosynthetically Active Radiation (photosynthetisch aktive Strahlung PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) Probennr. Probennummer QQ Quorum Quenching QS Quorum Sensing rdna ribosomale Desoxyribonukleinsäure R f -Wert retention factor (Retentionsfaktor) rpm rotation per minute (Rotation pro Minute) RT Raumtemperatur sec Sekunde(n) Tab. Tabelle TMM Trace-Metal-Mix Tris Trishydroxymethylaminomethan U Unit (µmol/min) UFT Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien ÜK Übernachtkultur UV Ultraviolett V Volt v/v (volume per volume) Volumen pro Volumen w/v (weight per volume) Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid 2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese ii

8 Nomenklatur für AHL-Signalmoleküle Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle C4-HSL C6-HSL C7-HSL C8-HSL 3-oxo-C4-HSL 3-oxo-C6-HSL 3-oxo-C8-HSL 3-oxo-C12-HSL 3-hydroxy-C4-HSL 3-hydroxy-C6-HSL 3-hydroxy-C8-HSL 3-hydroxy-C12-HSL N-Butanoyl-L-Homoserinlacton (BHL) N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton (HHL) N-Heptanoyl-L-Homoserinlacton N-Octanoyl-L-Homoserinlacton (OHL) N-(3-oxo-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (OBHL) N-(3-oxo-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (OHHL) N-(3-oxo-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (OOHL) N-(3-oxo-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (OdDHL) N-(3-hydroxy-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (HBHL) N-(3-hydroxy-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (HHHL) N-(3-hydroxy-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (HOHL) N-(3-hydroxy-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (HdDHL) iii

9 1. Einleitung 1. Einleitung Lange Zeit bestand die Auffassung, dass Bakterien unabhängig voneinander in strikt solitärer Lebensweise existieren. Bereits vor 65 Jahren lieferten jedoch Untersuchungen an marinen Leuchtbakterien erste Hinweise auf ein multizelluläres Verhalten von Bakterien (DOUDOROFF, 1942). Die Fähigkeit zur interzellulären Kommunikation bildet hierbei die Voraussetzung für eine derartige mikrobielle Organisationsform (BEN JACOB et al., 2004; PARSEK und GREENBERG, 2005). Die Zell-Zell-Kommunikation wurde erstmals bei dem Gram-positiven Bakterium Streptococcus pneumoniae (TOMASZ, 1965) und den marinen Gram-negativen Bakterien Vibrio fischeri und Vibrio harveyi (NEALSON et al., 1970; NEALSON und HASTINGS, 1979) beschrieben, wobei chemische Signale der Kommunikation und der Koordination von Gruppenaktivitäten dienen. Das Phänomen einer interzellulären Kommunikation bei Bakterien wurde erst Jahrzehnte später anerkannt und Kommunikation zwischen Individuen nicht mehr einzig höheren Organismen oder spezialisierten Bakterien zugeschrieben. Anfang der 1990er Jahre gewann dieses Arbeitsgebiet aufgrund von Untersuchungen an pflanzen- und humanpathogenen Gram-negativen Bakterien (GAMBELLO und IGLEWSKI, 1991; BAINTON et al., 1992; Fuqua et al., 1994) zunehmend an Bedeutung. Mittlerweile wird die Zell-Zell- Kommunikation als die wichtigste intrazelluläre Signalreaktion zwischen Bakterien verstanden (SZENTHE und PAGE, 2003). 1.1 Zell-Zell-Kommunikation ( Quorum Sensing ) In der Literatur werden Kommunikationssysteme, mit Hilfe derer Bakterien die eigene Populationsdichte wahrnehmen und in Abhängigkeit von dieser physiologische Aktivitäten regulieren können, als Quorum Sensing -Systeme zusammengefasst. Dabei stellt die kleinste Einheit, welche zu Zelldichte-abhängigen Reaktionen befähigt ist, per Definition das Quorum dar (FUQUA et al., 1994; GEISENBERGER, 2000). Zur Ermittlung der Zellpopulationsdichte verwenden Mikroorganismen eine große Vielfalt an niedermolekularen Substanzen, die unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen (siehe Abb. 1.1) (DONG und ZHANG, 2005; WILLIAMS, 2007). Diese als Autoinducer bezeichneten Signalmoleküle sind meistens sehr artspezifisch (SMITH et al., 2004) und werden von den Bakterien zur Koppelung der Expression bestimmter Gene an die Populationsdichte eingesetzt, welches eine 1

10 1. Einleitung synchrone Koordination biologischer Aktivitäten innerhalb einer lokalen Population ermöglicht (CHA et al., 1998; WILLIAMS, 2007). Das Wahrnehmen der eigenen Populationsdichte wird dabei durch die Messung der Signalmolekül-Konzentration ermöglicht, da die Konzentration der produzierten und in die Umwelt freigesetzten Signalmoleküle mit Zunahme der Bakterienpopulation proportional ansteigt. Mittlerweile wurden verschiedene QS-Systeme beschrieben, welche sich in der Verwendung der Signalmoleküle und regulatorischen Proteine unterscheiden. Das LuxR/LuxI-QS-System mit N-Acyl-L-Homoserinlactonen (AHLs) als Signalmolekülen wird von den Gram-negativen Bakterien verwendet (FUQUA et al., 2001; WHITEHEAD et al., 2001). Weitere QS-Systeme vereinigen Komponenten Gramnegativer und Gram-positiver QS-Systeme, wie für Vibrio harveyi beschrieben (READING und SPERANDIO, 2006). Dieses marine Bakterium verwendet zwei QS- Systeme, ein AHL-QS-System zur intraspezifischen Kommunikation (BASSLER et al., 1994) und ein weiteres System zur interspezifischen Kommunikation (SURETTE und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003), an dem ein Furanosylboratdiester (borhaltiges Furanon) als Autoinducer ( Autoinducer II (AI-2), siehe Abb. 1.1) beteiligt ist (CHEN et al., 2002). Genomanalysen belegten, dass das für die AI-2-Synthese benötigte LuxS-Enzym unter den Bakterien weitverbreitet ist (SUN et al., 2004). Für die mittlerweile weiteren nachgewiesenen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien mit AI-2-Signalmolekülen (LuxS/AI-2-QS-System) wird ebenfalls angenommen, dass die universellen Signalmoleküle eine interspezifische Kommunikation ermöglichen (WATERS und BASSLER, 2005). Die am häufigsten verwendeten Signalmoleküle zur interzellulären Kommunikation unter den Gram-positiven Bakterien sind lineare, z.t. zyklische Oligopeptide (AIP = autoinducing peptides) (KLEEREBEZEM et al., 1997; MILLER und BASSLER, 2001; CAMILLI und BASSLER, 2006), aber es wurden auch γ-butyrolactone bei Streptomyceten und AI-2-Signalmoleküle bei z.b. Streptococcus pneumoniae, S. anginosus und Staphylococcus aureus nachgewiesen (MILLER und BASSLER, 2001; AHMED et al., 2007, WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.1). 2

11 1. Einleitung halogeniertes Furanon Al-2 Abb. 1.1: Zusammenstellung verschiedener, repräsentativer QS-Signalmoleküle und deren Strukturen. 3-oxo-C6-HSL, N-3-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone; A-Factor, 2-isocapryloyl-3-hydroxymethyl-γbutyrolactone; Pseudomonas quinolone signal (PQS), 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone; HHQ, 2-heptyl-4(1H)-quinolone; DSF ( diffusible factor ), 11-methyl-2-dodecenoic acid; 3OH-PAME, hydroxyl-palmitic acid methyl ester; AIP-1, staphylococcal autoinducing peptide 1; DPD (AI-2- Precursor-Molekül), 4,5 dihydroxy-2,3-pentanedione; AI-2 (Autoinducer-2), furanosyl borate diester; halogeniertes Furanon aus Delisea pulchra. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von WILLIAMS (2007) und FROMMBERGER (2005). In den letzten Jahren wurde in vielen Gram-negativen Bakterienspezies, überwiegend Proteobakterien, und in einigen Gram-positiven Bakterienspezies QS- Systeme identifiziert, welche zum Informationsaustausch über den Zustand der Gesamtpopulation befähigt sind. Damit bestätigte sich, dass Quorum Sensing ein weitverbreiteter Mechanismus der Genregulation in Bakterien ist (READING und SPERANDIO, 2006; CAMILLI und BASSLER, 2006). Die Angaben über QS-Systeme bei Gram-negativen Bakterien gehen in den Publikationen weit auseinander. Berichten SHIN und Mitarbeiter (2007) von lediglich über 30 Spezies, konnten alleine CASE und Mitarbeiter (2008) bei nahezu 50 Spezies (aus etwa 30 Gattungen) QS- Systeme dokumentieren. Dabei werden für weit mehr Bakterienspezies AHL-QS- Systeme angenommen. Bereits 1996 wurde aber am Beispiel der Meeresalge Delisea pulchra aufgezeigt, dass QS-Komponenten (z.b. halogenierte Furanone, siehe Abb. 1.1) auch in Eukaryoten vorkommen (GIVSKOV et al., 1996), welche z.b. bakterielle QS-Systeme durch eine Degradation des LuxR-Rezeptors inhibieren (MANEFIELD et al., 2002). Die Alge wird folglich kaum von bakteriellen Biofilmen besiedelt. 3

12 1. Einleitung Quorum Sensing stellt ein Regulationssystem mit großem Wirkungsbereich dar, welches eine Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen ermöglicht bzw. der Bakterienpopulation einen erheblichen Vorteil verschaffen kann (CASE et al., 2008). QS kann dabei eine Vielzahl physiologischer Prozesse und phänotypischer Veränderungen der Bakterienzelle regulieren. Diese Prozesse schließen die Antibiotika-Produktion, die bakterielle Konjugation, die Produktion von Virulenzfaktoren, die Sporenbildung, die Lumineszenz, die Biosynthese von Exopolysacchariden, die Produktion von Sekundärmetaboliten und Exoenzymen, die Regulation von Zellfunktionen in der stationären Wachstumsphase, die Motilität und das Schwärmen, die Biofilmbildung und die Zellaggregation ein (WITHERS et al., 2001; WATERS und BASSLER, 2005; WILLIAMS, 2007; DIGGLE et al., 2007a). Dementsprechend kommt dem bakteriellen QS z.b. in der Medizin hinsichtlich neuer Therapieansätze eine entscheidende Bedeutung zu, da die Ausprägung wichtiger Virulenzfaktoren sowie die Antibiotikaproduktion bei einer Reihe von Organismen, wie dem humanpathogenen Bakterium Pseudomonas aeruginosa, unter QS- Kontrolle stehen (BJARNSHOLT und GIVSKOV, 2007). 1.2 Quorum Sensing bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer AHL-abhängigen Genregulation bei Gram-negativen Bakterien Das marine Leuchtbakterium Vibrio (Photobacterium) fischeri lebt in der Natur im freien Meerwasser oder als Symbiont in Lichtorganen von Fischen und Weichtieren, in denen das Bakterium zu sehr hohen Zelldichten anwächst ( Zellen/ml) und die Lumineszenz ausgelöst (BOETTCHER und RUBY, 1995). Der Wirtsorganismus zieht Nutzen aus der Lichtemission und stellt den Bakterien innerhalb der Lichtorgane im Gegenzug Nährstoffe zur Verfügung. Im freien Meerwasser liegen lediglich geringe Zelldichten vor, wodurch eine Lumineszenz nicht induziert und keine Energie in dieser nährstoffarmen Umgebung für eine unnötige Lichtproduktion verbraucht wird (NEALSON und HASTINGS, 1979; LEE und RUBY, 1992). Bei V. fischeri sind niedermolekulare Verbindungen ( Autoinducer ) für diese Zelldichte-abhängige Regulation der Lumineszenz verantwortlich (EBERHARD et al., 1981). Die acylierten Derivate des Homoserinlactons (bei V. fischeri: 3-oxo-C6-HSL) werden dabei von dem LuxI-Protein, einer AHL-Synthase, konstitutiv synthetisiert (EBERHARD et al., 1981; ENGEBRECHT und SILVERMAN, 1984) und diffundieren 4

13 1. Einleitung frei durch biologische Membranen und die Zellwand (KAPLAN und GREENBERG, 1985) (siehe Abb. 1.2 A). Aufgrund der freien Diffusion werden die Signalmoleküle auch außerhalb der Bakterienzelle lokal akkumuliert. Dementsprechend steigt die intrazelluläre und (lokale) extrazelluläre Konzentration dieser Autoinducer bei Zunahme der Zellpopulationsdichte proportional. Die AHL-Signalmoleküle binden bei einer kritischen Schwellenwert-Konzentration (treshold concentration) als Ligand an das LuxR-Protein (Transkriptionsaktivator) im Cytoplasma mit nachfolgender Aktivierung der Transkription des luxicdabe-operons durch Bindung des LuxR- Autoinducer -Komplexes an die Promotorregion (ENGEBRECHT et al., 1983) (siehe Abb. 1.2 B). Diese als lux-boxen bezeichneten speziellen Promotorsequenzen sind 20 bp große invertierte, repetitive Sequenzen (ZHANG et al., 2002a). Neben den für die Lumineszenz benötigten Genen kodiert das lux-operon das luxi-gen. Eine gesteigerte Transkription der Lumineszenz-Gene führt somit durch eine positive feedback -Regulation zu einer Verstärkung der eigenen Signalmolekül-Produktion (Autoinduktion) (EBERHARD et al., 1981) (siehe Abb. 1.2 B). Studien an V. fischeri belegen, dass das LuxR/LuxI-QS-System zudem weitere, nicht für die Lumineszenz erforderliche Gene reguliert (QIN et al., 2007). Abb. 1.2: Zelldichte-abhängige QS-Regulation der Lumineszenz bei Vibrio fischeri. A: Bei niedrigen Zelldichten werden die Lumineszenz-Gene luxcdabe aufgrund einer niedrigen Konzentration des Signalmoleküls (3-oxo-C6-HSL) lediglich schwach transkribiert. B: Bei hohen Zelldichten bindet das Signalmolekül bei Erreichen einer Schwellenwert-Konzentration als Ligand an das LuxR. Die gesteigerte Transkription der luxcdabe-gene führt zur Lichtemission sowe zur Verstärkung der Signalmolekül-Produktion. Abbildung nach WHITEHEAD (2001), verändert nach FROMMBERGER (2005) 5

14 1. Einleitung 1.3 N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien In vielen Gram-negativen Bakterien (vor allem bei α-, β- und γ-proteobakterien) wurden mittlerweile LuxR/LuxI-homologe QS-Systeme nachgewiesen. Diese auf molekularer Ebene am besten verstandenen QS-Systeme setzen sich aus regulatorischen LuxI- und LuxR-homologen Proteinen zusammen, wobei die LuxIhomologen Proteine die N-Acyl-L-Homoserinlactone (AHLs) als Quorum Sensing (QS)-Signalmoleküle synthetisieren (CASE et al., 2008). Die Stoffklasse der N-Acyl-L-Homoserinlactone zeichnet sich durch einen Homoserinlactonring und einer N-acylierten Seitenkette aus, verbunden über eine Amid-Bindung. Die N-Acyl- Seitenketten unterscheiden sich in Länge (zwischen 4-18 C-Atomen), Sättigung sowie durch eine eventuelle Substitution am C 3 -Atom (3-Oxo- oder 3-Hydroxygruppe) (WHITEHEAD et al., 2001; WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.3). Dieses bedingt eine beträchtliche strukturelle Diversität von AHL-Molekülen. Abb. 1.3: Struktur von AHL-Signalmolekülen. AHL, N-Acyl-L-Homoserinlacton; 3-oxo-AHL, N-3-oxo- Acyl-L-Homoserinlacton; 3-hydroxy-AHL, N-3-hydroxy-Acyl-L-Homoserinlacton. R = C1 bis C15.. Die Acyl-Seitenketten können zudem eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen. 3-oxo-C12-HSL, N-3-oxo-Dodecanoyl-L-Homoserinlacton. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von WILLIAMS (2007) S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) und acyliertes acyl carrier protein (acyl-acp), letzteres ein Zwischenprodukt der Fettsäurebiosynthese, sind die Substrate der LuxIhomologen Enzyme (AHL-Synthasen) für die AHL-Synthese. Der Homoserinlactonring der N-Acyl-HSLs wird dabei aus dem S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) synthetisiert, die N-Acyl-Seitenkette der AHL-Moleküle aus den Acyl-Resten der acyl-acp-moleküle (SCHAEFER et al., 1996). 6

15 1. Einleitung 1.4 AHL-Biosensoren Die Identifizierung einer großen Anzahl von AHL-QS-Systemen in Bakterien wurde durch die Entwicklung und den Einsatz bakterieller AHL-Biosensoren bedeutend vorangebracht, welche auch heutzutage in AHL-Untersuchungen Anwendung finden. Diese bakteriellen Biosensoren produzieren selber keine AHL-Signalmoleküle, zeichnen sich aber durch eine phänotypische Nachweisreaktion in Gegenwart bestimmter N-Acyl-HSLs aus. Diese Reaktion beruht auf dem Vorhandensein eines LuxR-homologen Proteins, welches die Aktivierung eines bestimmten Reportergens induziert (z.b. Lumineszenz, β-galaktosidase, GFP, Violacein-Pigment) (WAGNER- DÖBLER et al., 2005; STEINDLER und VENTURI, 2007). Das jeweilige Protein aus der LuxR-Familie bestimmt für jeden AHL-Biosensor die AHL-Spezifität, kann aber auch in manchen Fällen (bei höheren Konzentrationen) durch nahverwandte AHLs angesprochen werden. Dementsprechend gibt es gentechnisch konstruierte Biosensoren, welche auf AHL-Moleküle mit kurz- und mittellangen Acyl-Seitenketten (z.b. Chromobacterium violaceum CV026: MCCLEAN et al., 1997), mit langen Acyl- Seitenketten (z.b. Pseudomonas aeruginosa PAO1 (M71LZ): DONG et al., 2005), aber auch auf ein breites Spektrum von AHL-Molekülen (z.b. Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4): FARRAND et al., 2002) reagieren. Andere Biosensoren reagieren hingegen nur auf bestimmte Modifikationen in der Acyl-Seitenkette, wie der 3-hydroxy-AHL detektierende Biosensor Pseudomonas fluorescens 1855 (psf105, psf107) (KHAN et al., 2005). Neben Modifikation und Länge der Acyl-Seitenkette ist die AHL-Konzentration für eine Aktivierung der jeweiligen Reportergene von großer Bedeutung (Sensitivität) (STEINDLER und VENTURI, 2007). 1.5 Interspezifische Kommunikation bei Bakterien QS-Signalmoleküle sind größtenteils sehr art-spezifisch (SMITH et al., 2004). Die N-Acyl-L-Homoserinlactone der Gram-negativen Bakterien weisen eine große strukturelle Ähnlichkeit auf, werden aber dessen ungeachtet mit einer hohen Spezifität von ihrem jeweiligen LuxR-homologen Protein erkannt (FEDERLE und BASSLER, 2003; WAGNER-DÖBLER et al., 2005). Aufgrund dieser Spezifität zwischen LuxR-Homologen und N-Acyl-HSL-Molekülen wurde das bakterielle AHL- QS-System vor allem als ein intraspezifisches Kommunikationssystem verstanden (FEDERLE und BASSLER, 2003; READING und SPERANDIO, 2006). Mittlerweile sind einige LuxR-homologe Proteine bekannt, welche mehr als ein AHL- 7

