Aus der Kinderklinik und Poliklinik der Universität Würzburg Direktor: Professor Dr. med. Ch. P. Speer

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1 Aus der Kinderklinik und Poliklinik der Universität Würzburg Direktor: Professor Dr. med. Ch. P. Speer Analyse der Immunglobulinrepertoire-Veränderungen in B Zellen von Kindern mit Autoimmunerkrankungen Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg vorgelegt von Henner Morbach aus Hagen Würzburg, Juni 2006

2 Referent: Priv.-Doz. Dr. med. Hermann Girschick Koreferent: Prof. Dr. med. Hans Konrad Müller-Hermelink Dekan: Prof. Dr. med. Georg Ertl Tag der mündlichen Prüfung: Der Promovend ist Arzt

3 Meiner Familie

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Rezeptoren des angeborenen und adaptiven 1 Immunsystems 1.2 B Zellen sind die Träger der humoralen Immunität Die Entstehung der Antikörpervielfalt Der molekulare Mechanismus der V(D)J-Rekombination Der zeitliche Ablauf der V(D)J-Rekombination während der 8 B Zellentwicklung im Knochenmark 1.4 Der Kappa Lokus B Zell Reifung und Differenzierung außerhalb des 14 Knochenmarkes B1 B Zellen B Zellen des peripheren Blutes Rezeptor Editing Rezeptor Revision Systemischer Lupus Erythematodes Juvenile Idiopathische Arthritis Die Rolle von B Zellen in der Pathogenese von 24 Autoimmunerkrankungen 1.11 Die Rolle von Rezeptor Editing und Rezeptor Revision in 25 der Entstehung autoreaktiver Immunglobuline 1.12 Fragestellungen 27 2 Material und Methoden Herkunft der Proben Isolierung mononukleärer Zellen Durchflusszytometrie Grundlagen Verwendete Durchflusszytometer und technische Einstellung 31

5 2.3.3 Färbeprotokoll Durchflusszytometrie Genexpressionsanalyse in individuellen Zellen Einzelzellsortierung und Zelllyse Reverse Transkription RNA Verdau Einzelzell PCR Analyse der PCR Produkte Spezifischer Nachweis der PCR Produkte bei der Analyse 43 der Genexpression von beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, CD154 oder VpreB Vakuum Dot-Blot (Southern Blot) Nachweis mit markierten Oligonukleotid-Sonden Herstellung DIG-dUTP gekoppelter Oligonukleotid-Sonden Hybridisierung der Membranen mit DIG-dUTP markierten 45 Oligonukleotid-Sonden Nachweis der spezifisch gebundenen, DIG-dUTP 46 markierten Oligonukleotid-Sonden Analyse der PCR Produkte zur Untersuchung des V kappa 47 J kappa Rearrangements Aufreinigung der PCR Produkte Sequenzierung der PCR Produkte Analyse der Sequenzen des V kappa J kappa 49 Rearrangements 2.5 Immunmagnetische Sortierung von Zellpopulationen mit 49 der MACS-Technologie 2.6 RNA Isolierung aus Zellpopulationen Reverse Transkription der aus Zellpopulationen isolierten 51 RNA 2.8 Quantitative Real Time PCR Statistische Auswertungen Materialien und Geräte 54

6 3 Ergebnisse Charakterisierung der B Zellen von Kindern mit 56 frühkindlicher Oligoarthritis Durchflusszytometrische Analyse der B Zellen des 56 peripheren Blutes Molekulare Analyse der B Zellen des peripheren Blutes Untersuchung des V kappa J kappa Rearrangements V kappa Familien V kappa Gensegmente J kappa Gensegmente CDR 3 Länge der V kappa J kappa Verbindung Exonukleaseaktivität am 5` und 3` Ende der V kappa Jκ 71 kappa Verbindung N-Nukleotide innerhalb der V kappa J kappa Verbindung P-Nukleotide am 5` und 3` Ende der V kappa J kappa 76 Verbindung Analyse der RAG und VpreB mrna Expression Durchflusszytometrische Analyse der B Zellen der 87 Synovialflüssigkeit 3.2 Molekulare Analyse der B Zellen von Kindern mit Systemischen Lupus Erythematodes 96 4 Diskussion Zeigen die B Zellpopulationen des peripheren Blutes bei 111 Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis eine Verteilungsstörung oder Zeichen der Aktivierung? 4.2 Die Analyse des Kappa Leichtkettenrepertoires der B 111 Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und von gesunden Kindern Werden B Zellen des peripheren Blutes mit bestimmten V oder J kappa Gensegmenten von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis im Vergleich zu gesunden 111

7 Kindern positiv oder negativ selektioniert? Gibt es Unterschiede in der V kappa J kappa Schnittstelle der B Zellen des peripheren Blutes zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern? 4.3 Zeigen die B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Anzeichen für eine aktive Rezeptor Revision? 4.4 Gibt es bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis zwischen B Zellen des peripheren Blutes und denen der Synovialflüssigkeit Unterschiede hinsichtlich der Differenzierung oder Aktivierung? 4.5 Bestehen Hinweise auf eine aktive Rezeptor Revision in B Zellen des peripheren Blutes bei Kindern mit SLE? Zusammenfassung Abkürzungen Literatur 142

8 1 Einleitung 1.1 Rezeptoren des angeborenen und adaptiven Immunsystems Das Immunsystem hat sich als ein System mit Fremderkennungs- und Effektormechanismen ausgebildet. Es bietet dem Individuum den Vorteil der Erkennung und Elimination körperfremder, potentiell pathogener Erreger bei gleichzeitiger Gewährleistung von Toleranz gegenüber körpereigenen Strukturen. Eine der zentralen Aufgaben, die das Immunsystem dabei zu bewältigen hat, ist die Unterscheidung zwischen Selbst und nicht Selbst (1). An der Antigenerkennung und anschließenden Zellaktivierung sind Rezeptoren beteiligt, die entweder dem Teil des angeborenen (z.b. Toll-like Rezeptoren) oder des adaptiven Immunsystems (B Zell und T Zell Rezeptoren) zuzuordnen sind (2-4). Die Gene der Rezeptoren des angeborenen Immunsystems zeigen weitestgehend interindividuelle Identität und werden als funktionsfähige Gene weitervererbt (3). Die für die Rezeptoren der adaptiven Immunantwort kodierenden Gene hingegen werden als ein Repertoire von Gensegmenten vererbt. Die zufällige Auswahl und Zusammensetzung einzelner Gensegmente erfolgt in einem Rekombinationsprozess auf somatischer Ebene und führt zu einer hohen Rezeptorvielfalt (5). Charakteristisch für die adaptive Immunantwort ist die Ausbildung eines spezifischen, immunologischen Gedächtnisses. Die adaptive Immunantwort basiert auf der zufälligen Generierung von Rezeptoren durch somatische Rekombination sowie anschließender klonaler Selektion (6). An der Vermeidung der Aktivierung und klonalen Expansion autoreaktiver Lymphozyten und damit an der Aufrechterhaltung der Individualitätswahrnehmung sind zahlreiche Toleranzmechanismen beteiligt. Die Störung einzelner Toleranzmechanismen kann zum Auftreten von Autoimmunphänomenen führen. Sind diese Phänomene an einer Gewebeschädigung beteiligt, spricht man von einer Autoimmunerkrankung. 1

9 1.2 B Zellen sind die Träger der humoralen Immunität Am Beispiel der Diphterie und des Tetanus zeigte Emil von Behring im Jahre 1890, dass spezifische (humorale) Immunität durch einen Bestandteil des Serums übertragen werden kann (7) postulierte Paul Ehrlich in seiner Seitenkettentheorie die durch körperfremde Substanzen induzierte Entstehung von spezifischen Rezeptoren, welche später als Antikörper bezeichnet wurden (8). Ehrlich verwies erstmals ausfürlich auf das Problem der Autoimmunität ( horror autotoxicus ) demonstrierten Glick et al die Bedeutung der Bursa Fabricii der Vögel für die Entwicklung humoraler Immunität. B Zellen wurden kurze Zeit später als zelluläre Träger dieser Immunität identifiziert. Fagraeus schrieb den Plasmazellen der Milz von Kaninchen die Antikörperproduktion zu (9). Jerne, Burnet und Talmage entwickelten in ihren Theorien die Idee der klonalen Selektion von monospezifischen B Zellen, die sich nach Selektion durch ein Antigen und anschließender klonaler Expansion zu einer Antikörper produzierenden Zelle differenzieren (10, 11). Die Hypothese der Selektion auf zellulärer Ebene wurde durch neuere Arbeiten in Frage gestellt. Sie siedeln den Selektionsvorgang auf der subzellulären Ebene des B Zell Rezeptors (BZR) an (12) (Vergleiche 1.6 und 1.7). Abbildung 1: Paul Ehrlichs Illustration der Seitenkettentheorie (1900) (13) 2

