Charakterisierung, Präparation und Kristallisation des SMN-SIP-Komplexes. Diplomarbeit vorgelegt von Oliver Schieweck aus Wolfsburg

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1 Charakterisierung, Präparation und Kristallisation des SMN-SIP-Komplexes Diplomarbeit vorgelegt von Oliver Schieweck aus Wolfsburg angefertigt im Istitut für Mikrobiologie und Genetik der Georg-August-Universität zu Göttingen 2005

2 Referent: Korrferent: Prof. Dr. R. Ficner Prof. Dr. O. Einsle Tag der Abgabe der Diplomarbeit: Letzter Tag der mündlichen Prüfungen:

3 Für meine Familie

4 Danksagung Bei Herrn Prof. Dr. R. Ficner möchte ich mich für die interessante Themenstellung dieser Arbeit und seine gute Betreuung bedanken. Außerdem möchte ich mich bei Christos Gouloudis, Anette Bernd, Christina Kiecke, Johanna Anorsdottier, Peter T. Naumann, Simone Brauns, Sina Möhlmann und Winfried (Winni) Lendeckel für ihre große Hilfsbereitschaft und freundliche Arbeitsatmosphäre im Labor bedanken. Für die ständige Beantwortung meiner Fragen und ihre unkomplizierte Hilfe danke ich weiterhin Dr. Achim Dickmanns und Dr. Markus Rudolf. Des weiteren möchte ich mich bei Heiko Strehmel (Medizinische Fakultät d. G.-A.- Univ., Göttingen), Martin Labadz (Geographisches Institut d. G.-A.-Univ.,, Göttingen und Sabine Strauch (Siloah Klinik, Hannover) für ihre fachkundige Beratung, technische Hilfe und große Unterstützung danken. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern für ihre ständige Unterstützung in allen Phasen meines Studiums.

5 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG Die Struktur eukaryotischer Gene Das Spleißen und das Spleißosom Die Rolle des SMN-Komplxes bei der snrnp-assemblierung Der SMN-Komplex MATERIAL UND METHODEN Material Organismen, Gene, Proteine und Plasmide Organismen Gene und Proteine Plasmide DNA-Oligonukleotide, DNA-Größenmarker, Protein-Größen- Standard DNA-Oligonukleotide DNA-Grössenmarker Protein-Größenstandard Antibiotika, Kulturmedien und Medienzusätze Antibiotika Kulturmedien und Medienzusätze Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme Methoden Behandlung von Geräten, Lösungen und Puffer Arbeiten mit Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Fällung und Konzentrierung von Nukleinsäuren Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren Isolierung von Nukleinsäuren Analytische Isolierung von Plasmid-DNA (MiniPrep) Präparative Plasmidisolierung (MidiPrep) Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Reinigung von PCR-Fragmenten Restriktionsverdau von DNA Ligation von DNA-Fragmenten Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 28

6 Inhaltsverzeichnis DNA-Sequenzierung Analyse der Sequenzdaten Arbeiten mit Bakterien Trübungsmessung DNA-Transfer durch vermittelte Kompetenz Herstellung kompetenter E. coli Zellen Transformation durch Hitzeschock Durchmusterung von Transformanten Durchmusterung von Transformanten mit isolierter Plasmid-DNA Kolonie-PCR Stammhaltung Reinheitskontrollen Arbeiten mit Proteinen Expression heterologer Proteine Expression im analytischen Maßstab Expression im präparativen Maßstab Zellernte und Zellaufschluss Zellaufschluss im analytischen Maßstab Zellaufschluss im präparativen Maßstab Diskontinuierliche SDS-PAGE nach Laemmli (1970) Färbung von Protein-Gelen Proteinbestimmung nach Bradford (1976) Proteinreinigung Affinitätsreinigung Reinigung der Proteine im mittels Glutathion-Sepharose Reinigung der Proteine mittels IMAC (Immobilisierte Metal Ionen Affinitäts-Chromatographie) Regeneration der Säulenmatrix Proteolytische Spaltung des Fusionsproteins Spaltung mit PreScission-Protease Spaltung auf einer Säulenmatrix mit PreScission-Protease Umpufferung von Proteinen Bindungsexperimente 42

7 Inhaltsverzeichnis Bindungsexperimente mit einzeln aufgereinigten Proteinen Bindungs-Versuche mit ko-exprimierten Proteinen Spezifische Markierung von Proteinen durch Antikörper : Western blotting Nassblotten von Proteinen Immunologische Detektion von Proteinen auf einer PVDF- Membran Konzentrierung von Proteinen Röntgenstrukturanalyse von Proteinen Kristallisation biologischer Makromoleküle ZIELE DER ARBEIT ERGEBNISSE Klonierung Klonierung der SMN-Fragmente in das pgex-system Klonierung der SIP1-Fragmente in das pet-system Klonierung der SIP1-Fragmente in das pgex-system Expression Expression von GST-SF Expression von GST-SF Expression der Fragmente His6-SIF Expession von His6-SMN Ko-Expression von GST-SF160 und His6-SIF Expression von den GST-SIF1-5-Fragmenten Expression von GST-SIP Ko-Expression von GST-SIF1-5 mit His6-SMN Aufreinigung Aufreinigung der GST-SMN-Fragmente Aufreinigung von GST-SF160 und GST-SIF Bindungsversuche Bindungsversuche mit gereinigten Proteinen Bindungsversuche durch Ko-Expression Westernblot-Analyse der Ergebnisse von den Bindungsversuchen aus Ko-Expression Kristallisation von SF160 86

8 Inhaltsverzeichnis 5. DISKUSSION Organisation der Bindungs-Versuche und Klonierung der Fragmente Organisation der Bindungs-Versuche Klonierung der Fragmente Expression Expression der His6-Fusionsproteine Expression der SIP-Fragmente His6-SIF Expression des His6-SMN Expression der GST-Fusionsproteine Expression des GST-SIF4 und GST-SIF Expression des GST-SIP Ko-Expressionen Ko-Expression der His6-SIP-Fragmente1-3 und dem GST-SF Ko-Expression der GST-SIP-Fragmente1-4 mit dem His6-SMN Aufreinigung Bindungs-Experimente Bindungs-Experimente mit gereinigten Proteinen Bindungs-Versuche mit ko-exprimierten Proteinen Spezifischer Nachweis der GST- und 6His-Fusionsproteine 5.6 Durch Antikörper mittels Western-blotting ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Abkürzungen 111

9 Inhaltsverzeichnis

10 Einleitung 1 1. EINLEITUNG Einer der bedeutendsten Unterschiede zwischen pro- und eukaryotischen Zellen liegt in der Struktur der Gene, der in Nukleinsäuren verpackten Information zur Synthese von Proteinen. So besteht ein eukaryotisches Gen aus codierenden, den Exons und nicht-codierenden Regionen, den Introns, in alternierender Reihenfolge. Prokaryotische Gene bestehen dagegen nur aus codierenden Bereichen. Diese kompliziertere Bauweise der eukaryotischen Zelle besitzt große Vorteile für eukaryotische Organismen. Sie ermöglicht es, dass ein Gen für mehrere Genprodukte gleichzeitig codieren kann, was bei der großen Menge an verschiedenen Proteinen der höheren Organismen von Vorteil sein kann. Damit bei der Translation der Nukleinsäure-Information in Protein nur die Exons übersetzt werden, müssen die nicht-codierenden Introns aus dem Vorgänger der für diesen Prozess verwendeten Nukleinsäure messenger-rna (mrna), der PrämRNA, entfernt werden. Der Mechanismus, der dies vollbringt wird Spleißen genannt (eng. splicing). Der Splicing-Apparat der Zellen, das Spleißosom, besteht aus fünf RNA-Protein- Komplexen, den snrnps (small nuklear ribonucleoprotein particles) (gesprochen : snurps)), welche U1, U2 und U4 bis U6 genannt werden. Diese snrnps wiederum bestehen aus sogenannten snrnas (small nuclear RNAs) und spezifischen und gemeinen snrnp-proteinen. Die Synthese dieser snrnps ist ein komplexer und bei weitem noch nicht vollständig verstandener Vorgang, an dem mindestens weitere sieben verschiedene Proteine beteiligt sind, Gemin 1 bis Gemin 7 genannt und zusammen den SMN-Komplex bilden. SMN (survival of motorneuron protein oder Gemin 1), das Kern-Protein dieses bedeutsamen Komplexes wird in allen Säugetier-Zellen, am stärksten aber in Nervenzellen exprimiert (Coovert et al., 1997; Lefebvre et al., 1997). Die Bedeutung des SMN1, einer von zwei Formen des SMN, zeigt sich darin, dass Mutationen in dem SMN-Gen zu einer schweren neurologischen Krankheit führen kann, die SMA (spinale Muskel-Arthrophie). Diese Erkrankung betrifft die Vorderhornzellen des Rückenmarks und kann durch Degeneration dieser, zu schweren neurologischen Symptomen und sogar zur kompletten Lähmung des Patienten führen.

11 Einleitung Die Struktur eukaryotischer Gene Die Struktur eukaryotischer Gene ist im Allgemeinen in vielen Punkten komplizierter als die der prokaryotischen Organismen. Eukaryotische Gene bestehen im Gegensatz zu prokaryotischen aus kodierenden Regionen, den Exons und nicht-kodierenden Regionen, den Introns, in alternierender Reihenfolge. Abb. 1. Struktur eines eukaryotischen Gens. Die Introns, also die Gen-Abschnitte, die keinerlei Information für die Gestaltung und Physiologie der Zelle besitzen, bieten ihren Wirtsorganismen dennoch enorme Vorteile, denn sie können zum Einen als Puffer bei viralen Insertionen dienen. So gibt es Viren wie z.b. die Retroviren, weitere onkogene Viren, und andere genetische Elemente, wie z.b. die Transposons (springende Gene), die der Wirtszelle schaden können, indem sie mit ihrer DNA ins Wirtsgenom inserieren und das betroffene Gen damit oft schädigen und Mutationen hervorrufen. Durch die Existenz der Introns wird aber nicht bei jeder Insertion ein Gen geschädigt. Viele Insertionen treffen nämlich die Introns und da diese keine genetische Information tragen, führt dies auch nicht zu negativen Auswirkungen. Ein anderer Vorteil der Introns liegt in der hohen Gen-Variation: Ein Gen wird nicht direkt in die jeweilige Protein-Sequenz translatiert. Es wird zunächst in eine andere Nukleinsäure-Sequenz, die aus RNA (ribonucleic acid) und nicht aus DNA (desoxyribonucleic acid) besteht, umgeschrieben. Dabei werden alle nicht-kodierenden Bereiche eines Gens zunächst in die entstandene Prä-mRNA mitübersetzt, in Folge der Prä-mRNA-Prozessierung aber, welche der Prä-mRNA-Synthese (Translation) folgt, schließlich entfernt. So entsteht letztendlich eine Abschrift des Gens, die nur noch aus kodierenden Bereichen besteht.

12 Einleitung 3 Abb. 2. Die Introns werden in Folge der Prozessierung der mrna aus dieser herausgeschnitten. Dieses Herausschneiden der Introns aus der mrna wird Spleißen genannt und ist ein entscheidender Schritt im Laufe der Prozessierung der mrna und damit auch ein wichtiger Schritt bei der Protein-Synthese. Hier können die Introns einen Vorteil bringen, indem sie es der Zelle ermöglichen, die Prä-mRNA vieler Gene auch alternativ zu spleißen, das heißt, alternative Introns zu erkennen, welche länger sein und damit in die Sequenz eines Exons hereinragen können, oder aber auch kürzer sein können. In dem Fall wäre dann ein Exon um den jeweiligen Bereich eines Introns, um den sich die Spleiß-Stelle verschoben hat, länger. Dadurch können Eukaryoten ein Vielfaches an verschiedenen Formen von Enzymen (Isozyme) und anderen Proteinen exprimieren. 1.2 Das Spleißen und das Spleißosom Die Spleiß-Reaktion, welche durch das Spleißosom, einen Ribonukleoprotein- Komplex, katalysiert wird, ist chemisch gesehen eine Umesterungs-Reaktion und findet im Karyoplasma, also innerhalb des Zellkerns statt. Für diese Reaktion werden drei spezifische Sequenz-Abschnitte durch das Spleißosom erkannt, die zum einen den Anfang und zum anderen das Ende eines Introns markieren. Der Anfang eines Introns am 3 -Ende wird meistens durch den Sequenz-Abschnitt GU (Guanidin Uridin) erkannt, während dessen Ende am 5 - Ende mit AG (Adenosin Guanidin) markiert ist. Ein Intron besitzt auch eine Art innere Struktur. Nicht nur der Anfang und das Ende sind durch spezifische Sequenzen festgelegt, sondern auch innerhalb des

13 Einleitung 4 Introns findet sich ein Sequenz-Abschnitt wieder, welcher spezifisch erkannt wird, nämlich die sogenannte Verzweigungsstelle, die branching site (siehe Abb. 3). Diese besitzt meist die allgemeine Sequenz YARYNY, wobei Y ein Purinnucleotid, R ein Pyrimidinnucleotid und N irgendein beliebiges Nucleotid darstellt. Abb. 3. Struktur der Intron-Exon-Sequenz einer eukaryotischen Prä-mRNA. Bei der Spleiß-Reaktion greift die 2 -Hydroxyl- (OH-) Gruppe des Adenosin in der branching site an die 5 -Phosphat-Gruppe des Guanin der GU-5 -Spleißstelle an und knüpft damit über diese eine Bindung zum 5 -Ende des Introns. Das 3 -Exon- Ende das in 5 3 -Richtung vor dem Intron liegt wird dadurch frei. Dies führt zur Bildung einer intermediären Lassostruktur.Die frei gewordene 3 -OH-Gruppe am Ende des nun vom Intron gelösten vorderen Exons kann nun an die 5 -Phosphat- Gruppe der ersten Base des hinter dem Intron liegenden Exons angreifen. Damit löst sich die 3 (AG)- Spleißstelle von der daran liegenden hinteren Exon-Sequenz. Die beiden Exon-Stücke werden dadurch miteinander verknüpft (Abb. 4). Abb. 4. Der Spleiß-Mechanismus der Prä-mRNA. Nach Stryer et al. (2003).

14 Einleitung 5 Dadurch entsteht ein durchgehender codogener Sequenzbereich der schließlich bei der Translation in einem durch abgelesen und in die Protein-Squenz umgeschrieben werden kann. Zumindest in einigen Fällen wird das Intron-Lasso in der Zelle weiterverwendet, und dient dann als RNA-Struktur für die sno-rnp- (small nucleolar RNA-proteinparticle)-Synthese (Limbach et al., 1994; Tollervey und Kiss, 1997; Weinstein und Steitz, 1999; Kiss et al., 2001). Die snornps sind an weiteren wichtigen Modifikation von stabilen zellulären RNAs, wie snrnas, trnas und rrnas beteiligt. Diese Modifikationen, die Pseudouridylierungen und O Methylierungen umfassen dienen z.b. der Stabilität und der korrekten Faltung dieser RNA-Moleküle. So wird die richtige Ausbildung der Anti-Codon-Schleife von trnas durch die modifizierten Nukleotide unterstützt (Agris, 1996; Kiss et al., 2001). Neben den spezifischen Proteinen, der spleißosomalen U-snRNP, besitzen diese auch gemeine Proteine, die sogenannten Sm-Proteine (Sm von Smith), die alle U- snrnps (außer U6) gleichermaßen besitzen. Von diesen Sm-Proteinen gibt es insgsamt acht und diese werden SmB / B, SmD 1-3, SmE, SmG und SmF genannt und treten stets in bestimmten Paaren auf : Sm-EGF, Sm-D 1 D 2 und Sm-B/B D 3. U6-snRNPs besitzen anstelle dieser Sm-Proteine Sm-like (Lsm)-Proteine (Dreyfuss et al., 2002, Fischer et al., 2002) (siehe Abb. 5). Diese Sm-Proteine bilden, an die Sm-Bindestelle der snrna (Sm-site) gebunden, eine definierte Struktur, die Sm-core-Domain genannt wird. Abb. 5. Struktur eines snrnps. Nach Dreyfuss et al. (2002).

15 Einleitung 6 Doch wie katalysiert dieser Komplex aus den verschiedenen U-snRNPs die komplexen Reaktionen des Spleißens? Über eine hoch-spezifische Sequenz der U1-snRNA erkennt zunächst das U1-snRNP die 5 -Spleißstelle woraufhin die branching site des Introns von dem U2-snRNP erkannt und gebunden wird (siehe Abb. 6). So entsteht zunächst ein Komplex, der Komplex A genannt wird. Während dessen formiert sich ein Komplex aus U4/U6- und U5-snRNP. Dieser bindet daraufhin an den zuvor gebildeten Komplex A, der von da an Komplex B genannt wird. Die Intron-Sequenz wird dabei so verformt, dass U1 und U2 in Kontakt geraten. Durch diese in Komplex B stattfindenden Interaktionen kommen sich auch die 5 -Spleißstelle und die branching site näher. Die Katalyse geschieht schließlich durch Annäherung der entsprechenden Basen. Dabei führen zunächst Wechselwirkungen von U5 mit der 5 - und der 3 -Spleißstelle zu den erforderlichen Annäherungen, während sich U4 welches bis dahin als Inhibitor für U6 fungierte, davon löst und damit Wechselwirkungen zwischen U6 und U2 ermöglicht. Schließlich wird U1 von U6 verdrängt, wobei U6 und U2 das katalytische Zentrum des Spleißosom bilden, welches so die Struktur einer Helix besitzt. Diese Helix stellt das eigentliche katalytische Zentrum dar, nachdem sich viele nicht-snrnp-proteinen derweil an U5-snRNP angelagert haben. Der so entstandene Komplex wird Komplex B* genannt (oder auch 45S aktiviertes Spleißosom). Zu den sich an U5-snRNP-anlagernden Proteinen gehören unter anderem die sogenannten SKIP-Proteine, drei Cyclophiline, die RNA-Helikasen Prp22, und p68, ebenso wie viele zu dem Prp19-Komplex gehörende Proteine (Lührmann et al., 2002). Diese intramolekularen Umlagerungen führen schließlich zu den beiden Umesterungsreaktionen (Schritt 1 und Schritt 2), indem die jeweilige OH-Gruppe stets in die richtige Position für einen nucleophilen Angriff an die Phosphat-Gruppe der jeweiligen Spleißstelle einnimmt. Das Spleißosom zerfällt nach den Spleiß-Reaktionen in seine Komponenten, wobei auch das Intron in der Lasso-Struktur frei wird. Bei dieser Spleißosom- Auflösung bleiben die nicht-snrnp-proteine jedoch zunächst noch an das U5- snrnp gebunden und bilden so das 35S U5-snRNP, welches kurz darauf schließlich doch zerfällt und die Komponenten so wieder für eine erneute Spleiß- Aktion zur Verfügung stellen.

16 Einleitung 7 Abb. 6. Schematische Darstellung der spleißosomalen und snrnp-umordnungen. Das Splicing ist energieabhängig. Viele Schritte benötigen die Hydrolyse von ATP. Diese Schritte sind meist die nötigen Umlagerungsreaktionen. Da daran stets RNA-Moleküle beteiligt sind und diese aber auch gleichzeitig stark dazu neigen, sich zu verwinden ist es ständig nötig, diese energieaufwendig wieder durch RNA- Helikasen zu entwinden. Dabei spielen meist sogenannte DEAD-box-Helikasen eine Rolle, eine Art von Helikasen, die durch das für diese Gruppe charakteristische DEAD-box-motiv geprägt sind, das an der Bindung und Hydrolyse von ATP beteiligt ist. DEAD-Box-Proteine wurden bislang in verschiedensten Organismen gefunden und sind durch 4 verschiedene charakteristische Motive gekennzeichnet. Motiv I besitzt die allgemeine Sequenz AXXGXGKS/T und ist das ATPase-Motiv, das dieser Gruppe die für diese DEAD-Box-Helikasen essentielle Funktion verleiht. Das Motiv II ist das namensgebende DEAD-Box-Motiv und besitzt die Sequenz Asp-Glu-Ala-Asp, D-E-A-D. Beide Motive werden als Walker-Motive I und II bezeichnet und sind verantwortlich für die Bindung des Nucleotid-Triphosphat- Mg 2+ -Komplexes, die für die ATP-Hydrolyse unentbehrlich ist. Des weiteren ist das Motiv III die eigentliche Helikase-Domäne, während das Motiv IV für die Bindung von Nukleinsäure unerlässlich ist (Sadovsky et al., 2002).