16 1. Einleitung Signalmolekül erkennen und in erster Linie an einer interspezifischen Kommunikation beteiligt sind (READING und SPERANDIO, 2006). Eine Interspezies-Kommunikation ist dabei nicht immer zu einem beiderseitigen Vorteil. Mögliche Interaktionen sind dabei neben einer Aktivierung des LuxR-homologen Regulatorproteins des Weiteren eine Blockierung der AHL-Bindungsstelle durch Spezies-fremde AHL-Moleküle. In diesem Zusammenhang wurde für Chromobacterium violaceum eine Inhibierung der Produktion von Violacein durch langkettige AHL-Moleküle (C 10 - C 14 -Seitenketten) beschrieben (MCCLEAN et al., 1997). Ein Beispiel interspezifischer Kommunikation ist die zwischen den opportunistisch pathogenen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia, welche die Lungen von Patienten mit Cystischer Fibrose co-infizieren und gemischte Biofilme ausbilden. In diesem Fall aktivieren die synthetisierten AHL-Moleküle von P. aeruginosa das Pathogenese regulierende QS-System bei B. cepacia, wodurch B. cepacia Nutzen aus Spezies-fremden AHLs zieht (RIEDEL et al., 2001). Die LuxRhomologen Proteine der beiden Spezies weisen eine hohe Verwandtschaft zueinander auf, welches evolutionär auf einen lateralen Gentransfer schließen lässt, resultierend in einer erleichterten Interspezies-Kommunikation (CASE et al., 2008). Das marine Bakterium Vibrio harveyi existiert in natürlichen Habitaten in gemischten Populationen, bestehend aus verschiedenen Bakterienspezies (MILLER und BASSLER, 2001). Das interspezifische QS-System mit dem Autoinducer II (AI-2)- Signalmolekül ermöglicht es V. harveyi neben der eigenen Populationsdichte zudem die der anderen AI-2-synthetisierenden Bakterienspezies in ihrer lokalen Umgebung wahrzunehmen (SURETTE und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003). Die Fähigkeit einer Verhaltensänderung in Abhängigkeit von den Populationsverhältnissen in der Gesamtpopulation beruht bei diversen Bakterienspezies auf der Erkennung verschiedener AI-2-Signalmoleküle, ausgehend vom 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD, siehe Abb. 1.1) (CHEN et al., 2002; MILLER et al., 2004). Untersuchungen an gemischten Bakterienpopulationen mit verschiedenen Bakterienspezies zeigten, dass die AI-2-Produktion durch Escherichia coli in anderen Bakterienspezies QS-gesteuerte Vorgänge bereits bei niedrigen Zelldichten einleitete. Ein Abbau der AI-2-Signalmoleküle durch E. coli verursachte indes bei benachbarten Bakterienspezies eine zu geringe Einschätzung der eigenen 8

17 1. Einleitung Populationsdichte, wodurch QS-gesteuerte Prozesse nicht eingeleitet oder nicht beendet wurden (XAVIER und BASSLER, 2005). Neben der bakteriellen Interspezies-Kommunikation wurden auch Interaktionen zwischen Bakterien und höheren Organismen beschrieben (inter-kingdom). Dabei können höhere Organismen bakterielle QS-Systeme über sogenannte AHL-Mimetika stimulieren, wobei Assoziationen mit Bakterien z.b. beim Menschen zur Erhaltung seiner Darmflora dienen könnten (CAMILLI und BASSLER, 2006). In Reispflanzen (Oryza sativa) wurden AHL-Mimetika nachgewiesen (DEGRASSI et al., 2007), deren biologische Bedeutung bisweilen noch nicht erfasst wurde, aber vermutlich im Zusammenhang mit Reis-pathogenen Burkholderia-Spezies stehen. 1.6 Quorum Quenching (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation Die Hemmung der interzellulären Kommunikation ( Quorum Quenching ) stellt womöglich einen wichtigen Mechanismus in der Regulation des bakteriellen QS, aber auch bei der Interaktion von verschiedenen Mikroorganismen sowie von Mikroorganismen und höheren Organismen dar. In diesem Zusammenhang übernimmt wahrscheinlich der Abbau von Signalmolekülen durch Quorum Quenching -Enzyme (als eine Möglichkeit des QQ) eine wichtige Funktion (DONG und ZHANG, 2005). AHL-degradierende Enzyme, AHL-Lactonasen, wurden beispielsweise bei Bacillus-Spezies (z.b. DONG et al., 2000) und bei Agrobacterium tumefaciens (ZHANG et al., 2002b), AHL-Acylasen bei Pseudomonas aeruginosa (HUANG et al., 2003) und einem Anabaena-Stamm (ROMERO et al., 2008) nachgewiesen. Ein Abbau bzw. eine Inaktivierung von Signalmolekülen ermöglicht wahrscheinlich, wie für A. tumefaciens beschrieben (ZHANG et al., 2004), das Abschalten der QS-regulierten Genexpression. Des Weiteren wird für einige Bakterienspezies eine Inhibierung der interzellulären Kommunikation konkurrierender und pathogener Bakterienspezies vermutet. In vielen Fällen regulieren die bakteriellen QS-Systeme die Expression von Virulenz-Genen sowie die Antibiotika- Produktion. Die in höheren Organismen detektierten AHL-degradierenden Enzyme besitzen ebenfalls eine inhibierende Funktion gegen pflanzen- bzw. humanpathogene QS-Systeme (DONG und ZHANG, 2005). Dementsprechend kann die bakterielle Virulenz deutlich herabgesetzt werden. Neben QS-Inhibitoren wird den AHL-degradierenden Enzymen eine Rolle bei der medizinischen Bekämpfung von humanpathogenen Bakterien zugesprochen (HASELTINE und ARNOLD, 2008). 9

18 1. Einleitung 1.7 Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten In der vorliegenden Arbeit wurde eine Auswahl von marinen Gram-negativen Bakterienstämmen für Quorum Sensing -Untersuchungen eingesetzt, welche zuvor auf Grundlage von Voruntersuchungen (SCHOMAKER, 2007) als AHL-Produzenten beschrieben worden waren. Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo wurde aus der nicht-axenischen Cyanobakterienkultur Stamm Bo 53 (Nodularia harveyana) isoliert und nach 16SrDNA-Sequenzierung der Gattung Porphyrobacter zugeordnet (HUBE, 2008), welche erstmals von FUERST und Mitarbeitern (1993) beschrieben wurde. Porphyrobacter- Spezies sind aerobe anoxygen phototrophe Bakterien und gehören zur α-4- Untergruppe der Proteobakterien (YURKOV und BEATTY, 1998). Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo wurde aus der nicht-axenischen Cyanobakterienkultur von Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 isoliert und nach Sequenzierung der 16S-rDNA als Vertreter der Gattung Muricauda (Gruppe: Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides, Familie: Flavobacteriaceae) identifiziert (HUBE, 2008). Der Typenstamm Muricauda aquimarina ist ein Gram-negatives, nicht-sporenbildendes, leicht halophiles Stäbchen (YOON et al., 2005). Das Genus Muricauda wurde erstmals von BRUNS und Mitarbeitern (2001) beschrieben. Weiterhin wurde das Cyanobakterium Stamm Flo 1 für QS-Untersuchungen hinzugezogen. Dieser Cyanobakterienstamm gehört zur Ordnung Oscillatoriales und wurde ursprünglich aufgrund rein morphologischer Kriterien als Oscillatoria limnetica bezeichnet. Durch molekularbiologische Untersuchungen konnte SCHRÜBBERS (2007) aber eindeutig aufzeigen, dass Stamm Flo 1 eine Spezies der Gattung Geitlerinema ist. Cyanobakterien leben in engen assoziierten Lebensgemeinschaften mit heterotrophen Bakterien (STEVENSON und WATERBURY, 2006). Cyanobakterien stellen den heterotrophen Bakterien im Austausch gegen remineralsierte Nährstoffe labile Substrate zur Verfügung (TUOMAINEN et al., 2006). Durch Fluoreszenz-Insitu- Hybridisierung (FISH) wurden Porphyrobacter Stamm Bo und Muricauda Stamm Bo ebenfalls als Teil der heterotrophen Begleitflora des Geitlerinema- Stammes Flo 1 detektiert (HUBE, 2008, persönliche Mitteilung). In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, in wieweit die assoziierten Lebensgemeinschaften interspezifisch über (AHL)-Signalmoleküle miteinander kommunizieren und über QS-gesteuerte Prozesse beeinflusst werden. 10

19 1. Einleitung 1.8 Ziel der Arbeit In der vorliegenden Diplomarbeit sollte eine dünnschichtchromatographische Methode mit Biosensoren zum Nachweis von AHL-Molekülen etabliert werden. Des Weiteren sollte die AHL-Produktion in Abhängigkeit vom ph-wert und der Wachstumsphase für die heterotrophen Bakterien Porphyrobacter Stamm Bo und Muricauda Stamm Bo sowie für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 untersucht werden. Eine Untersuchung des Lichteinflusses sowie weiterer Einflussfaktoren wie Temperatur und Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion der heterotrophen Bakterien sollte zudem durchgeführt werden. Aussagen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterien sollten mittels physiologischer Untersuchungen getroffen werden. Ferner sollte durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden wie 16S-rDNA- Sequenzierung, gyrb-gen-analyse und ITS-Amplifikation überprüft werden, ob es sich bei den aufgrund morphologischer Kriterien klassifizierten Cyanobakterien Nodularia harveyana Stamm Bo 53 und Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 tatsächlich um diese Spezies handelt. 11

20 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme sowie deren Herkunft sind in den Tabellen zusammengefasst. Hierbei erfolgte eine Unterteilung in die zu untersuchenden Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1 und Tab. 2.2) sowie in die für den Nachweis von AHL-Signalmolekülen erforderlichen Stämme und Referenzstämme (siehe Tab. 2.3). Die Cyanobakterienstämme (siehe Tab. 2.2) wurden aus der Stammsammlung der Abteilung Marine Mikrobiologie (UFT, Universität Bremen) entnommen. Die Stämme Bo 53 und Bo 10 stammen ursprünglich von einem marinen Standort an der Ostsee (Boiensdorf, Stammbezeichnung Bo), Stamm Flo 1 stammt aus einem Mangrovenwäldchen in Key Biscayne (Florida (USA), Stammbezeichnung Flo). Die heterotrophen Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1) wurden von Dipl.-Biologin A. Hube (Abt. Marine Mikrobiologie, UFT, Universität Bremen) zur Verfügung gestellt (siehe Kap. 1.7). Tab. 2.1: Liste der ausgewählten heterotrophen Bakterien und ihre Identifizierung nach HUBE (2008) Stammbezeichnung Bo Bo Identifizierung nach Sequenzierung Muricauda sp. Porphyrobacter sp. Tab. 2.2: Übersicht der ausgewählten Cyanobakterienstämme aus der Stammsammlung und deren Stammbezeichnung sowie ihre taxonomische Einordnung und ihre Abteilungszugehörigkeit nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979) Stamm und Abteilungszugehörigkeit (RIPPKA et al., 1979) Stammbezeichnung Ordnung Oscillatoriales (Unterabteilung III) Geitlerinema sp. a) Flo 1 Oscillatoria brevis Bo 10 Ordnung Nostocales (Unterabteilung IV) Nodularia harveyana Bo 53 a) reklassifiziert (SCHRÜBBERS, 2007) 12

21 2. Material und Methoden Tab. 2.3: Zusammenstellung weiterer Bakterienstämme sowie deren Verwendung und Herkunft Bakterienstamm Eigenschaft/ Verwendung Referenz/Herkunft Vibrio sp. AHL-Positivkontrolle Max-Planck-Institut, Bremen Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4) trag::lacz trar (pzlr4) AHL-Sensorstamm FARRAND et al., 2002 Agrobacterium tumefaciens NT1 (ptic58 accr ) AHL-Positivkontrolle FARRAND et al., 2002 Agrobacterium tumefaciens NTL4 AHL-Negativkontrolle FARRAND et al., 2002 Chromobacterium violaceum CV026 Stamm PCC 7105 (Geitlerinema sp. ) mini Tn5 AHL-Sensorstamm cyanobakterieller Referenzstamm McCLEAN et al., 1997 Pasteur-Culture-Collection (PCC, Paris, Frankreich) 2.2 Verwendete Kulturmedien Die Lagerung der Flüssigmedien erfolgte bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, die der Festmedien bei 4 C im Dunkeln ASN III/2 -Medium (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995) Zur Anzucht von Stamm Flo 1 wurde das Artificial Seawater Nutrient -Medium (ASN III/2 -Medium) mit Nitrat (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995) verwendet, welchem zur Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo ,0% Fleischextrakt als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurde. In Tabelle 2.4 sind die Bestandteile des Mediums und in Tabelle 2.5 die Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung angegeben. Die Lösungen des Mediums wurden mit Aqua bidest. angesetzt und mit Ausnahme der sterilfiltrierten Vitamin B 12 -Lösung autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na 2 CO 3 ) wurde zur Vermeidung von Ausfällungen separat in Aqua bidest. angesetzt und autoklaviert. Diese Komponente und die Zusätze wurden dem autoklavierten Grundmedium steril zugegeben. Das ASN III/2 -Medium wies eine Salinität von 15 auf. Das Kulturmedium hatte einen ph-wert von 9,0, das mit 1% Fleischextrakt versetzte Kulturmedium einen ph-wert von 7,1. Zur Herstellung von ASN III/2 -Festmedium wurde dem Grundmedium zusätzlich 1,5% (w/v) Agar zugesetzt. 13

22 2. Material und Methoden Tab. 2.4: Zusammensetzung des ASN III/2 -Mediums (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995) NaCl MgCl 2 x 6 H 2 O KCl NaNO 3 MgSO 4 x 7 H 2 O CaCl 2 x 2 H 2 O Komponenten Grundmedium Fleischextrakt a) Aqua bidest. Na 2 CO 3 Zusätze KH 2 PO 4 x 3 H 2 O-Stammlösung (4 g/l) Fe-NH 4 -Citrat-Lösung (6 g/l) g/l oder ml/l 12,5 g 1,0 g 0,25 g 0,75 g 1,75 g 0,25 g 10,0 g ad 900 ml 0,12 g/100 ml 2,50 ml 0,25 ml Vitamin B 12 -Stammlösung b) (1 mg/100 ml) 0,50 ml Spurenelement-Lösung (Trace Metal Mix) 0,50 ml a) Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo b) sterilfiltriert Tab. 2.5: Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung (Trace Metall Mix) (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995) Komponenten Na 3 -Citrat x 2 H 2 O 3,0 Na 2 -EDTA x 2 H 2 O 5,5 H 3 BO 3 2,86 MnCl 2 x 4 H 2 O 1,81 ZnSO 4 0,222 Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O 0,318 CuSO 4 x 5 H 2 O 0,079 Co(NO 3 ) 2 x 6 H 2 O 0,0494 Aqua bidest. g/l ad 1000 ml LB(Luria Bertani)-Medium (SAMBROOK et al., 1989) Die Anzucht von Chromobacterium violaceum CV026 erfolgte im LB-Flüssigmedium (SAMBROOK et al., 1989). Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.6 dargestellt. Vor dem Autoklavieren wurde der ph-wert durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius, PB-11). Durch Zugabe von 1,5% (w/v) Agar wurde LB-Festmedium hergestellt. 14

23 2. Material und Methoden Tab. 2.6: Zusammensetzung des LB-Flüssigmediums (SAMBROOK et al., 1989) Komponenten g/l Tryptone 10,0 Hefeextrakt 5,0 NaCl 10,0 Aqua bidest. ad 1000 ml LB(Luria Bertani)-Weichagar (SAMBROOK et al., 1989) In Tabelle 2.7 sind die Medienkomponenten des LB-Weichagars (SAMBROOK et al., 1989) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe Kap ) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält. Tab. 2.7: Zusammensetzung des LB-Weichagars (SAMBROOK et al., 1989) Komponenten g Agar 1,12 Tryptone 1,0 Hefeextrakt 0,5 NaCl 1,0 Aqua bidest. ad 100 ml Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI, Bremen) Die Anzucht von Vibrio sp. erfolgte im Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI, Bremen). Die Medienkomponenten wurden getrennt in Aqua bidest. angesetzt und anschließend autoklaviert. Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.8 dargestellt. Tab. 2.8: Zusammensetzung des Leuchtbakterien-Mediums (Angaben lt. MPI, Bremen) Komponenten CaCl 2 x 2 H 2 O 1 Glycerin 3 Hefeextrakt 3 KCI 0,5 MgSO 4 x 7 H 2 O 9 NaCl 20 Pepton 5 Aqua bidest ml g/l 15

24 2. Material und Methoden ABG-Medium (CHILTON et al., 1974) Die Anzucht der Agrobacterium tumefaciens-stämme erfolgte im ABG-Medium (CHILTON et al., 1974). In Tabelle 2.9 ist die Zusammensetzung des ABG-Mediums, in den Tabellen 2.10 und 2.11 die der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers dargestellt. Vor dem Autoklavieren der 20x AB-Puffer-Stammlösung wurde der ph- Wert durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius PB-11). Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung wurden dem autoklavierten Aqua bidest. steril zugegeben. ABG-Festmedium wurde durch Zugabe von 1,5 % (w/v) Agar hergestellt. Tab. 2.9: Zusammensetzung des ABG-Mediums (CHILTON et al., 1974) Komponenten 20x AB-Salze 50 20x AB-Puffer 50 Glucose (Stammlösung 20%) 10 Aqua bidest. 890 ml Tab. 2.10: Zusammensetzung der 20x AB-Salze-Stammlösung (CHILTON et al., 1974) Komponenten NH 4 Cl 20 MgSO 4 x 7 H 2 O 6 KCl 3 CaCl 2 0,2 FeSO 4 x 7 H 2 O 0,05 Aqua bidest. ad 1000 ml g/l Tab. 2.11: Zusammensetzung der 20x AB-Puffer-Stammlösung (CHILTON et al., 1974) Komponenten K 2 HPO 4 60 NaH 2 PO 4 23 Aqua bidest. ad 1000 ml g/l 16