10 Antikörper sind tetramere Proteine, bestehend aus zwei leichten und zwei schweren Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken verbunden sind (Abb 2). Die carboxyterminalen Abschnitte dieser Ketten zeigen trotz mehrerer auftretender Varianten einen hohen Konservierungsgrad und werden als konstante Regionen bezeichnet. Über diese wird die Effektorfunktion des Antikörpermoleküls vermittelt. Bei der schweren Kette werden fünf Varianten (Isotypen) unterschieden (μ, δ, γ, α und ε), bei der leichten Kette zwei (κ und λ). Die Peptidsequenz der aminoterminalen Abschnitte (variable Regionen) weisen eine hohe Variabilität auf, die sich auf drei Bereiche (hypervariable Regionen HV 1-3) konzentriert. In der Tertiärstruktur des Antikörpers bilden die hypervariablen Regionen die Antigenbindungsstelle, deren spezifische Oberflächenstruktur komplementär zum Antigen ist. Daher werden die hypervariablen Regionen auch als complementarity determining regions (CDR 1-3) bezeichnet (14). B Zellen können Antikörper sezernieren und/oder als membranständiges Oberflächenmolekül exprimieren. Durch Assoziation mit dem Igα/Igβ Heterodimer entsteht der B Zellrezeptor. Igα/Igβ sind an der Signaltransduktion des B Zellrezeptors beteiligt. Abhängig vom Reifungsstadium und der Umgebung der B Zelle kontrollieren die Signale des B Zellrezeptors das Überleben, die Differenzierung und die Proliferation der B Zelle (15). 1.3 Die Entstehung der Antikörpervielfalt Die Entstehung der Antikörpervielfalt wir durch eine Reihe lymphozytenspezifischer molekularer Mechanismen bewerkstelligt. Diese beinhalten die nahezu zufällige Rekombination einer Auswahl von V, J und im Falle der schweren Kette zusätzlichen D Gensegmenten zum Immunglobulingen (V(D)J-Rekombination) (5). Hinzu kommen die Addition und Deletion einzelner Nukleotide an den Verbindungen zwischen diesen Gensegmenten sowie die zufällige Paarung von leichter und schwerer Kette (16). Diese Mechanismen vollziehen sich in unreifen B Zellen des Knochenmarks. In reifen, aktivierten B Zellen des Keimzentrums kann die Akkumulation von Punktmutationen an bestimmten Stellen des 3

11 Immunglobulingens zu Änderungen der Polypeptidsequenz des Antikörpers führen (somatische Hypermutation) (17, 18). Dies hat eine weitere Diversifizierung des Immunglobulinrepertoires zur Folge. VH CH1 VL Protein CL CH2 AAA mrna CH3 DNA nach VJ-Rekombination Keimbahn - DNA RAG RAG 1 J Gensegmente V Gensegmente Abbildung 2: Somatische Rekombination von Gensegmenten als molekularer Mechanismus der Entstehung von Antikörpervielfalt Dargestellt ist die Somatische Rekombination am Beispiel eines Leichtkettenlokus. Das Antikörpermolekül besteht aus den Variablen Regionen der leichten (VL) und der schweren (VH) Kette. Die schwere Kette besteht aus drei konstanten Teilen (CH1, CH2, CH3), die leichte Kette aus einem konstanten Teil (CL). Modifiziert nach (14) 4

12 1.3.1 Der molekulare Mechanismus der V(D)J-Rekombination Die V(D)J-Rekombination wird durch Doppelstrangbrüche an definierten Bruchstellen (Rekombinationssignalsequenzen, RSS) der Gensegmente initiiert (19). Daran ist ein aus den Proteinen RAG1 und RAG2 bestehendes, lymphozytenspezifisches Heterodimer mit Endonukleaseaktivität beteiligt (V(D)J-Rekombinase). Die Proteine RAG1 und RAG2 sind in den Rekombination Aktivierenden Genen (RAG) 1 und 2 kodiert (20, 21). Die RSS besteht aus einem konservierten Heptamer und Nonamer, welche durch einen Platzhalter (spacer) mit einer Länge von 12 oder 23 Nukleotiden getrennt sind. Ein Gensegment, dessen RSS mit einem 12 Nukleotide langen Platzhalter ausgestattet ist (12-RSS), wird in der Regel nur mit einem solchen kombiniert, dessen Platzhalter eine Länge von 23 Nukleotiden hat (23-RSS). Da die RSS der verschiedenen Gensegmentgruppen (V, D und J) mit unterschiedlich langen Platzhaltern ausgestattet sind, ist gewährleistet, dass ein J- mit einem V- Gensegment, bzw. im Falle der schweren Kette ein J- mit einem D- und dieses mit einem V-Gensegment kombiniert wird (12/23-Regel) (19, 22) (Abb 3). Im ersten Abschnitt der V(D)J-Rekombination werden 12-RSS und 23-RSS durch die V(D)J-Rekombinase in räumliche Nähe gebracht und Einzelstrangbrüche an der Übergangsstelle zwischen Heptamer und kodierendem Gensegment durchgeführt. Dabei wird die Phosphatesterbindung zwischen dem letzten Nukleotid des kodierenden Gensegmets und dem ersten Nukleotid des Heptamers hydrolysiert. Zwischen den beiden komplementären Einzelsträngen eines jeweiligen kodierenden Gensegments bildet sich an der Schnittstelle durch Umesterung eine Haarnadelstruktur aus, welche als Kodierende Enden bezeichnet werden. Die stumpfen, 5 -phosphorilierten Enden der RSS werden Signalenden genannt. Es entsteht ein Komplex mit 4 DNA-Enden: zwei kodierende Enden mit Haarnadelstruktur und zwei stumpfe 5`-phosphorilierten Signalenden (19, 22) (Abb 3). Diese Enden werden im zweiten Abschnitt der V(D)J-Rekombination prozessiert. Zunächst wird die Haarnadelstruktur des kodierenden Endes durch Endonukleaseaktivität wieder geöffnet. Liegt der Schnitt dabei nicht genau am Scheitelpunkt der Haarnadelstruktur, entsteht ein überhängender Einzelstrang, 5

13 der mit den ehemals komplementären Nukleotide des anderen Stranges endet. So entstehen palindromische Sequenzen. Palindrome sind Nukleotidabfolgen, die in beiden Richtungen gelesen die gleiche Sequenz ergeben. Die entstandenen palindromischen Sequenzen werden am anderen Strang durch komplementäre Nukleotide ergänzt. Diese matritzenkodierten Nukleotide werden als P-Nukleotide bezeichnet (23). Zudem können durch Aktivität des Enzyms Terminale Deoxynukleotid Transferase (TdT) bis zu 15 Nukleotide an einen Strang der geöffneten Harnadelstruktur angefügt werden. Diese nichtmatritzenkodierten Nukleotide werden als N-Nukleotide bezeichnet (24, 25). Durch Exonukleaseaktivität kann es an den kodierenden Enden auch zum Nukleotidverlust kommen (Abb 3). Die beiden Signalenden und die beide Kodierenden Enden werden jeweils miteinander ligiert. Im Gegensatz zu der sehr variablen Verknüpfung der kodierenden Enden, werden die Signalenden präzise miteinander verknüpft. Dabei entsteht der Signalend-Komplex, der aus einem zirkulären DNA-Segment besteht (22). Der RAG1/2-Komplex ist der lymphozytenspezifische und essentielle Faktor der V(D)J-Rekombinase. Die Funktion der Endonukleasen RAG1/2 kommt vor allem im ersten Abschnitt der V(D)J-Rekombination zum tragen. Die weiteren Vorgänge (Prozessieren des Kodierenden Endes, Verknüpfen von Kodierendem Ende und Signalende) werden hauptsächlich durch ubiquitär vorkommende DNA-Reparaturenzyme bewerkstelligt (Artemis, DNA-PK CS, DNA-Ligase IV, XRCC4 Protein, Histonprotein H2AX) (26, 27). Diese sind auch an der Reperatur von Doppelstrangbrüchen anderer Ursache, z.b. ionisierende Strahlung, beteiligt (Abb 3). 6

14 12-RSS 23-RSS V J RAG1 RAG2 AC V G C T G Kodierende Enden Signal Enden J DNA-PKCS Artemis Ku70 Ku80 A Palindrombildung V TGCGC Kodierende Enden J Signal Enden TdT DNA ligase IV XRCC4 N-Nukleotide V NNNN J Kodierende Verbindung Signal Verbindung Abbildung 3: Der molekulare Mechanismus der V(D)J-Rekombination Dargestellt ist die Beteiligung der lymphozytenspezifischen Faktoren RAG1 und RAG2 an den ersten Schritten der V(D)J-Rekombination sowie die Beteiligung der universell vorhandenen DNA-Reparaturenzyme (DNA-PKCS, Ku70, Ku80, DNA ligase IV, XRCC4) an den weiteren Vorgängen. Der Einbau von P- und N-Nukleotiden ist exemplarisch verdeutlicht. Modifiziert nach (28). 7