17 Einleitung Die Rolle des SMN-Komplxes bei der snrnp-assemblierung Der Zusammenbau des Spleißosoms ist ein recht komplizierter Vorgang und ein Teil davon wird durch einen Protein-Komplex vollzogen, der SMN-Komplex genannt wird (Mattaj und De Robertis, 1985; Mattaj, 1988; Lührmann et al., 1990; Fischer et al., 1997). Das Kern-Protein dieses Komplexes heißt SMN (Survival of Motor Neuron). Der Name rührt von der Tatsache her, dass eine durch eine Mutation defekte Form dieses Proteins in 1 von 6000 Menschen zu einer schweren neurologischen Krankheit führt, der SMA (Spinale Muskel-Atrophie). SMA ist eine Krankheit, die vor allem die Motor-Neurone in den Vorderhornzellen des Rückenmarks betrifft und zu dessen Degradation führt (Hua und Zhou, 2003; Dreyfuss et al., 1999; Roberts et al., 1970; Pearn, 1980; Czeizel and Hamula, 1989 ). Dies kann bei den betroffenen Personen zu Muskelschwäche, Dystrophie, Lähmungen unterschiedlicher Schweregrade und in einigen Fällen zum Tode führen (Dreyfuss et al., 2004). Die Sm-core-Domäne, die Struktur der gemeinen snrnp-proteinen, besitzt eine heptamere Ringstruktur (siehe Abb. 5) und wird von dem SMN-Komplex gebildet und schließlich auch von diesem auf die U-snRNAs übertragen. Sie entsteht durch Wechselwirkungen von bestimmten für Sm-Proteine charakteristische β-strängige Strukturen, den Sm-Falten. Diese Sm-Falten werden von den sogenannten Sm- Motiven, Sm1 und Sm2, gebildet, die ein Großteil der Sm-Protein-Sruktur ausmachen. Neben den Sm-Motiven besitzen die Sm-Proteine B/B, D1, D3 und das Lsm-Protein 4 auch eine RG-reiche Sequenz, das RG-Motiv (siehe Abb. 7) Abb. 7. Verteilung der Protein-Motive der Sm-Proteine. Nach Fischer et al. (2002). Die Assemblierung der U-snRNA mit den Sm- bzw. Lsm-Proteinen wird von dem SMN-Komplex durch Zusammenarbeit mit einem weiteren Komplex, dem PMRT5-

18 Einleitung 9 Komplex (Protein-Arginin-Methyl-Transferase 5-Komplex) katalysiert (Dreyfuss et al., 2002). Der PRMT5-Komplex ist ein heterotrimerer Protein-Komplex und besteht aus der eigentlichen Methyltransferase JBP1 (PRMT5), dem WD45-Motiv-Protein MEP50 und einem für die snrnp-assemblierung inhibitorischen Faktor picln. Der PRMT5-Komplex übernimmt bei der snrnp-assemblierung eine regulatorische Rolle. An sich besitzen die Sm-Motive nur geringe Affinität zu der Tudor-Domäne des SMN. Durch Methylierung der RG-Box der Sm-Proteine (siehe Abb. 7) wird die Affinität deutlich erhöht. Der PRMT5-Komplex dimethyliert spezielle Arginin- Resten der RG-Box der Sm-Proteine symmetrisch (siehe Abb. 8) und erhöht dadurch die Affinität dieser zu der SMN-Tudor-Domäne. Der inhibitorische Faktor picln des PRMT5-Komplex, bindet freie Sm-Proteine und blockiert diese so zunächst für die Formierung der Sm-core-Domäne, (Clapham et al., 1999, Fischer et al., 2002). Abb. 8. symmetrisch dimethyliertes Arginin (sdma). Nach Fischer et al. (2002) Insgesamt werden die U-snRNAs bei der snrnp-assemblierung durch spezifische U-snRNA-Kerntransporter aus der Kernmatrix in das Cytoplasma transportiert. Dort werden die Sm-Proteine D 1, D 3, B oder B und das Lsm Protein 4 via PRMT5- Komplex zweifach symmetrisch methyliert (siehe Abb. 8). Der PRMT5-Komplex bindet daraufhin, inklusive der von ihm methylierten Sm-Proteine, an den SMN- Komplex. Bei dem daraus entstandenen SMN-PRMT5-Komplex binden die Sm-

19 Einleitung 10 Proteine direkt an das SMN des SMN-Komplexes (Liu et al., 1997; Pellizoni et al., 1999; Fischer und Meister, 2002), an dem sie dann die heptamere Ringstruktur der Sm-core-Domäne ausbilden, die schließlich durch den SMN-Komplex auf die freien snrnas übertragen wird (siehe Abb. 9). Freie Sm-Proteine, die durch schwächere Interaktionen mit dem SMN-Komplex, die snrnp-assemblierung stören könnten, werden zwischenzeitig durch den inhibitorischen Faktor des PRMT5-Komplexes, picln gebunden. Zum Schluss wird das m 7 G-Cap der U-snRNA, des eben entstandenen U- snrnps, von einer weiteren Methyltransferase zu einem m 3 G-Cap ( 3 für dreifach methyliert) hypermethyliert, bevor die snrnps durch einen U-snRNP- Kerntransporter wieder in den Kern zurück importiert wird, wo sie an der Spleiß- Reaktion beteiligt sind (Mattaj, 1996; Lührmann et al., 1990; Neumann de Vegvar und Dahlberg, 1990; Zieve und Sauterer, 1990). Abb. 9. Biogenese-Weg der spleißosomalen snrnps. In neueren Veröffentlichungen (Matera et al.,2004) wird beschrieben, dass der SMN-Komplex wahrscheinlich während der gesamten Zeit des Rück-Importes des snrnp in den Zellkern an diesem gebunden bleibt und sich davon erst im Karyoplasma wieder löst.

20 Einleitung Der SMN-Komplex Der SMN-Komplex besteht wie bereits erwähnt aus den sieben verschiedenen Proteinen, Gemin 1 bis Gemin 7, und liegt in der Zelle als Dimer vor (Charroux et al., 2000; Grundhoff et al., 1999; Campbell et al., 2000; Meister et al., 2000, 2001; Pellizoni et al., 2002;) (Abb. 9). Abb. 9. Der SMN-Komplex. Nach Dreyfuss et al. (2004). Gemin 1 (SMN), das Kern-Protein des SMN-Komplexes ist ein ca. 33 kda großes Protein aus 281 Aminosäuren. Das SMN-Gen ist als invertierte Wiederholung in einer 500 kbp-region auf Chromosom 5 an dem Locus (Gen-Ort) 5q13 dupliziert (Dreyfuss et al., 1999; Brzustowicz et al., 1990; Melki et al., 1990, 1994; Lefebvre et al., 1995; Burghes et al., 1997). Es gibt 2 fast identische Kopien des SMN- Gens, eine telomerische (SMN1) und eine centromerische Form (SMN2). Der einzige Unterschied der beiden Formen ist eine Punktmutation im Exon 7, die zu einer Deletion dieses Exons in der Proteinstruktur führt und damit zu einem um 16 Aminosäuren am C-Terminus verkürztem Protein. Über 98 % der SMA-Patienten besitzen zu dem eine Deletion bzw. eine Mutation in dem SMN1-Gens wodurch die Funktionen dieses Proteins vermindert oder verloren wird (DREYFUSS et al., 1999; Bussaglia et al., 1995; Chang et al., 1995; Cobben et al., 1995; Hahnen et al., 1995; Lefebvre et al., 1995; Rodrigues et al., 1995; Velasco et al., 1996). SMN2 kann durch seine verkürzte Struktur dabei nicht alle Aufgaben oder einige zumindest nur eingeschränkt wahrnehmen und so in diesen Fällen dadurch den

21 Einleitung 12 Verlust des SMN1 nicht kompensieren. Zudem wird in SMA-Patienten meist ein allgemeiner Mangel an SMN-Protein festgestellt, damit kommt es wohl zusätzlich noch zu einem, bedingt durch die Mutation verstärktem Abbau des SMN in den Zellen. Bis jetzt sind drei funktionelle Domänen des SMN charakterisiert worden, die SIP1-bindende Domäne, die im Bereich des Exons 1 und 2a (aa 18 bis aa 44) lokalisiert ist (Wang und Dreyfuss, 2001), die sogenannte Tudor-Domäne, die in Exon 3 (aa 91 bis aa 142) lokalisiert ist und die Tyrosin-Arginin-reiche Domäne (YG-Box), die im hinteren Bereich des Exon 6 (268 bis 279) codiert ist (Wang und Dreyfuss, 2001) (siehe Abb. 10). Allerdings konnte bei dem Ex1-2a-Bereich in BIAcore sensor chip -Versuch via kovalent gebundene Anti-Maus IgG mit den SMN-Fragmenten Ex1-2, 2,2a,2b,3,4 und 6 keine Interaktion mit SIP1 gezeigt werden. Bei diesen Versuchen konnte dagegen eine Interaktion von SIP1 und der Ex2b-Sequenz (aa 52 bis 90) von SMN nachgewiesen werden (Morris et al., 2000). Abb. 10. Schematische Darstellung der Domänen-Verteilung des SMN. Die in Exon 3 codierte Tudor-Domäne wird hauptsächlich für die Bindung der Sm- Proteine benötigt. Durch Röntgen-Kristallographie konnte die drei-dimensionale Struktur der Tudor-Domäne gelöst werden (Groves et al., 2002, Sattler et al., 2001). Sie bildet mit fünf anti-parallelen β-faltblättern (β1 β5) und den drei dazwischen liegenden ω-schleifen (loop 1 loop 3) eine Fass-ähnliche Struktur, in der die Faltblätter β4 und β5 durch einen helikalen turn miteinander verbunden sind (siehe Abb. 11).

22 Einleitung 13 Abb. 11. Bänder-Modell der SMN-Tudor-Domäne. Der helikale turn zwischen den b-faltblättern 4 und 5 ist grün dargestellt. Nach Sattler et al. (2001). Die gesamte Fass-Struktur wird vor allem durch acht innen liegende Aminosäurereste, Cys 98, Ala 100, Ala 111, Ile 113, Ile 116, Cys 123, Val 125 und Leu 141 stabilisiert (siehe Abb. 12). Abb. 12. Die Tudor-Domäne wird von acht innen liegenden Aminosäure-Resten stabilisiert. Nach Sattler et al. (2001). Die Struktur der Tudor-Domäne besitzt große Ähnlichkeit zu der Struktur der Sm- Falte der Sm-Proteine. So liegt die Vermutung nahe, dass so, wie die Sm-Falten der Sm-Proteine SmD 3 -B/B und SmD 1 -D 2, deren Bindung über eine, durch die β- Faltblätter 3 und 4 gebildete Schnittstelle stattfindet (Abb. 13), auch die Tudor-

23 Einleitung 14 Domäne über so eine ähnliche Schnittstelle an die durch SMN gebundenen Sm- Proteine bindet (Abb. 14). Bei diesen Bindungen, also der Bindung zwischen der Tudor-Domäne und der Sm-Falten, ebenso wie zwischen der Sm-Falten unter sich, besitzt eine Dimethylierung spezieller Arginin-Reste eine verstärkende Funktion (Sattler und Fischer et al., 2001). Die C-terminale Y/G-Box spielt ebenfalls eine Rolle bei der Bindung an Sm- Proteine, in welcher Weise, ist jedoch noch nicht bekannt. Des Weiteren dient diese aber auch noch der Bindung an Gemin 3 und Gemin 7, die ohne eine intakte Y/G-Box nicht an SMN binden können ( Dreyfuss und Wang et al., 2001, Dreyfuss et al., 2002). Abb. 13. Die Sm-Proteine D1-D2 und D3-B/B Abb. 14. Die Tudor-Domäne besitzt strukturelle Ähnlichkeit binden aneinander durch eine intermolekulare mit den Sm-Proteinen und bindet diese womöglich auf Schnittstelle durch die β-stränge β4 und β5. einer ähnlichen Weise wie diese sich untereinander binden. Nach Sattler et al. (2001). Nach Sattler et al. (2001). Gemin 2 wird auch SIP1 genannt (von SMN-Interacting-Protein) und ist so noch nicht charakterisiert worden. Gemin 3, auch DP103 genannt, ist eine DEAD-Box- RNA-Helikase und interagiert sowohl mit SMN als auch mit Gemin 4, wodurch es auch als Bindeglied zwischen diesen beiden SMN-Komplex-Komponenten fungiert, da Gemin 4 direkt nicht an SMN bindet. Dadurch wird vermutet, das es sich dabei um einen ATPase-, bzw. Helikase-Co-Faktor des Gemin 3 handeln könnte. Gemin 4 (GIP) bindet zugleich auch direkt an die Sm-core-Proteine, wie SmB/B, SmD 1-3 und SmE und ist an die U-snRNA assoziiert (Dreyfuss et al., 2000). Dagegen interagiert Gemin 5, auch p175 genannt, ein WD-Wiederholungs- Motiv-Protein direkt mit SMN, wobei dieses WD-Wiederholungs-Motiv, welches im

24 Einleitung 15 allgemeinen multiple Protein-Interaktionen verstärkt, damit vermutlich als Plattform für die Assemblierung des Proteinkomplexes dient (Feng und Dreyfuss et al., 2004). Genau wie Gemin 4 interagiert Gemin 6 nur über ein Binde-Protein, in diesem Fall Gemin 7, mit SMN und bindet auch Sm-Proteine, darunter hauptsächlich SmD 2 und SmE aber auch SmD 1 und SmD 3. Ebenfalls Sm-Proteine bindet das zwischen Gemin 6 und Gemin 1 als Linker fungierende Protein Gemin 7. Dieses interagiert hauptsächlich mit SmE, aber wie auch Gemin 4 und 6 ebenfalls mit weiteren Sm- Proteinen in etwas schwächerer Form. Gemin 7 besitzt eine evolutionär konservierte Sequenz, das RG-Motiv. Dieses namentlich Arg-Gly-reiche Motiv ist ebenfalls charakteristisch für die Sm-Proteine und dient diesen für die Bindung an das SMN über dessen Tudor-Domäne. Das RG-Motiv ist allerdings für die Interaktion zwischen SMN und Gemin 7 nicht nötig (Dreyfuss et al., 2002). Die Proteine des SMN-Komplexes wurden bei zellbiologischen Untersuchungen sowohl im Cytoplasma, als auch im Karyoplasma gefunden und sind in zellulären Körperchen den sogenannten Gems lokalisiert (Liu et al., 1997). Gems sind in Größe und Anzahl den sogenannten Cajal-Körpern, oder auch coiled bodies (CBs), sehr ähnlich und mit diesen auch assoziiert. Cajal-Körper sind Komplexe mit hoher Anzahl von bestimmten Faktoren, die in Vorgänge wie Transkription, Prozessierung von nuclearer RNA, wie snrna und snorna und drei eukaryotischer RNA-Polymerasen, beteiligt sind. Cajal-Körper wurden im Jahr 1903 zum ersten Mal beschrieben. Sie wurden aber nie direkt an DNA, unreifer mrna und nicht-snrnp essentielle Spleiß-Faktoren assoziiert gefunden. Von daher wird davon ausgegangen, dass Cajal-Körper keine aktiven Orte für Transkription oder fürs Spleißen sind, sondern eher Orte, an denen Assemblierung und Modifikation von RNA-Komplexen stattfinden (Dreyfuss et al., 2004). Gems (von Gemini von Cajal-Körper) werden damit vor allem in Verbindung mit snrnp-assemblierung gebracht. Die einzelnen Komponenten des SMN-Komplexes erhielten von den Gems auch ihre Namen (Gemins). Der SMN-Komplex spielt aber auch noch in anderen Bereichen, außerhalb der Assemblierung des Spleißosoms eine Rolle. So konnte nachgewiesen werden, dass SMN auch weitere RNP-Proteine, wie einige der Box CD und Box H/ACA snornp-proteine und andere, wie Fibrillarin, GAR1, hnrnp-u, -Q und -R, sowie

25 Einleitung 16 RNA-Helikase A, Nucleolin und Coilin der Cajal-Körper bindet. Sogar das EBVnuclear-Anigen-2 wird durch SMN gebunden. Eine Eigenschaft, welche die meisten dieser Proteine gemeinsam haben, ist die Anwesenheit eines RG-motivs, wie es auch in der Sm-Falte der Sm- und Lsm-Proteine vorkommt. So spielt der SMN-Komplex vermutlich auch eine Rolle bei der Formation anderer RNPs. Eine weitere Beobachtung, die durch Überexpression von SMN in Neuronen gemacht wurde, nämlich die Auswirkung auf die Lokalisation der β-aktin-mrna in Neuronen, steht vermutlich auch in engem Kontakt mit der SMA-Krankheit. Damit kann auch für wahrscheinlich gehalten werden, dass der SMN-Komplex auch in dem Transport von speziellen mrna-molekülen in Motor-Axone involviert ist (Dreyfuss et al., 2004). Schließlich konnte ebenfalls gezeigt werden, dass SMN mit Proteinen interagiert, ohne dass diese eine RG-Box besitzen oder dass diese mit RNPs assoziiert sind, wie z.b. Profilin, FUSE-bindende Proteine, ZRP1 oder der Tumorsupressor p53. Des Weiteren interagieren Gemin 3 und 4 auch mit mikro-rna-komponenten, die eif2e2 enthalten, so wirkt sich eine Defekt-Mutation vermutlich auch auf die Aktivität von mikro-rnas aus.

26 Einleitung 17

27 Material und Methoden MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material Organismen, Gene, Proteine und Plasmide Organismen : Klonierungsstämme: Expressionstämme: Escherichia coli DH5α Escherichia coli BL21 Escherichia coli XL1-blue Escherichia coli BL21(DE3)-RIL (Cam r ) Stamm Genotyp Referenz/Quelle DH5α F - f80 laczdm15 D(lacZYA-argF)U169 Invitrogen, deor thi-1 reca1 enda1 hsdr17/r - k m + k ) Karlsruhe phoa supe44 l - gyra96 rela1 XL1-blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 Stratagene, rela1 lac [F proab laciqz M15 Tn10 (Tet r )] La Jolla, USA BL21 E. coli B F dcm ompt hsds(rb mb ) gal Stratagene BL21(DE3)-RIL E. coli B F ompt hsds(rb mb ) dcm+ Tetr gal λ(de3) enda Hte [argu ileyleuw Cam r ] Stratagene Tab. 2. Genotypen der Stämme Gene und Proteine Das Gen, das für das SMN (Gemin1) kodiert, war bereits in pet28a (Novagen) mit den Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI kloniert. Das Gen, das für das SIP1 (Gemin2) kodiert, war dagegen bereits in pcdna3.1 (Invitrogen life technologies) ebenfalls mit den Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI, einerseits und andererseits in einen pet28a kloniert. Die SIP1-Sequenz im pet28 war allerdings durch das Fehlen von bp 1 bis 45 verkürzt und konnte von daher nicht für die

28 Material und Methoden 18 Generation aller SIP1-Fragmente verwendet werden. Alle Konstrukte wurde freundlicherweise von Prof. Dr. Utz Fischer (Institut für Biochemie, Würzburg) zur Verfügung gestellt. Die Um die SMN-Fragmente [SF71(1-71) und SF160(1-160)] und die SIP1-Fragmente [SIF1(1-95), SIF2(1-168), SIF3(96-168), SIF4( und SIF5( )] mittels PCR konstruieren zu können, wurden die Gensequenzen aus der Datenbank Pubmed mit der Accession-Nr. NM_ für SMN und der Accession-Nr. NP_ für SIP1 entnommen. In Tab. 3 sind die Beschreibungen der verwendeten Gene und deren Accession-Nr. aufgeführt. Gen Beschreibung Accession Nr. SMN 1 telomere Form des humanen Gemin1 NM_ SIP1 humanes Gemin2 NP_ Tab. 3. Verwendete Gene der SMN-Komplex-Komponenten und deren Accession Nr Plasmide In der vorliegenden Arbeit wurden die in Tab. 4 aufgelisteten Plasmide zur Klonierung und Expression verwendet. Plasmide Herkunft/Beschreibung pet28a Novagen, Bad Soden pgex-6p1 Amersham Bioscience, Freiburg pgex-6p1+1 zwischen der BamHI- und EcoRI-Schnittstelle befindet sich noch eine zusätzliche NdeI-Schnittstelle pcdna3.1 Invitrogen life technologies Tab. 4. Plasmide.