25 2. Material und Methoden ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974) In Tabelle 2.12 sind die Medienkomponenten des ABG-Weichagars (CHILTON et al., 1974) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe Kap ) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält. Die Zusammensetzung der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers ist in Kapitel 2.2.4, Tabelle 2.10 und 2.11 dargestellt. Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung wurden der autoklavierten Agar-Aqua bidest.-mischung steril zugegeben. Tab. 2.12: Zusammensetzung des ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974) Komponenten Agar Aqua bidest. 20x AB-Salze 20x AB-Puffer Glucose (Stammlsg. 20 %) g oder ml 1,12 g 89 ml 5 ml 5 ml 1 ml 2.3 Pufferlösungen Für die Pufferung von Kulturmedien wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Pufferlösungen (DAWSON et al. 1986) verwendet, deren Zusammensetzungen in der nachfolgenden Tabelle 2.13 zusammengefasst sind. Dabei wird jeweils die Pufferzusammensetzung für ein Endvolumen von 100 ml angegeben. Zur Herstellung der verschiedenen Pufferlösungen wurden die Komponenten abhängig von dem anzusetzenden ph-wert in einem bestimmten Verhältnis miteinander gemischt und nachfolgend gegebenfalls mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt. 17

26 2. Material und Methoden Tab. 2.13: Zusammensetzung verschiedener Pufferlösungen im Bereich von ph 2,0-11,0 (DAWSON et al., 1986) Pufferlösungen ph, 25 C Komponenten (ml) Aqua bidest. (ml) Clark and Lubs-Pufferlösung Citronensäure-Natriumcitrat- Pufferlösungen Tris-Maleat-Pufferlösungen Clark and Lubs-Pufferlösungen Tris-Pufferlösungen Clark and Lubs-Pufferlösungen Glycin-NaOH-Pufferlösungen Phosphat-Pufferlösung 0,2 M Kaliumchlorid-Lösung 0,2 M HCI 2,0 25,0 6,5 68,5 0,1 M Citronensäure-Lösung 0,1 M tri-natriumcitrat-lösung 3,0 82,0 18,0 -- 4,0 59,0 41,0 -- 5,0 35,0 65,0 -- 0,2 M Tris-Maleat-Lösung 0,2 M NaOH 6,0 a) 25,0 13,0 62,0 7,0 a) 25,0 24,0 51,0 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung 0,1 M NaOH 6,0 50,0 5,6 44,4 7,0 50,0 29,1 20,9 0,1 M Tris-Lösung 0,1 M HCl 7,1 50,0 45,7 4,3 8,0 50,0 29,2 20,8 8,5 50,0 14,7 35,3 8,9 50,0 7,0 43,0 0,1 M Kaliumchlorid/Borsäure-Lösung 0,1 M NaOH 8,0 50,0 3,9 46,1 8,5 50,0 10,1 39,9 9,0 50,0 20,8 29,2 9,5 50,0 34,6 15,4 10,0 50,0 43,7 6,3 0,2 M Glycin-Lösung 0,2 M NaOH 9,0 25,0 4,4 70,6 10,0 25,0 16,0 59,0 0,05 M di-natriumhydrogenphosphat-lösung 0,1 M NaOH 11,0 50,0 4,1 45,9 a) ph-wert bei 23 C 18

27 2. Material und Methoden 2.4 Lagerung der Bakterienstämme Zur langfristigen Lagerung der heterotrophen Bakterien wurden Glycerinstocks angelegt. Die Bakterienstämme wurden hierzu im jeweiligen Medium angezogen und in sterilen Eppendorfreaktionsgefäßen (ERG) in Glycerin (Bakterienkultur und steriles 87%iges Glycerin in 4:1 Volumenanteilen) bei -80 C eingefroren. Für alle nachfolgenden Untersuchungen wurde mit einer Impföse oder einer Eppendorfpipette steril Bakterienmaterial entnommen und in das jeweilige Flüssigmedium überführt. Die Kontrolle der Reinheit erfolgte über die jeweiligen Agarplatten für das Bakterium mittels Drei-Ösen-Ausstrich und Inkubation bei 28 C im Brutschrank (Heraeus Instruments, kelvitron t) unter aeroben Bedingungen für 2-4 Tage. Parallel zu den Glycerinstocks wurden die heterotrophen Bakterienstämme auf den jeweiligen festen Nährmedien ausgestrichen und bei 28 C für 4-5 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Agarplatten im Kühlraum bei 4 C gelagert und bildeten ein zusätzliches Bakterienmateriallager. 2.5 Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo und Bo Die Anzucht der Vorkulturen erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 20 ml ASN III/2 - Medium (siehe Kap ) gefüllten 50 ml Erlenmeyerkolben. Vorkulturen wurden stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks angeimpft (siehe Kap. 2.4) und für h bei 21 C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei 120 rpm unter aeroben Bedingungen inkubiert (= Übernachtkultur (ÜK)). Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens (siehe Kap. 2.6) als auch zur Untersuchung auf AHL-Moleküle (siehe Kap ) wurden die Vorkulturen mit einer O.D. 600nm von 0,1 angesetzt, wobei diese aus einer Übernachtkultur (ÜK) inokuliert wurden. Die Bakterienstämme wurden, wenn nicht anders beschrieben, für h bei 21 C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei 120 rpm unter aeroben Bedingungen im Dunkeln inkubiert. 19

28 2. Material und Methoden Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo 53 Die Hälterung der Flo 1-Kulturen erfolgte bei einer konstanten Temperatur von 21 C im Brutraum mit einem konstanten Photonenfluss von 1 µe m -2 s -1 PAR (Photosynthetic Active Radiation). Die Kulturen wurden in einem Abstand von 4-5 Wochen in frisches ASN III/2 -Medium (siehe Kap ) überführt. Das Überimpfen erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 40 ml Kulturmedium gefüllten 100 ml Erlenmeyerkolben bzw. in mit 100 ml Kulturmedium gefüllten 250 ml Erlenmeyerkolben. Vor dem eigentlichen Versuch wurden Vorkulturen angesetzt, die an die jeweiligen Versuchsbedingungen für 3-4 Wochen adaptiert wurden. Die Voranzucht des Cyanobakteriums Stamm Bo 10 wurde von Dipl.-Biologin A. Hube, die des Cyanobakteriums Bo 53 von Dr. B. Heyduck-Söller durchgeführt. 2.6 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der Stämme Bo und Bo wurden Wachstumskurven mit ungepufferten Kulturmedien sowie bei verschiedenen ph-werten generiert und das ph-minimum, -Maximum und -Optimum der heterotrophen Bakterien ermittelt. Des Weiteren wurden die Kulturen bei einer Photonenflussdichte von 5 µe m -2 s -1 PAR (Photosynthetic Active Radiation) inkubiert und Wachstumskurven aufgenommen. Da die Hälterung der Cyanobakterien in der Stammsammlung der Abt. Marine Mikrobiologie bei einer konstanten Temperatur von 21 C erfolgt, wurde diese Temperatur auch zur Anzucht der Bakterienstämme Bo und Bo gewählt, um eine AHL-Produktion der ansonsten in Assoziation lebenden heterotrophen Bakterien bezüglich einer interspezifischen Kommunikation unter identischen Inkubationstemperaturen zu untersuchen. Die Wachstumsmessungen wurden in der vorliegenden Arbeit über O.D.-Messungen bei einer Wellenlänge von 600 nm mittels eines Spektralphotometers (biochrom Libra S12) durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte in Plastikküvetten gegen das jeweilige unbeimpfte Kulturmedium als Blindprobe. Für jeden Versuchsansatz wurde eine Doppelbestimmung (n = 2) durchgeführt mit anschließender Berechnung der Mittelwerte. Der Abbruch des Versuches erfolgte in der stationären Phase der Kulturen. Während und nach Beendigung der Wachstumsmessungen wurde der ph- Wert der Kulturüberstände kontrolliert (siehe Kap ). 20

29 2. Material und Methoden Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASN III/2 - Medium im Dunkeln Die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo wurden, wie in Kapitel beschrieben, im ASN III/2 -Medium inkubiert. Nach Ermittlung der O.D. 600nm der Vorkultur wurden die ungepufferten Versuchskulturen mit einer Ausgangs-O.D. 600nm von 0,1 inokuliert und bei 21 C im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei 120 rpm im Doppelansatz inkubiert. Die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im Abstand von 4 h (siehe Kap. 2.6) Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen ph- Werten im Dunkeln Zur Ermittlung des ph-minimums, -Optimums und -Maximums der heterotrophen Testorganismen Stamm Bo und Stamm Bo wurde das Wachstum in gepuffertem ASN III/2 -Medium in Schritten von einer ph-einheit im Bereich ph 2,0-10,0 getestet. Eine Ausnahme bildete der ph-wert von 8,5. Die für diese Versuchsreihe verwendeten Pufferlösungen sind in Tabelle 2.14 zusammengetragen und wurden in Vorversuchen ausgewählt (siehe Kap. 2.3). Die Komponenten des Grundmediums (siehe Kap , Tab. 2.4) wurden dazu direkt dem jeweiligen Puffer zugesetzt und autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na 2 CO 3 ) wurde ungelöst autoklaviert und dem autoklavierten Grundmedium zugegeben. Der ph-wert wurde nach Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums kontrolliert und gegebenenfalls durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen ph-wert eingestellt (Sartorius PB-11). Mit steigendem ph-wert der gepufferten Kulturmedien (ph- Bereich von 8,5-10,0) konnte eine zunehmende Trübung des Mediums durch Ausfall von Salzen (z.b. Mg 2+ - und Ca 2+ -Ionen) festgestellt werden. 21

30 2. Material und Methoden Tab. 2.14: Verwendete Pufferlösungen im Bereich von ph 2-10 (siehe Kap. 2.3, Tab. 2.13) zur Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Verwendete Pufferlösungen ph-wert Clark and Lubs-Pufferlösung ph 2,0 Citronensäure-Natriumcitrat-Pufferlösung ph 3,0-5,0 Clark and Lubs-Pufferlösung ph 6,0 Tris-Maleat-Pufferlösung ph 7,0 Tris-HCl-Pufferlösung ph 8,0 und ph 8,5 Glycin-NaOH-Pufferlösung ph 9,0 und ph 10,0 Die gepufferten Versuchsansätze wurden aus einer Vorkultur (siehe Kap ) mit einer O.D. 600nm von 0,1 inokuliert und anschließend, wie in Kapitel beschrieben, inkubiert. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6) Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstum der heterotrophen Bakterien wurden ungepufferte Versuchsansätze und Versuchsansätze beim jeweiligen ph-optimum des heterotrophen Bakteriums bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR auf einem Inkubationsschüttler (Heidolph UNIMAX 2010) kultiviert (siehe Kap ). Die Vorkulturen (siehe Kap ) wurden ebenfalls bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR auf dem gleichen Inkubationsschüttler angezogen. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6) ph-wert-bestimmung in den Kulturüberständen Der ph-wert der Versuchskulturen wurde parallel zu den photometrischen Messungen sowie nach Beendigung der Wachstumsversuche bestimmt. Hierzu wurden jeweils 200 µl Zellkultur aus den Parallelansätzen für 1 min bei rpm zentrifugiert (Heraeus Instruments, Biofuge pico) und der ph-wert des Überstandes mit einem ph-streifen (Macherey-Nagel; ph 6,0-10,0) ermittelt. Die abschließende 22

31 2. Material und Methoden ph-bestimmung in den Kulturüberständen erfolgte nach Zentrifugation (Beckman, Avanti TM J-25 Centrifuge) der gesamten Zellkultur bei rpm für 10 min mittels einer ph-elektrode, gekoppelt an einem ph-meter (Sartorius PB-11). Es wurde eine Doppelbestimmung (n = 2) mit anschließender Berechnung der Mittelwerte durchgeführt. 2.7 Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL- Signalmolekülen Die Detektion von AHL-Signalmolekülen erfolgte mit Hilfe der AHL-Sensorbakterien Chromobacterium violaceum CV026 bzw. Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4). Diese Indikatorbakterien synthetisieren durch gentechnische Veränderungen keine AHL-Signalmoleküle, sind aber in der Lage diese nachzuweisen (siehe Kap und ). Die Sensorbakterien werden nachfolgend näher beschrieben Chromobacterium violaceum CV026 (MCCLEAN et al., 1997) In Abhängigkeit von der Zelldichte wird in C. violaceum die Produktion von Violacein reguliert. Dieses nicht-wasserlösliche, violette Pigment besitzt antimikrobielle Eigenschaften. Die Doppelmutante C. violaceum CV026 wurde durch minitn5 Transposonmutagenese generiert. Infolge der Insertion wurde die AHL-Produktion unterbrochen, gekoppelt mit einem Verlust der Pigmentierung. Der C. violaceum Wildtypstamm produziert N-hexanoyl-L-Homoserinlacton (C6-HSL) als einziges AHL- Signalmolekül, demzufolge der Stamm C. violaceum CV026 besonders sensitiv auf dieses Signalmolekül mit Violaceinproduktion reagiert. Der Sensorstamm eignet sich besonders für den Nachweis von kurzkettigen, unsubstituierten AHL-Signalmolekülen (vor allem C6-HSL) als Biosensor, wird hingegen von längerkettigen N-Acyl-L- Homoserinlactonen (Acyl-Seitenketten länger als C 8 ) sowie von N-Acyl-HSLs mit 3-Hydroxy-Substitution nicht zur Violaceinproduktion angeregt (STEINDLER und VENTURI, 2007). AHL-Signalmoleküle mit einer C 8 -, C 10 -, C 12 - und C 14 -Seitenkette sind jedoch fähig, bei vorheriger Zugabe von C6-HSL oder 3-oxo-C6-HSL in angemessener Konzentration, die Pigmentierung der Mutante zu inhibieren. 23

32 2. Material und Methoden Hierdurch kann mit diesem AHL-Biosensor ebenfalls ein Nachweis längerkettiger AHLs erzielt werden Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4) (FARRAND et al., 2002; SZENTHE und PAGE, 2003) Der Wildtypstamm von A. tumefaciens ist ein pflanzenpathogenes Bakterium, welches in seinen Wirtspflanzen Wurzeltumorwachstum induziert. Der Prozess der Tumorbildung wird durch die Übertragung der T-DNA (oncogenic DNA) und ihrer Integration in das Pflanzenchromosom verursacht. Die T-DNA ist ein kleiner Abschnitt des Ti-Plasmids in A. tumefaciens. Auf dem Ti-Plasmid sind weitere Gene, z.b. für den Transfer der T-DNA in die Wirtspflanze (vir-gene) und den konjugativen Transfer des Ti-Plasmids zwischen Stämmen von A. tumefaciens (tra-gene), lokalisiert. Die für einen konjugativen Transfer des Ti-Plamids nötigen Gene sind dabei in einer Regulationseinheit (tra-regulon) zusammengefasst. Bei A. tumefaciens wird dieser Transfer über Quorum Sensing gesteuert, wobei die LuxI/LuxR-homologen Proteine TraI und TraR des A. tumefaciens-qs-systems die Zelldichte-abhängige Expression des tra-regulons (tra-operon, trb-operon, tram) regulieren. TraI ist eine Autoinducer-Synthase und synthetisiert das AHL- Signalmolekül 3-oxo-C8-HSL. Das Protein TraR stellt den entsprechenden Transkriptionsaktivator dar. Bei hoher Zelldichte und ebenfalls hoher intrazellulärer N-Acyl-HSL-Konzentration bindet TraR das HSL-Molekül und aktiviert sowohl die Transkription der tra-gene als auch die Expression des trai-gens, letzteres resultierend in einer positiven Feedback-Schleife. Der AHL-Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) besitzt kein Ti-Plasmid, aber ein rekombinantes Plasmid (pzlr4). Dieses enthält Inserts von dem Plasmid ptic58 mit trar und einem tra-operon, welches eine trag::lacz-fusion aufweist. Neben diesen Genen sind die Gene für Gentamycin- und Carbenicillin-Resistenz auf dem Vektor kodiert, wobei Gentamycin das bestgeeignete Antibiotikum zur Selektion darstellt. Der Stamm ist eine AHL-Synthase-Mutante und somit nicht in der Lage, eigene AHL-Moleküle zu synthetisieren. Folglich reagiert der Stamm aufgrund der trag::lacz-fusion erst bei Anwesenheit geeigneter exogener AHL-Moleküle über die Aktivierung des TraR-Proteins mit der Expression der lacz-kodierten β-galaktosidase. TraR aktiviert dabei die Transkription des trag-gens, welches jedoch durch die Insertion des lacz-gens nicht exprimiert wird. Dementsprechend 24

33 2. Material und Methoden kann die Anwesenheit entsprechender AHL-Moleküle (bei ausreichender Konzentration) über die β-galaktosidase-aktivität durch Umsetzung des Substrates X-Gal zu einem hellblauen Farbstoff nachgewiesen werden. Der A. tumefaciens-sensorstamm detektiert ein breites Spektrum an AHL- Signalmolekülen und weist unter den bisweilen konstruierten Biosensoren gegenüber diesen Komponenten zudem mitunter die höchste Sensitivität auf (STEINDLER und VENTURI, 2007). Entsprechend des eigenen QS-Systems zeigt der Indikatorstamm eine höhere Sensitivität gegenüber 3-oxo-substituierten AHL-Signalmolekülen mit C 4 - bis C 12 -Seitenketten, vor allem gegenüber 3-oxo-C8-HSL. Weiter eignet sich der Sensorstamm, mit Ausnahme von C4-HSL, zum Nachweis unsubstituierter AHL- Moleküle sowie von 3-hydroxy-Derivaten mit C 6 -, C 8 - und C 10 -Seitenketten (STEINDLER und VENTURI, 2007). Weitere A. tumefaciens-stämme, welche in der vorliegenden Arbeit Verwendung fanden, waren der A. tumefaciens-stamm NTL4 und NT1 (ptic58 accr). Stamm NTL4 fehlt ein Ti-Plasmid und ist demzufolge nicht fähig, AHL-Moleküle zu synthetisieren. Neben dieser AHL-Negativkontrolle wurde der Stamm NT1 (ptic58 accr) als AHL-Positivkontrolle eingesetzt, da dieser aufgrund eines veränderten Ti-Plasmids (tra c ) konstitutiv die tra-gene exprimiert und folglich auch konstitutiv N-Acyl-HSLs synthetisiert Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo und Bo Zur Untersuchung der AHL-Produktion in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern variierten die Kultivierungsbedingungen für die Stämme Bo und Bo Für die Extraktion von AHL-Molekülen (siehe Kap ) wurden die Bakterienstämme in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 250 ml Endvolumen angezogen. Die Inokulation und Anzucht der jeweiligen Versuchsansätze wurden in den jeweiligen unten genannten Kapiteln zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der heterotrophen Bakterienstämme beschrieben. Zur Ermittlung des ph-wert-einflusses auf die AHL-Produktion wurden die AHL- Gehalte bei dem jeweiligen ph-minimum, ph-optimum und ph-maximum der 25