15 1.3.2 Der zeitliche Ablauf der V(D)J-Rekombination während der B Zellentwicklung im Knochenmark B Zellen entwickeln sich im Knochenmark aus hämatopoetischen Vorläuferzellen. Die früheste Vorläuferzelle, die der B Zelllinie zugeordnet werden kann, ist die pre-pro B Zelle. Die Immunglobulingene liegen in diesem Differenzierungsstadium noch als Gensegmentgruppen in Keimbahnkonfiguration vor (29). Pro B Zellen stellen die nächste Differenzierungsstufe in der B Zellreihe dar. Die V(D)J-Rekombination wird in diesen Zellen am Lokus der Schweren Kette initiiert. Die frühen Pro B Zellen sind durch das Rearrangement von D- und J-Gensegmenten der Schweren Kette charakterisiert. Anschließend wird in den späten Pro B Zellen ein V-Segment mit den schon rearrangierten DJ-Segmenten rekombiniert (30). Nach funktionsfähiger V(D)J-Rekombination der schweren Kette kommt es zur Synthese einer membrangebundenen Form der Schweren Kette, deren konstanter Teil der Isotypenklasse μ angehört (migμ). Dieses Protein assoziiert an der Zelloberfläche mit einer Ersatzleichtkette, welche aus den Proteinen VpreB und 14.1 (λ5 bei der Maus) besteht. Schwere Kette, Ersatzleichtkette, und die BZR Signalkomponenten Igα und Igβ bilden den Pre B Zellrezeptor (prebzr) (30-33). Nur solche Pro B Zellen, bei deren V(D)J-Rekombination keine Verschiebung des Leserasters auftrat, können einen funktionsfähigen prebzr bilden. Bleibt die Bildung einer funktionsfähigen schweren Kette aus, kann die Rekombination auf dem zweiten Allel fortgesetzt werden. Entsteht dabei auch keine funktionsfähige schwere Kette, stirbt die Zelle durch Apoptose. Durch Expression des prebzr wird eine weitere V(D)J-Rekombination am zweiten Allel unterdrückt und sicher gestellt, daß in jeder B Zelle nur eine schwere Kette einer Spezifität gebildet wird (Allelische Exklusion) (34). Nach erfolgreicher V(D)J-Rekombination der Gene der schweren Kette proliferieren die nun entstandenen großen Pre B Zellen. Die Zellen verlieren dabei den membrangebundenen prebzr und differenzieren zu kleinen Pre B Zellen, die in der G1-Phase des Zellzyklus verharren. Es folgt die erneute 8

16 Expression der RAG Gene und die VJ-Rekombination der leichten Kette. Zunächst werden V- und J-Segmente an einem Kappa Lokus rekombiniert. Liegt die Sequenz des rekombinierten Exons nicht im Leseraster, kann die Rekombination mit weiter außenliegenden V- und J-Segmenten wiederholt werden. Kommt es dabei auch zu keiner produktiven VJ-Rekombination, können die Mechanismen am zweiten Allel des Kappa Lokus oder am Lambda Lokus weitergeführt werden. Ein erfolgreiches Rearrangement führt zur Expression des membrangebundenen BZR der Isotypenklasse IgM auf der Zelloberfläche. Ähnlich dem prebzr inhibiert die Expression eines intakten und nicht autoreaktiven BZR die Expression der Gene RAG1 und 2 und verhindert weitere V(D)J-Rekombination (35, 36) (Abb 4). Die V(D)J-Rekombination lässt sich nur in Lymphozyten nachweisen. Dies kann durch die zelltypspezifische Expression der Gene RAG1 und RAG2 erklärt werden. Die geordnete Abfolge der Rekombination der Gensegmente V, D und J der schweren und der leichten Kette, die Allelische Exklusion und die Tatsache, dass T-Zellen keine vollständig rekombinierten Immunglobulingene aufweisen (und vice versa), kann nicht allein durch die regulierte Expression einer universalen V(D)J-Rekombinase erkärt werden. Möglicherweise sind hieran Mechanismen beteiligt, welche die V(D)J-Rekombinase zu bestimmten Gensegmenten leiten oder den Zugriff der V(D)J-Rekombinase auf bestimmte Gensegmente ermöglichen bzw. verhindern (accessibility hypothesis) (37-41). 9

17 IgH IgL sig RAG KB - - SZ - KB - - DJ - - Pre-pro B Pro-B +/- + Antigen unabhängig VDJ - prebzr große pre-b - VDJ VJ prebzr kleine pre-b + unreife B unreife B trans. B unreife B unreife B Rezeptor Editing RAG+ Autoreaktiver Rezeptor Deletion Anergie Antigen abhängig IgM+ IgD+ IgM+ Abbildung 4: Der zeitliche Ablauf der V(D)J-Rekombination während der B Zellentwicklung im Knochenmark Dargestellt ist der Rearrangement-Status des Lokus der schweren (IgH) und der leichten (IgL) Kette sowie die Aktivität der Rekombination Aktivierenden Gene (RAG) in den sich entwickelnden B Zellen des Knochenmarkes. Die B Zellen verlassen das Knochenmark als transitionelle B Zellen (trans. B). KB = Keimbahn, BZR = B Zell Rezeptor. 10

18 1.4 Der Kappa Lokus Die Gensegmente, aus denen das Gen für die Kappa Leichtkette des Antikörpers zusammengesetzt wird, befinden sich im Kappa Lokus auf Chromosom 2 (2q11.2) (42). Einige Sequenzen, die den V kappa (Vκ) Gensegmenten zuzuordnen sind, konnten außerhalb dieses Lokus gefunden werden (Orphons). Der genomische Aufbau des kappa Lokus ist zweigeteilt, wobei eine proximal zu den 5 J kappa Gensegmenten liegende Kassette von einer diesen Segmenten distal angeordneten Kassette unterschieden werden kann (43). Die J kappa distale und J kappa proximale Kassetten sind durch eine 800 kb lange Sequenz voneinander getrennt und liegen zueinander invertiert mit entsprechend gegenläufiger 5` 3` Polarität (43). Beide Kassetten beinhalten die V Gensegmente des Kappa Lokus. Nach ihrer Anordnung innerhalb der Kassette werden die V Gensegmente in mehrere Regionen zusammengefasst. Die 40 V Gensegmente der J kappa proximalen Kassette liegen in den Regionen B, Lp, Ap und Op, die 36 V Gensegmente der J kappa distalen Kassette innerhalb der Regionen Od, Ad und Ld (44). Die V Gensegmente beider Kassetten zeigen untereinander eine hohe Homologie, ein Großteil der V Gensegmente liegt paarweise vor (44-46). Von den insgesamt 76 bekannten V Gensegmenten des Kappa Lokus werden den funktionellen V kappa Gensegmenten zugeordnet (47-49). Eine weitere Klassifikation vollzieht sich nach funktionellen Kriterien und teilt die V kappa Gensegmente je nach ihrer Homologie untereinander in 7 verschiedene V kappa Familien ein. Die V Gensegmente einer Familie zeigen eine Sequenzidentität von mehr als 80%. Neben den V und J Gensegmenten enthält der Kappa Lokus zudem eine Region, die für den konstanten Teil der Kappa Leichtkette kodiert (C kappa). Die symmetrisch verdoppelte, invertierte Struktur des Kappa Lokus entstand möglicherweise durch Verdoppelung einzelner Gensegmente und durch Duplikation von Gensegmentgruppen (50). Das Vκ Jκ Rearrangement wird in verschiedene Abschnitte unterteilt. Drei Abschnitte kodieren für den antigenbindenden Teil der Kappa Leichtkette (Complementarity Determining Region, CDR 1-3), die übrigen Abschnitte kodieren für die Gerüstregion des Proteins (Framework Region, FR 1-3). Innerhalb der CDR 3 Region des Gens 11

19 für die Kappa Leichtkette des Immunglobulins liegt die Schnittstelle zwischen Vκ und Jκ. Die CDR 3 Region beginnt bei Kodon 89 (Vκ) und endet bei Kodon 97 (Jκ). Durch Exonukleaseaktivität können Nukleotide des Vκ und/oder Jκ Gensegmentes entfernt und die CDR 3 Region verkürzt werden. Das Einfügen von N-Nukleotiden und/oder P-Nukleotiden führt zur Verlängerung der CDR 3 Region. 12