29 Material und Methoden DNA-Oligonukleotide, DNA-Größenmarker, Protein-Größen- Standard DNA-Oligonukleotide Die Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) bezogen. Sie wurden sowohl zur Herstellung der SIP1- und SMN-Fragmente und zur Sequenzierung verwendet (Tab. 5). Primer Sequenzen 1SIP1forw: 5 -ggggtat catatg cgc cga gcg gaa ctg gct gg-3 (33mer) 2SIP1rev : 5 -gggtat ctcgag tta acc ttc agg ggc ggg ttg gc-3 (35mer) 3SIP1rev : 5 -gggtat ctcgag tta ggc tgg tcc aac agc ccc g-3 (34mer) 4SIP1forw: 5 -ggggtat catatg tat tcc cca aca ctt caa tgg-3 (34mer) 5SIP1rev : 5 -gggtat ctcgag tta aga tgg ctc atc agc taa atc-3 (36mer) 6SIP1forw: 5 -ggggtat catatg gcc aca aat gaa agt cct gg-3 (33mer) 1SMNforw: 5 -ggta ggatcc atg gcg atg agc agc ggc ggc-3 (31mer) 2SMNrev : 5 -gggtat ctcgag tta ttt agg tgt ggt ttt tgg-3 (33mer) 3SMNforw: 5 -ggta ggatcc aaa aga aaa cct gct aag aag-3 (31mer) 4SMNrev : 5 -gggtat ctcgag tta ttc att ctc ttg agc att-3 (35mer) T7forw : 5 -ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc-3 (21mer) Sequenzierungsprimer T7rev : 5 -cgc cag ggt ttt ccc agt cac gac-3 (21mer) Sequenzierungsprimer pgexforw : 5 -ggg ctg gca agc cac gtt tgg tg-3 (34mer) Sequenzierungspri Sequenzierungsprimer pgexrev : 5 -ccg gga gct gca tgt gtc aga gg-3 (36mer) Sequenzierungsprimer Tab. 5. DNA-Oligonukleotide. Restrikionsenzym-Erkennungssequenzen sind in blau ( NdeI: catatg; XhoI: ctcgag & BamHI: ggatcc), Stop-Codons (tta) sind in rot, Sart-Codons (atg) in grün dargstellt.

30 Material und Methoden 20 Bei der Erstellung der Primer wurde darauf geachtet, dass diese eine Überhang- Sequenz aufwiesen, die immer vor der Restriktionsschnittstelle liegt. Diese Überhang-Sequenz wird von Restriktionsenzymen gebraucht, um die eigentliche Erkennungssequenz zu erkennen. Die Länge dieser Überhang-Sequenzen hängt von den Eigenschaften der zu verwendenden Nuklease ab und sollte gc-reich sein. Des weiteren mussten bei Vorwärts-Pimern, in den Fällen, in denen die Gen- Sequenz nicht hinter einen Fusions-tag kloniert werden sollte, ein Start-Codon eingebaut werden, während bei Rückwärts-Primern, in den Fällen, in denen die Gen-Sequenz nicht vor einen Fusions-tag einkloniert werden sollte, ein Stop- Codon eingebaut werden musste. Die 3 -Enden der Primer sollten für eine bessere Bindung an das Templat stets gc-reich sein DNA-Grössenmarker Zur Bestimmung der Größe von DNA-Fragmenten mittels Agarosegel- Elektrophorese wurden die Gene Ruler 1 kb DNA Ladder #SF0241 und #SF0321 (MBI, Fermentas, St. Leon-Rot) eingesetzt (Abb. 11) #SF0241 #SF0321 Abb. 11. Gene Ruler 1kb Ladder.

31 Material und Methoden Protein-Größenstandard Zur Bestimmung des Molekulargewichtes der rekombinanten Proteine mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden der Protein- Größenstandard BR (Broad Range) von der Firma New England Biolabs (Frankfurt a. M.) und der selbst hergestellte SM-Marker (Self Made) verwendet. Auf einem 15%-igen bzw. 4-20%-igen SDS-Gel ergibt sich für den SM-Marker bzw. für den BR-Marker das in Abb. 12 bzw. Abb. 13 beschriebene Bandenmuster: Abb.12: SM-Marker (in kda) Abb.13: BR-Marker (in kda) Antibiotika, Kulturmedien und Medienzusätze Antibiotika Die Antibiotika Stammlösung wurde nach Sambrock et al. (1989) eingesetzt, sterilfiltriert und bei 20 C aufbewahrt. Aus diesen sterilen Stammlösungen wurden die Antibiotika den Nährmedien nach dem Autoklavieren und Abkühlen zugegeben. Ampicillin wurde in H 2 O bidest. gelöst (100 mg/ml). Es wurde in einer Endkonzentration von 100 µg/ml eingesetzt. Kanamycin wurde in H 2 O bidest. gelöst (50 mg/ml). Die eingesetzte Endkonzentration betrug 50 µg/ml.

32 Material und Methoden 22 Chloramphenicol wurde in Ethanol gelöst (35 mg/ml). Die Endkonzentration betrug 35 µg/ml Kulturmedien und Medienzusätze -Luria Bertani (LB)-Medium: 1 % (w/v) Trypton, 0.5 %(w/v) Hefeextrakt, 1 %(w/v) NaCl, ad 1 l H 2 O bidest., autoklaviert. -LB-Agar: 1,5 % (w/v) Agar, ad 1 l LB-Medium, autoklaviert -IPTG (Isopropyl-β-thio-galactosid) wurde als 1 M Stammlösung hergestellt und sterilfiltriert. Die eingesetzte Endkonzentration betrug 1 mm Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme Sofern nicht anders angegeben, wurden Chemikalien mit den Reinheitsgraden p.a. oder reinst von den Firmen Applichem (Darmstadt), Fluka (Buchs, Schweiz), Oxoid (Basingtoke, Hampshire), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen. Die Restriktionsendonukleasen und die T4- DNA-Ligase stammten von der Firma New England Biolabs (Fankfurt a. M.). 2.2 Methoden Behandlung von Geräten, Lösungen und Puffer Zur Inaktivierung eventuell vorhandener Nukleasen wurden alle hitzestabilen Geräte und Lösungen für 20 min bei 120 C autoklaviert. Kleingeräte aus Metall wurden vor Gebrauch mit Ethanol abgeflammt und nicht autoklavierbare Materialien mit 70% (v/v) Ethanol gespült. Lösungen mit hitzeempfindlichen Chemikalien und Puffer wurden sterilfiltriert.

33 Material und Methoden Arbeiten mit Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmungen doppelsträngiger DNA wurden in entsprechenden Verdünnungsstufen photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm gegen H 2 O bidest. in Kunststoffeinmal-Küvetten durchgeführt. Bei einer Schichtdicke von 1 cm gilt für gereinigte dsdna: E 260 = 1 entspricht 50 µg dsdna (Davis et al., 1980). Verunreinigungen z.b. durch Polysaccharide und Proteine konnten durch eine zusätzliche Messung bei 230 nm und 280 nm erfasst werden. Im Idealfall gilt für eine reine DNA-Lösung: E 230 (Polysaccharide): E 260 (DNA): E 280 (Proteine) verhält sich wie 0,45 : 1 : 0,515 (Marmur, 1961) bzw. E 260 (DNA) : E 280 (Proteine) wie 1,8 : 1 (Sambrock et al., 1989). Signifikante Abweichungen des DNA-Werts vom Polysaccharid- bzw. Protein-Wert erlaubten keine verlässliche Konzentrationsbestimmung Fällung und Konzentrierung von Nukleinsäuren Die DNA-Lösung wurde mit einer 7 M Ammoniumacetat Lösung auf eine Salzkonzentration von 0,7 M eingestellt und schließlich mit 2 Vol. eiskaltem Ethanol (96 % (v/v), unvergällt) oder 0,7 Vol. Isopropanol versetzt. Nach Durchmischen wurde die DNA bei der Ethanolfällung 30 min bei 20 C bzw. bei Isopropanolfällung ca. 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde die DNA bei x g für 30 min bei 4 C sedimentiert (Eppendorf Zentrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg). Der Vorteil des Ammoniumacetats war, dass es sich bei Trocknung des DNA Pellets verflüchtigte und somit die Salzkonzentration in der DNA-Lösung bei Wiederaufnahme des Pellets in H 2 O bidest. geringer war. Durch Fällung und Aufnahme des DNA Pellets in entsprechend geringeren Volumina war es möglich, DNA-Lösungen zu konzentrieren.

34 Material und Methoden Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren Gelelektrophoretische Auftrennungen von Nukleinsäuren sowohl für analytische als auch für präparative Zwecke erfolgten in horizontalen Elektrophoresekammern. Die Gelvolumina betrugen ml (8 x 11.5 cm) für Analysen und ml (16 x 21.5 cm) für präparative Gele. Es wurde 1% (w/v) Agarose in TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA-Puffer) aufgekocht, wobei der TBE-Puffer gleichzeitig als Elektrophorese-Puffer diente. Vor dem Auftragen in die Geltaschen wurden die DNA-Proben auf einen Parafilmstreifen pipettiert und mit 1/6 Volumen Schwerelösung (DNA Loading Dye, MBI Fermentas, St. Leon-Rot) versetzt. In der Regel wurde bei den analytischen Gelen eine Spannung von V (Laufzeit min) und bei präparativen Gelen eine Spannung von 100 V (Laufzeit ca. 1 h) angelegt. Anschließend wurde das Agarosegel in einem mit Ethidiumbromid (2 µg/ml) versetzen TBE-Bad inkubiert und schließlich mit einer Geldoc 2000 (Bio-Rad, München) unter UV- Licht dokumentiert. TBE-Puffer Tris EDTA Borsäure M 0.02 M M Isolierung von Nukleinsäuren Analytische Isolierung von Plasmid-DNA (MiniPrep) Für eine schnelle Isolierung von Plasmid-DNA diente das kommerziell erhältliche QIAprep Spin MiniPrep Kit (Qiagen, Hilden), das prinzipiell auf der Plasmidisolierungsanleitung von Birnboim und Doly (1979) beruhte. Dabei adsorbiert die DNA in Gegenwart chaotroper Salze, die die Wasserstruktur zerstören, an eine Silica Membran und wird anschließend z.b. durch H 2 O bidest eluiert. Die Zusammensetzung der nachfolgend angeführten Puffer und Lösungen sind im Handbuch des Herstellers beschrieben.

35 Material und Methoden 25 Dazu wurden 1,5 ml der über Nacht im LB-Medium gewachsenen Kultur bei x g für 5 min sedimentiert (Eppendorf Zentrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg) und das erhaltene Zellpellet in 250 µl P1-Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte in Form der alkalischen SDS-Lyse durch Zusatz von 250 µl P2-Puffer und Inkubation für 5 min bei RT. Nach Zugabe von 350 µl N3-Puffer zur Proteindenaturierung wurde die Suspension für 10 min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dann auf eine QIAprep spin Säule überführt und zentrifugiert ( x g, 30 s, RT). Die Säulen wurden mit 750 µl PE-Puffer versetzt und nach zwei Mal Zentrifugieren erfolgte die Zugabe von 50 µl EB-Puffer. Nach einer Inkubation für 1 min bei RT wurde die DNA dann eluiert. Die so erhaltene DNA konnte anschließend für Restriktionsverdaue oder für Transformationen eingesetzt werden Präparative Plasmidisolierung (MidiPrep) Die Isolierung von Plasmid-DNA in größeren Mengen wurde mit Hilfe des kommerziell erhältlichen Qiagen Plasmid Midi Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Das für Plasmid-DNA selektive Aufreinigungsprinzip beruht dabei auf einer alkalischen SDS-Lyse der Zellen mit nachgeschalteter Anionenaustausch-Chromatographie. Die Zusammensetzung der nachfolgend angeführten Puffer und Lösungen sind in dem Handbuch des Herstellers beschrieben. Eine 50 ml über Nacht angezogene Kultur wurde in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und für 10 min bei 3000 x g bei 4 C sedimentiert (Allegra 2IR, Beckman Coulter, Krefeld) und das erhaltene Zellpellet in 4 ml P1-Puffer mit 40 µl RNase- Lösung resuspendiert. Es erfolgte dann die Zugabe von 4 ml P2-Puffer und nach Inkubation für 5 min bei RT wurden 4 ml P3 zugesetzt. Anschließend wurde das Lysat in eine QIAfilter Midi-Spritze überführt und 10 min bei RT stehen gelassen. Das durch die Spritze filtrierte Lysat wurde auf eine zuvor mit 4 ml QBT-Puffer äquilibrierte Qiagen-tip-100 Säule gegeben und zweimal mit 10 ml QC-Puffer gewaschen. Anschließend wurde die DNA mit 5 ml QF-Puffer eluiert und durch Zugabe von 0,7 Vol. Isopropanol bei RT gefällt. Durch die 30-minütige

36 Material und Methoden 26 Zentrifugation bei x g (Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter) wurde ein Pellet erhalten und mit 2 ml eiskaltem 70%-igem (v/v) Ethanol gewaschen. Anschließend wurde das Pellet bei RT getrocknet und in 80 µl H 2 O bidest. aufgenommen. Die gewonnene Plasmid-DNA konnte direkt für Restriktionsverdau oder für Transformationen eingesetzt werden Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Die Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen wurde mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dabei adsorbiert die DNA in Gegenwart chaotroper Salze, die die Wasserstruktur zerstören, an eine Silica Membran und wird anschließend durch z.b. H 2 O bidest. eluiert. Dazu wurden die DNA Fragmente nach Anfärben mit Ethidiumbromid unter UV Licht mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten und anschließend 3 Volumen QG zu 1 Volumen Gelstück gegeben. Nach Inkubation bei 50 C für 10 min wurde die Suspension auf eine QIAquick spin Säule gegeben und bei x g für 1 min zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg). Nachdem der Durchfluss verworfen worden war, wurden 750 µl PE Puffer, der 80% Ethanol enthielt, zugegeben und für 1 min zentrifugiert. Um mögliche Ethanolspuren zu entfernen, wurde die Säule für eine weitere Minute zentrifugiert. Abschließend wurde die Säule in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt, 30 µl bis 50 µl EB Puffer auf die Membran gegeben und 1 min bei RT inkubiert. Durch die anschließende Zentrifugation für 1 min wurde die DNA von der Säule eluiert Reinigung von PCR-Fragmenten Die Umpufferung bzw. Reinigung von PCR Produkten wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dazu wurden 5 Volumen des PB Puffers zu 1 Volumen PCR Probe gegeben und gründlich vermischt. Dann wurde die Suspension auf eine QIAquick spin Säule überführt und für 1 min bei x g zentrifugiert (Eppendorf

37 Material und Methoden 27 Zentrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg). Nachdem der Durchfluss verworfen worden war, wurde die Säule mit 750 µl PE Puffer versetzt und für 1 min bei x g zentrifugiert. Die Säule wurde noch einmal für 1 min zentrifugiert und dann in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Abschließend wurden 30 µl auf die Säule gegeben und die DNA durch Zentrifugation eluiert Restriktionsverdau von DNA Die in H 2 O bidest. gelöste DNA wurde mit 2-10 U/µg DNA der entsprechenden Restriktionsendonuklease in dem vom jeweiligen Hersteller des Enzyms angegebenen Puffer für 1 bis 3 h bei 37 C inkubiert. Die entsprechenden Puffer wurden dabei in der Regel als 10-fach konzentrierte Stammlösungen geliefert und mit 0.1 Volumen zu den Ansätzen gegeben, deren Volumina zwischen 20 und 50 µl variierte. Restriktionsverdaue mit mehr als einem Enzym erfolgten, soweit möglich, im selben Puffersystem. War dies nicht möglich, wurden die Restriktionsverdaue nacheinander mit einer dazwischen geschalteten Ethanolfällung vorgenommen Ligation von DNA-Fragmenten Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe der T4-DNA-Ligase Kits (New England Biolabs, Frankfurt a. M.) durchgeführt. Das Gesamtvolumen einer Ligation betrug 20 µl. Zur Ligation wurde die DNA den Präparationen nach der Isolierung aus Agarosegelen entnommen. In einem 3 bis 6 fachen molaren Überschuss wurde Insert-DNA zu Vektor-DNA in 1-fach konzentriertem T4-DNA- Ligationspuffer gegeben. Anschließend wurde 1 µl T4-DNA-Ligase zugegeben und für 10 min bei RT inkubiert. Alternativ wurde der Ligationsansatz über Nacht bei 16 C inkubiert. Der Ansatz wurde dann für Transformationen eingesetzt.

38 Material und Methoden Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Die PCR ist eine in vitro Amplifikation eines definierten DNA Fragmentes. Der Reaktion liegt folgendes Prinzip zugrunde: DNA wird durch Hitze (95 C) in ihre Einzelstränge zerlegt. Durch eine Temperaturänderung z.b. auf 50 C werden zwei chemisch synthetisierte Oligonukleotide (Primer) an die denaturierte DNA anhybridisiert. Die Sequenz der 5 - und 3 -Primer ist so gewählt, dass sie komplementär zu jeweils einem der Bereiche ist, die die zu vermehrende DNA flankieren. Die so entstehenden kurzen doppelsträngigen DNA-Regionen mit den in Richtung der zu amplifizierenden DNA weisenden 3 -OH-Enden der Primer sind Substrat für die DNA-Polymerase. Unter für das Enzym geeigneten Temperaturbedingungen werden die Primer mit dntps verlängert, so dass die entstehenden DNA-Stränge nun als Matrize für den jeweils anderen Primer dienen können. So kommt es zur Anreicherung der DNA. Für die Generierung der SMN- und SIP1-Fragmente wurde folgender Ansatz pipettiert und anschließend folgendes Temperaturprofil gewählt. 50 µl PCR-Ansatz Temperaturprofil 50 ng Templat-DNA (z.b. pet28a-smn) 95 C 180 s 1 µm Primer forw/rev 95 C 60 s 0.2 µm dntps C 45 s 5 µl Taq-Puffer (10x) 72 C 120 s x µl H 2 O bidest. 72 C 600 s 1 µl Taq Polymerase 30x Die Annealing-Temperatur für alle SMN- und SIP1-Fragmente betrug 55 C DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung von DNA erfolgte nach dem Sanger-Verfahren (Sanger, 1977) durch fluoreszenzmarkierte Nukleotide, die zugleich als Terminatoren dienten. Die Sequenzierung doppelsträngiger Plasmid-DNA erfolgte in der Abteilung für

39 Material und Methoden 29 Entwicklungsbiologie (GZMB, Institut für Mikrobiologie und Genetik, Universität Göttingen) am ABI PRISM 337 DNA-Sequencer Analyse der Sequenzdaten Die Sequenzen wurden mit Hilfe des online zur Verfügung stehenden Programms ClustalW mit der originalen Sequenz aus der Datenbank (2.1.1) verglichen und so auf ihre Richtigkeit analysiert Arbeiten mit Bakterien Trübungsmessung Die optische Dichte von Bakterienkulturen wurde in Einmalküvetten in einem Spektralphotometer (Eppendorf Biophotometer, Eppendorf, Hamburg) bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600 ) gegen LB-Medium bestimmt. Proben mit hohen Zelldichten wurden stets mit LB-Medium auf eine optische Dichte zwischen 0.07 und 0,7 verdünnt und anschließend die Extinktion bestimmt DNA-Transfer durch vermittelte Kompetenz Herstellung kompetenter E. coli Zellen Kompetente Zellen haben die Eigenschaft, zirkuläre, fremde DNA aufzunehmen. Dies kann z.b. durch einen Hitzeschock induziert werden. Dafür müssen die Bakterien vorher mit Chemikalien wie z.b. CaCl 2 oder RbCl 2 Transformationskompetent gemacht werden. Die E. coli Zellen wurden durch die CaCl 2 -Methode kompetent gemacht. Dazu wurden 500 ml LB-Medium mit einer 10 ml Übernachtkultur inokuliert, bei 37 C inkubiert und bei einer OD 600 von 0,4-0,5 die Zellen für 10 min bei 4000 x g sedimentiert (Avanti 20 XPI, Beckman Coulter, Krefeld). Im Fall der BL21(DE3)-

40 Material und Methoden 30 RIL-Zellen enthielt das LB-Medium zusätzlich Chloramphenicol. Das Pellet wurde in 100 ml eiskaltem 0,1 M MgCl 2 aufgenommen, 20 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert (2500 x g, 10 min). Dieser Schritt wurde mit 250 ml eiskaltem 0.1 M CaCl 2 wiederholt und das Pellet dann in 5 ml CaCl 2 -Lösung [85% (v/v) 0,1 M CaCl 2, 15% (v/v) Glycerin] aufgenommen und in 1,5 ml Reaktionsgefäße aliquotiert. Die Zellen wurden bei -80 C gelagert Transformation durch Hitzeschock Die kompetenten E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut, und pro Ansatz wurden in einem vorgekühlten 1,5 ml Reaktionsgefäß µl kompetente Zellen mit 10 bis 200 ng DNA versetzt. Nach vorsichtigem Vermischen wurde der Ansatz für 10 min auf Eis inkubiert und dann für 30 s auf 42 C erwärmt. Zur Regenerierung der Zellen folgte nach Zugabe von 800 µl LB-Medium eine Inkubation für 20 min bei 37 C. Der Transformationsansatz wurde anschließend auf LB-Agar-Platten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und über Nacht bei 37 C inkubiert Durchmusterung von Transformanten Durchmusterung von Transformanten mit isolierter Plasmid-DNA Nach der Klonierung wurden mehrere Klone gepickt und mit Hilfe einer MiniPrep die rekombinante DNA isoliert. Zur Kontrolle der Insertgröße wurden Restriktionsenzyme eingesetzt, die auch bei der Klonierung verwendet wurden. Anschließend wurde der Ansatz auf einem Agarosegel analysiert und schließlich sequenziert Kolonie-PCR Eine Methode zur Durchmusterung von Transformanten, mit der man möglichst viele Transformanten in möglichst kurzer Zeit durchmustern kann ist die Kolonie-

41 Material und Methoden 31 PCR. Dazu werden ganze Zellen direkt von der master-plate mit einem sterilem Zahnstocher in den PCR-Ansatz gegeben. Die Zellen lysieren schließlich während des PCR-Vorgangs durch die hohe Denaturierungs-Temperatur und geben somit die Plasmid-DNA frei. Die DNA, jener Kolonien, bei denen so das entrprechende Fragment amplifiziert werden konnte, wurde schließlich isoliert und sequenziert Stammhaltung Für die kurzfristige Stammhaltung wurde E. coli auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum-Zusatz bei 4 C gelagert. Diese Kulturen wurden alle 4 Wochen überimpft. Für eine langfristige Stammhaltung wurden 850 µl eine Übernachtkultur mit 150 µl 87%igem Glycerin versetzt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei 70 C Reinheitskontrollen Kulturen von E. coli wurden im Phasenkontrastmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen) anhand ihrer Zellmorphologie auf Reinheit überprüft. Auch die Koloniemorphologie wurde als Nachweis für eine Reinkultur verwendet, wozu von E. coli Vereinzelungsausstriche auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum angelegt wurden.