34 2. Material und Methoden heterotrophen Bakterien im Dunkeln bei 21 C verglichen (siehe Kap ). Des Weiteren wurden ungepufferte Versuchsansätze im Dunkeln (siehe Kap ) und bei einer Photonenflussdichte von 5 µe m -2 s -1 PAR (siehe Kap ) bei 21 C kultiviert und auf Signalmoleküle untersucht. Die Produktion von AHL- Signalmolekülen wurde in der stationären Wachstumsphase, für die ungepufferten und ph-optimalen Ansätze zudem in der logarithmischen Wachstumsphase untersucht. Die generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2 und 3.3) dienten der Anzucht als Referenz. Zur Überprüfung einer Korrelation des Zellwachstums zwischen 250 ml und 25 ml Versuchsansätzen, wurde das Wachstum der Kulturen stichprobenartig durch photometrische Messungen der O.D. 600nm kontrolliert. Ferner war die AHL-Produktion in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur und von der Kohlenstoffquelle von Interesse. Hierzu wurden Versuchsansätze mit ungepuffertem ASN III/2 -Medium (siehe Kap ) bei 28 C im Dunkeln und zur Untersuchung des Einflusses der Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion im ASN III/2 -Medium mit 0,1% Fleischextrakt bei 21 C im Dunkeln kultiviert. Die Inokulation und Anzucht der Versuchskulturen erfolgte wie in Kapitel beschrieben, wobei die Vorkulturen für die 28 C Inkubation (Temperaturversuch) bei gleicher Temperatur angezogen wurden. Die jeweilige Inkubationsdauer der Versuchskulturen ist im Anhang als Tabelle 7.1 hinterlegt Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit dem Cyanobakterium Stamm Flo 1 Zur Untersuchung der AHL-Produktion durch Stamm Flo 1 wurden Versuchsansätze mit ungepuffertem Kulturmedium (siehe Kap ) sowie gepufferten Kulturmedien (ph 7,0, 8,0, 8,5 und 9,0) bei einer konstanten Temperatur von 21 C und einem konstanten Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR für 14 Tage (logarithmische Phase) bzw. 21 Tage (stationäre Phase) kultiviert. Die Inkubationsdauer wurde auf Grundlage der von SCHRÜBBERS (2007) erzielten Ergebnisse gewählt. Die eingesetzten Vorkulturen wurden 3-4 Wochen an die Wachstumsbedingungen adaptiert (siehe Kap ) und anschließend bei rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman, Avanti TM J-25 Centrifuge). Der Kulturüberstand wurde verworfen, die cyanobakterielle Biomasse vereinigt und homogenisiert. Mit Hilfe einer Analysenwaage (Sartorius, MC 1 Research RC 210P) wurden jeweils 1000 mg Homogenat in sterile ERG eingewogen und als Inokulum für die 250 ml AHL- 26

35 2. Material und Methoden Versuchsansätze eingesetzt. Die Weiterbehandlung der Ansätze nach Beendigung der Anzucht ist in Kapitel beschrieben. Für die Versuchsreihe wurden für ph 7,0 und 8,0 Tris-HCl-Pufferlösungen, für ph 8,5 und 9,0 Clark and Lubs-Pufferlösungen verwendet (siehe Kap. 2.3). Das Ansetzen der gepufferten Kulturmedien erfolgte wie in Kapitel beschrieben. Nach Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums wurde der ph-wert kontrolliert und gegebenenfalls durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen ph- Wert eingestellt (Sartorius PB-11) Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo Herstellung zellfreier Kulturüberstände Nach erfolgter Inkubation der 250 ml Zellkulturen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo (siehe Kap ) sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 (siehe Kap ) wurden diese bei xg für 30 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert (Beckman, Avanti TM J-25 Centrifuge) und der Zellkulturüberstand anschließend sterilfiltriert (sterilfiltriert; 0,2 µm Porengröße). Die bakterielle Biomasse wurde entweder bei -20 C gelagert oder sofort für intrazelluläre AHL-Untersuchungen weiterverwendet (siehe Kap ) Azidifizierung von Kulturüberständen (YATES et al., 2002) Eine Azidifizierung von ungepufferten Kulturüberständen der heterotrophen Stämme Bo und Bo sowie des cyanobakteriellen Stammes Flo 1 wurde nach YATES und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Nach Gewinnung von zellfreien Überständen (siehe Kap ) wurden diese mit konzentrierter HCl auf einen ph- Wert < 2 eingestellt und anschließend für 24 h bei 21 C inkubiert. Die Weiterbehandlung erfolgte wie in Kapitel beschrieben. 27

36 2. Material und Methoden Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen (GEISENBERGER, 2000) Die Extraktion von AHL-Signalmolekülen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 erfolgte aus 250 ml Zellkulturüberstand nach GEISENBERGER (2000). Hierzu wurde zellfreier Kulturüberstand (siehe Kap ) in einen 1000 ml Scheidetrichter vorgelegt, zweimal mit 100 ml Dichlormethan versetzt und für 10 min durch kräftiges Schütteln gemischt. Ein ausreichender Druckausgleich wurde durch zwischenzeitliche Belüftung des Scheidetrichters gewährleistet. Nach deutlicher Phasentrennung wurde die untere Dichlormethan-Phase in einem 250 ml Erlenmeyerkolben aufgefangen. Restliches Wasser in den vereinigten Dichlormethanextrakten wurde vollständig durch Zugabe von wasserfreien Natriumsulfat und anschließendem Rühren entfernt. Nachfolgend wurden die Extrakte gefiltert (Sartorius 3 hw) und im Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei einer Wasserbadtemperatur von C ohne Anlegen eines Vakuums eingetrocknet. Alternativ wurden die gefilterten Extrakte unter dem Abzug offen stehen gelassen, wodurch diese eindampften. Die Aufnahme des Rückstandes erfolgte in 250 µl Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v) Essigsäure). Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20 C. Vibrio sp. wurde für einen positiven Extraktionsnachweis bzw. als positive AHL- Kontrolle im Leuchtbakterien-Medium (siehe Kap ) bei 4 C im Dunkeln angezogen, wobei Bakterienmaterial aus einer 24 h-übernachtkultur (ÜK) als Inokulum verwendet wurde. Die ÜK wurde mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Kultivierung wurde nach Auftreten deutlicher Lumineszenz abgebrochen Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen Für den Nachweis von intrazellulären AHL-Signalmolekülen wurde die AHL- Extraktion aus Bakterienzellen nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in abgeänderter Form durchgeführt. Nach Zentrifugation einer 250 ml Zellkultur (siehe Kap ) wurde das Zellpellet vollständig vom Überstand befreit und die gesamte bakterielle Biomasse in 40 ml 4 C kaltem Ethanol resuspendiert und anschließend für 72 h bei 4 C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde die Zellsuspension für 5 min bei rpm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, 30 ml der organischen Phase ohne Aufnahme von Zellsediment entnommen und diese in einem 28

37 2. Material und Methoden Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei RT mit Anlegen eines Vakuums eingetrocknet. Der Rückstand wurde in 1-1,5 ml 10 mm Ammoniumacetat (ph 6,5) aufgenommen, erneut mit Hilfe des Rotationsevaporators auf ein Endvolumen von 250 µl eingeengt und anschließend bei -20 C gelagert Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signalmolekülen Die Dünnschichtchromatographie ist eine chromatographisches Trennmethode, bei der ein Lösungsmittel oder eine Lösung eines Substanzgemisches (mobile Phase) über ein Sorptionsmittel (stationäre Phase), meistens Silicagel (Kieselgel), geleitet wird (LOTTSPEICH und ZORBAS, 1998). Bei dieser Adsorptionschromatographie befindet sich letzteres als dünne Schicht auf einem Träger. Die in der mobilen Phase gelösten Substanzen haben unterschiedliche Affinität zur mobilen bzw. stationären Phase, resultierend in unterschiedlichen Laufstrecken der einzelnen gelösten Substanzen. Bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Umkehrphasen- Chromatographie (reversed phases chromatography) kommt es durch eine unpolare, chemisch modifizierte stationäre Phase (Kieselgel lipophilisiert mit unpolaren C 18 - Alkylresten) zu einer verbesserten Auftrennung hydrophober Substanzen in einem stark polaren Laufmittelgemisch (mobile Phase), da unpolare Substanzen stärker zurückgehalten werden (STADLBAUER, 2006). Die Auftrennung der N-Acyl-L-Homoserinlacton-Extrakte wurde mit Umkehrphasen- Dünnschichtchromatographie-Platten (RP-18 W/UV F254s, 20x20 cm, Macherey- Nagel, Düren, Deutschland) nach Geisenberger (2000) mit geringfügiger Modifikation durchgeführt. Die Ethylacetat- und Ammoniumacetatlösungen (siehe Kap und ) wurden entlang einer Auftragslinie in einem Abstand von 2,0 cm auf die DC-Platte aufgetragen. Der Abstand vom unteren Rand und von den beiden Seitenrändern der DC-Platten betrug dabei 2,0 cm. Das Probenvolumen der Ethylacetat- bzw. Ammoniumacetatlösungen variierte in Abhängigkeit von dem Testorganismus und dem verwendeten Biosensor zwischen 2,0 µl und 100 µl, wobei die Proben parallel zur Auftragung mit einem kalten Luftstrom eingetrocknet wurden. Für die dünnschichtchromatographische Auftrennung der Extrakte wurden 110 ml Laufmittelmischung aus Methanol und Aqua bidest (60:40 (v/v)) verwendet (ca. 0,7 cm Höhe) und die Seitenwände der DC-Kammer anschließend mit Filterpapier (Sartorius 3 hw) ausgekleidet. Die DC-Platten wurden bei vollständiger Sättigung der 29

38 2. Material und Methoden Kammer (24 h) in diese gestellt. Nach ca. vierstündigem Lauf lag die Lösungsmittelfront ca. 2 cm unterhalb des oberen DC-Plattenrandes, und die DC- Platten wurden aus der Kammer genommen. Nach Markierung der exakten Höhe der Lösungsmittelfront erfolgte die Trocknung der DC-Platten mit kalter Luft eines Föns für 1 h unter dem Abzug. Die DC-Platten konnten, eingewickelt in Frischhaltefolie, zur Aufbewahrung bei -20 C gelagert werden Visualisierung der DC-Signale Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme Vorkulturen wurden stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Voranzucht erfolgte in 50 ml, die Anzucht der Versuchskulturen in 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Inkubationsschüttler (New Brunswick Scientific innova TM 4000 Incubator Shaker). Eine A. tumefaciens-vorkultur wurde als Übernachtkultur (ÜK) in 5 ml ABG-Medium (siehe Kap ) bei 28 C und 200 rpm angezogen. Als ÜK wurden Kulturen definiert, welche h inkubiert wurden. Die Vorkultur wurde anschließend mit 45 ml Kulturmedium versetzt und unter gleichbleibenden Bedingungen bis in die spät-exponentielle Phase angezogen. Alternativ konnten 50 ml Kulturmedium mit 1 ml Vorkultur inokuliert werden. Die Anzucht erfolgte bei 28 C und 200 rpm für 24 h. C. violaceum wurde zur Voranzucht als Übernachtkultur (ÜK) bei 30 C und 120 rpm in 5 ml LB-Medium (siehe Kap ) angezogen. Anschließend wurden 50 ml LB-Medium mit 1 ml Vorkultur angeimpft und bei 30 C und 120 rpm für 24 h inkubiert. Die Vorkulturen der verwendeten bakteriellen Biosensoren wurden unter Selektionsdruck durch Zugabe verschiedener Antibiotika kultiviert. Hierzu wurde das LB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin, das ABG-Medium mit 30 µg/ml Gentamycin und 100 µg/ml Carbenicillin versetzt. Die Anzucht der weiteren A. tumefaciens-stämme NTL4 und NT1 (ptic58 accr) erfolgte ebenfalls als ÜK in 5 ml ABG-Medium bei 28 C und 200 rpm. 30

39 2. Material und Methoden Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien Zur Detektion der AHL-Signalmoleküle auf der DC-Platte wurde diese mit 150 ml Indikatorbakterienkultur in Weichagar überschichtet. Hierzu wurden die DC-Platten in einen Kunststoffrahmen, ausgekleidet mit Klarschichtfolie, eingesetzt. 50 ml Biosensorkultur A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) bzw. C. violaceum CV026 wurden mit 100 ml ABG-Weichagar (siehe Kap ) bzw. LB-Weichagar (siehe Kap ) bei einer Temperatur von ca. 42 C versetzt und ohne Erzeugung von Luftblasen gemischt. Vor Zugabe der A. tumefaciens-kultur wurden dem ABG-Weichagar bei einer Temperatur < 50 C 90 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D- Galactopyranosid) zugesetzt, resultierend in einer Endkonzentration von 60 µg/ml. Das X-Gal wurde als Stammlösung in N,N-Dimethylformamid (20 mg/ml) angesetzt und bei - 20 C gelagert. Nach Überschichtung der DC-Platten und Verfestigung des Agars wurden die DC-Platten in einer luftdichten Kammer, ausgekleidet mit feuchtem Küchenpapier, bei 28 C (Heraeus Instruments, kelvitron t) für 48 h inkubiert. Durch Auftragung der AHL-Extrakte auf überschichtete Festagarplatten ohne den jeweiligen Biosensor, wie in Kapitel beschrieben, wurden Negativkontrollen durchgeführt. Eine Extraktion des unbeimpften Kulturmediums (siehe Kap ) und anschließender Auftragung auf A. tumefaciens-indikatorplatten (siehe Kap ) diente als weitere Negativkontrolle Auswertung und Dokumentation der DC-Platten Die Auswertung der überschichteten DC-Platten wurde nach einer Bebrütung bei 28 C für 48 h durchgeführt. Aufgetrennte AHL-Moleküle konnten je nach verwendetem Biosensor anhand violetter Spots bei C. violaceum CV026 bzw. hellblauer Spots durch die β-galaktosidase-aktiviät von A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) lokalisiert und identifiziert werden. Die Intensität und Größe der DC-Signale konnte bei längerer Inkubationszeit leicht zunehmen. Durch einen Größenvergleich der Flecken konnten halbquantitative Aussagen gemacht werden. Als Referenz wurden synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL), gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v) Essigsäure), auf die DC-Platten aufgetragen. Die DC-Spots wurden mit den synthetischen Referenzmolekülen (Standards) verglichen und somit eine Eingrenzung an potentiellen AHLs bzw. eine Identifizierung von AHLs erreicht. Die Referenzmoleküle dienten des Weiteren dazu, die Nachweisgrenzen des jeweiligen Sensorsystems einzuschätzen. Die Auftragung 31

40 2. Material und Methoden der synthetischen AHLs wurde so bemessen, dass in etwa vergleichbare Signalintensitäten erhalten werden sollten. Die aufgetragenen AHL-Mengen für die verschiedenen Biosensoren sind in Tabelle 2.15 dargestellt und wurden durch Agarplattentests (siehe Kap und 3.4.1) und dünnschichtchromatographische Voruntersuchungen ermittelt. Tab. 2.15: Eingesetzte Stoffmengen der synthetischen AHL-Moleküle zum dünnschichtchromatographischen Nachweis unter Verwendung der Biosensoren A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) und C. violaceum CV026 AHL-Molekül A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) C. violaceum CV026 eingesetzte Stoffmenge (in mol) eingesetzte Stoffmenge (in mol) C4-HSL 1,5 x 10-9 bis 2 x x 10-8 C6-HSL 1,5 x x 10-9 C8-HSL 2,5 x x 10-9 Aufgrund einer begrenzten Anzahl zur Verfügung stehender Referenzmoleküle wurden zudem die R f -Werte (retention factor) der DC-Signale bestimmt. Ein Abgleich der R f -Werte der DC-Signale mit Literaturwerten zur Identifizierung der AHL- Signalmoleküle konnte jedoch nicht durchgeführt werden, da die ermittelten R f -Werte der Referenzmoleküle nicht mit den bekannten R f -Werten (SHAW et al., 1997) übereinstimmten Der R f -Wert errechnet sich als Quotient aus Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke des Laufmittels vom Startpunkt aus (LOTTSPEICH und ZORBAS, 1998). Für die Dokumentation erfolgten alle Aufnahmen von DC-Platten in der vorliegenden Arbeit mittels Digitalkamera Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHLproduzierender Bakterien Zum schnellen Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurden verschiedene Screeningverfahren in einer Voruntersuchung getestet (siehe Kap und ), wobei ein Nachweis über die Biosensoren Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4) und Chromobacterium violaceum CV026 (siehe Kap ) erfolgen sollte. Des Weiteren wurde ein Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) durchgeführt (siehe Kap ). Alle Aufnahmen von Agarplatten in der vorliegenden Arbeit erfolgten mittels Digitalkamera. 32

41 2. Material und Methoden Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) Zur Detektion von AHL-produzierenden Bakterien wurde ein Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) durchgeführt. Anstelle von LB-Agarplatten (siehe Kap ) wurden ASN III/2 -Agarplatten (siehe Kap ) verwendet, da die zu testenden Bakterienstämme aufgrund zu geringer Salinität des LB-Mediums nicht auf diesem Agarmedium wuchsen. Für einen Nachweis mit dem Indikatorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) wurde das Festmedium zusätzlich nach dem Autoklavieren bei einer Temperatur < 50 C mit 50 µg/ml X-Gal versetzt. 50 µl einer 24 h-übernachtkultur des auf AHL zu testenden Bakterienstammes (siehe Kap ) wurden auf einer Agarplatte mit einer Impföse als Bakterienstreifen ausplattiert. In einem geringen Abstand zum Testorganismus wurden anschließend parallel 50 µl des jeweiligen Sensorstammes aus einer ÜK (siehe Kap ) auf der Agarplatte ausgestrichen. Das jeweilige Sensorbakterium wurde als Negativkontrolle eingesetzt, wobei bei Verwendung des Sensorstammes A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) zudem der Ti-plasmidlose Stamm A. tumefaciens NTL4 als Negativkontrolle verwendet werden konnte. Zur Untersuchung einer Temperatur-abhängigen Produktion von AHL- Signalmolekülen erfolgte die Inkubation bei 21 C (Brutraum), 28 C und 37 C (Heraeus Instruments, kelvitron t) für 24 h. Ein AHL-Nachweis wurde durch eine violette Pigmentierung der Mutante C. violaceum CV026 bzw. einer Blaufärbung des Indikatorstammes A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) erbracht. Eine Bewertung der AHL- Produktion wurde über die Intensität der Färbung vorgenommen Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) Zum weiteren Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurde ein Screeningtest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Zur Herstellung der verwendeten A. tumefaciens-indikatorplatten wurden ABG-Agarplatten (siehe Kap ) mit jeweils 4-5 ml ABG-Weichagar (siehe Kap ) überschichtet, welcher zuvor mit A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) versetzt worden war. Die Anzucht des Sensorstammes erfolgte wie in Kapitel , das Versetzen der Kultur mit dem Weichagar wie in Kapitel beschrieben. Die Fest- und Weichagar enthielten zusätzlich 50 µg/ml X-Gal, welches nach dem Autoklavieren bei einer Temperatur < 50 C hinzugesetzt wurde. Nach Verfestigung des Weichagars wurden 30 µl einer 24 h-übernachtkultur des zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstammes (siehe Kap ) oder 30 µl Kulturüberstand einer ungepufferten 14 Tage bzw. 33