20 Abbildung 5: Schematische Abbildung des genomischen Aufbaus des Kappa Lokus beim Menschen (44) 13

21 1.5.1 B Zell Reifung und Differenzierung außerhalb des Knochenmarks Nach erfolgreicher Generierung und Oberflächenexpression eines Immunglobulins verlassen die B Zellen als unreife B Zellen ( transitional B cells T1 T3) das Knochenmark und migrieren in die Milz. Dort reift ein kleiner Teil dieser B Zellen zu länger lebigen reifen B Zellen heran (51). An der negativen und möglicherweise positiven Selektion der B Zellen könnten sowohl die Signalgebung durch den B Zellrezeptor als auch Umgebungsfaktoren beteiligt sein. Einen entscheidenden Einfluß auf die B Zellreifung scheint in diesem B Zellstadium das Zytokin BAFF/BLys zu haben (52). Während die transitional B cells in der Maus gut charakterisiert sind, gibt es beim Menschen nur wenig Erkenntnis über diese B Zellpopulation. Reife B Zellen rezirkulieren durch die sekundär lymphatischen Organe und haben Zutritt zu deren Primärfollikeln. Die Follikel sind der Ort der antigenspezifischen B Zellaktivierung, der somatischen Hypermutation und des Immunglobulinklassenwechsels. Zu Beginn einer Immunantwort nehmen Dendritische Zellen am Ort der Entzündung Antigen auf und präsentieren dieses auf ihrer Oberfläche über MHC II Moleküle. Nach Reifung und Migration dieser Dendritischen Zellen in sekundär lymphatische Organe, sind diese Zellen an der antigenspezifischen Aktivierung von T Zellen beteiligt (53). Antigenspezifische B und T Zellen treten über MHC II-Antigen T Zellrezeptor (TZR) Wechselwirkungen sowie über kostimulatorische Liganden und deren Rezeptoren miteinander in Kontakt. Hierbei erfolgt die antigenspezifische B Zellaktivierung (54). Die Interaktion zwischen CD40 der B Zellen und CD154 (CD40L) der T Zellen scheint von besonderer Bedeutung für den Immunglobulinklassenwechsel zu sein (55). Ein Teil dieser aktivierten B Zellen differenziert in kurzlebige Plasmazellen, deren Immunglobulingene nur wenig somatisch hypermutiert sind. Alternativ beginnen die aktivierten B Zellen sich zu teilen (Zentroblasten). Begleitet wird die klonale Expansion durch Somatische Hypermutation (SHM), wobei durch Nukleotidaustausch Mutationen in die variablen Regionen der Immunglobulingene eingefügt werden (18, 56). Nach Beendigung des Zellzyklus migrieren die Zellen als Zentrozyten in einen Bereich mit Follikulär Dendritischen Zellen, die auf ihrer Oberfläche Antigen in 14

22 Form von Immunkomplexen präsentieren. Die spezifische Bindung dieser Antigene durch den B Zellrezeptor der Zentrozyten liefert zusätzlich zu den Signalen von antigenspezifischen T Zellen Überlebenssignale an die B Zelle. Dieser Selektionsmechanismus begünstigt nach erfolgter Somatischer Hypermutation vor allem die B Zellen mit hoch-affinem Rezeptor (57). Die Zentrozyten verlassen das Keimzentrum als langlebige Gedächtnis B Zellen oder als frühe Plasmazellen (58, 59). Während die Gedächtnis B Zellen durch die sekundär lymphatischen Organe rezirkulieren, migrieren die frühen Plasmazellen (Plasmablasten) in das Knochenmark oder an den Ort einer Entzündung, wo das Vorhandensein verschiedener Zytokine ihnen eine Überlebensnische bietet. Dort erfolgt die Differenzierung zu langlebigen Plasmazellen, die zum Teil jahrelang persistieren und an der Aufrechterhaltung spezifischer Immunglobulinspiegel beteiligt sind (60-64) (Abb 6). Antigenaufnahme am Entzündungsort IgM+ Plasmazelle B Zelle DZ B Zelle CD4+ T Zelle B Zell - T Zell Interaktion MHC II CD80 (B7.1) CD86 (B7.2) CD40 OX40L Fas LFA-1 (CD11a/CD18) * * T Zelle TZR, CD4 CD28/CTLA-4 CD28/CTLA-4 CD40L (CD154) OX40 FasL ICAM-1 (CD54) Zentroblasten Dunkle Zone SHM Apoptose IKW Affinitätsreifung FDZ Zentrozyten Helle Zone IgG/A/E+ frühe Plasmazelle Gedächtnis B Zelle Abbildung 6: B Zell Aktivierung und Differenzierung innerhalb von Keimzentren sekundär lymphatischer Organe Dendritische Zelle (DZ), Somatische Hypermutation (SHM), Immunglobulin Klassenwechsel (IKW), Follikulär Dendritische Zelle (FDZ). Modifiziert nach (54, 65) 15

23 1.5.2 B1 B Zellen Konventionelle B Zellen (B2 B Zellen) rezirkulieren durch die peripheren sekundär lymphatischen Organe (Milz, Lymphknoten, Tonsillen) und sind Träger der adaptiven Immunität. Ihre Aktivierung und Differenzierung zur Gedächtnis B Zelle oder Plasmazelle verläuft meist in einer T zellabhängigen Immunantwort. B1 B Zellen unterscheiden sich durch ihren Phänotyp, ihr Auftreten während der Ontogenese, ihr funktionelles Verhalten und durch ihr Immunglobulinrepertoire von konventionellen B Zellen (B2 B Zellen). B1 B Zellen der Maus sind IgM high, IgD low, CD23-, CD43+ CD5+ (B1a) bzw CD5- (B1b). Sie treten sehr früh in der Ontogenese auf, scheinen langlebig und refraktär auf B Zellrezeptor Stimulierung zu sein (66-68). Die Aktivierung dieser B Zelle erfolgt ohne T Zellhilfe durch T zellunabhängige Antigene vom Typ 2 (z.b. repetitive Zuckerstrukturen). Dabei werden weder das Auftreten von somatischer Hypermutation noch die Differenzierung zu Gedächtnis B Zellen beobachtet. Die Charakterisierung der B1 B Zellen basiert vor allem auf Experimenten mit Mausmodellen. Das Immunglobulinrepertoire der B1 B Zellen zeigt Tendenzen zur Bindung von Autoantigenen und häufigen Bakterienbestandteilen (69, 70). Das natürliche IgM des Serums, welches unabhängig von Antigenkontakt gebildet wird, wird hauptsächlich von B1 B Zellen produziert (71-73). Unter diesen Immunglobulinen finden sich unter anderem Spezifitäten gegen Phosphorylcholin, Phosphatidylcholin, Lipopolysaccharide, Influenzavirus oder Streptococcus pneumoniae (72). Zusammen mit den Marginalzonen B Zellen scheinen B1 B Zellen an einer schnellen, aber eher unspezifischen humoralen Erstantwort gegen Erreger beteiligt zu sein und könnten damit die zellulären Träger des humoralen natürlichen/angeborenen Gedächtnisses darstellen (72, 74). An Hand von Transferexperimenten fetaler Leberzellen in bestrahlte und deshalb immuninkompetente Mäuse konnte die Rekonstitution der B Zellen durch das Auftreten von B1 und B2 B Zellen demonstriert werden. Aus transferierten Knochenmarkszellen adulter Mäuse entwickelten sich in diesem 16

24 System allein B2 B Zellen (75). Es wurde deshalb vermutet dass sich B1 B Zellen als eigenständige B Zelllinie während der Fetalzeit aus einer Vorläuferzelle differenzieren. Die Erneuerung der peripheren B Zellpopulation soll durch Zellteilung erfolgen (76). Mit der Beobachtung, dass B2 B Zellen nach B Zellrezeptorstimulation ohne T Zellhilfe einen B1 Phänotyp annehmen, wurde eine weitere Hypothese zur deren Entstehung aufgeworfen ( Modell der induzierten Differenzierung ). Demnach entstehen B1 B Zellen nach Kontakt mit Autoantigenen oder Thymus-unabhängigen-Antigenen (TI-2) aus einer undifferenzierten Vorstufe (B0) (77-79). Möglichwerweise bestimmt die BZR- Spezifität der unreifen B Zelle die weitere Differenzierung in B1, B2 oder Marginalzonen B Zelle und damit die Zuordnung in verschiedene Kompartimente des Körpers. Somit wäre die Funktion der B Zelle entsprechend ihrer Antigen-Spezifität auf das Auftreten typischer Antigene dieser Umgebung abgestimmt (80). Möglicherweise stellt die Induktion des B1 B Zellphänotyps einen Mechanismus zur Toleranzinduktion dar (81). Das CD5 Molekül ist an der negativen Regulation der B Zellrezeptor-Signaltransduktion beteiligt und könnte so die Aktivierungsschwelle autoreaktiver B Zellen heraufsetzen (67, 82, 83). Aufgrund der Produktion von niedrig-affinen autoreaktiven Antikörpern durch B1 B Zellen erschien diese B Zellpopulation als eine mögliche Quelle der Autoantikörperproduktion bei Autoimmunerkrankungen. Eine gestörte Induktion des B1 B Zell Phänotyps autoreaktiver Zellen oder eine gestörte negative Regulation der Aktivierung von B1 Zellen könnte dafür verantwortlich sein. Möglicherweise könnten B1 B Zellen auch an einer Keimzentrumsreaktion beteiligt sein, wobei durch Immunglobulinklassenwechsel, Somatische Hypermutation und/oder Rezeptor Revision ein pathologischer, hoch-affiner Autoantikörper der Isotypenklasse IgG entstehen könnte (72, 84, 85). Eine erhöhte Häufigkeit CD5+ B1 B Zellen konnte bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen gefunden werden (86-88). Die CD5+ B Zellpopulation des Menschen ist weniger gut charakterisiert. Es ist bislang nicht eindeutig geklärt, ob die CD5+ B Zellpopulation des Menschen ein Äquivalent der B1 B Zellpopulation der Maus darstellt. 17