42 Material und Methoden Arbeiten mit Proteinen Expression heterologer Proteine Die Expression von Proteinen mit dem pet- und pgex-system basieren auf einem ähnlichen molekularen Mechanismus. Die verwendeten E.coli-Sämme BL- 21(DE3) besitzen verminderte allgemeine Protease-Aktivität, um die Rate des proteolytischen Abbaus der überexpremierten Proteine herabzusetzen. Des weiteren besitzen sie ein zusätzliches unter der Kontrolle des LacY-Promotors und Operators stehendes T7-Polymerase-Gen (DE3). Ein Gen, das in die MCS eines pet28a-vektors einkloniert ist, befindet sich dort unter der Kontrolle des T7-Promotors und unter Kontrolle des LacY-Operators. Die Expression eines Gens, das unter der Kontrolle des Lac-Operators steht, wird in der nicht-induzierten Phase durch Bindung des Lac-Repressors an den Lac- Operator gehemmt. Durch die Induktion mit IPTG, welches ebenfalls an den Lac- Operator bindet und den Repressor verdrängt, wird die Expression der T7- Polymerase auf der genomischen Sequenz aktiviert. Die T7-Polymerase wird schließlich für die Expression der Sequenz in der MCS der Vektoren benötigt. Die Hemmung der Expression dieser Sequenz durch den Lac-Repressor wird so ebenfalls durch die Bindung des IPTG an den dort befindlichen Lac-Operator aufgehoben (Novagen-Produkt-Information Catalog ) (siehe Abb. M1). Abb. M1. Schematische Darstellung der Funktionsweise des pet-systems.

43 Material und Methoden 33 Die Expression der Sequenz in der MCS des pgex-6p-1 ist stets von der Expression der davor liegenden GST-Sequenz abhängig. Diese steht zum einen unter der Kontrolle des tac-promotors und zum anderen ebenfalls unter der Kontrolle der Lac-Operators, welcher auch wie bei dem pet-system durch IPTG induziert werden kann Expression im analytischen Maßstab Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte in E. coli BL21(DE3)-RIL Zellen. Dazu wurden 5 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum mit einer Einzelkolonie des frisch transformierten Expressionsstammes angeimpft und bei 37 C über Nacht unter Schütteln inkubiert (200 Upm). 20 ml Hauptkultur wurden 1:30 mit einer Übernachtskultur inokuliert und bei C inkubiert. Bei OD 600 ~0.7 erfolgte die Induktion durch Zugabe von 1 mm IPTG und die Expressionsdauer betrug 2-16 h. Dabei wurde kurz vor der Expression (nicht induziert) und nach Beendigung der Expression (induziert) jeweils eine 1ml Probe für die SDS-Gel Analyse genommen. Die 1 ml Proben wurden für 2 min bei x g (Eppendorf, Zentrifuge 5415 R, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert und die resultierenden Zellpellets mit 10 µl Laemmli-Lösung pro OD 600 ~0,1 versetzt Expression im präparativen Maßstab Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte in der Regel im 1 l Maßstab mit Hilfe der E. coli BL21 bzw. BL21(DE3) RIL Zellen. Dazu wurde eine 50 ml in LB-Medium wachsende Kultur mit einer Einzelkolonie des frisch transformierten Expressionsstammes angeimpft und in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums bei 37 C über Nacht inkubiert (200 Upm). Die Hauptkultur (500 ml LB-Medium pro 2 l Erlenmeyerkolben) wurde 1:30 mit einer Übernachtkultur inokuliert. Nach Erreichen von OD 600 ~0,7 wurde die Expression durch Zugabe von 1 mm IPTG eingeleitet. Die Inkubation erfolgte bei C für 4-16 h. Kurz vor der Expression (nicht induziert) und nach Beendigung der Expression (induziert) wurde jeweils eine 1 ml Probe für die SDS-Gel Analyse genommen. Die 1 ml Proben wurden für 2 min bei x g (Eppendorf, Zentrifuge 5415 R, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert und die resultierenden Zellpellets mit 10 µl

44 Material und Methoden 34 Laemmli-Lösung pro OD 600 ~0,1 versetzt. Nach der Expression wurden die Zellen bei x g für 15 min sedimentiert (Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter, Krefeld) und der Überstand vollständig verworfen. Das Pellet wurde entweder bei -20 C weggefroren oder gleich aufgearbeitet Zellernte und Zellaufschluss Zellaufschluss im analytischen Maßstab Es wurden 1,5 ml E. coli Zellen in 2 ml Reaktionsgefäße überführt und für 10 min bei x g zentrifugiert [(4 C), Eppendorf Zentrifuge 5810 R, Eppendorf, Hamburg)] und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 500 µl vorgekühltem Lysis-Puffer (50 mm Tris-HCl, ph 7.5, 300 mm NaCl) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym, 1 mm EDTA, 10 µl complete EDTA-free Protease Inhibitor Lösung [(1 Tablette pro 2 ml H 2 O bidest. ), Roche, Penzberg] resuspendiert und für 20 min bei 4 C unter Schwenken inkubiert. Anschließend wurde die Suspension alternierend 5 Mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 37 C aufgetaut. Die lysierten Zellen wurden anschließend für 15 min bei x g (4 C) zentrifugiert, um die unlöslichen Bestandteile von der Suspension zu trennen. Der klare Überstand wurde vorsichtig abgenommen und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Für die Analyse des Gesamtzellproteins, des löslichen Überstandes und Pellets durch SDS-PAGE wurden jeweils 50 µl Probe genommen und in einem 1:1-Verhältnis mit Laemmli-Lösung versetzt Zellaufschluss im präparativen Maßstab Die pelletierten Zellen wurden in 50 ml eiskaltem Lysis-Puffer pro Liter Expressionskultur in Gegenwart einer halben complete EDTA-free Protease Inhibitor Tablette (Roche, Penzberg) und 1 mm EDTA resuspendiert. Im Fall der IMAC Reinigung wurde kein EDTA verwendet. Die Zelllyse erfolgte mit Hilfe eines Fluidizers (Microfluidics, Massechussats, USA). Zuerst wurde der Fluidizer bei 7 bar und unter Kühlung (4 C) mit 500 ml H 2 O bidest. gespült und anschließend mit

45 Material und Methoden 35 dem gewünschten Puffer äquilibriert. Anschließend wurde der Fluidizer mit der Zellsuspension versetzt, und nach 5 Durchgängen waren die Zellen lysiert. Mit ml H 2 O bidest. wurde der Fluidizer gespült und in Isopropanol gelagert. Zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wurde die Suspension für 15 min bei 4 C zentrifugiert ( x g). Der klare Überstand wurde vorsichtig abgenommen und sterilfiltriert (0,25 µm oder 0,45 µm Filter) und anschließend für die Affinitätschromatographie verwendet. Für die Analyse des Gesamtzellproteins, des löslichen Überstandes und Pellets durch SDS-PAGE, wurden jeweils 50 µl Probe genommen und in einem 1:1- Verhältnis mit Laemmli-Lösung versetzt. Alternativ dazu konnten die Zellen aber auch mit Hilfe des Sonifier 250 (Branson) aufgeschlossen werden. Bei dem Aufschluss mit dem Sonifier werden die Zellen durch Ultraschallwellen, die von einer tief in die Zellsuspension eintauchenden Metall-Sonde ausgehen, aufgeschlossen. Das Protokoll dazu entspricht dem des Aufschluss mit dem Fluidizer (Microfluidics, Massechussats, USA), nur wird hier die Sonde des Sonifier tief bis kurz über den Gefäßboden der Zellsuspension getaucht und in Intervallen (hier 5 x 100 s) Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 10 bis 100 % und verschieden einstellbaren Stoß-Stärken in die Suspension gesendet. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Zell-Suspension nicht warm wurde, indem sie stets auf Eis gehalten wurde und gegebenenfalls Pausen von mehreren Minuten zwischen den Intervallen eingelegt wurden. Der Sonifier eignet sich im Gegensatz zu dem Fluidizer (Microfluidics, Massechussats, USA) auch für kleinere Volumina ab 1 ml Diskontinuierliche SDS-PAGE nach Laemmli (1970) Bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) werden Proteine denaturiert und nach deren Molekulargewichten aufgetrennt. Dabei werden die Disulfidbrücken durch β-mercaptoethanol durch Reduktion gelöst und mit Hilfe von Sodium-Dodecylsulfat (SDS) wird die dreidimensionale Struktur aufgelöst. Durch die Bindung des SDS an das Protein wird eine starke negative Ladung in die Polypeptidkette eingeführt. Als Gelmatrix dient polymeres Acrylamid.

46 Material und Methoden µl Proteinprobe wurden 1:1 mit Laemmli-Lösung versetzt und 10 µl in die zuvor mit einer Pipette gespülten Geltaschen geladen. Um die Molekulargewichte gelelektrophoretischer aufgetrennter, denaturierter Proteine abschätzen zu können, wurden 10 µl Protein-Größenstandard parallel zu den Proben aufgetragen. Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 120 V bis kurz vor Auslaufen des Farbfront. In Tab. 6 ist die Zusammensetzung der SDS-Gele dargestellt. Benötigte Lösungen: 30% Acrylamid-Stammlösung (PAA 30 ; Verhältnis Acrylamid:Bisacrylamid von 37,5:1) Trenngelpuffer: 1,88 M Tris/HCl, ph 8,8 Sammelgelpuffer: 0,625 M Tris/HCl, ph 6,8 0,5% (w/v) SDS-Lösung 100% N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TEMED) 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) Laufpuffer: 25 mm Tris/HCl, ph 8,8, 192 mm Glycin, 0,1 % (w/v) SDS 2x SDS-Probenpuffer: 20% 0,625 M Tris/HCl, ph 6,8, 2% (w/v) SDS, 50% (v/v) Glycerin, 5% (v/v) ß-Mercaptoethanol, 1% (v/v) Bromphenolblau (1%-ig in Ethanol) Laemmli-Lösung Komponenten 10% iges Trennge l 12,5%ige s Trenngel 5%iges Sammelgel PAA 30 [ml] 2 2,5 0,33 Trenngelpuffer [ml] 1,2 1,2 -- Sammelgelpuffer [ml] ,4

47 Material und Methoden 37 SDS-Lösung [ml] 1,2 1,2 0,4 H 2 O bidest. [ml] 1,6 1,1 0,87 Temed [µl] APS [µl] Tab. 6. SDS-Gele Färbung von Protein-Gelen Nach der SDS-PAGE wurde das Gel in eine mit Coomassie-Färbelösung [25% (v/v) Isopropanol, 10% (v/v) Eisessig, 0,2% (w/v) Coomassie Brilliant Blau R250, 0,05% (w/v) Coomassie G250] gefüllte Schale gelegt und für mindestens 15 min unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Färbung wurde das Protein-Gel in eine Entfärbelösung [45% (v/v) Ethanol, 10% (v/v) Essigsäure] gelegt und solange entfärbt, bis Banden zu erkennen waren. Anschließend wurde das Gel in H 2 O überführt und mit einer Geldoc 2000 (Bio-Rad, München) dokumentiert Proteinbestimmung nach Bradford (1976) Die Quantifizierung von Proteinen erfolgte mit Hilfe des kommerziell erhältlichen Bradford Reagenzes (Bio-Rad, München). Der Bradford-Assay beruht auf der Anfärbung durch den Farbstoff Coomassie Brilliantblau G 250. Dabei kommt es beim Kontakt von Proteinen mit dem Farbstoff zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm (protonierte braunrote kationische Form) auf 595 nm (unprotonierte blaue anionische Form), da die anionische Sulfonatform in einem Proteinkomplex stabilisiert wird. Die Bindung erfolgt an kationische und exponierte hydrophobe Seitenketten des Proteins. Dazu wurden 20 µl Proteinsuspension zu 980 µl einer 1:5 mit H 2 O bidest. verdünnten Bradford-Lösung in einer Einmalküvette gegeben und sorgfältig vermischt. Es folgte eine Inkubation für 5 min bei RT. Die Probe wurde anschließend im

48 Material und Methoden 38 Photometer (Eppendorf Bio-Photometer) gegen den Leerwert bei 595 nm gemessen und die Extinktion entsprach unmittelbar der Proteinkonzentration in mg/ml Proteinreinigung Affinitätsreinigung Die Grundlagen der Affinitätschromatographie liegen in den spezifischen Wechselwirkungen zwischen (Makro)Molekülen. Besonders wichtig sind hierbei Antikörper Antigen, Protein Substrat, Hormon Rezeptor, Kohlenhydrat Lectin und komplementäre Nukleinsäuren. Zur Affinitätsreinigung nimmt man so genannte beads (Kügelchen), die aus einer Matrix wie z.b. Agarose bestehen, an der kovalent spezifische Liganden (Substrat) gebunden sind. Bei der Affinitätsreinigung bindet das Zielprotein an seinem Substrat und wird abschließend mit einem kompetitiven Liganden eluiert, siehe Abb. M2). Abb. M2. Schematische Darstellung des Affinitätschromatographie-Prinzips. Zunächst wird der Protein-Rohextrakt auf die Säule mit dem am Trägermaterial (mint) gebundenem Substrat gegeben. Proteine, die mit einem, für das Substrat spezifischen Fusionsprotein-tag, exprimiert wurden (blau), bleiben über diesen auf dem Säulenmaterial zurück, während die anderen (hier rot, grün und lila dargestellt) durchlaufen. Das Fusionsprotein kann schließlich durch Verwendung eines kompetetiven Liganden (orange) wieder eluiert werden Reinigung der Proteine im mittels Glutathion-Sepharose Im Falle des Enzyms Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum benutzt man dessen Affinität zu der reduzierten, monomeren Form des Tripeptid

49 Material und Methoden 39 NH + 3 -Glu-Cys-Gly-COO - (kurz GSH, Glutathion), um es aus einem Proteinrohextrakt von E. coli zu reinigen. Der Ligand GSH ist dabei kovalent an eine Trägermatrix wie z. B. Sepharose gebunden. So bindet das GST- Fusionsprotein an GSH, während die restlichen E. coli-proteine durchlaufen. Das GST-Fusionsprotein kann anschließend durch einen Überschuss an reduziertem GSH von den beads eluiert werden. Bei der Reinigung der Proteine mittels Glutathion-Sepharose im batch-verfahren wurden 20 ml Glutathion Sepharose 4B (Amersham Bioscience, Freiburg), welche vom Hersteller in 20%iger Ethanollösung geliefert wird, auf eine Leersäule (Poly- Prep Chromatography Columns, Biorad, München) gegeben und mit drei Säulenvolumen H 2 O bidest. gewaschen. Dann wurden 50 ml des löslichen Proteinextraktes auf einer mit L/B-Puffer äquilibrierten Säulenmatrix gegeben und anschließend solange mit L/B-Puffer gespült, bis im Durchfluss kein Protein mittels Bradford nachweisbar war. Protein mit L/B-Puffer mit 30 M red. Glutathion von der Säulenmatrix eluiert. Alternativ dazu wurde für die Aufreinigung auch die Äkta Prime (Amersham Bioscience, Freiburg) verwendet. Hierzu wurde die Flussgeschwindigkeit auf 1 ml/min eingestellt und die Absorption der Moleküle wurde bei 280 nm verfolgt. Der Durchfluss wurde in 8 ml und die Elution der Proteine in 2 ml Fraktionen gesammelt. Die Säulenmatrix wurde solange mit L/B-Puffer gewaschen, bis keine Absorption der Moleküle bei 280 nm zu erkennen war. Anschließend wurde das GST-Fusionsprotein mit L/B-Puffer (mit 30 mm red. Glutathion) eluiert und die Proben auf einem SDS-Gel analysiert. Lysis-Bindungs (L/B)-Puffer : 300 mm NaCl 50 mm Tris/HCl 2 mm BME (β-mercaptoethanol)

50 Material und Methoden Reinigung der Proteine mittels IMAC (Immobilisierte Metal Ionen Affinitäts-Chromatographie) Eine effektive Methode der Aufreinigung rekombinanter Proteine ist die Adsorption an Ni-NTA (Nickelchelat-Nitrilotriacetic Acid). Dabei bilden die konsekutiven Histidinreste (His-tag) einen stabilen Koordinationskomplex mit den Nickel-Ionen, die an der NTA gekoppelt sind. Das NTA ist seinerseits an einer Matrix wie z.b. Agarose gebunden. Durch das Imidazol, welches mit dem Histidin um die Bindung an Nickel konkurriert, kann das Protein in einem Konzentrationsgradienten eluiert werden. Diese Art der Reinigung wurde für Bindungs-Tests mit ko-exprimierten Proteinen (His6-SMN und GST-SIF1-4) verwendet. Diese Versuche fanden nur im batch- Verfahren im Eppi statt. Dazu wurde nur der Lysis-/Bindungs-Puffer (L/B-Puffer) ( ) verwendet. Elution der Proteine (gewöhnlich mit Elutions-Puffer (mit 50 bis 600 mm Imidazol)) war nicht notwendig, da zur Analyse direkt die Ni-NTA-beads auf das SDS-Gel aufgetragen wurden Regeneration der Säulenmatrix Die GSH-Sepharose Säule wurde mit 2 Säulenvolumen H 2 O bidest., 1 Säulenvolumen 6 M Guandiniumhydrochlorid und 3-5 Säulenvolumen H 2 O bidest. gespült. Die Säulenmatrix wurde dann in 20 % Ethanol überführt Proteolytische Spaltung des Fusionsproteins Spaltung mit PreScission-Protease Zu 1 mg Protein wurden 20 µl GST-PreScission Protease (~0.3 mg/ml) gegeben und für 16 h bei 4 C unter leichtem Schwenken inkubiert.