42 2. Material und Methoden 21 Tage alten Geitlerinema Flo 1-Kultur (siehe Kap ) auf die A. tumefaciens- Indikatorplatte aufgetragen. Eine ÜK des AHL-produzierenden Stammes A. tumefaciens NT1 (ptic58 accr) (siehe Kap ) wurde mit gleichem Auftragungsvolumen als Positivkontrolle eingesetzt. Überschichtete Agarplatten ohne Biosensor, auf denen die Proben aufgetragen wurden, dienten als Negativkontrollen. Zusätzliche Negativkontrollen mit A. tumefaciens-indikatorplatten und unbeimpftem Kulturmedium als Probe sollten eine Aktivierung des AHL-Reporters durch im Medium enthaltene Komponenten ausschließen. Die Bebrütung der Indikatorplatten und Negativkontrollen erfolgte bei 28 C (Heraeus Instruments, kelvitron t) für 24 h. Bei der Auswertung der Indikatorplatten wurde eine diffuse blaue Zone im Bereich der Auftragung als Nachweis einer AHL-Produktion gewertet Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) Zum Nachweis von kurzkettigen AHLs mit dem Sensorbakterium C. violaceum CV026 wurde der Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) durchgeführt. Als Kontrolle wurden synthetische AHL-Moleküle eingesetzt, wobei die Sensitivitäten (Nachweisgrenzen) sowie Spezifitäten von Stamm C. violaceum CV026 gegenüber bestimmten AHL-Molekülen untersucht wurden. Zur Herstellung von C. violaceum-indikatorplatten wurden LB-Agarplatten (siehe Kap ) mit jeweils 4-5 ml LB-Weichagar (siehe Kap ) überschichtet, versetzt mit C. violaceum CV026. Die Anzucht des Indikatorbakteriums erfolgte wie in Kapitel , das Versetzen der C. violaceum CV026-Kultur mit dem Weichagar wie in Kapitel beschrieben. Nach Verfestigung des Weichagars wurden in einem Abstand von ca. 2 cm steril Löcher (Ø 6 mm) in den Agar gestanzt. In die Löcher wurden 5 x 10-9 mol und 5 x 10-8 mol synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL), gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v) Essigsäure), bzw. je 10 µl AHL-Extrakt (siehe Kap ) pipettiert und mit LB-Medium (siehe Kap ) auf ein Endvolumen von 50 µl aufgefüllt. Als Negativkontrolle wurden 10 µl Ethylacetat mit 40 µl LB-Medium versetzt und eingesetzt. Die Agarplatten wurden 48 h bei 30 C im Brutschrank (Heraeus Instruments, kelvitron t) inkubiert. Eine violette Pigmentierung des bakteriellen Teppichs um die Auftragungspunkte wurde als ein Nachweis für intakte AHL- 34

43 2. Material und Methoden Moleküle gewertet, wobei sich die AHL-Konzentration in der Spotgröße widerspiegelte. 2.8 Molekularbiologische Untersuchungen In der vorliegenden Arbeit wurden des Weiteren die Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 molekularbiologisch untersucht. Bei beiden Mikroorganismen wurden die 16S-rDNA und als weitere Möglichkeit zur Einordnung auf molekularer Ebene das Gen gyrb mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Zudem erfolgte die Amplifikation der ITS (internal transcribed spacer) von Stamm Bo 10. Diese nichtkodierenden intergenischen Regionen sind zwischen den 16S-rRNA-, 23S-rRNAund 5S-rRNA-Genen lokalisiert. Die Anzahl und Größe der amplifizierten ITS- Regionen stellen einen zusätzlichen taxonomischen Marker zur phylogenetischen Einordnung von Mikroorganismen dar (ITEMAN et al., 2002). Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo (HUBE, 2008) sowie für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 (SCHRÜBBERS, 2007) wurden in diesem Zusammenhang von den genannten Autoren bereits 16S-rDNA-Sequenzierungen mit anschließender phylogenetischer Einordnung durchgeführt. Ergänzend sollte in der vorliegenden Arbeit eine Amplifikation der ITS von Stamm Flo 1 sowie eine Amplifikation und Sequenzierung des gyrb-gens der Stämme Bo und Bo durchgeführt werden. Auf Basis der erstellten Sequenzen sollten über die Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen Verwandtschaftsbeziehungen aufgezeigt werden. Stamm Bo 53 wurde freundlicherweise von Dr. B. Heyduck-Söller, Stamm Bo 10 von Dipl.-Biologin A. Hube zur Verfügung gestellt. Chromosomale DNA vom Stamm Flo 1 und vom Referenzstamm Geitlerinema PCC 7105 wurde von Dipl.-Biologen J. Schrübbers für die Untersuchungen überlassen Extraktion der chromosomalen DNA nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) Für die DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) (modifiziert nach HEYDUCK-SÖLLER, 2003) wurden 8-10 Tage alte Cyanobakterienkulturen von Stamm Bo 53 und Stamm Bo 10 verwendet, die bei konstanten 21 C und einer konstanten Photonenflussdichte von 1 µe m -2 s -1 PAR gehältert wurden. Die Anzucht der heterotrophen Stämme Bo und Bo erfolgte als Übernachtkultur bei 35

44 2. Material und Methoden einer konstanten Temperatur von 21 C und 120 rpm im Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) (siehe Kap ). 1 ml der jeweiligen Kultur wurde für 5 min bei rpm zentrifugiert (Heraeus Instruments, Biofuge pico). Der Überstand wurde verworfen, die Kultur anschließend mit 1 ml STE-Puffer (100 mm NaCl; 10 mm Tris-HCl, ph 8,0; 1 mm Na 2 EDTA, ph 8,0) versetzt und wie oben beschrieben erneut zentrifugiert. Nach Dekantierung des Überstandes wurde erneut 1 ml STE-Puffer auf den Ansatz pipettiert, wobei cyanobakterielle Proben zum Ablösen der heterotrophen Begleitflora in einem Ultraschallbad (Elma, Transsonic Digital) bei 20 C für 10 min bei maximaler Stärke beschallt wurden. Die Ultraschallbad-Behandlung wurde bei nicht der DNA- Extraktion aus den heterotrophen Bakterien durchgeführt. Nach Zentrifugation (5 min und rpm) und Dekantierung des Überstandes wurde nochmals 1 ml STE-Puffer hinzugesetzt, anschließend zentrifugiert (siehe oben) und der Überstand vollständig entfernt. Nachfolgend wurde der Ansatz mit 400 µl STE-Puffer überschichtet sowie mit autoklavierten Glasperlen (Ø 0,1-0,2 µm; Fa. BIOmatik GmbH) im gleichen Volumenanteil (des jeweiligen Pellets) und mit 1 ml 75 C heißem Phenol versetzt. Nach Vortexen auf einem Whirl-Mixer für sec und anschließender Kühlung auf Eis erfolgte zur Trennung von Phenol- und wässriger Phase eine Zentrifugation (Beckman GS-15R) für 20 min bei 4 C und rpm. Die DNA-enthaltende obere wässrige Phase wurde in ein steriles ERG überführt und das Volumen bestimmt. Anschließend wurden 2 µl Poly A RNA (10 mg/ml) zugegeben. Zur Entfernung von eventuell noch vorhandenen Proteinen wurde 1 Volumenanteil Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 (v/v)) hinzugesetzt, anschließend gevortext und für 5 min bei rpm zentrifugiert. Ein Großteil der oberen wässrigen Phase (350 µl) wurde in ein steriles ERG überführt und mit 0,1 Volumenanteil 3 M Natriumacetat (ph 5,2) versetzt. Zur Fällung der DNA erfolgte die Überschichtung mit 0,8 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol, anschließender Lagerung bei -80 C für 20 min und Zentrifugation bei rpm für 30 min. Nach Dekantierung des Überstandes wurde das Pellet zur vollständigen Entfernung von eventuell vorhandenen Salzen mit 1 ml frisch angesetztem 70%igem Ethanol versetzt und nach Durchmischung für 10 min bei rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes erfolgte die Zugabe von 1 ml Ethanol abs. und eine erneute Zentrifugation (s.o.). Das vom Überstand befreite DNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur (RT) zum Trocknen für 1 h stehengelassen. Abhängig von der 36

45 2. Material und Methoden DNA-Menge wurde das Pellet in µl TE-Puffer (10 mm Tris-HCl, ph 8,0; 1 mm Na 2 EDTA, ph 8,0) über Nacht bei RT resuspendiert. Die DNA wurde im Dunkeln bei 4 C gelagert Bestimmung der DNA-Konzentration Die Konzentration und die Reinheit der extrahierten DNA wurden mit Hilfe eines Spektralphotometers (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) photometrisch bei Wellenlängen von 260 und 280 nm ermittelt. Zur Quantifizierung der DNA wurde die Absorption der eingesetzten DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die Reinheitsbestimmung der DNA erfolgte über das Verhältnis der Absorptionen bei 260 und 280 nm (A 260nm /A 280nm ) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrb-gens und der ITS (siehe Kap. 2.8) wurde eine Standard-PCR durchgeführt. Hierzu wurde standardmäßig jeweils ein PCR- Ansatz mit 50 µl Endvolumen pipettiert, dessen Zusammensetzung in Tabelle 2.16 dargestellt ist. Für die PCR wurde ein Vielfaches der angegebenen Mengen in Form eines Mastermix (ohne DNA-Template) angesetzt und auf die PCR-Reaktionsgefäße verteilt. Die Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifikation und Sequenzierung der 16S-rDNA, des gyrb-gens und der ITS sind in Tabelle 2.17 zusammengefasst. 37

46 2. Material und Methoden Tab. 2.16: PCR-Ansatz zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrb-gens und der ITS Reagenz Endkonzentration Menge/Ansatz (µl) Nukleasefreies Wasser a) 28,1 10 x PCR-Puffer 1x 5,0 MgCl 2 (25 mm) 2 mm 4,0 dntps (10 mm) 200 µm 1,0 Forward-Primer (10 µm) 0,8 µm 4,0 Reverse-Primer (10 µm) 0,8 µm 4,0 BSA (20 mg/ml) 1 mg/ml 2,5 DNA-Polymerase (5 U/µl) a) 2 U 0,4 DNA-Template b) 1,0 Summe 50,0 a) Platinum-Taq-Gold, Invitrogen b) Zur Amplifikation der ITS wurden 2 µl DNA-Template und dementsprechend 27,1 µl Nukleasefreies Wasser pro PCR-Ansatz eingesetzt. Tab. 2.17: Zusammenstellung der verwendeten Primer mit den jeweiligen Sequenzen Primerbezeichnung 5` 3`-Sequenz Verwendung Referenz 8F (GM3F) (Forward-Primer) AGA GTT TGA TCC TGG C 16S-rDNA LANE (1991) 1494R (Reverse-Primer) GTA CGG CTA CCT TGT TAC GAC 16S-rDNA TATON et al. (2003) 380F a) (Forward-Primer) TTT TCC GCA ATG GGC G 16S-rDNA YAN (2005) GM4F (1507F) (Forward-Primer) GAA GTC GTA ACA AGG TA ITS LANE (1991) 23R23S (Reverse-Primer) GTG CCT AGG TAT CCA CC ITS YAN (2005) GB/3MF (Forward-Primer) AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG gyrb GB/CR-2 (Reverse-Primer) CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC gyrb SEO und YOKOTA (2003) SEO und YOKOTA (2003) a) Primer 380F wurde als interner Primer zur Sequenzierung der cyanobakteriellen 16S-rDNA eingesetzt Die Ansätze wurden nach Zugabe des jeweiligen DNA-Templates mit 30 µl sterilfiltriertem Paraffinöl als Verdunstungsschutz überschichtet. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Biometra Personal Cycler TM durchgeführt, wobei zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrb-gens und der ITS unterschiedliche Cycler-Programme verwendet wurden, dargestellt in den Tabellen 2.18 bis Eine Negativkontrolle mit nukleasefreiem Wasser anstelle des jeweiligen DNA-Templates wurde als Blindprobe mitgeführt. 38

47 2. Material und Methoden Tab. 2.18: PCR-Programm zur Amplifikation der 16S-rDNA aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 Programmschritte und Anzahl der Zyklen Temperatur ( C) Dauer (sec) 1x Startdenaturierung 93,0 120 Denaturierung 93, x Annealing 45,0 35 Elongation 72, x Finale Elongation 72, x Kühlung 20,0 1 Tab. 2.19: PCR-Programm zur Amplifikation der ITS aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10, Flo 1 und PCC 7105 Programmschritte und Anzahl der Zyklen Temperatur ( C) Dauer (sec) 1x Startdenaturierung 94,0 120 Denaturierung 94, x Annealing 50,0 45 Elongation 72,0 60 1x Finale Elongation 72, x Kühlung 20,0 1 Tab. 2.20: PCR-Programm zur Amplifikation des gyrb-gens aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 Programmschritte und Anzahl der Zyklen Temperatur ( C) Dauer (sec) 1x Startdenaturierung 94,0 120 Denaturierung 94, x Annealing 50,0 60 Elongation 72, x Finale Elongation 72, x Kühlung 20, Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte Zur Kontrolle der Standard-PCR wurden die 16S-rDNA- und gyrb-amplifikate auf ein 1%iges, die ITS-Amplifikate auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und Gelelektrophoresen (peqlab-elektrophoresekammer) durchgeführt. Dazu wurden 5 µl 16S-rDNA- bzw. gyrb-pcr-produkt mit 1 µl 6x Loading Dye versetzt und in eine Geltasche pipettiert. Für die Auftrennung der ITS-Amplifikate wurden je 20 µl PCR- Produkt eingesetzt, versetzt mit 1/5 Volumenanteil 6x Loading-Dye. Als Referenz wurde ein Molekulargewichtsmarker (Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI Fermentas) mitgeführt, wobei das eingesetzte Volumen dem des jeweiligen PCR- 39

48 2. Material und Methoden Produktes entsprach. Bei einer angelegten Spannung von 70 V (Power Pac 300, Biorad) betrug die Laufzeit der 16S-rDNA-Produkte und der gyrb-amplifikate ca. 1 h, die der ITS-Produkte ca. 3 h bei 50 V Spannung. Nach anschließender Gelfärbung für 15 min in 0,1%iger Ethidiumbromid-Lösung erfolgte die Auswertung am Transilluminator (Fluco-Link, Biometra) unter UV-Licht bei 254 nm. Die 16S-rDNA- PCR-Produkte bzw. gyrb-pcr-produkte sollten bei 1500 bp bzw bp eine deutliche Bande aufweisen, während die Bandenanzahl und die Fragmentgröße der ITS-Amplifikate variieren konnten. Die Amplifikate der 16S-rDNA von Stamm Bo 10 wurden durch Extraktion (siehe Kap ) der 1500 bp-bande aus dem Gel erhalten, da das PCR-Produkt mehrere Banden im Gel aufwies. Hierzu erfolgte eine Auftrennung des gesamten PCR- Produkts in einem 2%igen Agarosegel in mehreren Gelläufen. Die Laufzeit betrug 10 h bei einer angelegten Spannung von 50 V Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten Die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde mittels des Qiagen QIAquick PCR Purification -Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA-Eluierung erfolgte in 40 µl EB-Puffer. Die Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarosegelen erfolgte unter Verwendung des QIAquick Gel Extraktion -Kits (Qiagen) nach Angaben des Herstellers. Die DNA wurde in 40 µl EB-Puffer eluiert. Die Konzentration an PCR-Produkt wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) bestimmt (siehe Kap ) Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrb-gens Die Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrb-gens mittels aufgereinigter PCR- Produkte wurde von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) unter Verwendung der in Kapitel 2.8.3, Tabelle 2.17 aufgeführten Primer durchgeführt Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen Das Alignment der Teilsequenzen wurde mit dem Programm ChromasPro durchgeführt. Die generierten Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 wurden unter Anwendung von nucleotide BLAST mit den gegenwärtig hinterlegten Sequenzen der öffentlichen NCBI-Datenbank 40

49 2. Material und Methoden ( Stand: März 2008) verglichen. Basierend auf den erzielten Ergebnissen erfolgte unter Abgleichung mit Sequenzen von Referenzstämmen mit den größten Homologien aus der NCBI-Datenbank die Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes. Das Alignment der ausgewählten Sequenzen sowie das Zuschneiden der Alignmentsequenzen wurden mit den Programmen Bioedit und GeneDoc durchgeführt. Die phylogenetischen Stammbäume wurden mit der Neighbor-Joining -Methode (NJ) mit dem Programm MEGA (Version 4.0) konstruiert. Die Berechnung der evolutionären Distanzen zwischen den Sequenzen erfolgte nach der Methode von JUKES und CANTOR (1969). Die evolutionäre Distanz ergbt sich aus dem Verhältnis zwischen verschiedenen Basen zweier gleichlanger Sequenzen zu allen Basen der Sequenz. Eine statistische Absicherung der Topologie der phylogenetischen Stammbäume erfolgte durch 1000 Wiederholungen der Bootstrap-Analysen. 2.9 Herkunft der verwendeten Chemikalien Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wiesen p.a.-qualität oder HPLC-Grade auf und wurden von den folgenden Firmen bezogen: Acros Organics (Geel, Belgien), AppliChem (Darmstadt, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz), Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland), Jannsen Chimica (Geel, Belgien), MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Qiagen (Hilden, Deutschland), Riedel de Haën (Seelze, Deutschland), Roche (Mannheim, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland), Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) und VWR international (Leuven, Belgien). 41