25 1.5.3 B Zellen des peripheren Blutes Die B Zellen des peripheren Blutes stellen eine heterogene Population dar. Das Blut ist weniger als eigenständiges immunologisches Organ als vielmehr Im Sinne eines Verbindungsweges zwischen primär und sekundären lymphatischen Organen sowie Entzündungorten anzusehen. Allein die Tatsache, dass beim Menschen das Blut oftmals die einzig zugängige Probe zur Untersuchung von Immunfunktionen ist, bedingt die häufige Charakterisierung lymphatischer Zellen dieses Kompartimentes. B Zellen können durch die Expression des Markers CD27 in Gedächtnis (CD27+) und naive B Zellen (CD27-) unterteilt werden (89). Innerhalb der naiven B Zellen befinden sich die im Blut ansässigen transitionellen B Zellen, die als Übergangsstadium zwischen unreifer B Zelle des Knochenmarks und reifer B Zelle der Peripherie angesehen werden (90, 91). Bei der Gedächtnis B Zellpopulation können IgD- B Zellen (Immunglobulinklassenwechsel zu IgA, IgG oder IgE) von IgD+IgM+ Gedächtnis B Zellen unterschieden werden. Die Immunglobulingene der IgD+CD27+ B Zellpopulation weisen somatische Hypermutation auf, der Immunglobulinklassenwechsel erfolgte jedoch nicht (92). Möglicherweise handelt es sich bei dieser B Zellpopulation um rezirkulierende Marginalzonen B Zellen der Milz (93). B Zellen mit sehr hoher Expression von CD27 und CD38 konnten als frühe Plasmazellen (sogenannte Plasmablasten) identifiziert werden (94). Bei Gesunden sind nur sehr wenige dieser frühen Plasmazellen im Blut zu finden. Weiter können die B Zellen durch die Expression des Markers CD5 in B1B Zellen (CD5+) und B2 B Zellen (CD5-) unterschieden werden (95). Bei Gesunden scheint eine geregelte Homöostase der peripheren B Zellpopulationen vorzuliegen. Zahlreiche Autoimmunerkrankungen weisen ein gestörtes Muster der B Zellverteilung im Blut auf. 18

26 1.6 Rezeptor Editing Der ungerichtete molekulare Mechanismus der Generierung von Antikörpervielfalt hat gleichzeitig die Entstehung von autoreaktiven Immunglobulinen zur Folge. Bis zu 75% aller unreifen B Zellen des Knochenmarks exprimieren einen autoreaktiven Rezeptor. Der Anteil autoreaktiver B Zellen verringert sich mit deren Differenzierung zu reifen, peripheren B Zellen (96). An Hand transgener Mausmodelle mit autoreaktiven B Zellrezeptoren konnten klonale Deletion und Anergie als entscheidende Mechanismen zentraler B Zelltoleranz identifiziert werden (97). Ein weiterer Toleranzmechanismus konnte in diesen transgenen Systemen beobachtet werden: der Austausch eines autoreaktiven Rearrangements durch Rekombination weiter distal liegender Gensegmente (Rezeptor Editing). In den nicht deletierten B Zellen dieser Mäuse war zwar die schwere Kette des Transgens erhalten geblieben, jedoch zeigte sich, daß endogene, nichttransgene kappa oder lambda Gensegmente verwendet wurden. Eine starke Expression der Rekombination Aktivierenden Gene (RAG) sowie die Verwendung weiter distal gelegener V und J Gensegmente wies auf den Ersatz des Leichtketten Transgens durch weitere Rekombination am endogenen Leichtketten Lokus hin (98, 99). Auch bei in vitro Experimenten konnten gleiche Phänomene nach B Zellrezeptor Bindung beobachtet werden (100, 101). Rezeptor Editing scheint der dominierende Mechanismus der Aufrechterhaltung zentraler B Zelltoleranz zu sein (102). Man schätzt, dass bis zu 25% aller im Immunglobulinrepertoire vorhandenen Antikörper durch eine sekundäre V(D)J- Rekombination entstanden sind (103). Rezeptor Editing führt zu einem Austausch des Immunglobulins und kann die drohende Apoptose der autoreaktiven B Zelle verhindern. In einigen autoreaktiven B Zellen kann möglicherweise die Expression zweier verschiedener Immunglobuline nach Rezeptor Editing die Zelle vor Apoptose schützen (receptor dilution) (104). Sekundäre V(D)J-Rekombination wurde vor allem an den Leichtketten Loki beobachtet. In diesen Genloki wird die Rekombination der V und J Gensegmente je nach Transkriptionsrichtung der beiden Segmente durch 19

27 Exzision der dazwischenliegenden DNA oder durch Inversion dieses Abschnittes an einen anderen Ort durchgeführt. Weiter distal liegende V und J Gensegmente bleiben erhalten und können genauso wie der durch Inversion verlagerte Genabschnitt zur erneuten Rekombination herangezogen werden (105) (Abb 7). Deletion oder Inversion J1-V1 J2-V2 V3 Autoreaktiver Rezeptor Rezeptor Editing J2 RAG 1 2 J1-V1 2 RAG 1 V2 V3 Primäre VJ-Rekombination J2 J1 RAG RAG 1 V1 V2 V3 Abbildung 7: Sekundäre VJ-Rekombination (Rezeptor Editing) am Beispiel des Kappa Leichtkettenlokus Die primäre VJ-Rekombination führte zu einem Rearrangement (J1-V1), welches für einen autoreaktiven B Zellrezeptor kodierte. Im Rahmen einer sekundären VJ- Rekombination (Rezeptor Editing) wird das primäre VJ-Rearrangement durch Deletion oder Inversion entfernt und das dem J weiter distal liegende V Segment, und das dem V weiter distal liegende J Segment neu rekombiniert (J2-V2). Bei der V(D)J-Rekombination am Lokus der schweren Kette werden alle nicht rekombinierten D Gensegmente herausgeschnitten. Die übrigen V und J Gensegmente können nicht rekombiniert werden, da sie beide mit einer 23-RSS enden. Somit kann eine sekundäre V(D)J-Rekombination mit Benutzung klassicher RSS nicht durchgeführt werden. In der Maus konnte jedoch eine sekundäre D zu J Rekombination beobachtet werden. Zudem konnten Zeichen für den Ersatz eines rekombinierten V Gensegmentes durch ein weiteres gefunden werden (V H Replacement). Als Schnittstelle im rekombinierten VDJ 20

28 konnte dabei eine konservierte, RSS-ähnliche Sequenz der rearrangierten V Gensegmente identifiziert werden ( ). Rezeptor Editing vollzieht sich vor allem in den frühen Entwicklungsstufen unreifer B Zellen des Knochenmarks, wahrscheinlich vor dem Mechanismus klonaler Deletion (112, 113). Somit ermöglicht dieser Mechanismus durch potentielle Rezeptor Modifizierung und Rezeptor Selektion das Überleben der Zelle bevor klonale Deletionsmechanismen greifen. Inwieweit der Reifungsgrad der Zelle oder die Umgebungsbedingungen des Knochenmarks für die Sensibilisierung der Zelle gegenüber Rezeptor Editing und der zeitlichen Unterdrückung klonaler Deletion durch Apoptose verantwortlich sind, ist letztendlich nicht geklärt (114, 115). Rezeptor Editing scheint nicht nur an negativen sondern auch an positiven Selektionsmechanismen beteiligt zu sein (15). 1.7 Rezeptor Revision Es konnte gezeigt werden, dass reife B Zellen in vitro nach Aktivierung durch LPS + IL-4 oder anti-cd40 + IL-4 erneut RAG exprimieren (116). Dies führte zur Hypothese einer möglichen RAG Reexpression in aktivierten B Zellen im Rahmen einer Immunreaktion. In immunisierten Mäusen konnte in B Zellen des Keimzentrums RAG mrna und RAG Protein Expression nachgewiesen werden. Die RAG+ Zellen wurden dem Differenzierungsstadium der Zentrozyten zugeordnet ( ). Das Phänomen einer sekundären V(D)J- Rekombination in reifen B Zellen außerhalb des Knochenmarks wurde als Rezeptor Revision bezeichnet (119). Auch in Keimzentren menschlicher Tonsillen konnte eine RAG Expression beobachtet werden. Die Expression war in Zentrozyten am stärksten und konnte nicht in den sich teilenden Zentroblasten gefunden werden (100, 120, 121). Die RAG Expression in reifen B Zellen des Menschen wurde vor allem in der Gedächtnis B Zellpopulation mit der Expression von CD5 assoziiert (122). In einer immunhistochemischen Untersuchung menschlicher Tonsillen konnten RAG+ TdT+ B Zellen identifiziert werden, die aber vor allem in extrafollikulären Gebieten und nicht im Keimzentrum lokalisiert waren (123). 21