51 Material und Methoden Spaltung auf einer Säulenmatrix mit PreScission-Protease Nach dem Zellaufschluss wurde der Überstand mit Glutathion Sepharose, die sich in eine Leersäule (Poly-Prep Chromatography Columns, Bio-Rad, München) befand, inkubiert und anschließend die Verunreinigungen durch Spülen mit Wasch-Puffer entfernt. Dann wurde zu einem Bettvolumen Säulenmaterial ein Volumen Wasch-Puffer gegeben. Die Suspension wurde in ein Falcon Röhrchen überführt und anschließend mit PreScission Protease unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde das Säulenmaterial wieder in eine Leersäule (Poly- Prep Chromatography Columns, Bio-Rad, München) überführt und das Zielprotein aufgefangen. Durch Zugabe eines Wasch-Puffers (hier L/B-Puffer ( ))wurde das auf der Säulenmatrix noch befindliche Zielprotein herunter gewaschen. Abschließend wurde mit Elutions-Puffer das GST von der Säulenmatrix eluiert Umpufferung von Proteinen Proteinlösungen können z.b. durch Dialyse umgepuffert werden. Eine andere Methode ist die Umpufferung mit Hilfe von PD-10 Säulen (Amersham Bioscience, Freiburg). Das Prinzip basiert auf einer Gelfiltration. Bei der Gelfiltration werden Moleküle ihrer Größe nach getrennt. Der über die Säule fließende Puffer stellt die flüssige Phase dar. Bei der stationären Phase handelt es sich um keine feste Phase im klassischen Sinne, sondern die feste Phase besteht vielmehr aus schwammartigen Gelpartikeln, die in ihrem Inneren mit Pufferflüssigkeit gefüllt sind und den Puffer fixieren. Die Gelpartikel bestehen aus einem inerten, stark hydratisierten polymeren Material wie z.b. Dextran-Gel. Kleinere Proteine können in die mit Puffer gefüllten Räume der Schwamm-artigen Gel-Partikel eindringen und benötigen so mehr Zeit um die gesamte Gelmatrix in der Säule zu durchqueren als größere Proteine und werden so auch später eluiert. Die PD-10 Säulen können so z.b. dazu benutzt werden, die größeren Proteinmoleküle von den in einem Puffer gelösten Salz-Teilchen zu trennen. Dazu wurde eine PD-10-Säule mit 25 ml Puffer X äquilibriert und anschließend 2,5 ml

52 Material und Methoden 42 Proteinsuspension aufgetragen. Nach Zugabe von 3,5 ml Puffer X erfolgte die Elution der Proteine. Über die Proteintrennung und Umpufferung hinaus kann die Gelfiltration auch zur Molekulargewichtsbestimmung eingesetzt werden Bindungsexperimente Bindungsexperimente mit einzeln aufgereinigten Proteinen (Interaktion des SMN160-Fragment (SF160) mit den GST-SIP-Fragmenten 1-3 (GST-SIF1-3)) Die mittels GSH-Sepharose-Affinitätschromatographie aufgereinigten Proteinfragmente GST-SIP1, 2, 3 und das SF160, dass im Anschluss daran durch PreScission-Protease vom GST-tag befreit wurde, wurden nochmals mittels PD-10 Säulen vom zur Elution verwendeten Glutathion befreit. Schließlich wurden die Protein-Konzentrationen der einzelnen Fragmente mittels Bradford-Reagenz bestimmt. Die SMN- und die SIP1-Fragmente wurden einmal in gleichen Mengen- Anteilen (Verhältnis 1:1) mit einer Protein-Konzentration von 0,05 mg/ml und einmal in dem Verhältnis 2:1 (GST-SIF1-3 : SF160), mit einer Protein- Konzentration von SF160 : ebenfalls von 0,05 mg/ml, miteinander im Eppi in einem Gesamt-Volumen von 1 ml vermengt. Die Protein-Gemische wurden 10 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss daran wurden ca. 100 µl saubere und mit L/B- Puffer äquilibrierte GST-Sepharose-beads zu dem Reaktions-Ansatz dazu gegeben und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Dabei wurden die, sich mit der Zeit absetzenden beads, ca. alle 2 min einmal mit der 1000 µl Pipette aufgeschwemmt. Anschließend wurden die beads 10 x mit 200 µl L/B-Puffer gewaschen, wobei die beads nach jedem Waschschritt mit 300 x g (Eppendorf Zentrifuge 5810 R, Eppendorf, Hamburg) sedimentiert wurden, und schließlich direkt aufs SDS-Gel aufgetragen.

53 Material und Methoden Bindungs-Versuche mit ko-exprimierten Proteinen Für die Bindungs-Versuche mit co-exprimierten Proteinen wurden die Protein- Fragmente GST-SIF1-4 und das 6His-SMN gleichzeitig in E. coli BL21 (DE3) RIL Zellen über Nacht bei 16 C in einem Expressionsvolumen von 50 ml exprimiert. Die Zell-Pellets wurden im analytischen Maßstab aufgeschlossen. Zu dem Überstand wurden zunächst ca. 100 µl saubere mit L/B-Puffer equilibrierte GST- Sepharose-beads gegeben. Diese wurden dann, nach 10 min Inkubation auf Eis, 10 x mit 200 µl L/B-Puffer gewaschen und daran gebundene Proteine schließlich mit 100 µl L/B-Puffer + 30 mm Glutathion ; ph 7,5 eluiert. Zu dem Eluat wurden anschließend 100 µl saubere und mit L/B-Puffer equilibrierte Ni-NTA-beads gegeben, die nach weiteren 10 min Inkubation auf Eis 10 x mit 200 µl L/B-Puffer gewaschen und anschließend direkt aufs Gel aufgetragen wurden Spezifische Markierung von Proteinen durch Antikörper : Western blotting Antikörper haben die Eigenschaft, spezifisch Epitope bestimmter Proteine zu erkennen und daran zu binden. Diese Eigenschaft macht man sich beim protein blotting (Western blotting) zu nutze. Um ein bestimmtes Protein spezifisch zu markieren, kann ein Antikörper verwendet werden, der bestimmte Epitope des Proteins, bindet. Daran anschließend kann ein zweiter Antikörper verwendet werden, um den zu erst verwendeten Antikörper zu erkennen. Der zweite Antikörper ist dabei meist mit einem Enzym fusioniert, das bei Zugabe eines bestimmten Substrates eine Farbreaktion katalysiert. Die entstandene Färbung markiert so nur die Proteine, die durch den ersten Antikörper erkannt wurden. Die Markierung findet dabei auf einer Nitrocellulosemembran oder PVDF- Membran statt, auf die, die Proteine, nach der Auftrennung durch eine SDS- PAGE, von dem SDS-Gel elektrophoretisch (blotting) übertragen wurden.

54 Material und Methoden Nassblotten von Proteinen Dabei wurde ein SDS-Acrylamidgel, in dem die Proteine zuvor elektrophoretisch aufgetrennt wurden, zwei Lagen Whatman Papier, eine PVDF-Membran, und drei Schwämme, für ca. 10 min in TP (Towbin-Puffer) inkubiert und dann in folgender Reihenfolge in einer Blot-Kammer (minive electrophoresis & electrotransfer unit, Amersham Bioscience, Freiburg) übereinander gelegt: ein Schwamm, Whatman Papier, SDS-Gel, PVDF-Membran, Whatman Papier, und schließlich zwei Schwämme. Dabei wurden diese verschiedenen Schichten so in die Blot-Kammer eingespannt, dass das SDS-Gel auf der Kathoden-Seite und die Membran auf der Seite der Anode lag. Die Blot-Kammer wurde schließlich mit TP aufgefüllt und der Transfer erfolgte bei ca. 4 C für 1,5 h bei einer Stromstärke von 400 ma bei einer Spannung von 50 V Immunologische Detektion von Proteinen auf einer PVDF-Membran Nach dem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran wurden zunächst unspezifische Bindestellen durch 1 h Inkubation der PVDF-Membran in TBST mit 5% (w/v) Magermilchpulver abgesättigt. Die Bindung des ersten Antikörpers erfolgte durch Inkubation bei 4 C über Nacht unter Schütteln mit einer Verdünnung des ersten Antikörpers von 1:2000 in TBST mit 5% (w/v) Magermilchpulver. Anschließend wurde die Membran 7 mal 7 min mit TBST gewaschen. Die Bindung des zweiten Antikörpers erfolgte bei RT für 1 h mit einer Verdünnung des zweiten Antikörpers von 1:20000 in TBST mit 5% Magermilchpulver. Anschließend wurde die Membran 6 mal für 5 min mit TBST gewaschen. Für die Markierung war der zweite Antikörper mit alkalischer Phosphatase fusioniert. Für die Farbreaktion wurde die Membran 5 min in 10 ml AP-Puffer mit 66 µl NBT und 33 µl BCIP bei RT inkubiert. Die PVDF-Membran wurde schließlich 3 mal 10 min mit TBST gewaschen. Für die Markierung der GST-Fusionsproteine wurde ein monoklonaler α-gst- Antikörper (1. Antikörper), aus einer Ziege, verwendet, der schließlich durch einen polyklonalen α-ziege-antikörper (2. Antikörper) erkannt wurde.

55 Material und Methoden 45 His6-Fusionsproteine wurden durch einen monoklonalen α-his6-antikörper (1. Antikörper), aus einer Maus und einen polyklonalen α-maus-antikörper (2. Antikörper) markiert. Towbin-Puffer: TBST-Puffer: AP-Puffer: 25,0 mm Tris 20 ml 1M Tris, ph7,5 100 mm Tris, 9,5 192,0 mm Glycin 60 ml 5 M NaCl 100 mm NaCl 3,5 mm SDS 1 ml Tween-20 5 mm MgCl 2 20% Methanol add 2 L Konzentrierung von Proteinen Nach der Reinigung wurden die Proteinlösungen mit Hilfe von Konzentratoren (Sartorius, Göttingen) auf die gewünschte Konzentration gebracht. Dabei wird die zu konzentrierende Proteinlösung auf einem Filter mit einer definierten Ausschlussgrenze gegeben (cut-off) und bei x g (Allegra 2IR, Beckman Coulter, Krefeld) zentrifugiert. Das Konzentrat wurde anschließend resuspendiert und in neue Reaktionsgefäße überführt Röntgenstrukturanalyse von Proteinen Für eine röntgenkristallographische Analyse braucht man drei Komponenten: Eine Quelle für Röntgenstrahlen, ein Proteinkristall und einen Detektor. Röntgenstrahlen sind elektromagnetische Wellen. Sie entstehen in einer Röntgenröhre. Diese besteht aus einer Glühkathode und einer Anode. Durch das Anlegen von Spannung zwischen Kathode und Anode werden die aus der Glühkathode austretenden Elektronen in Richtung Anode beschleunigt. Die Elektronen prallen nun auf die Anode und Röntgenstrahlung entsteht. Ein Teil des Röntgenstrahls geht ohne jede Richtungsänderung durch den Kristall hindurch, der Rest aber wird in verschiedene Richtungen gebeugt oder gestreut. Die gebeugte Strahlung kann mit einem Detektor registriert und anschließend können 3-dimensionale Elektronendichtekarten berechnet werden.

56 Material und Methoden Kristallisation biologischer Makromoleküle Kleine anorganische und organische Moleküle können durch einfache Methoden (z.b. kontrolliertes Abkühlen einer heißen gesättigten Lösung oder langsame Präzipitation) kristallisiert werden. Das Kristallwachstum von Proteinmolekülen hingegen ist ein Prozess, der von vielen verschiedenen Faktoren (z.b. Temperatur, Konzentration und Reinheit des Proteins, Art und Konzentration von Puffern und Fällungsmitteln) abhängig ist. Da in den meisten Fällen die Menge des Proteins, die Zeit und das Geld begrenzt sind, gibt es Initial-Screens, deren Zusammensetzung statistisch aus bereits bekannten Kristallisationsbedingungen ermittelt wurde. Auf diese Weise erhält man in ersten Kristallisationsexperimenten Hinweise auf eine mögliche Zusammensetzung der Kristallisationslösung (Mutterlösung). Durch Variation der Komponentenkonzentrationen, den Austausch gleichwertiger Ionen und der Konzentrationsänderung des Proteins können die Kristallisationsbedingungen optimiert werden. Die verwendete Dampfdiffusion, durchgeführt als hängender oder sitzender Tropfen, ist die häufigste Methode zur Herstellung von Kristallen. Zu Beginn der Experimente werden die Tropfen in einem 1:1-Verhältnis von Proteinlösung und Kristallisations-Puffer der jeweiligen Bedingung in einem Volumen von meist zwischen 2 und 5 µl zu Kristallisationslösung gemischt und in einem abgeschlossenen System durch die Platzierung auf einem Stempel (sitzender Tropfen) oder unter dem Deckel (hängender Tropfen) mit der Reservoirlösung von der Außenluft getrennt. Ein Konzentrationsgradient wird aufgrund der unterschiedlichen Konzentrationen des Fällungsmittels in Tropfen und Reservoir aufgebaut. Daraufhin diffundiert das Wasser aus dem vergleichsweise kleinen Tropfenvolumen und sowohl die Konzentration der Proteinlösung als auch des Fällungsmittels werden erhöht. Zur Kristallisation der in dieser Arbeit produzierten Proteine wurden Cryschem Platten verwendet (sitzender Tropfen, Hampton Research, USA). Es wurden die kommerziell erhältlichen Screens der Firmen Hampton Research (Crystal Screen 1 und 2) verwendet. Im Reservoirbehälter befanden sich 400 µl Kristallisations- Puffer, von der 1 µl mit 1 µl Proteinlösung (ca. 5 mg/ml, die Proteine befanden sich

57 Material und Methoden 47 in 25 mm Tris-HCl, ph 7.4, 150 mm NaCl, 2 mm DTT) vermischt wurde. Anschließend wurden die Platten mit einem lösungsmittelbeständigen Klebeband abgedichtet und bei 20 C aufbewahrt. In regelmäßigen Abständen wurden dann die Ansätze mit Hilfe eines Leica MZ125-Stereo Mikroskops kontrolliert.

58 Ziele der Arbeit ZIELE DER ARBEIT Die Protein-Synthese eukaryotischer Zellen ist im hohen Maße von der Bildung der messenger-rna (mrna) abhängig. Wie in der Einleitung dargestellt wurde, können eukaryotische Zellen ihre genomische Information jedoch nicht direkt in mrna, die der Protein-Synthese als direktes Templat dient, transkribieren. Vielmehr bilden die Zellen zunächst einmal eine Vorstufe dieser, die Prä-mRNA, die sich im Wesentlichen durch den Besitz von Introns, nicht-kodierenden Regionen innerhalb des Moleküls, von der reifen mrna unterscheidet. Die kodierenden, für die Protein-Synthese verwendeten Regionen der Prä-mRNA und mrna werden Exons genannt. Um zur reifen mrna zu gelangen, müssen verschiedene Prozessierungs-Vorgänge von der Zelle durchgeführt werden. Einer dieser Vorgänge betrifft das Herausschneiden der Introns aus der PrämRNA und das Zusammenfügen der Exons zur reifen mrna. Dieser Prozess wird Spleißen genannt und der Komplex, der diese Reaktionen katalysiert heißt Spleißosom. Dieses Spleißosom besteht aus fünf small nuclear ribonucleoprotein particles (snrnps), U1, U2, U4, U5 und U6. Diese UsnRNPs bestehen wiederum aus der snrna und spezifischen und gemeinen Proteinen. Die gemeinen Proteine werden Sm-Proteine genannt. Der Zusammenbau dieser snrna mit den Sm-Proteinen ist ein komplexer Vorgang, der im Cytoplasma stattfindet und an dem mindestens zwei Protein-Komplexe beteiligt sind, der PRMT5-Komplex und der SMN- Komplex. Der SMN-Komplex, der die Sm-Proteine schließlich auf die snrna überträgt besteht aus 8 verschiedenen Proteinen (Gemin1-8) und besitzt eine dimere Struktur. Die Aufgabe dieser Arbeit war es die Interaktion der beiden SMN-Komplex- Komponenten Gemin1 (SMN) und Gemin2 (SIP1) zu charakterisieren. Dazu wurden verschiedene Fragmente des SIP1 und ein Fragment des SMN inklusive der Region, die bereits als SIP1-Binde-Domäne beschrieben wurde selbst hergestellt, via Affinitätschromatographie aufgereinigt und versucht auf mögliche Interaktionen zwischen dem SMN- und den SIP-Fragmenten durch in vitro und in vivo Bindungs-Experimenten zu untersuchen. Diese Bindungs-Experimente wurden zusätzlich durch Kristallisations-Versuche der SIP1-Bindedomäne des SMN unterstützt.

59 Ziele der Arbeit 49

60 Ergebnisse ERGEBNISSE Voraussetzung für die angestrebte Charakterisierung der Interaktion zwischen SMN und SIP1 war zunächst einmal Herstellung der dafür notwendigen SMN- und SIP1-Fragmente durch Klonierung. Diese sollten im weiteren Verlauf exprimiert, aufgereinigt und schließlich für die in vivo und in vitro Bindungs-Experimente und Kristallisations-Versuche Verwendung finden Klonierung Klonierung der SMN-Fragmente in das pgex-system Die Wahl der Größe und Position an der Volllängen-Sequenz der Fragmente erfolgte mit Hilfe von Sekundär-Struktur-Analysen durch die entsprechende Software GOR4, SOPMA und HNN und unter Einbeziehung der Ergebnisse von J. Wang und G. Dreyfuss (2001) und G.E. Morris (2000), nach denen sich die SIP1- Binde-Domäne innerhalb der Region des Exons 1 bis 2b befinden soll. Von daher wurden die zwei folgenden Fragmente gewählt : 1. SMN-Fragment 1(SF71) ; aa SMN-Fragment 2(SF160) ; aa (siehe Abb. A1). Abb. A1. Die SMN-Fragmente SF71 und SF160 Bei der Planung der Fragmente wurde darauf geachtet, dass die Enden der Fragmente nicht in Sekundärstruktur-Elemente, wie α-helix-bereiche oder β- Faltblätter fielen (siehe Abb. A2 A4). Um eine möglichst hohe Sicherheit bei der Erstellung der Sekundär-Struktur-Vorhersagen zu bekommen wurden

61 Ergebnisse 50 verschiedene Programme, die jeweils mit modifizierten Rechen-Operationen arbeiten, ausgewählt. Abb. A2. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SMN1 durch GOR4. Die Sekundär-Struktur-Analyse durch GOR4 zeigt im Bereich der N-terminalen Hälfte des SMN β-faltblatt- (rot) und α-helikale Elemente (blau) in den Bereichen von AS 18 bis 62 und AS 81 bis 155. Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär- Strukturen, wie β-faltblätter und α-helices berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS 63 bis AS 81 und AS 167 bis AS 257. Abb. A3. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SMN1 durch SOPMA. Die Sekundär-Struktur-Analyse zeigt im Bereich der N- terminalen Hälfte des SMN β-faltblatt- (rot), α-helikale (blau) und β-turn Elemente (grün) in den Bereichen von AS 1 bis 57 und AS 89 bis 154. Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär- Strukturen, wie β-faltblätter und α-helices berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS 57 bis AS 89 und AS 154 bis AS 213.

62 Ergebnisse 51 Abb. A4. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SMN1 durch HNN. Die Sekundär-Struktur-Analyse zeigt im Bereich der N- terminalen Hälfte des SMN β-faltblatt- (rot) und α-helikale (blau) in den Bereichen von AS 19 bis 60 und AS 85 bis 154 Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär-Strukturen, berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS 61 bis AS 84 und AS 155 bis AS 256. Bereiche, in denen von allen verwendeten Programmen eine hohe Wahrscheinlichkeit für eine bestimmte Sekundär-Struktur-Elemente berechnet worden ist, liegen in der Region von AS ~30 und AS ~50 (hier wurde stets eine hohe Wahrscheinlichkeit für α-helikale Strukturen vorhergesagt) und die Region zwischen AS ~80 und AS ~160, in der drei β-faltblatt-regionen von zwei α- helikalen Bereichen begrenzt werden. Die β-faltblatt-region zwischen AS ~100 und AS ~130 ist mit der Literatur vereinbar, da sich in diesem Bereich die sogenannte Tudor-Domäne befindet, welche aus fünf β-faltblatt-strukturen besteht. (Fischer und Sattler et al., 2001; Groves et al., 2002 und Wang und Dreyfuss, 2001). Regionen, in denen von allen drei verwendeten Programmen eine sehr geringe Wahrscheinlichkeit für solche Sekundär-Struktur-Elemente berechnet wurde, lagen zwischen AS ~60 und AS ~80 und AS ~160 und AS ~250, so dass entschieden wurde, die Fragmentierung in diesen Regionen durchzuführen. Als Templat für die Herstellung der SMN-Fragmente diente eine, in einen pet28a- Vektor klonierte Volllängen-SMN-Sequenz ( ), die mittels Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI in die MCS (multiple cloning site) des Vektors einkloniert war (siehe Abb. A5).