50 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Verwendete Puffersysteme Für die ph-untersuchungen der Bakterienstämme Bo 53-33, Bo und Flo 1 wurde eine große Bandbreite an Puffersystemen getestet (siehe Kap. 2.3), bevor die in den generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2) und zur AHL-Untersuchung (siehe Kap ) eingesetzten Puffer zum Einsatz kamen. Erhebliche Schwierigkeiten traten vor allem durch den Ausfall von Salzen (z.b. Mg 2+ - und Ca 2+ -Ionen) in ph-gepufferten ASN III/2 -Medien und durch starke ph-wert- Verschiebungen dieser (von dem jeweiligen eingestellten ph-wert) nach Autoklavieren auf, die ein Ansetzen von gepufferten Kulturmedien mit höheren ph- Werten stark erschwerten (ph 8,5-10,0) bzw. unmöglich machten (ph 11,0). Die Trübung des Nährmediums und die ph-abweichungen nahmen dabei sukzessive mit steigendem ph-wert zu, wobei vor allem die mit Fleischextrakt versetzten Kulturmedien zu Ausfällungen neigten. In diesem Zusammenhang waren insbesondere die Clark & Lubs-Pufferlösungen im Bereich von ph 8,0-10,0 aufgrund oben genannter Probleme zur Kultivierung der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo lediglich bedingt verwendbar (ph 8,0 und 8,5) bzw. völlig ungeeignet gewesen (ph 9,0 und 10,0). Untersuchungen zum Wachstumsverhalten mit Clark & Lubs-gepufferten Medien (ph 8,0 und 8,5) zeigten bei Stamm Bo kein und bei Stamm Bo ein nur schwaches Wachstum (Daten nicht gezeigt). Neben einem durch Mineralsalz-Ausfällungen bedingten Nährstoffentzug könnte ebenfalls ein hemmender Einfluss des Puffers ein Grund für ein nur schwaches Wachstum der heterotrophen Bakterien sein. Die letztlich verwendeten Tris-HCl- und Glycin-Puffer in diesem ph-bereich bedingten im Kulturmedium ebenfalls leichte bis mittlere Ausfällungen und ph-verschiebungen nach dem Autoklavieren, welche aber tolerierbar waren. Der geforderte ph-wert wurde gegebenenfalls nachträglich durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH eingestellt. Starke Ausfällungen in den Kulturmedien wurden zudem bei Verwendung des Tris-HCl-Puffers ph 8,9 und des Clark & Lubs-Puffers ph 7,0 (Phosphat-Puffer) beobachtet und erwiesen sich somit neben dem Tris-Maleat-Puffer ph 6,0 als ungeeignet, bei dessen Anwesenheit kein Wachstum der heterotrophen Bakterien erfolgte. 42

51 3. Ergebnisse Weitere Probleme traten mit ph-wert-verschiebungen während des Wachstums auf, die anhand der ph-endwerte der Versuchskulturen deutlich werden (siehe Kap und 3.3.1). Durch die Erhöhung der Molarität und somit der Pufferkapazität (150 mm) wurde versucht, diesem entgegenzuwirken, welches sich jedoch überwiegend negativ auf ein Wachstum der Bakterien auswirkte (Daten nicht gezeigt) und zudem mit stärkeren Ausfällungen im Nährmedium ab ph 8,5 einherging. Das Ansetzen von getrennt autoklavierten Stammlösungen bestimmter ASN III/2 - Komponenten (CaCl 2 x 2 H 2 O, MgCl 2 x 6 H 2 O und MgSO 4 x 7 H 2 O), welche nach Autoklavieren des restlichen gepufferten Grundmediums diesem bei RT hinzugesetzt wurden, bewirkte sowohl bei schwächer als auch stärker gepufferten Kulturmedien oberhalb von ph 8,0 hinsichtlich einer Minimierung der Ausfällungen keine Abhilfe. 3.2 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo bei unterschiedlichen ph-werten Zur Ermittlung des ph-toleranzbereiches (ph-minimum und ph-maximum) und ph- Optimums für die heterotrophen Stämme Bo und Bo wurde das Wachstum im ph-bereich von 2,0-10,0 untersucht (siehe Kap ). Als Referenz wurden ungepufferte Versuchsansätze inkubiert (siehe Kap ). Wachstum wurde definiert als Zunahme in der O.D. 600nm von mindestens 0,1 nach 24 h Inkubation. Gemäß dieser Definition konnte im Bereich von ph 2,0-5,0 sowie bei ph 10,0 kein Wachstum der Stämme Bo und Bo beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo im Bereich von ph 6,0-9,0 sowie in ungepuffertem ASN III/2 - Medium sind in den Abbildungen 3.1 und 3.3 dargestellt, wobei die Ergebnisse durch Versuchswiederholungen abgesichert wurden (Daten nicht gezeigt). 43

52 3. Ergebnisse OD (600 nm) 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit (h) ph 6,0 ph 7,0 ph 8,0 ph 8,5 ph 9,0 ungepuffert Abb. 3.1: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo bei unterschiedlichen ph-werten in gepufferten ASN III/2 -Medien und in ungepuffertem ASN III/2 -Medium, determiniert über Messungen der O.D. 600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert. Abbildung 3.1 ist zu entnehmen, dass ein Wachstum von Stamm Bo im Bereich von ph 6,0-9,0 vorliegt. Dabei fiel das Zellwachstum beim ph-minimum (ph 6,0) mit einer O.D. 600nm von 0,65 (nach 120 h) leicht stärker aus als das beim ph- Maximum (ph 9,0) mit einer O.D. 600nm von 0,50 (nach 80 h). Bei ph 6,0 bzw. ph 9,0 lag das Wachstum dabei auf einem nahezu konstant niedrigen Niveau und gelangte nach 72 h bzw. 48 h in die stationäre Wachstumsphase, wobei über den gesamten weiteren Messzeitraum eine leichte Zunahme in der Zelldichte zu verzeichnen war. Morphologisch unterschieden sich die ph 6- und ph 9-gepufferten Kulturen von den sonstigen Versuchskulturen durch Ausbildung von Zellagglomeraten, während das Kulturmedium verhältnismäßig ungetrübt blieb (siehe Abb. 3.2 a - b). Abb. 3.2 a - b: Wachstum der Kulturen von Stamm Bo in ASN III/2 -Medium bei ph 6 (a) und in ungepuffertem ASN III/2 -Medium (b) bei 21 C und 120 rpm nach 72 h Inkubation. Die Aufnahmen erfolgten mittels Digitalkamera. 44

53 3. Ergebnisse Maximales Wachstum für Stamm Bo wurde in gepufferten Versuchsansätzen bei einem ph von 7,0 (maximale O.D. 600nm : 4,24) detektiert, das damit deutlich über dem der ph 8,0-gepufferten bzw. ph 8,5-gepufferten Versuchskulturen mit maximalen O.D. 600nm -Werten von 2,88 bzw. 2,23 lag. Das ph-optimum des Bakterienstammes liegt damit bei ph 7,0. Die gepufferten Versuchsansätze (ph 7,0, 8,0 und 8,5) traten nach h in die stationäre Wachstumsphase ein, wobei die O.D. 600nm -Werte im weiteren Verlauf noch leicht zunahmen. Die ungepufferten Referenzansätze wiesen mit einer maximalen O.D. 600nm von 5,34 das deutlich stärkste Zellwachstum auf. 4,0 3,5 3,0 OD (600 nm) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit (h) ph 6,0 ph 7,0 ph 8,0 ph 8,5 ph 9,0 ungepuffert Abb. 3.3: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo bei unterschiedlichen ph-werten in gepufferten ASN III/2 -Medien und in ungepuffertem ASN III/2 -Medium, determiniert über Messungen der O.D. 600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert. Aus Abbildung 3.3 geht hervor, dass der Bakterienstamm Bo im ph-bereich von 6,0-9,0 wächst. Beim ph-minimum des Toleranzbereiches wies Stamm Bo ein wesentlich stärkeres Wachstum auf (maximale O.D. 600nm : 0,89) als bei seinem ph-maximum (maximale O.D. 600nm : 0,37). Bei letzterem gingen die Kulturen nach Erreichen der stationären Wachstumsphase umgehend in die Absterbephase über. Maximales Wachstum für Stamm Bo wurde in gepufferten Versuchsansätzen bei ph 8,0 ermittelt (maximale O.D. 600nm : 3,08) und ist damit geringfügig höher als bei ph 7,0 (maximale O.D. 600nm : 2,86) und ph 8,5 (maximale 45

54 3. Ergebnisse O.D. 600nm : 2,75). Die gepufferten Kulturen (ph 7,0, 8,0 und 8,5) erreichten nach etwa 64 h die stationäre Wachstumsphase, gefolgt von einer weiteren leichten Zunahme der Zelldichten. Die ungepufferten Referenzkulturen wiesen mit einer maximalen O.D. 600nm von 3,39 ein leicht stärkeres Wachstum als die gepufferten Kulturen auf. Die Referenzansätze traten nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase ein ph-werte der Zellkulturüberstände Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten erfolgte parallel eine ph-messung der Kulturüberstände mittels ph-indikatorpapier (Macherey-Nagel; ph 6,0-10,0) (siehe Kap ) (Daten nicht gezeigt). Nach Abschluss der Untersuchung zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo wurden die ph-endwerte der Kulturüberstände mittels einer ph-elektrode, gekoppelt an einem ph-meter, bestimmt. Die ermittelten ph-endwerte sind in Tabelle 3.1 zusammengefasst. Tab. 3.1: ph-werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo und Bo nach Inkubation. Ungepuffertes ASN III/2 -Medium und gepuffertes ASN III/2 -Medium mit unterschiedlichen ph-werten diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in die stationäre Wachstumsphase (siehe Kap. 3.2) in einem Schüttelwasserbad (120 rpm) bei 21 C im Dunkeln. n = 2 ph-wert des Kulturmediums vor Inkubation ph-wert des Kulturüberstandes von Bo nach Inkubation ph-wert des Kulturüberstandes von Bo nach Inkubation ph 7,1 (ungepuffert) ph 8,36 ph 8,37 ph 6,0 ph 6,32 ph 6,27 ph 7,0 ph 8,18 ph 8,31 ph 8,0 ph 8,25 ph 8,40 ph 8,5 ph 8,50 ph 8,55 ph 9,0 ph 8,65 ph 8,80 In Tabelle 3.1 sind die ph-werte vor und nach Inkubation der Versuchsansätze der Stämme Bo und Bo dargestellt. Bei beiden Bakterienstämmen ist, abgesehen von ph 8,5 und 9,0, ein Anstieg des ph-wertes sowohl in den ungepufferten als auch in den gepufferten Versuchskulturen zu verzeichnen. Eine kontinuierliche Alkalisierung der Überstande konnte dabei für die ungepufferten Versuchsansätze bereits nach 8 h Inkubation, für die gepufferten Versuchsansätze hingegen erst nach h Inkubation festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). 46

55 3. Ergebnisse Der ph-wert der ph 6-gepufferten Dunkelansätze verschob sich lediglich geringfügig auf Werte von 6,35 (Stamm Bo 53-33) und 6,25 (Stamm Bo 10-09), während die ungepufferten sowie die ph 7- und ph 8-gepufferten Dunkelansätze nach Inkubation ph-endwerte zwischen 8,05 und 8,36 (Stamm Bo 53-33) sowie zwischen 8,37 und 8,50 (Stamm Bo 10-09) aufwiesen. Eine Ausnahme bei beiden heterotrophen Stämmen bildeten die ph 8,5-gepufferten Dunkelansätze mit gleich bleibenden und die ph 9,0-gepufferten Dunkelansätze mit leicht abnehmenden ph-endwerten in den Kulturüberständen. 3.3 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo und Bo erfolgte eine Inkubation bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR (siehe Kap ). Hierzu wurden die heterotrophen Bakterien bei ihrem ermittelten ph-optimum und in ungepuffertem Kulturmedium inkubiert. Als Kontrolle wurden ungepufferte Dunkelansätze angezogen (siehe Kap ). Die Ergebnisse der Wachstumsmessungen sind in den Abbildungen 3.4 und 3.5 dargestellt. OD (600 nm) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit (h) ph 7,0; 5 µe PAR ungepuffert; 5 µe PAR ungepuffert; Dunkel Abb. 3.4: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo in gepuffertem (ph- Optimum) und ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR, determiniert über Messungen der O.D. 600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert. 47

56 3. Ergebnisse Aus Abbildung 3.4 geht hervor, dass eine Photonenflussdichte von 5 µe m -2 s -1 PAR keinen ersichtlichen Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Stamm Bo hatte. Das Wachstum ungepufferter Licht- und dunkel-inkubierter Kulturen wies einen ähnlichen Verlauf auf, wobei die Kulturen der Dunkelansätze (maximale O.D. 600nm : 5,04) ein leicht besseres Wachstum aufwiesen als die Licht-inkubierten Ansätze (maximale O.D. 600nm : 4,46). Nach einem zunächst logarithmischen Wachstumsverlauf gingen die Kulturen nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase über. Der Eintritt in die Absterbephase erfolgte nach h. Bei ihrem ermittelten ph- Optimum wiesen die Licht-inkubierten Kulturen ebenfalls ein ähnliches Wachstumsverhalten auf, jedoch auf einem niedrigeren Wachstumsniveau (maximale O.D. 600nm : 3,57). 4,0 3,5 3,0 OD (600 nm) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit (h) ph 8,0; 5 µe PAR ungepuffert; 5 µe PAR ungepuffert; Dunkel Abb. 3.5: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo in gepuffertem (ph- Optimum) und ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR, determiniert über Messungen der O.D. 600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert. Abbildung 3.5 ist zu entnehmen, dass das Wachstum von Stamm Bo nicht erkennbar durch eine Photonenflussdichte von 5 µe m -2 s -1 PAR beeinflusst wurde. Das Wachstumsverhalten der ungepufferten, belichteten Versuchsansätze entsprach in etwa dem der ungepufferten, dunkel-inkubierten Kulturen, wobei der Wachstumsverlauf (maximale O.D. 600nm : 3,44) leicht unter dem der Dunkelansätze 48

57 3. Ergebnisse (maximale O.D. 600nm : 3,63) lag. Die bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR und ph-optimum inkubierten Kulturen wiesen den gleichen Wachstumsverlauf auf wie die ungepufferten Versuchsansätze, lediglich auf leicht geringerem Wachstumsniveau (maximale O.D. 600nm : 3,40) ph-werte der Zellkulturüberstände Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten wurden parallel die ph-werte der Kulturüberstände mittels ph-indikatorpapier (Macherey-Nagel; ph 6,0-10,0) bestimmt (siehe Kap ) (Daten nicht gezeigt). Nach Abschluss der Wachstumsversuche erfolgte eine Bestimmung der ph- Endwerte der Kulturüberstände mittels einer ph-elektrode, gekoppelt an einem ph- Meter. Die ermittelten ph-endwerte sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst. Tab. 3.2: ph-werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo und Bo nach Inkubation. Ungepuffertes ASN III/2 -Medium und gepuffertes ASN III/2 -Medium mit optimalem ph-wert für den jeweiligen Stamm diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in die stationäre Wachstumsphase (siehe Kap. 3.3) auf einem Rotationsschüttler (120 rpm) bei 21 C und einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR oder im Dunkeln. n = 2 ph-wert des Kulturmediums vor Inkubation ph-wert des Kulturüberstandes von Bo nach Inkubation ph-wert des Kulturüberstandes von Bo nach Inkubation ph 7,1 (ungepuffert) ph 8,78 ph 8,78 ph 7,0 (gepuffert) ph 8,50 -- ph 8,0 (gepuffert) -- ph 8,78 ph 7,1 (ungepuffert) ph 8,80 a) ph 8,70 a) a) nach Inkubation im Dunkeln In Tabelle 3.2 sind die ph-werte von Kulturmedien vor und nach Inkubation der Versuchsansätze der Stämme Bo und Bo dargestellt. Bei beiden Bakterienstämmen konnte eine deutliche Alkalisierung der ungepufferten sowie gepufferten Versuchsansätze nach der Inkubation festgestellt werden. Hierbei wiesen die ungepufferten Kulturüberstände beider Stämme, unabhängig von einer Licht- oder Dunkelinkubation, ph-endwerte zwischen 8,7-8,8 auf. Bei ungepufferten Kulturen konnte bereits nach 8 h, bei gepufferten Kulturen hingegen erst nach h Inkubation eine ph-verschiebung von dem Ausgangswert beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). 49

58 3. Ergebnisse 3.4 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026 nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) Für einen AHL-Nachweis kurzkettiger AHL-Moleküle wurde der Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) durchgeführt (siehe Kap ). Es wurden synthetische AHL-Moleküle und AHL-Extrakte getestet. Letztere wurden aus Versuchskulturen der Stämme Bo und Bo unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen gewonnen (siehe Kap ). Nach entsprechender Inkubation konnten mit dem Biosensor C. violaceum CV026 für beide Stämme keine AHL-Signalmoleküle über eine violette Pigmentierung der Indikatorplatten um die jeweiligen Auftragungspunkte nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht dargestellt). In Abbildung 3.6 a - b ist exemplarisch eine C. violaceum-indikatorplatte mit synthetischen AHL-Molekülen in Abhängigkeit verschiedener Konzentrationen und der Inkubationszeit dargestellt. Abb. 3.6 a - b: Nachweis von synthetischen AHL-Molekülen mittels C. violaceum-indikatorplatte nach 24 h (a) und 48 h (b) Inkubation bei 30 C über eine violette Pigmentierung des Biosensors um die Auftragungspunkte. Auftragungsschema: 1: NK (10 µl Ethylacetat, verdünnt auf 50 µl mit LB- Medium); 2-3: C4-HSL; 4-5: C6-HSL; 6-7: C8-HSL. Die Auftragung der jeweiligen AHL-Moleküle und deren Konzentrationen (5 x 10-9 mol und 5 x 10-8 mol) erfolgte im Uhrzeigersinn. Aus Abbildung 3.6 a - b wird ersichtlich, dass C. violaceum CV026 eine hohe Sensitivität gegenüber C6-HSL aufweist, wobei 5 x 10-9 mol (Abb. 3.6 a, Nr. 4) noch deutlich durch eine Violacein-Produktion nachgewiesen wurde. Für C4-HSL und C8-HSL liegen die Nachweisgrenzen hingegen wesentlich höher. C8-HSL wurde von C. violaceum CV026 nach längerer Inkubation (48 h) lediglich schwach nachgewiesen (Abb. 3.6 b, Nr. 6 und 7), 5 x 10-9 mol C4-HSL gar nicht (Abb. 3.6 b, Nr. 2). 50