29 Es stellte sich die Frage, ob es sich bei der Rezeptor Revision ähnlich dem Rezeptor Editing um eine Toleranzmechanismus handelt (117). Nach Induktion der RAG Expression in den reifen B Zellen in vitro führte die Quervernetzung des B Zellrezeptors oder die Bindung hochaffiner Liganden zur Beendigung der Expression (100, 101, 124). Somit stellt die Rezeptor Revision im Gegensatz zum Rezeptor Editing eher einen Mechanismus dar, der zur Diversifizierung des Repertoires führt. Rezeptor Revision könnte es B Zellen mit niedrig affinem Rezeptor (zum Beispiel nach Somatischer Hypermutation) ermöglichen, durch sekundäre V(D)J-Rekombination die Antikörperspezifität zu verändern, um so wieder einen Selektionsvorteil in der Keimzentrumsreaktion zu erhalten (positive Selektion) (125). Die RAG+ B Zellen des Keimzentrums der Maus zeigten Expressionsmarker unreifer B Zellen des Knochenmarks (117). Möglicherweise handelt es sich bei dem Phänomen der Rezeptor Revision weniger um eine Reinduktion der RAG Expression in reifen B Zellen als vielmehr um eine Akkumulation unreifer B Zellen mit anhaltender RAG Expression. Experimente unter Verwendung eines Mausmodells, in dem die Expression von RAG1 oder RAG2 zugleich auch zur Expression eines grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) führte, unterstützten diese Annahme ( ). In diesen Modellen wurden die RAG+ B Zellen des Keimzentrums den unreifen B Zellen, nicht aber den Zentrozyten des Keimzentrums zugeordnet. Das Auftreten dieser unreifen RAG+ B Zellen in der Peripherie wurde durch eine veränderte Lymphopoese während Immunisierung oder Infektion gedeutet (128). Die in vitro Experimente zur Induktion der RAG Expression zeigten mit dieser Methode keine detektierbare RAG Expression (128, 130). Andere Untersuchungen in Mausmodellen und menschlichen B Zellen erbrachten konträre Ergebnisse, da hier eine Rezeptor Revision in somatisch hypermutierten B Zellen beobachtet wurde (107, 131, 132). 22

30 1.8 Systemischer Lupus Erythematodes Der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) ist eine systemische Autoimmunerkrankung, die der Gruppe der Kollagenosen zugeordnet wird. Bei Patienten mit SLE und in Lupus Mausmodellen konnten zahlreiche gestörte Mechanismen im Immunsystem identifiziert werden. Neben den Dendritischen Zellen und den T Zellen, scheint bei der zellulären Immunpathologie den B Zellen eine besondere Rolle zuzukommen ( ). Nahezu pathognomonisch ist der Nachweis von Autoantikörpern im Serum, die gegen doppelsträngige DNA Moleküle (dsdna) gerichtet sind. Eine große Anzahl weiterer Autoantikörper kann beim SLE beobachtet werden. Diese Autoantikörper scheinen direkt oder als Immunkomplexe an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Entzündungen beteiligt zu sein (136). Möglicherweise entwickeln sich B Zellen mit niedrig-affinen, autoreaktiven oder nicht autoreaktiven Immunglobulinen während der Affinitätsreifung im Keimzentrum zu B Zellen mit hoch-affinen autoreaktiven Immunglobulinen im Rahmen pathologischer Immunmechanismen beim SLE (137). Zusätzlich scheinen zahlreiche Toleranzmechanismen gestört zu sein ( ). 1.9 Juvenile Idiopathische Arthritis Verschiedene rheumatische Erkrankungen bei Kindern unter 16 Jahren, die mit einer länger als 6 Wochen bestehenden Arthritis einhergehen, werden unter dem Sammelbegriff Juvenile Idiopathische Arthritis zusammengefasst (142). Die einzelnen Untergruppen unterscheiden sich sowohl in den Symptomen als auch in der Pathogenese. Die häufigste Form der Juvenilen Idiopathischen Arthritis stellt die Gruppe der frühkindlichen Oligoarthritis dar (Early-onset Pauciarticular Arthritis, EOPA). Häufig erkranken Kinder unter 5 Jahren. Das weibliche Geschlecht überwiegt. Per Definition sind nicht mehr als vier Gelenke betroffen. Bei etwa 70% der betroffenen Kinder fällt ein positiver Titer der antinukleären Antikörper auf (ANA). Es bsteht ein Risiko von 15-35% für das Auftreten einer Iridozyklitis. Über die Rolle der B Zellen in der Pathogenese der frühkindlichen Oligoarthritis ist wenig bekannt. Das Auftreten antinukleärer Antikörper weist jedoch auf eine Beteiligung der B Zellen hin. Die Rolle dieser 23

31 Autoantikörper in der Pathogenese der Erkrankung ist nicht abschließend geklärt (143, 144) Die Rolle von B Zellen in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen B Zellen können auf unterschiedliche Weise in die Pathogenese verschiedener Autoimmunerkrankungen eingreifen. Am längsten bekannt ist die Produktion von Autoantikörpern, die direkt oder als Immunkomplexe zur Gewebeschädigung beitragen können (136). B Zellen scheinen zudem effiziente antigenpräsentierende Eigenschaften zu besitzen. Durch Präsentation von Autoantigenen über MHC II Moleküle und Heraufregulierung kostimulatorischer Moleküle (CD80/B7.1, CD86/B7.2) kann eine T Zellaktivierung vermittelt werden ( ). Hierbei bilden die membranständigen, autoreaktiven Immunglobuline die Rezeptoren zur Aufnahme des Antigens (150). Weiterhin kann die Produktion proinflammatorischer Zytokine die lokale Entzündungsreaktion beeinflussen (151, 152). Die Chemokinproduktion der B Zellen scheint Einfluß auf die Infiltration von Leukozyten zu haben. Insbesondere die Produktion von Lymphotoxin beta ist an der Ausbildung von (ektopen) Keimzentren beteiligt (153). Die B Zellaktivierung erfolgt hauptsächlich über den B Zellrezeptor und zieht die beschriebenen Effektormechanismen nach sich. Der Kontrolle der Entstehung und Aktivierung autoreaktiver B Zellen kommt somit ein zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung von Toleranz zu (154). Neben der Signalgebung über den B Zellrezeptor scheint eine polyklonale B Zellaktivierung auch über Komplementrezeptoren, Toll like Rezeptoren und Rezeptoren für Zytokine zu erfolgen. Verschiedene Kostimuli, welche die BZR Aktivierungsschwelle herabsetzen, scheinen sehr bedeutend in der Verstärkung der antigenpräsentierenden Funktion der B Zelle zu sein (65, ). 24

32 1.11 Die Rolle von Rezeptor Editing und Rezeptor Revision in der Entstehung autoreaktiver Immunglobuline Rezeptor Editing und Rezeptor Revision führen zu einer Veränderung des Immunglobulinrepertoires durch sekundäre V(D)J-Rekombination. Dabei können ähnlich wie bei der erstmaligen Umlagerung der Gensegmente in den frühen unreifen B Zellen des Knochenmarks autoreaktive Immunglobuline entstehen. Trotz gleichem molekularen Mechanismus unterscheiden sich beide Vorgänge in den ihnen folgenden Selektionsvorgängen: Antigenbindung führt in unreifen B Zellen nach erfolgtem Rezeptor Editing zur weiteren V(D)J- Rekombination oder zur Apoptose (Toleranzmechanismus). In reifen B Zellen führt die Bindung von Antigen nach erfolgter Rezeptor Revision eher zum Überleben der Zelle und bietet somit einen Diversifizierungsmechanismus (100, 101). Unreguliertes oder aberrantes Rezeptor Editing/Revision könnte zur Entstehung autoreaktiver Immunglobuline beitragen. Während nach einem Defekt im Rezeptor Editing weitere periphere Toleranzmechanismen durchbrochen werden müssten, könnte eine gesteigerte und dysregulierte Rezeptor Revision in aktivierten, reifen B Zellen leichter zur Produktion autoreaktiver Immunglobuline führen (163). Die Signalstärke des B Zellrezeptors bestimmt das weitere Überleben, die Differenzierung und die Proliferation der B Zelle. Auch Rezeptor Editing und Rezeptor Revision werden durch die B Zellrezeptor Signaltransduktion beeinflusst. Eine gestörte Signaltransduktion dieses Rezeptors sowie veränderte modulierende Einflüsse könnten einen Einfluß auf das Ausmaß sekundärer V(D)J-Rekombination haben (15). In B Zellen von SLE Patienten mit Lupus Nephritis konnte ein Rearrangement mit den Kappa Segmenten A30-J2 gefunden werden, welches bei Gesunden kaum Verwendung fand. Dieses Rearrangement könnte in kationischen antidsdna spezifischen Antikörpern verwendet werden. Das Vorkommen dieses Rearrangements in B Zellen von SLE Patienten wurde durch ein defektes Rezeptor Editing erklärt (164, 165). 25