63 Ergebnisse 52 Abb. A5. SMN1-volllängen in pet28a Die Amplifikation der SMN-Fragmente erfolgte mittels PCR ( ) mit entsprechenden Primern ( ) (siehe Abb. A6). Abb. A6. 1-%iges Agarosegel der Amplifikation der SMN-Fragmente SF71 (Schaubild I) und SF 160 (Schaubild II) durch PCR. Bei der Amplifikation des SF71 (213 bp) (Schaubild I) wurde ein Fragment erhalten, dass bei sich zu einer Größe von knapp 300 bp verhielt. Bei der Amplifikation des SF160 (480 bp) (Schaubild II) wurde ein Fragment erhalten, dass bei sich zu einer Größe von knapp 500 bp verhielt. Die PCR-Produkte wurden durch ein PCR-Purification-Kit ( ) gereinigt und die Enden der Fragmente durch Restriktions-Verdau ( ) mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI an den dafür vorgesehenen Schnittstellen abgetrennt. Die Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese (AGE)

64 Ergebnisse 53 ( ) von den ab verdauten Sequenz-Stücken getrennt (siehe Abb. A7) und mittels Gel-Extraktion ( ) erneut aufgereinigt. Abb. A7. 1-%iges präparatives Agarosegel der Fragmente SF71 (Schaubild I) und SF160 (Schaubild II) nach dem Verdau mit BamHI und XhoI. Schaubild I zeigt zwei Banden, des verdauten SF71 (213 bp), die sich bei einer Größe von rund 300 bp, Die Laufhöhe des SF160 (480 bp) dagegen konnte bei knapp 600 bp ermittelt werden (rechte Bande des Schaubilds II) Parallel dazu wurde der pgex-vektor (1xx), der ein Gen, das 90K, das über die selben Restriktionsschnittstellen einkloniert wurde, mit den selben Enzymen verdaut und ebenfalls durch Gel-Extraktion ( ) aufgereinigt (siehe Abb. A8). Abb. A8. 1-%iges präparatives Agarosegel des pet28a- (Schaubild I) und des pgex-vektors (Schaubild II) beide mit 90K- Fragment nach dem Verdau mit BamHI und XhoI. Beide Schaubilder zeigen mehrere Spuren des jeweiligen verdauten Vektors mit zwei Banden. Die oberste Bande lief bei über 3000 bp und entspricht in jedem Fall dem verdauten Vektor (pet28a : 5369 bp ; pgex-6p-1 : 4800 bp), die untere Bande entspricht dem infolge des Verdaus rausgeschnittenem Insert 90k (2,5 kbp).

65 Ergebnisse 54 Die Ligation ( ) der Fragmente erfolgte nach Standartprotokoll in den pgex- 6P-1-Vektor über die Restriktions-Schnittstellen BamHI und XhoI (siehe Abb. A9). Die ligierten SF71- und SF160-pGEX-Konstrukte wurden schließlich in E. coli XL1- blue durch Hitzeschock nach Standartprotokoll transformiert ( ) und auf Ampicillin selektiert. Abb. A9. Schematische Darstellung des pgex-6p-1-vektors mit den Schnittstellen BamH I und Xho I. Die Fragmente SF71 und SF160 wurden in den mit BamHI und XhoI geschnittenen pgex- 6P-1 über eben diese Schnittstellen ligiert. Vermeintlich positive Klone wurden durch Kolonie-PCR ( ) überprüft. Hier zeigten die Kolonien 1 bis 3 für das SF71 und die Kolonien 1 bis 7 für das SF160 jeweils ein positives Signal (siehe Abb. A10). Eine anschließende Sequenzierung ( ) der in der MCS der Plasmide enthaltenen Fragmente konnte nach einer Plasmid-Reinigung mit einem Plasmid-Purification-Kit ( /2) durchgeführt werden. Diese erbrachte die endgültige Sicherheit über die Richtigkeit der Sequenz der SMN-Fragmente SF71 und SF160 (siehe Anhang). Das alignment der durch die Sequenzierung erhaltenen Fragment- Sequenz mit der originalen SMN-Sequenz aus der Datenbank erfolgte mit Hilfe der Software der Internet-Seite ( ).

66 Ergebnisse 55 Abb. A10. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie-PCR der Fragmente SF71 (Schaubild I) und SF160 (Schaubild II). Schaubild I zeigt die Kolonie-PCR von drei Klonen, die damit auf das SF71 untersucht werden sollten (K1 K3). Bei allen konnte dadurch ein DNA-Fragment amplifiziert werden, das auf der gleichen Höhe lief wie das SF71 (213 bp) der Positiv-Kontrolle (PK). Die Negativ-Kontrolle zeigte kein Signal. Schaubild II zeigt die Kolonie-PCR von acht Klonen, die damit auf das SF160 untersucht werden sollten (K1 K8). Bei allen konnte ein DNA-Fragment amplifiziert werden, das auf der erwarteten Höhe (~ 500 bp) lief wie das SF160 (480bp). Eine Positiv-Kontrolle wurde hier nicht durchgeführt. Die Negativ-Kontrolle zeigte kein Signal Klonierung der SIP1-Fragmente in das pet-system Die Wahl von Größe und Position an der SIP1-Volllängen-Sequenz der SIP1- Fragmente erfolgte ebenfalls mit Hilfe von Sekundär-Struktur-Vorhersagen durch die entsprechende Software GOR4, HNN und SOPMA. Um verschiedene Bereiche des SIP1-Proteins in Hinsicht auf Binde-Eigenschaften mit SMN zu untersuchen, wurde die SIP1-Sequenz in fünf verschiedene Fragmente unterteilt: 1. SIP-Fragment 1(SIF1) ; aa SIP-Fragment 2 (SIF2) ; aa SIP-Fragment 3 (SIF3 ; aa SIP-Fragment 4 (SIF4) : aa SIP-Fragment 5 (SIF5) ; aa (siehe Abb. A11) Abb. A11. Die SIP1-Fragmente SIF1-5.

67 Ergebnisse 56 Bei der Erstellung der SIP1-Fragmente wurde ebenfalls darauf geachtet, dass die Enden der Fragmente nicht in Sekundärstruktur-Elemente, wie α-helix-bereiche oder β-faltblättern fielen (siehe Abb. A12 A15). Abb. A12. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SIP1 durch GOR4. Die Sekundär-Struktur-Analyse durch GOR4 zeigt viele Bereiche mit hohen errechneten Wahrscheinlichkeiten für Sekundär-Struktur.Elemente, die mit einer gewissen Gleichmäßigkeit über die gesamte Protein-Sequenz, in fast alternierender Reihenfolge, verteilt sind. Die β-faltblatt- Elemente sind rot, die α-helix-elemente sind blau dargestellt. Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär-Strukturen berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS ~30 bis AS ~50, AS ~90 bis AS ~100, AS ~150 bis ~170 und AS ~200 bis ~210. Abb.A13. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SIP1 durch HNN. Die Sekundär-Struktur-Vorhersage durch HNN zeigt die Bereiche mit hohen errechneten Wahrscheinlichkeiten für Sekundär-Struktur.Elemente, wie β-faltblatt- und α-helix- Elemente. Die β-faltblatt-elemente sind rot, die α-helix-elemente sind blau dargestellt. Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär-Strukturen berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS ~30 bis AS ~50, AS ~90 bis AS ~100, AS ~120 bis ~140 und AS ~160 bis ~170.

68 Ergebnisse 57 Abb. A14. Sekundär-Struktur-Vorhersage von SIP1 durch SOPMA. Die Sekundär-Struktur-Vorhersage durch SOPMA zeigt Bereiche mit hohen errechneten Wahrscheinlichkeiten für Sekundär-Struktur.Elemente, wie b-faltblatt- und a-helix- Elemente. Die β-faltblatt-elemente sind rot, die α-helix-elemente sind blau dargestellt. Die größten zusammenhängenden Bereiche, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit für Sekundär-Strukturen berechnet wurde, lagen hier im Bereich der AS ~30 bis AS ~50, AS ~90 bis AS ~100, AS ~120 bis ~135 und AS ~160 bis ~170. Es war gedacht, das Protein dreifach zu teilen, um die entstehenden Fragmente nicht zu kurz werden zu lassen. Dabei wurden die Schnittstellen in die Bereiche mit geringer Wahrscheinlichkeit für Sekundär-Strukturen, bei AS ~90 bis AS ~100 und AS ~160 bis AS ~170, gelegt. Mit den überlappenden Fragmenten, SIF2 und SIF4, sollten letztendlich fünf Fragmente konstruiert werden. Die überlappenden Fragmente dienten der Sicherheit, um auch die Bereiche für die Bindungs- Versuche abzudecken, in denen bei den ersten drei Fragmente die Schnittstellen liegen. Dies war wichtig für den Fall, falls die Schnittstellen doch eine für die Interaktion wichtige Domäne zerstören sollten. Als Templat für die Herstellung der SIP1-Fragmente diente eine, in einen pet28a- Vektor klonierte volllängen-sip1-sequenz ( ), die mittels Restriktionsschnittstellen NdeI, XhoI in die MCS des Vektors einkloniert war (siehe Abb. A15).

69 Ergebnisse 58 Abb. A15. Schematische Darstellung des pet28a-vektors mit SIP1. Das SIP1 war über die Restrikionsschnittstellen NdeI und XhoI in den Vektor einkloniert Die Amplifikation der SIP1-Fragmente erfolgte wie die der SMN-Fragmente mittels PCR ( ) mit entsprechenden Primern (siehe Abb. A16). Abb. A16. 1-%iges Agarosegel der Amplifikation der SIP-Fragmente SIF1 SIF5. In Spur 1 und 2 wurden die Proben der versuchten Amplifikation der SIP1- Fragmente SIF1 (285 bp) und SIF2 (504 bp) aufgetragen. Hier konnten keine DNA- Fragmente beobachtet werden, die als SIF1 bzw. SIF2 identifiziert werden konnten. In den Spuren 3 bis 5 wurden die Proben der Amplifikation der Fragmente SIF3-5 aufgetragen. Hier konnten jeweils Banden beobachtet werden, die als SIF3 (219 bp) (Spur 3), SIF4 (555 bp) (Spur4) und SIF5 (339 bp) (Spur5) identifiziert werden konnten Die Fragmente SIF1 und SIF2 konnten nicht amplifiziert werden. Die nachfolgende Sequenzierung des SIP1-volllängen-Templats zeigte eine Anomalie im Bereich der ersten 45 bp. Demnach fehlten der SIP1-Sequenz in dem pet28a 45 Basenpaare (bp), diese entsprechen 15 Aminosäuren (AS) in der Proteinsequenz. Da der Primer 1SIP1forw ( ) für die Amplifikation der Fragmente SIF1 und SIF2 gerade an diesen Bereich der SIP1-Sequenz binden muss, konnte die PCR

70 Ergebnisse 59 für die Fragmente SIF1 und SIF2 aus diesem Konstrukt nicht mit Erfolg durchgeführt werden. Die PCR-Produkte wurden, wie auch die SMN-Fragmente, durch ein PCR- Purification-Kit ( ) gereinigt und die Enden der Fragmente durch Restriktions-Verdau ( ) mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI an den dafür vorgesehenen Schnittstellen abgetrennt. Die Fragmente wurden durch AGE ( ) von den ab verdauten Sequenz-Stücken getrennt (siehe Abb. A17) und mittels Gel-Extraktion ( ) erneut aufgereinigt. Abb. A17. 1-%iges präparatives Agarosegel der Fragmente SIF3 bis SIF5 nach dem Verdau mit NdeI und XhoI. Auf den beiden Spuren SIF3, den beiden Spuren SIF4 und den Spuren SIF5 sind jeweils zwei Banden der entsprechenden Fragmente SIF3 (219 bp), SIF4 (555 bp) und SIF5 (339 bp) nach dem Restriktions-Verdau zu beobachten, die auf auch der jeweils erwarteten Höhe zu finden sind. Parallel dazu wurde der pet28a, mit dem 90K-Gen, mit den selben Enzymen verdaut und ebenfalls durch Gel-Extraktion ( ) aufgereinigt (siehe Abb. A9). Die Ligation ( ) der Fragmente SIF3-5 erfolgte nach Standard-Protokoll in den pet28a (siehe Abb. A18). Die ligierten SIF3, 4 und 5- pet28a-konstrukte wurden schließlich in E. coli DH5-α nach Standartprotokoll transformiert ( ) und auf Kanamycin selektiert.

71 Ergebnisse 60 Abb. A18. Schematische Darstellung des pet28a mit den Schnittstellen NdeI und XhoI und der darin über die entsprechenden Schnittstellen einklonierten Fragmente SIF1-5. Vermeintlich positive Klone wurden durch Kolonie-PCR ( ) überprüft (siehe Abb. A19). Hier zeigten die Kolonien 1 und 2 für das SIP-Fragment 3, die Kolonie 1 für das SIP-Fragment 4 und die beiden Kolonien 1 und 2 für das SIP-Fragment 5 jeweils ein positives Signal. Eine anschließende Sequenzierung ( ) der in der MCS der Plasmide enthaltenen Fragmente konnte nach einer Plasmid- Reinigung mit dem Plasmid-Purification-Kit ( /2) durchgeführt werden. Diese erbrachte wiederum die endgültige Sicherheit über die Richtigkeit der Sequenz der SIP-Fragmente SIF3-5 (siehe Anhang). Das alignment der durch die Sequenzierung erhaltenen Sequenz mit der originalen SMN-Sequenz aus der Datenbank erfolgte mit Hilfe der Software der Internet-Seite ( ). Abb. A19. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie-PCR der Klonierung der Fragmente SIF3-5 in den pet28a. Die Spuren 1 und 2 zeigen die durch die Kolonie-PCR amplifizierten SIP3-Fragmente der Klone SIF3-1 und -2. Die Spur 3 zeigt das amplifizierte SIP4- Fragment der Kolonie SIF4-1 und die Spuren 4 und 5 zeigen die durch die Kolonie-PCR amplifizierten SIP5-Fragmente der Kolonien SIF5-1 und -2. Alle beobachteten DNA-Fragmente liefen auf den zu erwartenden Höhen (SIF3 (219 bp), SIF4 (555 bp) und SIF5 (339 bp)). Bei der Negativ-Kontrolle konnte mit den verwendeten Primern kein Fragment amplifiziert werden (6)

72 Ergebnisse Klonierung der SIP1-Fragmente in das pgex-system Parallel zu der Klonierung der SIP1-Fragmente in den pet28a für die Bindungsversuche mit co-exprimierten Proteinen wurden SIF1-5 in den pgex-6p- 1+1 für die Einzel-Aufreinigung kloniert. Der pgex-6p-1+1 unterscheidet sich von dem pgex-6p-1 nur durch eine zusätzliche NdeI-Schnittstelle ( ) (siehe Abb. A20), die dieser besitzt. Dies war für die Klonierung der SIP1-Fragmente, die ja mit NdeI- und XhoI-Schnittstellen amplifiziert wurden günstig, da so keine weiteren Primer für die Klonierung der SIP1-Fragmente in das pgex-system benötigt wurden. Als Templat für die Herstellung der SIP1-Fragmente SIF1 und SIF2 diente eine, in einen pcdna-vektor klonierte volllängen-sip1-sequenz ( ), die mittels Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI in die MCS des Vektors einkloniert war. Die Richtigkeit dieser SIP1-volllängen-Sequenz wurde zuvor durch Sequenzierung ( ) bestätigt. Für die Klonierung der Fragmente SIF3 bis SIF4 wurden die bereits erstellten Fragmente aus der Amplifikation aus dem pet28a verwendet. Abb. A20. Schematische Darstellung des Vektors pgex-6p-1+1 mit zusätzlicher NdeI-Schnittstelle in den die Fragmente SIF1 bis SIF5 mit den Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI einkloniert werden sollten. Der pgex-6p-1+1 konnte durch die zusätzliche NdeI-Schnittstelle wie der pet28a durch NdeI und XhoI verdaut ( ) werden (Abb. A21).

73 Ergebnisse 62 Abb. A21. 1-%iges Agarosegel des mit NdeI und XhoI verdauten pgex-6p-1+1 mit 90k-Insert. Auf dem Agarosegel sind vier Spuren zu erkennen, die jeweils zwei Banden zeigen, wobei die obere Bande den mit NdeI und XhoI verdauten pgex-6p-1+1 (4800 bp) zeigen, während die unteren Banden das 90k-Insert (~2500 bp) darstellen. Die Amplifikation der SIP-Fragmente SIF1 und SIF2 erfolgte mittels PCR ( ) mit den bereits hergestellten Primern aus dem pcdna-3.1-vektor ( ) (siehe Abb. A22). Abb. A22. 1-%ige Agarosegele der Amplifikation der SIP-Fragmente SIF1 (Schaubild I) und SIF2 (Schaubild II) durch PCR. Die Spuren 1 bis 7 in Schaubild 1 zeigen die durch PCR amplifizierten SIP1-Fragmente (SIF1 (285 bp)), die bei einer Höhe von ~ 300 bp liefen, während die Spuren 8 bis 13 die durch PCR amplifizierten SIP2-Fragmente (SIF2 (504 bp)) darstellen, die bei einer Höhe von ~ 500 bp liefen. Für die PCR dieser Fragmente wurde das neu erhaltene pcdna3.1-sip1-konstrukt als Templat verwendet. Die ebenfalls durchgeführten Negativ-Kontrollen(Spur 7 und 13) waren negativ. Die PCR-Produkte wurden, wie gehabt, mit Hilfe eines PCR-Purification-Kit ( /2) gereinigt und die Enden der Fragmente durch Restriktions-Verdau ( ) mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI an den dafür vorgesehenen Schnittstellen abgetrennt. Die Fragmente wurden durch AGE ( ) von den ab

74 Ergebnisse 63 verdauten Sequenz-Stücken getrennt (siehe Abb. A23) und mittels Gel-Extraktion ( ) erneut aufgereinigt. Abb. A23. 2-%-iges präparatives Agarosegel der Fragmente SIF1 und SIF2 nach dem Verdau mit NdeI und XhoI. Die Spuren 2 und 3 zeigen die Banden des verdauten SIF1 (285 bp) bei einer Laufhöhe von ~ 400 bp, während die Spuren 4 und 5 die Banden des verdauten SIF2 (504 bp) zeigen, bei einer ungefähren Laufhöhe von 600 bp. Für die Ligation ( ) wurde der bereits mit NdeI und XhoI verdaute pgex-6p- 1+1-Vektor (siehe Abb. A21) der ebenfalls das 90K-Gen trug verwendet. Die Ligation ( ) der Fragmente SIF1-5 erfolgte dann in den pgex-6p-1+1 nach Standard-Protokoll. Die ligierten SIF1- bis SIF5- pgex-6p-1+1konstrukte wurden schließlich in E. coli XL-1blue nach Standartprotokoll transformiert ( ) und auf Ampicillin selektiert. Vermeintlich positive Klone wurden durch Kolonie-PCR ( ) überprüft (siehe Abb. A24, A25 und A26). Hier zeigten die Kolonien 1 bis 4 für SIF2, die Kolonien 1 und 2 für SIP1, die Kolonie 1 für SIF4, die Kolonien 1 und 3 für SIF3 und die Kolonien 1,2 und 4 für SIF5 jeweils ein positives Signal. Eine anschließende Sequenzierung ( ) der Plasmide dieser konnte nach einer Plasmid- Reinigung mit dem Plasmid-Purification-Kit ( /2) durchgeführt werden. Diese erbrachte die endgültige Sicherheit über die Richtigkeit der Sequenz der SIP-Fragmente SIF1 bis SIF5 im pgex-6p-1+1 (siehe Anhang). Das alignment der durch die Sequenzierung erhaltenen Sequenz mit der originalen SMN- Sequenz aus der Datenbank erfolgte mit Hilfe der Software der Internet-Seite ( ).