59 3. Ergebnisse Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern (2001) Die Screening -Methode nach RAVN und Mitarbeitern (2001) zur Detektion von AHL-Produzenten (siehe Kap ) wurde mit ASN III/2 -Agarplatten durchgeführt, da die zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo auf den verwendeten LB-Agarplatten nicht wuchsen. Der Reporterstamm C. violaceum CV026 wuchs nur unzureichend auf dem ASN III/2 -Agar, wodurch Aussagen zu einer AHL-Produktion mit Hilfe dieses Biosensors nicht möglich waren (Ergebnisse nicht dargestellt). In Abbildung 3.7 a - g sind exemplarisch die Ergebnisse des Screeningtests mit dem Biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4) dargestellt. Die Inkubation der Agarplatten erfolgte bei 21 C, 28 C und 37 C für 24 h mit anschließender Auswertung der Agarplatten, wobei ein Blauumschlag des Sensorbakteriums als AHL-Nachweis gewertet wurde. Stamm Bo Stamm Bo NK (ASN III/2 -Medium) NK (AGB-Medium) 21 C 28 C Abb. 3.7 a - g: Sreeningtest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) mit dem Sensorstamm Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pzlr4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die heterotrophen Stämme Bo (a und d: linker Ausstrich) und Bo (b und e: linker Ausstrich) nach 24 h Inkubation bei 21 C und 28 C über eine Blaufärbung des eingesetzten Sensorbakteriums A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) (jeweils rechter Ausstrich). Als Negativkontrolle (NK) wurde der Sensorstamm eingesetzt und unter gleichen Bedingungen (c und f) sowie bei 28 C für 24 h auf ABG- Medium (g) bebrütet. Aus Abbildung 3.7 a - g geht hervor, dass bei einer Inkubationstemperatur von 21 C für Stamm Bo keine und für Stamm Bo eine geringe AHL-Produktion über die Mutante A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) nachgewiesen werden konnte. Nach 51

60 3. Ergebnisse Inkubation bei 28 C wies der Indikatorstamm auf den ASN III/2 -Agarplatten mit Stamm Bo und Stamm Bo 10-09, einschließlich der Negativkontrolle (Abb. 3.7 f), eine Blaufärbung auf. Diese fiel in Gegenwart von Stamm Bo wesentlich schwächer aus als in Gegenwart von Stamm Bo Aussagen über eine AHL-Produktion waren aufgrund der positiven Negativkontrolle nicht bzw. kaum möglich. Versuchswiederholungen bestätigten die Ergebnisse. Eine weitere Bebrütung bei der jeweiligen Inkubationstemperatur führte bei allen ASN III/2 -Agarplatten entweder zu einem Auftreten einer Blaufärbung des Biosensors oder zu einer weiteren Signalverstärkung (Ergebnisse nicht dargestellt). Bei einer Inkubationtemperatur von 37 C wies der Sensorstamm nur ein unzureichendes Wachstum auf, wodurch eine Auswertung unmöglich wurde (Ergebnisse nicht dargestellt). Ein Ausstrich des Biosensors auf ABG-Festagar als NK zeigte nach 24 h (Abb. 3.7 g) und 48 h Inkubation (Ergebnisse nicht dargestellt) bei 28 C hingegen keine Blaufärbung auf. Weiter konnte in Gegenwart von X-Gal oftmals beobachtet werden, dass der ansonsten gelb-ockrige Stamm Bo eine deutliche Grünblau-Färbung aufzeigte Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) Zur Detektion von AHL-Produzenten wurde eine weitere Screening -Methode nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap ), da ein eindeutiger Nachweis nach RAVN und Mitarbeitern (2001) nicht erbracht wurde. In diesem Screeningtest wurde die AHL-Produktion der zu testenden heterotrophen Stämme Bo und Bo sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 bei 21 C untersucht. In Abbildung 3.8 a - c sind die A. tumefaciens-indikatorplatten nach 24 h Bebrütung bei 28 C dargestellt. 52

61 3. Ergebnisse Abb. 3.8 a - c: Sreeningtest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) mit dem Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die Stämme Bo (a), Bo (b) und Flo 1 (c). Die Proben der zu untersuchenden Stämme wurden links, die der Positivkontrolle A. tumefaciens NT1 (ptic58 accr) rechts auf den Agarplatten aufgetragen. Nach einer Bebrütung der A. tumefaciens-indikatorplatten bei 28 C für 24 h wurden intakte AHL-Moleküle als blaue Spots sichtbar. Wie aus Abbildung 3.8 a - c hervorgeht, konnte für den Stamm Bo im Gegensatz zu den Stämmen Bo und Flo 1 ein deutlicher AHL-Nachweis mit der Mutante A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) erzielt werden, sichtbar durch einen blauen Farbumschlag im Auftragungsbereich. Ein schwacher Farbumschlag im Agar deutete auf eine geringe AHL-Produktion durch Stamm Bo hin, während für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 über das eingesetzte Sensorbakterium keine AHL- Signalmoleküle nachgewiesen wurden. Die bebrüteten Agarplatten ohne Biosensor (NK) waren negativ, wodurch eine Hydrolyse von X-Gal durch produzierte Substanzen der Testorganismen ausgeschlossen werden konnte (Ergebnisse nicht dargestellt). Eine unspezifische Aktivierung des Indikatorstammes durch Medienkomponenten lag ebenfalls nicht vor, da eine Blaufärbung des Weichagars in den Negativkontrollen mit unbeimpftem Kulturmedium nicht beobachtet wurde (Ergebnisse nicht dargestellt). Eine Auswertung muss spätestens nach 48 h erfolgen, da nach h eine zunehmende Blaufärbung durch spontane Hydrolyse von X-Gal auftrat. Aussagen über vorliegende AHL-Mengen konnten über diese Methode nicht getätigt werden, da alle über den Biosensor detektierbaren AHL-Moleküle nachgewiesen werden und die Sensitivitäten gegenüber diesen Signalmolekülen unterschiedlich sind. 53

62 3. Ergebnisse 3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 Die Produktion von AHL-Signalmolekülen wurde unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen untersucht (siehe Kap ). Zum Nachweis der verschiedenen AHL-Signalmoleküle wurde nach AHL-Extraktion aus 250 ml Zellkulturüberständen (siehe Kap ) bzw. bakterieller Biomasse (siehe Kap ) eine Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (siehe Kap ) mit anschließender Überschichtung mit dem Agrobacterium- bzw. Chromobacterium-Sensor (siehe Kap ) zur Visualisierung der AHL-Moleküle durchgeführt. Eine Identifikation der Signalmoleküle erfolgte, soweit möglich, mit Hilfe von synthetischen AHL-Referenzmolekülen (siehe Kap , Tab. 2.15). Aufgrund der eingesetzten Standardmoleküle konnte, wie in Referenzarbeiten ebenso (GEISENBERGER, 2000; YATES et al., 2002), auf eine Auswertung über die ermittelten R f -Werte verzichtet werden. Für die DC-Untersuchungen mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnte eine Hydrolyse von X-Gal durch extrahierte Substanzen (z.b. Enzyme) sowie durch eine unspezifische Aktivierung des Biosensors durch das Ausbleiben einer Blaufärbung in den Negativkontrollen nicht festgestellt werden (siehe Kap ) (Ergebnisse nicht gezeigt) Einfluss des ph-wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 Zur Ermittlung des ph-wert-einflusses auf die Signalmolekül-Produktion wurden die AHL-Gehalte in den Kulturüberständen gepufferter Versuchskulturen miteinander verglichen. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo erfolgte die Untersuchung bei ihrem jeweiligen ph-minimum, -Optimum und -Maximum (siehe Kap ), ermittelt aus den zuvor generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2). Der ph-wert 8,5 war das zunächst ermittelte ph-maximum der heterotrophen Stämme und fand daher ebenfalls in den AHL-Untersuchungen Eingang. Eine Kultivierung unter ph-optimalen Bedingungen erfolgte bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase. Die weiteren gepufferten 54

63 3. Ergebnisse Versuchskulturen wurden bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Des Weiteren wurden die AHL-Gehalte in ungepufferten dunkel-inkubierten Kulturen in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase ermittelt. Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo mit dem Agrobacterium- Sensorstamm sind in Abbildung 3.9 dargestellt. Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurden keine AHL-Signalmoleküle detektiert, wobei für die DC-Analysen bis zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen wurden. C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.9: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium (Probennr. 3 und 4) und bei unterschiedlichen ph-werten in gepufferten ASN III/2 - Medien (Probennr. 5-9) bei 21 C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle; 2: Positivkontrolle (Vibrio sp.); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: ph 6, aus stationärer Phase; 6: ph 7, aus logarithmischer Phase; 7: ph 7, aus stationärer Phase; 8: ph 8,5, aus stationärer Phase; 9: ph 9,0, aus stationärer Phase. Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile belegt, dass in allen Ansätzen von Stamm Bo unabhängig vom ph-wert die Art der AHL-Moleküle sehr ähnlich ist. Wie der Abbildung 3.9 zudem deutlich zu entnehmen ist, besteht ein Zusammenhang zwischen dem ph-wert des Kulturmediums und der AHL-Menge in den Kulturüberständen. Die Größen der distinkten DC-Spots belegen, dass der höchste AHL-Gehalt im Überstand der Kultur vorlag, welche bei einem ph 6,0 inkubiert worden war, und dass der AHL-Gehalt mit steigendem ph-wert abnahm. Ein DC-Signal lag unterhalb von C6-HSL, wobei bei ph 6-inkubierten Kulturen zwei 55

64 3. Ergebnisse AHL-Moleküle detektiert wurden (Probennr. 5). Das zweite DC-Signal lag auf Höhe von C4-HSL. Signifikante Unterschiede der AHL-Gehalte in den Kulturüberständen von Stamm Bo in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase wurden nicht beobachtet, wobei der Gehalt an AHL-Molekülen in der logarithmischen Wachstumsphase (Probennr. 3) leicht höher war als in der stationären Wachstumsphase (Probennr. 4). Die AHL-Positivkontrolle Vibrio sp. wies im Kulturüberstand AHL-Signalmoleküle auf (Probennr. 2). Für den Bakterienstamm Bo wurde mit dem Agrobacterium-Sensorstamm DC- Signale detektiert (Abb. 3.10). Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde kein AHL-Nachweis erzielt, wobei bis zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen wurden (Ergebnisse nicht dargestellt). C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.10: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei ph 6 in gepuffertem ASN III/2 -Medium bis in die stationäre Wachstumsphase bzw. in ungepuffertem ASN III/2 - Medium bis in die logarithmische Wachstumsphase bei 21 C im Dunkeln inkubiert. Es wurden jeweils 30 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle; 2: ph 6, aus stationärer Wachstumsphase; 3: aus logarithmischer Wachstumsphase. In Abbildung 3.10 sind die AHL-Nachweise für Stamm Bo dargestellt. Im Überstand einer bei ph 6 kultivierten Kultur (Probennr. 2) wurden mindestens zwei AHL-Signalmoleküle nachgewiesen. In Überständen aus Bo Kulturen, welche beim ph-optimum (ph 8,0) bis in die logarithmische bzw. stationäre 56

65 3. Ergebnisse Wachstumsphase sowie beim ph-maximum (ph 9,0) bis in die stationäre Wachstumsphase kultiviert wurden, konnten keine AHL-Signalmoleküle detektiert werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Des Weiteren wurde in Überständen ungepufferter Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase ein AHL-Nachweis erzielt (Probennr. 3), jedoch nicht in der stationären Wachstumsphase (Ergebnis nicht dargestellt). Bei Stamm Flo 1 erfolgte die Untersuchung auf AHL-Moleküle bei ph-werten von 7,0, 8,0, 8,5 und 9,0 nach 14 bzw. 21 Tagen Kultivierung bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR (siehe Kap ). Für die DC-Analysen wurden jeweils 50 µl der AHL-Extrakte eingesetzt. Ein AHL-Nachweis wurde mit keinem Indikatorstamm erzielt Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Im Anschluss an die ph-untersuchungen wurde eine Azidifizierung von ungepufferten Kulturüberständen der Stämme Bo und Bo nach YATES und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap ). Eine Kultivierung der ungepufferten Dunkelansätze erfolgte bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase (siehe Kap ). Die Ergebnisse des Azidifizierungsversuches für den Stamm Bo mit dem Agrobacterium-Sensorstamm sind in Abbildung 3.11 a dargestellt, wobei ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen vorgenommen wurde. In der DC-Analyse mit dem Chromobacterium-Sensor wurden lediglich die azidifizierten Kulturüberstände untersucht (Abb b). 57

66 3. Ergebnisse C4-HSL C6-HSL a C8-HSL Probennummer b C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.11: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. a: Es wurden jeweils 2 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (ph < 2) und nicht-azidifizierten Kulturüberständen (Probennr. 3-6) bzw. 20 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (ph < 2) (Probennr. 7 und 8) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL- Referenzmolekül (C4-HSL); 3: ph < 2, aus logarithmischer Phase; 4: ph < 2, aus stationärer Phase; 5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase; 7: ph < 2, aus logarithmischer Phase; 8: ph < 2, aus stationärer Phase. b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (ph < 2) auf die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 1 und 2). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: ph < 2, aus logarithmischer Phase; 2: ph < 2, aus stationärer Phase; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL). Aus Abbildung 3.11 a geht deutlich hervor, dass der nachgewiesene AHL-Gehalt in azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher ist als in nicht-azidifizierten 58

67 3. Ergebnisse Kulturüberständen. In der logarithmischen Wachstumsphase wurde ein AHL-Molekül detektiert (DC-Signal unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 3). Im Vergleich zur stationären Wachstumsphase (Probennr. 4) lagen in beiden Wuchsphasen in etwa gleiche AHL-Mengen vor. Ein weiteres AHL-Molekül wurde in der stationären Wachstumsphase, dünnschichtchromatographisch auf der Höhe von C4-HSL, nachgewiesen. Bei einem Auftragungsvolumen von 20 µl AHL-Extrakt konnte zudem in der logarithmischen Wachstumsphase von Stamm Bo noch ein drittes AHL- Molekül in sehr geringer Menge (DC-Signal auf Höhe von C8-HSL) detektiert werden (Probennr. 7). Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde im azidifizierten Kulturüberstand der Kultur, welche bis in die logarithmische Wachstumsphase inkubiert worden war, ein kurzkettiges AHL-Molekül (DC-Spot etwas unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen (Abb b, Probennr. 1). Ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen von Stamm Bo mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ist in Abbildung 3.12 a dargestellt. Für die DC-Analysen mit dem Chromobacterium- Sensor wurden lediglich AHL-Extrakte aufgetragen, welche aus azidifizierten Kulturüberständen gewonnen wurden (Abb b). 59

68 3. Ergebnisse C4-HSL C6-HSL a C4-HSL C6-HSL b C8-HSL C8-HSL Probennummer Probennummer Abb. 3.12: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. a: Es wurden jeweils 30 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (ph < 2) (Probennr. 3 und 4) und nicht-azidifizierten Kulturüberständen (Probennr. 5 und 6) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL- Referenzmolekül (C4-HSL); 3: ph < 2, aus logarithmischer Phase; 4: ph < 2, aus stationärer Phase; 5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase. b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (ph < 2) auf die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 3 und 4). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: ph < 2, aus logarithmischer Phase; 4: ph < 2, aus stationärer Phase. Wie aus Abbildung 3.12 a ersichtlich, ist der nachgewiesene AHL-Gehalt in azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher als in nicht-azidifizierten Kulturüberständen. In beiden azidifizierten Kulturüberständen befanden sich mindestens zwei AHL-Signalmoleküle nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung auf Höhe von C8-HSL und im Bereich von C6-HSL (Probennr. 3 und 4). Ein drittes AHL-Molekül im Bereich von C4-HSL konnte durch weitere DC-Analysen nicht eindeutig bestätigt werden. Das Erscheinungsbild der beiden AHL-Profile belegt, dass die gleichen AHL-Molekültypen in den verschiedenen Wachstumsphasen vorkamen, die Mengen der produzierten AHL-Moleküle jedoch variierten. Während das längerkettige AHL-Molekül in der stationären Wachstumsphase in deutlich höherer Konzentration vorlag, nahm die Menge des kurzkettigen AHL-Moleküls hingegen ab. 60

69 3. Ergebnisse Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde in den azidifizierten Kulturüberständen der Kulturen, welche bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert worden waren, jeweils ein kurzkettiges AHL- Signalmolekül (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen (Abb b, Probennr. 3 und 4) Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Zur Ermittlung des Lichteinflusses auf die Signalmolekül-Produktion in den heterotrophen Bakterienstämmen wurden die AHL-Gehalte in den Kulturüberständen Licht-inkubierter und dunkel-inkubierter Kulturen, kultiviert bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase, miteinander verglichen (siehe Kap ). Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo mit dem Agrobacterium- Sensorstamm sind in Abbildung 3.13 dargestellt. DC-Vorversuche mit dem Chromobacterium-Sensorstamm hatten ergeben, dass trotz großer Auftragsvolumina von bis zu 100 µl nur sehr schwache AHL-Nachweise mit Stamm Bo zu verzeichnen waren. Daher wurde auf eine weitere Untersuchung mit diesem Sensorstamm verzichtet. 61

70 3. Ergebnisse C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.13: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR (Probennr. 3 und 4) bzw. im Dunkeln (Probennr. 5 und 6) in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: 5 µe m -2 s -1 PAR, aus logarithmischer Phase; 4: 5 µe m -2 s -1 PAR, aus stationärer Phase; 5: dunkel, aus logarithmischer Phase; 6: dunkel, aus stationärer Phase. Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile in Abbildung 3.13 bestätigt, dass die Art der AHL-Moleküle in den Licht-inkubierten und dunkel-inkubierten Versuchsansätzen sehr ähnlich ist. In allen AHL-Extrakten wurde ein Signalmolekül detektiert (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C6-HSL). Ein weiteres AHL- Molekül (DC-Spot lag auf Höhe von C4-HSL) wurde eindeutig in der stationären Wachstumsphase der Licht-inkubierten Versuchskultur nachgewiesen (Probennr. 4). Des Weiteren belegen die Spotgrößen, dass in den Überständen der Lichtinkubierten Versuchsansätze im Vergleich zu den jeweiligen Überständen der Dunkelansätze aus der logarithmischen bzw. stationären Wachstumsphase keine signifikanten Unterschiede in den AHL-Konzentrationen vorlagen. Für den Bakterienstamm Bo betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte jeweils 30 µl. Die Licht-inkubierten Versuchsansätze von Stamm Bo wiesen das gleiche AHL-Profil auf wie die dunkel-inkubierten Ansätze (siehe Kap , Abb. 3.10, Probennr. 3). Demnach wurde in der logarithmischen Wachstumsphase Licht-inkubierter Versuchsansätze in ähnlicher Konzentration ein AHL-Molekül 62