33 In transgenen Mausmodellen mit autoreaktiven Immunglobulinen wird der Toleranzbruch durch Rezeptor Editing verhindert (98, 99, 166). Wird dieses Transgen in Mäuse mit autoimmunem genetischen Hintergrund überführt, kommt es zur Produktion von Autoantikörpern. In einigen Mausmodellen lag der Autoantikörperproduktion jedoch nicht die Expression des Transgens zu Grunde. Hier war der Autoantikörper durch sekundäre V(D)J-Rekombination am endogenen Immunglobulinlokus entstanden (167, 168). Somit könnte eine unkontrollierte Rezeptor Revision zur Entstehung autoreaktiver Immunglobuline beitragen (132, 163). In B Zellen von SLE Patienten konnte die gehäufte Verwendung distaler V und J kappa Gensegmente beobachtet werden (169). Diese Anzeichen für vermehrte sekundäre V(D)J-Rekombination wurden durch den Nachweis der vermehrten RAG Expression in reifen, aktivierten B Zellen des peripheren Blutes dieser Patienten bekräftigt und wiesen auf eine aberrante Rezeptor Revision außerhalb sekundär lymphatischer Organe hin (170). Ähnliches konnte in Mausmodellen des SLE beobachtet werden ( ). Die erneute Expression von RAG in anti-dsdna produzierenden B Zellen eines SLE Mausmodells (NZBxNZW F1) wurde kürzlich als Mechanismus, der zur Toleranz führt, interpretiert (174). Auch in B Zellen des Synovialgewebes von Patienten mit Rheumatoider Arthritis wurden Anzeichen einer aktiven Rezeptor Revision beobachtet (175, 176). Im Blut dieser Patienten wurden gehäuft solche B Zellen gefunden, die nach sekundärer V(D)J-Rekombination ein Immunglobulin und einen pre B Zellrezeptor exprimieren (receptor dilution) ( ). Auch bei anderen Autoimmunerkrankungen und bei Lymphomen zeigten sich Hinweise für eine vermehrte sekundäre V(D)J-Rekombination in B Zellen ( ). 26

34 1.12 Fragestellungen Bei der Analyse der B Zellen des peripheren Blutes von erwachsenen SLE Patienten konnten an Hand der Analyse des Kappa Leichtkettenrepertoires und der Analyse der Expression von RAG1 und 2 Hinweise auf eine aktive Rezeptor Revision in diesen Zellen beobachtet werden. Diese sekundäre V(D)J- Rekombination wurde als ein möglicher Mechanismus der Entstehung eines autoreaktiven Immunglobulinrepertoires diskutiert. Es stellt sich die Frage, ob ein ähnliches Phänomen auch in den B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit SLE beobachtet werden kann. Zudem sollte analysiert werden, ob sich CD5+ und CD5- B Zellen hinischtlich ihres Potentiales zur Durchführung einer möglichen Rezeptor Revision unterscheiden. Während es sich beim SLE um eine systemische Autoimmunerkrankung handelt, ist das Organspektrum bei der Frühkindlichen Oligoarthritis, einer Untergruppe der Juvenilen Idiopathischen Arthritis, auf die Gelenke und das Auge beschränkt. Das häufig beobachtete Auftreten hoher Titer von Antinukleären Antkörpern weist auf eine mögliche Beteiligung der B Zellen in der Immunpathogenese dieser Erkrankung hin. Die B Zellen sind bei erkrankten Kindern bislang nur sehr wenig charakterisiert. Es stellt sich deshalb die Frage, ob wie bei vielen Autoimmunerkrankungen beobachtet - eine Verteilungsstörung der B Zellen des peripheren Blutes dieser Erkrankten beobachtet werden kann. Zudem sollte das Immunglobulinrepertoire dieser B Zellen am Beispiel der Kappa Leichtkette mit dem von gesunden Kindern verglichen werden. Hierbei sollte die Frage nach einer möglichen Selektion bestimmter Immunglobulin tragender B Zellen beantwortet werden. Zudem sollte diese Analyse Hinweise auf das mögliche Vorhandensein einer vermehrten sekundären V(D)J-Rekombination geben. Das Potential dieser B Zellen zur Durchführung einer Rezeptor Revision sollte durch die Analyse der RAG mrna Expression untersucht werden. 27

35 Abschließend stellte sich die Frage, ob sich die B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis von denen des Entzündungsortes hinsichtlich ihrer Differenzierung und ihres Aktivierungsstatus unterscheiden. 28

36 2 Material und Methoden 2.1 Herkunft der Proben Alle untersuchten Proben entstammen von Patienten der Universitäts- Kinderklinik Würzburg. Die Proben wurden im Rahmen diagnostischer oder therapeutischer Eingriffe gewonnen. Eine Einverständniserklärung der Patienten bzw. deren Sorgeberechtigten lag auf der Grundlage einer ethischen Prüfung durch die ständige Ethikkommission der Universität vor. 2.2 Isolierung mononukleärer Zellen Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sowie der Synovialflüssigkeit (Synovialflüssigkeit-MC) wurden mittels Zentrifugation in einem flüssigen Dichtegradienten isoliert. Dazu wurde eine Ficoll-Paque- Zuckerlösung (FicoLiteH, Linaris, Wertheim-Bettingen) mit einer Dichte von 1,077g/ml verwendet. Heparinisiertes Blut oder Synovialflüssigkeit von freiwilligen Spendern wurde in einer 1:2 Verdünnung mit 0,9% NaCl-Lösung verdünnt. 10 ml der Ficoll-Paque- Lösung wurde in 50 ml Falcon-Röhrchen gegeben. Darauf wurde vorsichtig die Blutzellen-Suspension überschichtet. Anschließend wurden die zwei Phasen bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 1500 x g (ohne Bremse) 25 min lang zentrifugiert. Durch die Zentrifugation sammelten sich die mononukleären Zellen als weißlich trüber Ring in einer Zone zwischen Ficoll- Paque und Plasma. Dieser Saum aus mononukleären Zellen wurde mit einer Pasteur Pipette vom Rand des Ringes her aufgenommen. Das aufgenommene Material wurde in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und erneut mit 0,9% NaCl- Lösung verdünnt. Um Ficoll-Paque-Lösung möglichst vollständig aus den gewonnen Zellen zu entfernen, wurde diese Lösung nochmals 10 min lang bei 5 C und 1500 x g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und verworfen. Die mit der Ficoll-Paque-Methode gewonnenen mononukleären Zellen wurden in einem bestimmten Volumen PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) + 1% BSA (Rinder Serumalbumin) resuspendiert. Anschließend wurde ein kleiner Teil der Zellsuspension mit Trypanblau angefärbt und in einer Neubauer- 29

37 Zählkammer unter einem Lichtmikroskop die Zellzahl sowie der Vitalitätsindex (Anteil lebender Zellen an allen gezählten Zellen) ermittelt. Die mononukleären Zellen standen nun zum einen für die durchflusszytometrische Analyse oder zur durchflusszytometrischen Sortierung zur Verfügung, zum anderen konnte direkt aus ihnen RNA isoliert werden. 2.3 Durchflusszytometrie Grundlagen Mit der Durchflusszytometrie können Zellen durch das Vorhandensein unterschiedlicher Oberflächenstrukturen/Eiweiße oder intrazellulärer Moleküle charakterisiert werden. Hierzu werden Zellen mit verschiedenen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern angefärbt. Die markierten Zellen werden im Durchflusszytometer von einem Laserstrahl erfasst, wodurch es zur Anregung der gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe und zur Emission von Licht einer bestimmten Wellenlänge kommt. Um jede Zelle einzeln zu analysieren, wird die Zellsuspension im Durchflusszytometer in einem laminaren Probenstrahl auseinandergezogen und die Zellen in einzelner Abfolge an einem (oder zwei) Lasern vorbeigeleitet. Trifft der Laserstrahl auf die Zellen des Probenstrahls, wird das Licht gestreut. Das von der Zelle in 180 Richtung gestreute Licht wird vom FSC-Detektor (Forward Scatter, Vorwärtsstreulicht), das in 90 Richtung gestreute Licht vom SSC-Detektor (Side Scatter, Seitwärtsstreulicht) aufgenommen. Durch das Vorwärtsstreulicht kann die Größe der Zelle, durch das Seitwärtsstreulicht die Granulierung der Zelle bestimmt werden. Trifft der Laserstrahl auf einen Antikörper-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff, wird ein Teil der Lichtenergie absorbiert und ein Licht einer spezifischen (höheren) Wellenlänge emittiert. Die von den verschiedenen Fluorochromen emittierten Lichtimpulse werden im Durchflusszytometer durch ein System hintereinandergeschalteter Spiegel und Filter gelenkt und treffen als einzelne Strahlen einer bestimmten (für den Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen) Wellenlänge auf vorher zugeordnete Detektoren. Am Detektor können die Signale verstärkt und der spezifische 30