75 Ergebnisse 64 Abb. A24. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie-PCR der Klonierung der Fragmente SIF2, SIF1 und SIF4. Die Spuren 2 bis 6 zeigen die Amplifikation der SIP2-Fragmente der Kolonien SIF2-1 bis 5. Dabei zeigen die Spuren 2 bis 4 eine mehr oder weniger deutliche Amplifikation des SIF2 (504 bp) bei einer Laufhöhe von ~ 500 bp. Bei der Kolonie 5 (Spur 6) konnte kein durch die Kolonie-PCR amplifiziertes Fragment beobachtet werden. Die Spuren 9 und 10 zeigen die Amplifikation der SIP1-Fragmente der Kolonien SIP1-1 und -2. Spur 9 zeigt eine deutliche Amplifikation des SIF1 (285 bp) bei einer Laufhöhe von ~ 300 bp. Bei Spur 10 konnten zwei Banden beobachtet werden, und die andere lief weiter höher bei ca. 500 bp. Die Spuren 11 und 12 zeigen die Amplifikation des SIF4 (555 bp) der Kolonien SIF4-1 und -2. Hier konnte nur bei Kolonie SIF4-2 (Spur 12) eine Amplifikation des Fragmentes bei einer Laufhöhe von ~ 600 bp beobachtet werden. Anhand der Positiv-Kontrollen (Spuren 7 (SIF2), 13 (SIF1) und 15 (SIF4)) konnte die Laufhöhe der originalen Fragmente mit denen der Kolonie-PCR verglichen werden. Die Negativ-Kontrollen (Spur 8 (SIF2), 14 (SIF1) und Abb. A29 Spur 1 (SIF4)) lieferten keine Signale. Abb. A25. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie-PCR der Klonierung des Fragmentes SIF3. Die Spuren 2 bis 6 zeigen die Amplifikation des SIP- Fragmentes SIF3 der Kolonien SIF3-1 bis SIF3-5. Hier konnten bei den Kolonien SIF3-1,-3 &-5 eine mehr oder weniger deutliche Amplifikation des SIF3 (219 bp) beobachtet werden, dessen Banden bei einer ungefähren Laufhöhe von 200 bp zu sehen sind. Die Positiv-Kontrolle (Spur 7) dient als Vergleichsmöglichkeit und die Negativ- Kontrolle (Spur 8) lieferte kein Signal.

76 Ergebnisse 65 Abb. A26. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie- PCR der Klonierung des Fragmentes SIF5 in den pgex-6p-1+1. Die Spuren 3 bis 7 zeigen die Amplifikation des SIP1- Fragementes SIF5 (339 bp) aus den Kolonien SIF5-1 bis -5. Hier lieferte die Kolonie SIF5-1 (Spur 3) das deutlichste Signal, wobei allerdings auch bei den Kolonien SIF5-2, -4 und -5 eine Amplifikation des SIF5 zu beobachten war. Die Banden waren bei einer Laufhöhe von ~ 300 bp zu finden. Die Positiv-Kontrolle (Spur 8) diente auch hier wieder zum Vergleich. Die Negativ- Kontrolle lieferte kein Signal. Auf Spur 2 wurde die Negativ-Kontrolle der SIF4- Kolonie-PCR aufgetragen. Des weiteren wurde die Volllängen-SIP1-Sequenz parallel dazu in den pgex-6p- 1+1 kloniert. Diese Sequenz sollte bei den Bindungsversuchen eine Möglichkeit der Positiv-Kontrolle geben und auch für Kristallisations-Versuche Verwendung finden. Die vollständige SIP1-Sequenz wurden dazu durch die Enzyme NdeI und XhoI aus dem SIP1-pcDNA-3.1-Konstrukt herausgeschnitten ( ) und mittels Gel-Extraktion ( ) gereinigt (siehe Abb. A27). Abb. A27. 1,5-%-iges Agarosegel des Verdau von pcdna3.1-sip1 mit NdeI und XhoI. Die beiden Spuren 2 und 3 zeigen die Banden des verdauten pcdna3.1 (5428 bp) (obere Bande) und des SIP1-Inserts (841 bp). Die gereinigten SIP1-volllängen-Fragmente wurden schließlich ebenfalls in den pgex-6p-1+1-vektor hinein ligiert ( ) und die vermeintlich positiven Klone

77 Ergebnisse 66 zunächst durch Kolonie-PCR (Abb. A28) und dann durch Sequenzierung ( ) überprüft. Abb. A28. 1-%-iges Agarosegel der Kolonie-PCR des SIP1 in pgex-6p Die Spuren 2 bis 9 zeigen die Ergebnisse der Kolonie-PCR des SIP1 aus den Kolonien SIP1-1 bis SIP1-8. Hier zeigen alle Spuren eine gelungene Amplifikation des SIP1 (841 bp) mit einer Bande, die bei ~ 900 bp lief. Die Positiv-Kontrolle (Spur 10) diente der Vergleichsmöglichkeit und die Negativ- Kontrolle (Spur 11) zeigte kein Signal. 4.2 Expression Die Abschätzung der Protein-Größen erfolgte mit Hilfe der auf Erfahrung basierenden Annahme, dass ein Peptid aus ca. 100 AS im Durchschnitt ungefähr etwas größer als 10 kda sind Expression von GST-SF71(pGEX-6P-1) Das SF71-Fragment sollte zunächst einzeln mit GST-tag exprimiert und aufgereinigt werden, um möglichst rein für die Bindungs-Experimente verwendet werden zu können. Das Fragment wurde nach Standard-Protokoll bei 37 C, 4 Stunden im präparativen Maßstab exprimiert ( ). Die Induktion fand bei einer Zelldichte von OD = 0,6 mit 0.3 mm IPTG statt. Anschließend wurden die Zellen zunächst im analytischen Maßstab aufgeschlossen ( ). Die Ausbeute wurde mit Hilfe der SDS-PAGE nach Laemmli ( ) analysiert und so die Protein-Ausbeute abgeschätzt (siehe Abb. A29).

78 Ergebnisse 67 Abb. A29. 12,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von GST-SF71(pGEX-P-1) in BL-21(DE3). Im Gegensatz zu der in Spur 1 zu sehenden Vor-Induktion, ist bei der in Spur 2 zu sehenden Nach-Induktion, eine deutliche Überexpression des GST-SF71 ( ~ 35 kda), anhand einer bei ungefähr 35 kda laufenden Protein-Bande zu beobachten. Diese Bande erschien auch im Überstand (Spur 3), was auf eine hohe Löslichkeit des Proteins hindeutete. In Spur 4 zeigte sich, dass sich das Protein ebenfalls durch Bindung an GSH-Sepharose-beads und anschließender Elution mit 30 mm GSH aufreinigen ließ, während dadurch der Durchfluss, der durch die beads gereinigten Protein-Lösung nahezu vollständig von GST-SF71 befreit werden konnte, was dafür spricht, dass fast alles GST-SF71 an die beads gebunden haben musste. Das GST-SF71-Fragment konnte laut SDS-PAGE ( ) deutlich überexprimiert werden Expression von GST-SF160(pGEX-6P-1) Das Fragment GST-SF160 sollte ebenfalls zunächst einzeln exprimiert und aufgereinigt werden, um möglichst rein für die Bindungs-Experimente verwendet werden zu können. Das Protein wurde zunächst nach Standard-Protokoll wie das GST-SF71 bei 37 C im präparativen Maßstab exprimiert ( ). Die Induktion fand bei einer Zelldichte von zwischen OD = 0,6 0,7 mit 0.5 mm IPTG statt. Die Zellen wurden zu Analysezwecke ebenfalls, wie beim GST-SF71- Fragment, im analytischen Maßstab aufgeschlossen ( ). Die Ausbeute wurde wieder mit Hilfe der SDS-PAGE ( ) abgeschätzt (siehe Abb. A30).

79 Ergebnisse 68 Abb. A30. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von GST-SF160 (pgex-p-1) in BL-21(DE3). Hier konnte im Gegensatz zu der in Spur 1 zu sehenden Vor- Induktion, bei der in Spur 2 zu sehenden Nach-Induktion eine deutliche Überexpression des GST-SF160 (~ 44 kda) anhand einer bei ungefähr 41 kda laufenden Protein-Bande beobachtet werden. Diese Bande erschien ebenfalls im Überstand (Spur 4), was auf eine hohe Löslichkeit des Proteins hindeutete. Das SDS-Gel zeigte damit, dass das Fragment GST-SF160 gut und löslich überexprimiert wurde Expression der Fragmente His6-SIF3-5(pET28a) Um zu untersuchen, ob sich die SIP-Fragmente im pet-system mit His6-tag einzeln in deutlichen Mengen herstellen lassen, wurde versucht, die SIP- Fragmente SIF3 bis SIF5 in E. coli BL21(DE3) über zu exprimieren. Die Expression erfolgte im präparativen Maßstab bei 30 C für 4 h. Der Aufschluss erfolgte ebenfalls im präparativen Maßstab mit dem Fluidizer (Microfluidics, Massechussats, USA) ( ), da aufgrund der geringen Größe der Fragmente kein Lysozym verwendet werden konnte. Lysozym läuft bei einer Größe von ungefähr 15 kda und hätte die mögliche Expression der Fragmente auf dem anschließenden SDS-Gel ( ) vollständig verdecken können (Abb. A31).

80 Ergebnisse 69 Abb. A31. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von SIF3-5(pET28a) in E. coli BL21(DE3). Wie in den Spuren 2 der Nach-Induktionen der Expression der Protein-Fragmente His6-SIF3-5 im Vergleich zu der in den Spuren 1 zu sehenden Vor-Induktionen und nach Aufschluss der Zellen (Spuren 3 & 4 (des Pellets und des Überstandes)) ersichtlich, konnten die Proteine nicht überexprimiert werden. Auch nach dem Versuch, Spuren dieser Proteine durch Ni- NTA-beads zu reinigen (Spuren 5) und so sichtbar zu machen, wurde keine Protein-Bande mit der jeweils zu erwartenden Größe (Hsi6-SIF3 (7 kda), His6-SIF4 (18 kda) und His6-SIF5 (11 kda)) beobachtet. Daraus wurde geschlossen, dass sich die einzelnen Fragmente laut der SDS- PAGE ( ) nicht in erkennbaren Mengen exprimieren ließen Expession von His6-SMN(pET28a) Als nächstes sollte versucht werden, das Volllängen-His6-SMN-Fusionsprotein aus dem pet28a über zu exprimieren. Die Expression fand im analytischen Maßstab ( ) und bei 16 C statt, um die Löslichkeit so hoch wie möglich zu halten. Es wurde bei einer optischen Dichte (OD) von ungefähr 0,7 mit 0,5 mm IPTG induziert und über Nacht (ca. 16 h) exprimiert ( ). Der Aufschluss erfolgte mit dem Sonifier (Stärke : 3; Frequenz : 50%; 4 x 20 s) auf Eis. Die SDS- PAGE (Abb. A32) gibt die Ergebnisse der Expression wieder.

81 Ergebnisse 70 Abb. A32. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von His6-SMN (pet28a) bei 16 C. Anhand des Vergleichs der Spuren 2 (Vor-Induktion) und 3 (Nach-Induktion) konnte keine Überexpression des His6-SMN (~ 28 kda) beobachtet werden. Nach dem Aufschluss allerdings (Spuren 4 (Pellet) und 5 (Überstand) war im Pellet eine Bande des His6-SMN bei ca. 28 kda zu sehen, während im Überstand davon nichts zu sehen war. Die Überexpression konnte hier also nur nach dem Aufschluss der Zellen beobachtet werden, nicht aber durch den einfachen Laemmli-Aufschluss der Vor- Induktions- und Nach-Induktions-Proben ( ). Und trotz der Maßnahme, durch Expression bei 16 C das Protein möglichst in Lösung zu halten, konnte es schließlich nur mit dem Pellet gefällt werden. Der Überststand war weitestgehend frei von His6-SMN-Fusionsprotein Ko-Expression von GST-SF160 und His6-SIF3-5 Obwohl sich die His6-SIF-Fragmente nicht einzeln exprimieren ließen, sollte untersucht werden, ob sich die Expressions-Effizienz in Ko-Expression mit einem SMN-Fragment, steigern ließe. Hierzu wurde das GST-SF160-Fragment gewählt. Die Expression wurde nach dem Standard-Protokoll im präparativen Maßstab ( ) durchgeführt. Der Aufschluss erfolgte ebenfalls im präparativen Maßstab mit dem Fluidizer ( ) (Abb. A33).

82 Ergebnisse 71 Abb. A33. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Ko-Expression von SIF3-5(pET28a) + SF160(pGEX-6P-1) in E. coli BL21(DE3). In Spur 2, der Nach-Induktion von dem einzeln exprimierten GST-SF160 (~ 44 kda), konnte dessen Expression anhand der bei ca. 41 kda laufenden GST-SF160-Protein-Bande beobachtet werden. Diese, als auch weitere zu erwartende Banden konnten in den Proben der Ko-Expressionen (GST-SF160 + His6-FIF3-5) (Spuren 5 bis 16) nicht gefunden werden. Anhand dieser SDS-PAGE ( ) konnte so kein Unterschied zwischen Vorund Nach-Induktion bei den Ko-Expressionen festgestellt werden. Und auch nach dem Aufschluss mit dem Fluidizer konnte keine Protein-Überexpression beobachtet werden Expression von den GST-SIF1-5-Fragmenten Nun wurde versucht die GST-SIP-Fragmente im pgex-system über zu exprimieren. Die Expression erfolgte im präparativen Maßstab ( ) nach Standard-Protokoll bei 37 C. Die Induktion erfolgte bei einer OD von ca. 0,6 mit 0,3 mm IPTG, siehe Abb. A34, A35 und A36.

83 Ergebnisse 72 Abb. A34. 17,5-%-ige SDS-Acrylamidgel der Expression von GST-SIF1,2 und 4 (pgex-6p-1+1) in BL-21(DE3) RIL. Bei der Nach-Induktion der Expression von GST-SIF1 (~ 37 kda) (Spur 2) und des Überstsandes (Spur 4 (GST-SIF1)) konnte die lösliche Expression des GST-SIF1 anhand einer, auf der Höhe von ca. 35 kda laufenden Bande bestätigt werden. Die lösliche Expression von GST-SIF2 (~ 44 kda) wurde anhand einer auf der Höhe von ca. 41 kda (Spur 2 (GST-SIF2) (Nach- Induktion GST-SIF2) und Spur 8 (GST-SIF2) ( Überstand GST-SIF2)) bestätigt, während die Expression von GST-SIF4 (~ 45 kda) durch eine schwache Bande im Überstand (Spur 12 (GST-SIF4)) nur erahnt werden konnte. Abb. A35. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von SIF3 (pgex-6p-1+1) in BL- 21(DE3) RIL. Die Überexpression von GST- SIF3 (~ 34 kda) konnte anhand einer bei ca. 35 kda laufenden Protein-Bande bei der Nach- Indukion (Spur 3) und des Überstsandes (Spur 4) deutlich beobachtet werden.

84 Ergebnisse 73 Abb. A36. 12,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von SIF5 (pgex-6p-1+1) in BL-21(DE3) RIL. Hier konnte keine Protein-Bande von GST-SIF5 (~ 38 kda) in der zu erwartenden Höhe, weder in der Nach-Induktion (Spur 2), noch in dem Überstand (Spur 3) oder Pellet (Spur 4) gefunden werden. Die Expression des GST-SIF1 und GST-SIF2 war, wie der SDS-PAGE ( ) zu entnehmen, sehr effizient und die Löslichkeit schien hier auch gegeben, während die Expression des GST-SIF4 nicht so effizient gewesen zu sein schien. GST- SIF3 schien wieder sehr gut mit einer ebenfalls guten Löslichkeit exprimiert werden zu können. Das Fragment GST-SIF5 wurde anscheinend gar nicht exprimiert Expression von GST-SIP1 Schließlich wurde versucht, das GST-SIP1 zu exprimieren. Das Protein sollte wieder nach Standard-Protokoll aber, um es möglichst löslich zu exprimieren, 16 h bei 30 C präparativ exprimiert werden ( ). Die Zellen wurden bei OD von 0.6 induziert, siehe Abb. A41. Die Zellen wurden im präparativen Maßstab ohne Lysozym mit Hilfe des Fluidizers (Microfluidics, Massechussats, USA) aufgeschlossen ( ), Abb. A37.

85 Ergebnisse 74 Abb. A37. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression von SIP1 (pgex-6p-1+1) in BL-21(DE3) RIL. Die Expression des GST-SIP1 (~ 57 kda) lässt sich anhand der Protein-Bande, die mit ca. 60 kda bei der Nach-Induktion (Spur 2) und im Pellet (Spur 4) lief, zeigen. Da aber nichts mehr davon im Überstand zu sehen war, wurde davon ausgegangen, dass das Protein hier nicht löslich exprimiert werden konnte. Die fetten Banden die im Pellet und im Überstand (Spur 5) mit ca. 15 kda liefen wurden als das für den Aufschluss verwendete Lysozym gewertet, dass bei genau dieser Größe läuft. An Hand der, nach der Expression angefertigten SDS-PAGE, ( ) ist zu sehen, dass das Protein zwar exprimiert wurde, aber da es nur im Pellet wieder zu finden war, nicht löslich exprimiert werden konnte Ko-Expression von SIF1-5(pGEX-6P-1+1) mit SMN1(pET28a) Alternativ zu der Strategie, His6-SIP-Fragmente im pet-system und den GST- SMN-Fragmente im pgex-system über zu exprimieren, durch Glutathion- Sepharose- und Ni 2+ -(Ni-NTA)-beads ko zu eluieren und die Fragmente so auf diese Weise auf deren Binde-Eigenschaften zu untersuchen, sollte nun, da sich die His6-SIP-Fragmente nicht in geeigneter Effizienz überexprimieren ließen, die im pet28a vorliegende Volllängen-SMN-Sequenz, mit den, in den pgex-6p-1+1 klonierten SIP1-Fragmenten (SIF1-SIF5) co-exprimiert und dann auf deren Binde- Eigenschaften zu untersucht werden. Für diese Ko-Expression wurden E. coli BL- 21 (DE3) RIL verwendet, um eine bessere Synthese-Leistung im Fall von seltenen Codons für die Aminosäuren Arginin, Isoleucin und Leucin, von denen die SIP1-

86 Ergebnisse 75 Sequenz zwar nur einige besitzt, zu erzielen. Die Expression fand im analytischen Maßstab ( ) nach Standard-Protokoll bei 16 C statt (siehe Abb. A38). Abb. A38. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Ko-Expression von His6-SMN (pet28a) und GST-SIF1-5 (pgex-6p1+1) bei 16 C. Bei der hier gezeigten SDS-PAGE wurden die jeweiligen Vor-Induktionen (Spuren 2, 6, 10, 14 und 18), die Nach- Induktionen (Spuren 3, 7, und 19) und die Aufschluss-Proben, das Pellet (Spuren 4, 8, 12 und 16) und der Überstand (Spuren 5, 9, 13, 17 und 20) aufgetragen. Bei keiner dieser Spuren konnte eine deutliche Überexpression der Proteine (His6-SMN (~ 28 kda), GST-SIF1 (~ 37 kda), GST-SIF2 (~ 44 kda), GST-SIF3 (34 kda), GST-SIF4 (~ 45 kda) und GST- SIF5 (~ 38 kda) beobachtet werden. Anhand der SDS-PAGE ( ) ist weder eine deutliche Überexpression der Proteine SIF1-5-GST aus dem pgex-6p-1+1 zu erkennen, noch des His6-SMN. Die Expression der Proteine ließ sich so nur mutmaßen. Da aber bei einer Expression, die mit zwei Proteinen gleichzeitig durchgeführt wird, oftmals keine deutliche Überexpression der Proteine nach der Induktion beobachtet wird, sollten die Proben trotzdem für die Ko-Elutions-Versuche ( ) verwendet werden (4.4.2)

87 Ergebnisse Aufreinigung Aufreinigung der GST-SMN-Fragmente Die Aufreinigung der GST-Fusionsproteine sollte durch Affinitätschromatographie mit Glutathion-Sepharose-beads ( ) durchgeführt werden. Zunächst sollte versucht werden, das GST-SF71-Fragment aufzureinigen. Das Fragment wurde mit Hilfe der Äkta Prime bei 4 C aufgereinigt ( ). Das Elutionsprofil zeigte, dass mit 30 mm reduziertem Glutathion Protein von der Säule eluiert werden konnte (siehe Abb. A39). Die SDS-PAGE ( ) (Abb. A40) zeigte, dass das so eluierte Protein bei der erwarteten Größe des GST-SF71 (~35 kda) lief. Allerdings war es noch durch einen geringen Anteil an Kontaminanten, wobei es vermutlich um verkürzte Fragmente von dem GST-SF71 handelte, verunreinigt, die ebenfalls an die Säule gebunden hatten und so mit-eluiert wurden. Die daraus resultierende Strategie, die Reinheit des Proteins weiter zu erhöhen, war es, zunächst den GST-tag durch proteolytischen Verdau durch die PreScission-Protease abzuspalten ( ) um dann durch einen weiteren Affinitätschromatographie-Schritt mit Glutathion-Sepharose ( ) und anschließender Gelfiltration ( ), den GST-tag und andere Kontaminanten rauszuwaschen. Der Verdau erfolgte nach Standart-Protokoll ( ) über Nacht bei 4 C (siehe Abb. A40). Abb. A39. Elutionsprofil des SF71 nach Aufreinigung mit Glutathion- Sepharose-AC. Bei dem Elutions- Profil ist die Absorbtionsstärke in mau (Y-Achse) gegen die Reinigungszeit in min (X-Achse) aufgetragen. Innerhalb der ersten 40 min wurde der Durchfluss eluiert und die Säule gewaschen. Der erste Elutions-Versuch erfolgte mit 15 mm GSH zwischen min ~50 bis min ~70. Dabei wurde eine Absorbtionsänderung von 17 mau beobachtet. Der Großteil des Proteins konnte allerdings erst bei einer GSH-Konzentration von 30 mm (Elution (GST-SF71) nach ~90 min eluiert werden.