71 3. Ergebnisse nachgewiesen. In der stationären Wachstumsphase konnte kein AHL-Nachweis erzielt werden Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo Die in Assoziation mit Cyanobakterien lebenden heterotrophen Bakterien existieren unter Mangelbedingungen. Eine Auswirkung von verschiedenen Nährstoffbedingungen auf die Produktion von AHL-Molekülen bei den zu untersuchenden heterotrophen Bakterien ist dementsprechend von Interesse. Daher wurden die Bakterienstämme im ASN III/2 -Medium mit nur 0,1% Fleischextrakt bis zur stationären Phase angezogen (siehe Kap ). Die unter diesen Bedingungen produzierten AHL-Moleküle wurden nach Extraktion mit den AHL- Molekülen verglichen, welche aus Kulturen mit dem standardmäßig verwendeten ASN III/2 -Medium mit 1% Fleischextrakt extrahiert worden waren. Zur Detektion der AHL-Moleküle wurde der Agrobacterium-Sensorstamm eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.14 dargestellt. 63

72 3. Ergebnisse C6-HSL C4-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.14: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen der Bakterienstämme Bo und Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in 0,1% FE versetztem bzw. standardmäßig verwendetem (1% FE) ASN III/2 -Medium bei 21 C im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl (Stamm Bo 53-33) bzw. jeweils 40 µl (Stamm Bo 10-09) der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: Stamm Bo 53-33, 1% FE; 2: Stamm Bo 53-33, 0,1% FE; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL- Referenzmolekül (C4-HSL); 5: Stamm Bo 10-09, 1% FE; 6: Stamm Bo 10-09, 0,1% FE. FE = Fleischextrakt. Aus Abbildung 3.14 wird ersichtlich, dass der mit 0,1% Fleischextrakt kultivierte Bo Ansatz (Probennr. 2) eine leicht stärkere AHL-Produktion aufwies als der mit 1% Fleischextrakt kultivierte (Probennr. 1), erkennbar durch den größeren DC- Spotdurchmesser (DC-Spot geringfügig unterhalb von C6-HSL). Ein schwacher AHL-Nachweis konnte für den Stamm Bo in einer Versuchskultur, kultiviert mit 0,1% Fleischextrakt, erzielt werden (dünnschichtchromatographisch geringfügig unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 6). Mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnten indes im Überstand einer Kultur, kultiviert mit 1% Fleischextrakt, keine AHL-Moleküle detektiert werden (Probennr. 5). Zur Feststellung eines Temperatureinflusses auf die AHL-Menge in Überständen bzw. auf die AHL-Produktion an sich wurden in einer weiteren Untersuchung Versuchsansätze der Stämme Bo und Bo bei 28 C bis in die stationäre Wachstumsphase hin inkubiert (siehe Kap ). Anschließend wurden die AHL- Gehalte der Überstände mit denen von Kulturen verglichen, welche bei 21 C bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert worden waren. Die Ergebnisse für den 64

73 3. Ergebnisse Bakterienstamm Bo unter Verwendung des Agrobacterium-Sensorstammes sind in Abbildung 3.15 dargestellt. Im Kulturüberstand von Stamm Bo konnte auch bei einer Inkubationstemperatur von 28 C in der stationären Wachstumsphase kein AHL- Nachweis erzielt werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Für den Stamm Bo betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte jeweils 30 µl. C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.15: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C (Probennr. 1) bzw. 28 C (Probennr. 2) im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: 21 C, aus stationärer Wachstumsphase; 2: 28 C, aus stationärer Wachstumsphase; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL). Wie aus Abbildung 3.15 hervorgeht, wurden nach einer Kultivierung von Stamm Bo bei 28 C bis in die stationäre Wachstumsphase zwei Signalmoleküle detektiert (Probennr. 2). Bei einem Vergleich der Spotdurchmesser (DC-Spot geringfügig unterhalb von C6-HSL) wird deutlich, dass der bei 28 C kultivierte Versuchsansatz eine wesentlich geringere AHL-Menge aufwies als der Versuchsansatz, welcher bei 21 C inkubiert wurde (siehe Probennr. 1 und 2). 65

74 3. Ergebnisse Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 Eine Anzucht von Stamm Flo 1 in ungepufferten Kulturmedien für 14 bzw. 21 Tage bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR (siehe Kap ) und anschließender Untersuchung von azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen auf AHL-Moleküle mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ergab die in Abbildung 3.16 dargestellten Ergebnisse. Des Weiteren wurden AHL-Moleküle aus 1000 ml Überstand extrahiert, wobei die Versuchskulturen zuvor für 8 Wochen unter gleichen Kultivierungsbedingungen angezogen worden waren. C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Abb. 3.16: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des cyanobakteriellen Stammes Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C für 14 bzw. 21 Tage (Probennr. 3-6) bzw. für 8 Wochen (Probennr. 7) bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR inkubiert. Es wurden jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (ph < 2) und nicht-azidifizierten 250 ml Kulturüberständen (Probennr. 3-6) bzw. 50 µl AHL-Extrakt aus einem nicht-azidifizierten 1000 ml Kulturüberstand (Probennr. 7) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: ph < 2, nach 14 Tagen; 4: ph < 2, nach 21 Tagen; 5: nach 14 Tagen; 6: nach 21 Tagen; 7: nach 8 Wochen. Wie aus Abbildung 3.16 hervorgeht, wurden nach 14- bzw. 21-tägiger Kultivierung der ungepufferten Flo 1-Kulturen in den Überständen AHL-Moleküle nachgewiesen (Probennr. 5 und 6). Die kleinen Durchmesser der einzelnen DC-Spots weisen auf einen geringen AHL-Gehalt in den Überständen hin. Es wurden zwei AHL- Molekültypen (DC-Signale auf Höhe von C8-HSL und C6-HSL) mit ähnlichen Konzentrationen in beiden Überständen gefunden. Eine Azidifizierung der 66

75 3. Ergebnisse Kulturüberstände führte bei der 21 Tage lang inkubierten Flo 1-Kultur zu einem stärkeren Nachweis des längerkettigen AHL-Moleküls (DC-Spot auf Höhe von C8- HSL) (Probennr. 4). Aufgrund einer fehlerhaft durchgeführten Azidifizierung des Überstandes der Flo 1-Kultur, angezogen für 14 Tage, konnten bezüglich einer AHL- Produktion in dieser Kultur keine gesicherten Aussagen getätigt werden (Probennr. 3). In 1000 ml Überstand aus Flo 1-Kulturen, welche für 8 Wochen inkubiert wurden, konnten drei AHL-Moleküle detektiert werden. Neben einem deutlich stärkeren Signal für das längerkettige AHL-Molekül auf Höhe von C8-HSL war ein weiterer DC-Spot auf Höhe von C4-HSL ein Beleg dafür, dass noch ein drittes AHL-Molekül im Überstand von Flo 1-Kulturen vorkommt (Probennr. 7) Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo und Bo sowie dem Cyanobakterium Stamm Flo 1 Sowohl die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo als auch der Cyanobakterienstamm Flo 1 wurden intrazellulär auf AHL-Moleküle hin untersucht. Der Stamm Flo 1 wurde dazu für 14 bzw. 21 Tage in ungepuffertem Nährmedium bei einer Photonenflussdichte von 5 µe m -2 s -1 PAR kultiviert (siehe Kap ) Die heterotrophen Stämme wurden, wie bereits in Kapitel beschrieben, in gepufferten und ungepufferten Nährmedien bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase angezogen. Die Aufarbeitung der bakteriellen Biomasse wurde nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in veränderter Form durchgeführt (siehe Kap ). Für den heterotrophen Bakterienstamm Bo wurde bei Auftragungsvolumina zwischen µl der Ammoniumacetat-Extrakte für keinen Versuchsansatz ein intrazellulärer AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm erzielt. Die Ergebnisse der analytischen DC für den Stamm Bo und Stamm Flo 1 sind in Abbildung 3.17 dargestellt, wobei der AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensor erfolgte. 67

76 3. Ergebnisse C4-HSL C6-HSL C8-HSL a b C4-HSL C6-HSL C8-HSL Probennummer Probennummer Abb. 3.17: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus bakterieller Biomasse des Bakterienstammes Bo und des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. a: Die Bo Kulturen wurden in ungepuffertem ASN III/2 -Medium (Probennr. 3 und 4) und bei unterschiedlichen ph-werten in gepufferten ASN III/2 -Medien (Probennr. 5-9) bei 21 C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 30 µl der Extrakte aus den bakteriellen Biomassen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: ph 6, aus stationärer Phase; 6: ph 7, aus logarithmischer Phase; 7: ph 7, aus stationärer Phase; 8: ph 8,5, aus stationärer Phase; 9: ph 9,0, aus stationärer Phase. b: Die Flo 1-Kultur wurde in ungepuffertem ASN III/2 -Medium bei 21 C für 21 Tage bei einem Photonenfluss von 5 µe m -2 s -1 PAR inkubiert. Es wurden 60 µl Extrakt aus der bakteriellen Biomasse auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pzlr4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: cyanobakterieller Extrakt; 2: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 3: AHL- Referenzmolekül (C4-HSL). Abbildung 3.17 a ist zu entnehmen, dass im heterotrophen Stamm Bo 53-33, abgesehen von einer Kultivierung bei ph 8,5 und ph 9,0, eine geringe AHL-Menge nachgewiesen wurde (Probennr. 3-7). Die detektierten DC-Spots lagen dabei auf gleicher Höhe (geringfügig unterhalb von C6-HSL) wie die jeweiligen AHL-Moleküle in extrazellulären Untersuchungen (siehe Kap , Abb. 3.9). Des Weiteren lassen die Spotdurchmesser vermuten, dass der AHL-Gehalt in exponentiell wachsenden Bakterienzellen höher war (Probennr. 3) als in Bakterienzellen in der Stationärphase (Probennr. 4). Für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 wurde in der 21 Tage lang inkubierten Versuchskultur ein intrazellulärer AHL-Nachweis erzielt (Abb b). Nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung der AHL-Extrakte wurden mit dem 68

77 3. Ergebnisse Agrobacterium-Sensor zwei DC-Spots erhalten. Ein DC-Signal lag auf Höhe der Probenauftragung, das andere geringfügig oberhalb von C4-HSL (Abb b, Probennr. 1). 3.6 Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen Extraktion der chromosomalen DNA Aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen Stämmen Bo und Bo wurde deren chromosomale DNA extrahiert (siehe Kap ) und bei 4 C im Dunkeln gelagert. DNA-Menge und Reinheit der DNA wurden mit einem Spektralphotometer (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) ermittelt (siehe Kap ). Die DNA-Ausbeuten sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. Tab. 3.3: Ermittelte DNA-Ausbeute nach DNA-Extraktion aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen Stämmen Bo und Bo Bakterienstamm DNA-Ausbeute [ng/µl] Bo 10 (Cyanobakterium) 740 Bo 53 (Cyanobakterium) 1153 Bo (heterotrophes Bakterium) 5975 Bo (heterotrophes Bakterium) Amplifikation der 16S-rDNA Durch die Amplifikation der 16S-rDNA von Cyanobakterium Stamm Bo 53 mittels einer Standard-PCR (siehe Kap ) wurde ein ca bp großes DNA-Fragment erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Für das Cyanobakterium Stamm Bo 10 wurde neben einer ca bp großen Bande noch weitere 1-2 Banden im Agarosegel detektiert. Eine Separation der 16S-rDNA-Amplifikate aus dem Gel erfolgte durch Extraktion (siehe Kap ) Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz Die ermittelten 16S-rDNA-Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 (1333 bp) und Bo 10 (1336 bp) sind nach Alignment im Anhang dargestellt (siehe Tab. 7.2 und Tab. 7.3). Die Sequenzen wurden mit Sequenzen aus der öffentlichen Datenbank 69

78 3. Ergebnisse NCBI mittels BLAST (nucleotide blast) verglichen. Die kultivierten Stämme mit der größten Sequenzübereinstimmung sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Der Stamm Bo 53 wurde bereits von LYRA und Mitarbeitern (2005) sequenziert und als Nodularia harveyana eingeordnet. Ein Abgleich der ermittelten 16S-rDNA-Sequenz mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten 16S-rDNA-Sequenz (Accession-Nr.: AJ ) zeigte eine Übereinstimmung von 99,85% auf. Der Stamm Bo 10 wurde von RETHMEIER (1995) auf Grundlage von morphologischen Merkmalen als Oscillatoria brevis klassifiziert. Für einen Vergleich von Stamm Bo 10 mit weiteren Stämmen der Ordnung Oscillatoriales wurden die 16S-rDNA-Sequenzen der Geitlerinema-Stämme Flo 1 (1372 bp) und PCC 7105 (Referenzstamm) (1378 bp) zur Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes herangezogen (SCHRÜBBERS, 2007). Tab. 3.4: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Nodularia harveyana-stammes Bo 53 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 53 in Prozent und die jeweilige Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt. Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr. Nodularia harveyana BECID27 Nodularia harveyana BECID29 Nodularia spumigena BY1 Nodularia sphaerocarpa BECID36 Nodularia spumigena HEM Nodularia spumigena Huebel 1987/311 Nodularia baltica BY ,70% AJ ,94% AJ ,57% AF ,50% AJ ,11% AJ ,33% AJ ,42% AJ Tabelle 3.4 ist zu entnehmen, dass der cyanobakterielle Stamm Bo 53 die größten 16S-rDNA-Sequenzhomologien mit Bakterienstämmen der Gattung Nodularia aufweist, insbesondere mit Vertretern der Spezies Nodularia harveyana. Gegenüber den Stämmen BECID27 bzw. BECID29 zeigt der zu untersuchende Stamm Bo 53 Sequenzübereinstimmungen von 99,70% bzw. 98,94% auf. Die ersten 50 16S-rDNA- Sequenzen, ermittelt mittels BLAST aus der NCBI-Datenbank, sind ausschließlich Sequenzen von Nodularia-Spezies mit mindestens 97%iger Sequenzhomologie. 70

79 3. Ergebnisse Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 53 und naheverwandten Stämmen (siehe Tab. 3.4) erfolgte nach der Neighbor-Joining -Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaumes (siehe Kap ) (siehe Abb. 3.18). 71 Nodularia spumigena HEM (AJ ) Nodularia spumigena Huebel 1987/311 (AJ ) 99 Nodularia spumigena BY1 (AF ) 86 Nodularia baltica BY1 (AJ ) Nodularia sphaerocarpa BECID36 (AJ ) Nodularia harveyana BECID29 (AJ ) 67 Nodularia harveyana BECID27 (AJ ) 100 Nodularia harveyana Bo 53 Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF ) 0.01 Abb. 3.18: Phylogenetischer Stammbaum nach der Neighbor-Joining -Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 53 und naheverwandten Nodularia-Spezies. Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF ) wurde als Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz-Sequenzen sind in Klammern angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die Bootstrap-Werte in Prozent dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid-Position. Abbildung 3.18 zeigt, dass Stamm Bo 53 insbesondere eine enge Verwandtschaftsbeziehung mit dem Nodularia harveyana-stamm BECID27 aufweist. Zu den weiteren Nodularia-Spezies ergab sich ein abgegrenztes Cluster. Der Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105 grenzt sich als verwendete Außengruppe deutlich von den Nodularia-Spezies ab. Tab. 3.5: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Stammes Bo 10 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 10 in Prozent und die jeweilige Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt. Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr. Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 Phormidium lumbricale UTCC 476 Phormidium cf. terebriformis KR2003/ ,32% AY ,64% AF ,42% AY Oscillatoria acuminata ,12% AB

80 3. Ergebnisse Tabelle 3.5 ist zu entnehmen, dass Stamm Bo 10 die nahesten Verwandtschaftsbeziehungen zu Vertretern der Gattung Phormidium und hier die größte Übereinstimmung in der 16S-rDNA-Sequenz mit Phormidium pseudopristleyi Stamm ANT.ACEV5.3 (99,32%) aufweist. Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 10 und naheverwandten Stämmen (siehe Tab. 3.5) sowie der 16S-rDNA-Sequenz der Stämme Flo 1 und PCC 7105 erfolgte nach der Neighbor-Joining -Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaumes (siehe Kap ) (siehe Abb. 3.19) Phormidium cf. terebriformis KR2003/25 (AY ) Oscillatoria acuminata (AB ) Oscillatoria brevis Bo 10 Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (AY ) Phormidium lumbricale UTCC 476 (AF ) Geitlerinema sp. PCC Geitlerinema sp. Flo 1 Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF ) 0.01 Abb. 3.19: Phylogenetischer Stammbaum nach der Neighbor-Joining -Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 10, naheverwandten Bakterienspezies sowie der Stämme Flo 1 und PCC Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF ) wurde als Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz- Sequenzen sind in Klammern angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die Bootstrap-Werte in Prozent dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid-Position. Aus Abbildung 3.19 geht hervor, dass Stamm Bo 10 zwar Verwandtschaftsbeziehungen mit verschiedenen Phormidium-Spezies und einer Oscillatoria-Spezies aufweist, aber ein eigenes Cluster bildet. Die beiden Geitlerinema-Stämme Flo 1 und PCC 7105 grenzen sich als Cluster, wie auch der als Außengruppe verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105, deutlich von den Vertretern der Gattungen Phormidium und Oscillatoria ab. 72

81 3. Ergebnisse Amplifikation des gyrb-gens Durch die Amplifikation des gyrb-gens der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 mittels einer Standard-PCR (siehe Kap ) wurde ein ca bp großes DNA- Fragment erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Die Sequenzen des gyrb-gens der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 konnten für eine Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der gyrb-sequenz aber nicht verwandt werden. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo und Bo konnten nach einer Standard-PCR mit den gyrb-spezifischen Primern keine ca bp großen Banden im Agarosegel detektiert werden Internal Transcribed Spacer (ITS) Nach Amplifikation der ITS der cyanobakteriellen Stämme Bo 10, Flo 1 und PCC 7105 (siehe Kap ) wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgetrennt (siehe Kap ). Das Gelbild ist in Abbildung 3.20 dargestellt. Proben bp Abb. 3.20: ITS-Bandenmuster der Cyanobakterienstämme Bo 10 (Probe 1 und 2), Flo 1 (Probe 3 und 4) und PCC 7105 (Probe 5 und 6) nach Fragmentauftrennung in einem 2%igen Agarosegel. M: Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder Plus; NK: Negativkontrolle ohne DNA-Template. Abbildung 3.20 zeigt das Gelbild der ITS-Amplifikate der cyanobakteriellen Stämme Flo 1, PCC 7105 und Bo 10. Für die beiden Geitlerinema-Stämme Flo 1 und PCC 7105 konnte im Bereich von 600 bp bp eine Bande dokumentiert werden. Für Stamm Bo 10 wurden im Bereich von 500 bp bp drei Banden detektiert. Die 73