88 Ergebnisse 77 Abb. A40. 17,5-%-iges SDS- Acrylamidgel der Aufreinigung von GST-SF160 (pgex-6p-1) und PreScission-Verdau. Die Spuren 1 und 2 zeigen das durch GSH-AC aufgereinigte GST-SF71 (~ 35 kda) bei einer Größe von ungefähr 35 kda. Die beiden schwächeren Banden unterhalb davon (~ 30 kda) und (28 kda) sind Kontaminanten, die vermutlich auch an die GSH-Sepharosebeads gebunden hatten und von daher angenommen werden kann, dass es sich dabei um verkürzte Fragmente des GST-SF71 aufgrund von vorzeitigem Translations-Abbruch handelte. Die Spuren 3 und 4 zeigen die Positiv- Kontrolle des PreScission-Protease-Verdaus. Der GST-tag ließ sich durch den PreScission-Verdau nicht abspalten. Dies wurde nochmals über längere Zeiträume versucht (24 h und 36 h bei 4 C und Raumtemperatur) (siehe Abb. A41). Abb. A41. 17,5-%-iges SDS- Acrylamidgel des PreScission- Protease-Verdau von GST-SF71 nach 24 h und 36 h ; bei 4 C und bei Raumtemperatur. Die SDS-PAGE zeigt die GST- SF71-Proben mit den zwei Banden der Kontaminanten vor und nach Inkubation der Proben mit PreScission-Protease bei 4 C und RT nach 24 h (Spuren 2 und 3), nach 36 h (Spuren 4 und 5) und nach 48 h (Spuren 6 und 7). Die Voraussetzung, um für die angestrebten Bindungs-Experimente verwendet werden zu können, musste das Fragment allerdings vom Fusionsprotein-tag befreit werden. Dadurch, dass sich der GST-tag nicht von dem Fragment abspalten ließ, kann angenommen werden, dass die native Faltung des Konstruktes nicht ideal verlaufen ist. Damit wäre das Fragment für die Bindungsund Kristallisations-Versuche ( ) nicht geeignet.

89 Ergebnisse Aufreinigung von GST-SF160 und GST-SIF1-5 Die Aufreinigung des GST-SF160-Fragment erfolgte, wie die des GST-SF71, durch GSH-Sepharose-Affinitätschromatographie ( ) allerdings im batch- Verfahren. Der GST-tag wurde ebenfalls durch PreScission-Verdau ( ) (4 C; 16 h) versucht abzuspalten (siehe Abb. A42). Der Verdau erfolgte auf der Säule ( ), um eine Elution zu sparen. Abb. A42. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Aufreinigung des GST-SF160 und Verdau mit PreScission-Protease nach 24 h Inkubation. Die SDS-PAGE zeigt in den ersten drei Spuren die nach dem Aufschluss genommenen Proben des Pellets (in dem nur wenig GST-SF160 (~ 44 kda) in einer Bande bei ca. 41 kda zu sehen ist), des Überstandes (in dem, aufgrund der dickeren 41-kDa-Bande, davon ausgegangen wurden, sich die Hauptmenge des Proteins befand) und der Durchfluss (der fast gar kein GST-SF160 mehr enthielt). Die Elutions-Proben (Spuren 5 bis 11) zeigten, dass die Hauptmenge bereits dicht zu Anfang eluiert wurde. Anhand des Bandenmusters nach dem PreScission-Protease-Verdau (Spur 12 und 13) konnte geschlossen werden, dass das Fusionsprotein vollständig verdaut werden konnte, da die GST-SF160-Bande mit ~ 44 kda vollständig verschwunden war und anstelle dessen zwei neue Banden, eine mit ~ 27 kda (GST : ~ 27 kda) und eine mit 18 kda (SF160 : ~ 18 kda) aufgetaucht waren. Der GST-tag ließ sich wie in Abb. A42 zu beobachten abspalten, doch die Proteinfraktionen sind ebenfalls mit vermeintlichen verkürzten GST-SF160- Fragmenten verunreinigt. So wurde als nächstes versucht, die Reinheit der Elution durch eine höhere NaCl-Konzentration im verwendeten Puffer (600 mm NaCl) zu erhöhen. Eine höhere NaCl-Konzentration kann zu einer Erhöhung der Bindespezifität führen und damit könnten schwächere Interaktionen von Kontaminanten verringert werden. Des weiteren wurde die Expressions-Dauer auf drei Stunden verkürzt um die Entstehung von verkürzten GST-SF160-Fragmenten zu verringern (siehe Abb. A43). Das so aufgereinigte Fragment wurde durch

90 Ergebnisse 79 Protein-Konzentratoren ( ) bis zu einer Protein-Konzentration von 4,56 mg / ml ankonzentriert (siehe Abb. A43) und auch für Kristallisationsversuche ( ) verwendet (4.5). Abb. A43. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Expression und Aufreinigung von GST-SF160(pGEX-6P-1) und des PreScission-Verdau und Aufreinigung des SF160. Die Spuren 1 bis 4 dokumentieren nochmals die Expression des GST- SF160, wobei man bei der Nach-Induktion (Spur 2) und des Überstandes (Spur 3) sieht, dass das Fusionsprotein deutlich überexprimiert werden konnte. Die Spuren 4 bis 7 zeigen die Aufreinigung des GST-SIF160 mit 600 mm NaCl, wobei man sieht, dass das eluierte Fusionsprotein an Reinheit gewinnen konnte (Spur 6 und 7). Der PreScission-Verdau (Spur 8) war erfolgreich und so konnte das Protein durch einen weiteren GSH-Affinitätschromatographie-Schritt vom GST befreit werden., was an der einzelnen Bande um ca. 18 kda zu erkennen ist (Spur 9). Mittels PD-10 Säulen wurde das Protein bis auf eine Konzentration von 4,6 mg ankonzentriert (Spur 10). Die verkürzten Fragmente konnten durch die Erhöhung der NaCl-Konzentration zwar nicht völlig beseitigt werden, allerdings konnte die Reinheit des Proteins wie anhand der SDS-PAGE ( ) in Abb.43 zu beobachten deutlich erhöht werden. Parallel dazu wurde schließlich auch das GST von der Säule nach Standard- Protokoll ( ) eluiert, siehe Abb. A44. Die Proteinlösungen wurden im Anschluss mit Hilfe von PD-10 Säulen ( ) vom zur Elution verwendeten Glutathion befreit.

91 Ergebnisse 80 Abb.A44. 17,5-%-iges SDS- Acryamidgel der Elution von SF160 und GST von der GSH- Sepharose Säule. Spur 1 bis 4 zeigen nochmals eine Elution des vom GST getrennten SF160 (~ 18 kda) mit Banden um 18 kda. Die Banden um 27 kda auf Spur 5 bis 8 zeigen die Elution des GST (~ 27 kda). Die GST-SIF1-5-Fragmente sollten auf die gleiche Art und Weise aufgereinigt werden wie das GST-SF160-Fragment (siehe Abb. A45). Hierzu wurden die Fragmente im präparativen Maßstab nach Standard-Protokoll bei 37 C exprimiert ( ) und die Zellen ebenfalls im präparativen Maßstab mit dem Fluidizer (Microfluidics, Massechussats, USA) nach Standard-Protokoll aufgeschlossen ( ). Die Eluate der Fragmente GST-SIF1-3 waren zwar noch durch Abbau-Produkte, oder verkürzte Fragmente verunreinigt, diese sollten allerdings keinen Einfluss auf die Bindespezifität für SF160 nehmen können. Der GST-Fusionsprotein-tag der GST-SIP-Fragmente (GST-SIF1-5) ist Grundlage für die Bindungsversuche weil die Fragmente darüber erneut aufgrereinigt und damit das SF160 im Falle der Bindung co-eluiert werden sollte. Von daher durfte der GST-tag nun nicht durch PreScission-Protease-Verdau ( ) abgespalten werden. Während der Aufreinigung wurde der Proteingehalt der Elution stets mit Bradford- Reagenz ( ) qualitativ bestimmt. Dabei konnte bei den Fragmenten GST- SIF4 und GST-SIF5 keine Protein-Elution beobachtet werden. Die Proteinlösungen wurden im Anschluss mit Hilfe von PD-10 Säulen ( ) vom zur Elution verwendeten Glutathion befreit.

92 Ergebnisse 81 Abb. A45. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Aufreinigung von GST-SIF1-3. Die Spuren 1 bis 7 (GST-SIF1) dokumentieren die Aufreinigung des GST-SIF1 (37 kda) via GSH-Sepharose. Hier kann man anhand der dicken Bande um 35 kda, in der Probe des Überstandes (Spur 1 (GST-SIF1)) sehen, dass das GST-SIF1 hauptsächlich hierin gelöst war. Mit 30 mm GSH konnte es dann eluiert werden (Spur 6 (GST-SIF1)). Die Spuren 1 bis 7 (GST-SIF2) dokumentieren die Aufreinigung des GST-SIF2 (~ 44 kda). Hier kann man anhand der dicken Bande um 40 kda, in der Probe des Überstandes (Spur 1 (GST-SIF2)) sehen, dass das GST-SIF2 ebenfalls löslich war. Mit 30 mm GSH konnte es dann eluiert werden (Spur 5, 6 &7 (GST-SIF2)). Die Aufreinigung des GST-SIF3 (~ 34 kda) ist durch die Spuren 1 bis 7 (GST-SIF3) dokumentiert. Hier ist die Löslichkeit des Proteins auch anhand der dicken ~ 35 kda-bande im Überstand zu sehen. Die Elution des GST-SIF3 ist dagegen in den Spuren 5, 6 & 7 (GST-SF3) zu beobachten. 4.4 Bindungsversuche Bindungsversuche mit gereinigten Proteinen Die Protein-Eluate der GST-SIF-Fragmente 1 bis 3 und SF160 wurden in gleichen Anteilen (1:1) und in 1:2 Anteilen (SF160 : GST-SIF) vermischt und versucht an Glutathion-Sepharose-beads zu binden ( ). Schließlich wurden die gewaschenen beads durch SDS-PAGE ( ) analysiert, wobei diese auf das SDS-Gel aufgetragen wurden (siehe Abb. A46, A47 und A48). Als Negativ- Kontrolle diente das vom GST-SF160 abgespaltene GST, um auszuschließen, dass im Fall einer Bindung von SF160 an einem GST-SIF, die Interaktion durch den GST-tag vermittelt wird.

93 Ergebnisse 82 Abb. A45. 17,5-%-iges SDS-Acrylamidgel der Bindungs-Versuche mit GST-SIF1 bis SIF3 und SF160 im Verhältnis 1:1 (Schaubild I) Abb. A46. Bindungs-Versuche mit GST-SIF1 bis SIF3 und SF160 im Verhältnis 1:1 und 2:1 (Schaubild II) Abb. A47. Bindungs-Versuche mit GST-SIF1 bis SIF3 und SF160 im Verhältnis 2:1 (Schaubild III). Die Spuren 1 & 2, 5 & 6 und 9 & 10 (Schaubild I) zeigen Proben des Überstands nach Inkubation beider vermeintlicher Protein- Bindungs-Partner im Verhältnis 1:1 und des Durchflusses, nach der Aufreinigung durch die GSH-Sepharose-beads, der Bindungs- Versuche von SF160 mit GST-SIF1, GST-SIF2 und GST-SIF3. In jeweils beiden Ansätzen sind beide vermeintliche Bindungs-Partner deutlich zu erkennen (GST-SIF1 (~ 37 kda) & SF160 (~ 18 kda) (Spuren 1 und 2), GST-SIF2 (~ 44 kda) & SF160 (Spuren 5 und 6) und GST-SIF3 (~ 34 kda) (Spuren 9 & 10)). Nach dem Waschen der beads wurden diese aufs SDS-Gel aufgetragen (Spuren 4 (GST-SIF1+SF160), 8 (GST- SIF2+SF160) & 12 (GST-SIF3+SF160)). An diesen Proben lassen sich die GST-SIP-Fragmente 1-3 wiederum gut erkennen, das erwartete SMN-Fragment SF160 ist jedoch nicht wieder zu finden. Bei der Negativ-Kontrolle (GST + SF160) wurde parallel dazu ebenfalls nur das GST an die beads gebunden (Schaubild II, Spuren 1-4). Schaubild II und Schaubild III zeigen den gleichen Versuch mit einem SF160 : GST-SIF1-3 Verhältnis von 1:2. Hier waren die Beobachtungen zu dem Versuch mit dem SF160:GST-SIF1-3 Verhältnis 1:1 (siehe Schaubild I und II) identisch.

94 Ergebnisse 83 Durch diese Bindungs-Versuche konnten keine Interaktionen zwischen den SMN- Fragment SF160 und den SIP1-Fragmenten SIF1-3 festgestellt werden Bindungsversuche durch Ko-Expression Für die Bindungsversuche durch Ko-Expression wurden die Proteine zuvor nicht gereinigt, sondern es wurde versucht, die Proteine direkt aus dem Zelllysat zunächst mit Glutathion-Sepharose-beads ( ) und schließlich mit Ni- NTA-beads ( ) im Eppi-Maßstab ( ) ko zu eluieren. Hierzu wurden Expressionen GST-SIF1-4 + His6-SMN verwendet (siehe Abb. A42). Bei der Expression von GST-SIF5 + His6-SMN gab es zu diesem Zeitpunkt Schwierigkeiten mit der Transformation und konnte von daher aus zeitlichen Gründen nicht im Nachhinein durchgeführt werden. Als letzten Schritt wurden die Ni-NTA-beads mit den Proteinen, die daran gebunden waren auf das Gel aufgetragen. Die Proben wurden so schließlich durch SDS-PAGE ( ) analysiert (siehe Abb. A48). Abb. A48. SDS-Acrylamidgel der Ko-Expression von SIF1-5 (pgex-6p1+1) mit Volllängen-SMN (pet28a) in E. coli RIL (Schaubild I)

95 Ergebnisse 84 Abb. A48. SDS-Acrylamidgel der Ko-Expression von SIF1-5 (pgex-6p1+1) mit Volllängen-SMN (pet28a) in E. coli RIL (Schaubild II). Die Spuren 1 bis 7 geben jeweils die Beobachtungen der in vivo Bindungs- Versuche von His6-SMN und den GST-SIP1-Fragmenten GST-SIF1-4 wieder. Bei den Proben des Überstandes (jeweils Spur 1) und des Durchflusses (jeweils Spur 2) konnten keine Proteine in überexprimierten Mengen beobachtet werden. Nach dem Waschen (jeweils Spur 3) allerdings, bei der Analyse der GSH-beads fielen einzelne Protein-Banden, die offenbar an die GSH-Sepharose binden konnten, auf. Einige dieser Banden liefen auf der Höhe, der jeweils erwarteten GST-SIP-Fragmente (GST-SIF1 (~ 37 kda) : Spur 4 (His6-SMN+GST-SIF1) bei ~ 38 kda, GST-SIF2 (~ 44 kda) : Spur 4 (His6-SMN+GST-SIF2) bei ~ 41 kda ( beide Schaubild I), (GST-SIF3 (~ 34 kda) : Spur 4 (His6-SMN+GST-SIF3) bei ~ 35 kda und GST-SIF4 (~ 45 kda) : Spur 4 (His6- SMN+GST-SIF4) bei ~ 42 kda ( beide Schaubild II). Des weiteren konnte zusätzlich eine weitere Doppel-Bande, die bei ~ 30 kda anzutreffen war beobachtet werden. Diese Doppel-Bande lief also mit ungefähr der gleichen Größe, wie es auch von dem His6-SMN zu erwarten gewesen wäre, auf allen GSH-bead-Spuren, außer bei His6-SMN+GST-SIF4. Das gleiche Banden-Muster, nur in abgeschwächter Form konnte auch nach der Elution der an die GSH-beads gebundenen Proteine mit 30 mm GSH beobachtet werden (Spuren 5 (His6-SMN+GST-SIF1, His6-SMN+GST-SIF2, His6-SMN+GST-SIF3, His6- SMN+GST-SIF4). Bei dem Auftrag der Ni-NTA-beads konnten keine Protein-Banden mehr gefunden werden (Spur 7 (His6- SMN+GST-SIF1, His6-SMN+GST-SIF2, His6-SMN+GST-SIF3, His6-SMN+GST-SIF4). Nach der Elution von den Glutathion-Sepharose-beads ( ) konnten Proteinbanden beobachtet werden, die auf der Höhe dem jeweiligen GST-SIF- Fragmente und des His6-SMN-Protein liefen. Mit Hilfe der aufgetragenen NI-NTAbeads ( ) allerdings, konnten keine Protein-Banden beobachtet werden. Ob es sich bei den nach der GSH-Elution wirklich um die erwarteten Proteine gehandelt hatte sollte mit Hilfe eines Western-Blottes ( ) nachgewiesen werden.

96 Ergebnisse Westernblot-Analyse der Ergebnisse von den Bindungsversuchen aus Co-Expression Der Westernblot wurde nach Standard-Protokoll ( ) durchgeführt. Es sollte damit zumindest Aufschluss darüber gewonnen werden, ob denn das His6-SMN- Volllängenprotein überhaupt überexprimiert wurde, was bei der Ko-Expression allein anhand der Expressions-Gele schlecht zu bestimmen war. Getestet wurden dazu die Proben des Zelllysats und die Elution von den Glutathion-Sepharose-beads der Ko-Expressionen GST-SIF1-3 + His6-SMN (siehe Abb. A53). Als Positiv-Kontrollen wurde GST-SIF5 für den α-gst-blot und His6-90k für den α-his6-blot verwendet. Siehe Abb.49! Als Negativ-Kontrolle fungierte jeweils der Protein-Marker. Abb. A49. Westernblot des Zelllysats und der Elution von den Glutathion-Sepharose-beads der Ko-Expressionen GST- SIF1-3 + His6-SMN. Schaubild I zeigt die Ergebnisse des Blots gegen den GST-tag der GST-SIP-Fragmente. Bei dem Blot mit den α-gst-antikörpern wurden bei allen Proben sehr viele Protein-Banden markiert (Spuren 2 bis 7), die sich während der SDS-PAGE ( ) bei Größen zwischen ~20 und ~100 kda anfanden. Bei dem Überstand des Bindungs-Tests His6- SMN+GST-SIF1 fallen markierte Banden oberhalb von ~ 40 kda auf. Ansonsten laufen die obersten Banden bis zu der Größe des in diese Probe erwartete Protein (GST-SIF1 (~ 37 kda) Spur 3 (GSH-Elution (His6-SMN+GST-SIF1)), GST- SIF2 (~ 44 kda) Spuren 4 & 5 (Überstand & GSH-Elution (His6-SMN+GST-SIF2)) und GST-SIF3 (+ 34 kda) Spuren 6 & 7 (Überstand & GSH-Elution(His6-SMN+GST-SIF3)). Die Positiv-Kontrolle (Spur 8 (GST-SIF1) wurde markiert. Bei der Negativ-Kontrolle, als welche der Marker fungierte, konnten keine markierten Proteine beobachtet werden. Schaubild II zeigt die Ergebnisse des Blots gegen den His6-tag des His6-SMN. Bei diesem α-his6-blot dagegen, konnten keine Protein-Banden markiert werden. Die Positiv-Kontrolle jedoch, war den Erwartungen entsprechend markiert.