38 Lichtimpuls in einen Spannungsimpuls ungewandelt werden, der dann in einem angeschlossenen Computer dargestellt und ausgewertet werden kann. Durch die Intensität der von den Fluorochromen ausgehenden, charakteristischen Lichtimpulse kann auf die Bindungshäufigkeit des fluoreszenzgekoppelten Antikörpers an der einzelnen Zelle und somit auf die relative Menge des spezifischen Antigens in oder auf der Zelle zurückgeschlossen werden Verwendete Durchflusszytometer und technische Einstellung Für die durchflusszytometrische Analyse verwendeten wir eine Multiparameter 6-Kanal Analyse (FSC, SSC, Fluoreszenzkanal FL 1-4). Eine Zelle konnte dabei gleichzeitig durch ihre Größe, Granulierung und durch das Bindungsverhalten vier verschiedener fluoreszenzgekoppelter Antikörper charakterisiert werden. Alle durchflusszytometrischen Daten wurden mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg) mit einer Kanalauflösung von 1024 für alle Messparameter erfasst. Das Streulichtsignal (FSC, SSC) wurde linear und das Fluoreszenzsignal (FL 1-4) logarithmisch verstärkt. Die optimale Spannung an den Detektoren wurde durch Färbung mit einzelnen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern und sogenannte Isotypenkontrollen ermittelt. Durch gegenseitige Kompensation der Detektoren wurde der überlappende Anteil eines Fluoreszenz-Emissionsspektrums in andere Detektoren gering gehalten, so dass klar unterscheidbare Signale ermittelt werden konnten. Die aufgenommenen Daten wurden mit einer Software (Cellquest Version 3.1, Becton Dickinson, Heidelberg) in Einparameter- (Histogramm) und Zweiparameterdarstellung (Dotplot) analysiert. Zur Zellsortierung (FACS, fluorescence activated cell sorting) wurde ein Durchflusszytometer mit Zellsortiereinrichtung verwendet (FACSVantage, Becton Dickinson, Heidelberg). In diesen Geräten wird der Probenstrahl zur Vibration angeregt und in einzelne Tröpfchen aufgebrochen. Tröpfchen, die eine Zelle mit vorher definierter Streulicht- und Fluoreszenzcharakteristik enthalten, werden in einem elektrostatischen Feld abgelenkt und in einem Gefäß aufgefangen. Die Zellen können in Populationsgröße gesammelt werden 31

39 oder mit einer angeschlossenen Einzelzellauswurfeinrichtung als individuelle Zellen sortiert werden Färbeprotokoll Durchflusszytometrie Für die Analyse der Genexpression in individuellen Zellen wurden die Zellen ex vivo direkt für die Sortierung verwendet. Für alle übrigen Fragestellungen wurden die Zellen zuvor aus dem Blut oder der Synovialflüssigkeit durch Ficoll Dichtezentrifugation vorsepariert und bis zum Analysezeitpunkt in einer Einfrierlösung (50% RPMI Medium, 30% Fetales Kälberserum (FCS), 20% DMSO) in flüssigen Stickstoff eingefroren. Für die Analyse wurden die eingefrorenen Zellen in 5 ml 4 C kaltem RPMI Medium aufgetaut und anschließend mit FACS-Puffer (PBS + 1% BSA, ph 7,4) gewaschen. Dazu wurden die aufgetauten Zellen für 2 min bei 1500 x g und 5 C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde dann in FACS-Puffer aufgenommen. Nach erneuter Zentrifugation für 2 min bei 1500 x g und 5 C wurden die Zellen erneut in FACS- Puffer mit 10% humaner IgG-Lösung (Flebogamma, 50 mg/ml, Grifols, Langen) resuspendiert. Das verwendete humane IgG diente zur Blockierung von Fc-Rezeptoren und damit zur Verhinderung unspezifischer Antikörperbindungen. Die Antikörper wurden dann in einem bestimmten Verdünnungsverhältnis hinzugegeben und in der Zellsuspension für 20 min bei 5 C in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß inkubiert (Tab 1a und 1b). Um ungebundene Antikörper zu entfernen wurden die Zellen erneut gewaschen. Nach diesem Waschvorgang wurden die Zellen in 500 µl FACS-Puffer aufgenommen und durch einen Filter in ein FACS-Röhrchen aus Polypropylen mit Rundboden überführt (Becton Dickinson). Um Adhärenz, Aggregation und Aktivierung der Zellen zu verhindern, wurden alle Arbeitsschritte auf Eis durchgeführt. 32

40 Bindungs- stelle Fluorochrom Klon Isotyp Verdün- nung Hersteller CD19 APC SJ25-C1 Maus IgG1, mk 1:50 Caltag CD19 TC SJ25-C1 Maus IgG1, mk 1:50 Caltag CD19 PE-Alexa Fluor SJ25-C1 Maus IgG1, mk 1:50 Caltag IgD Biotin IA6-2 Maus IgG1, mk 1:50 BD Biosciences IgD FITC --- Ziege, pk, F(ab) 2 1:50 Caltag CD27 FITC M-T271 Maus IgG1, mk 1 :50 BD Biosciences CD5 PE CD5-5D7 Maus IgG1, mk 1 :50 Caltag CD38 PE HIT2 Maus IgG1, mk 1 :50 Caltag CD80 PE MEM- Maus IgG1, mk 1 :50 Caltag 233 CD86 PE BU63 Maus IgG1, mk 1 :50 Caltag HLA-DR PE L243 Maus IgG2a, mk 1 :50 BD Biosciences CD20 PE B-Ly1 Maus IgG1, mk 1:50 DAKO Tabelle 1a: Liste der verwendeten Antikörper Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP), Tri-Color (= PE-Cyan5) (TC), Allophycocyanin (APC), monoklonal (mk), polyklonal (pk). 33

41 Isotyp Fluorochrom Herkunft Verdünnung Hersteller Maus IgG1 FITC Maus Myeloma 1 :50 Caltag Maus IgG1 PE Maus Myeloma 1 :50 Caltag Maus IgG1 TC Maus Myeloma 1 :50 Caltag Maus IgG1 PE-Alexa Fluor Maus Myeloma 1:50 Caltag Maus IgG1 APC Maus Myeloma 1 :50 Caltag Maus IgG1 Biotin MOPC-21 1:50 BD Biosciences Maus IgG2a PE G :50 BD Biosciences pk F(ab) 2 FITC + PE Ziege 1 :50 Caltag Tabelle 1b: Liste der verwendeten Isotypenkontrollen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP), Tri-Color (= PE-Cyan5) (TC), Allophycocyanin (APC), monoklonal (mk), polyklonal (pk). Einige der Antikörper waren anstatt mit einem Fluoreszenzfarbstoffes mit Biotin gekoppelt. Für die Kopplung dieser Antikörper mit einem Fluorochrom benutzten wir fluoreszenzgekoppeltes Streptavidin, welches mit hoher Affinität an Biotin bindet (Tab 1c). Fluorochrom Herkunft Verdünnung Hersteller Streptavidin PerCP :100 BD Biosciences Tabelle 1c: Charakteristika des verwendeten Straptavidins 34

42 2.4 Genexpressionsanalyse in individuellen Zellen Einzelzellsortierung und Zelllyse Die Zellen wurden wie in beschrieben mit einem Zellsortiergerät mit Einzelzellauswurf sortiert. Dabei wurde jeweils eine Zelle in ein Loch einer 96- Loch PCR-Platte abgelegt, in der sich 10 μl einer Lyselösung befanden (Tab 2). Substrat Volumen 10 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 4,85 5X First Strand Buffer 2 1 X Igepal CA % RNAsin RNAse Inhibitor 40U/ μl 0,25 1 U/μl Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,8 0,8 mm Oligo dt 1 μg/ μl 0,1 0,01 μg/ μl DTT 0,1M 1,0 10 mm Tabelle 2: Zusammensetzung der Lyselösung für die Einzelzellanalyse Es folgte die Lyse der Zellen sowie die Anlagerung des Oligo-Desoxythymidin (Oligo-dT) an den polya-schwanz der mrna. Dazu wurden die 96-Loch-Platten für 2 min bei 5 C und 780 x g zentrifugiert. Anschließend wurde die Zellsuspension bei 65 C für eine Minute und bei 20 C für zwei Minuten inkubiert Reverse Transkription Ausgehend vom Oligo-dT Primer kann durch das Enzym Reverse Transkriptase die mrna in cdna umgeschrieben werden. In jedes Loch der 96-Loch-Platte wurde 3 μl eines Mastermixes für die Reverse Transkription hinzugegeben (Tab 3). 35

43 Substrat Volumen 3 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 2 μl 5X First Strand Buffer 0,6 μl 1 X RNAsin RNAse Inhibitor 40U/ μl 0,05 μl 0,66 U/μl DTT 0,1M 0,3 μl 10 mm Superscript II RNAseH RT 0,05 μl 20 U/μl Tabelle 3: Zusammensetzung des Mastermix für die Reverse Transkription bei der Einzelzellanalyse Anschließend wurde der Reaktionsansatz mit 25 μl Mineralöl überschichtet, um ein Verdampfen des Reaktionsansatzes zu verhindern. Die Umschreibung der mrna in cdna wurde bei 42 C für 50 min und bei 65 C für 10 min durchgeführt RNA Verdau In einem letzten Reaktionsschritt ist die vorher als Matrize dienende mrna durch ein Enzym mit RNAse-Aktivität zerstört worden. Dazu wurde in jeden Reaktionsansatz 2 μl eines Mastermixes hinzugefügt (Tab 4). Substrat Volumen 2 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 1,384 μl 5X First Strand Buffer 0,4 μl 1 X DTT 0,1M 0,2 μl 10 mm Ribonuclease H 1000 U/μl 0,016 μl 8 U/μl Tabelle 4: Zusammensetzung des Mastermix für den RNA Verdau bei der Einzelzell Analyse Die 96-Loch-Platten wurden für 7min bei 780 x g und 5 C zentrifugiert. Der RNA Verdau wurde für 20 min bei 37 C und für 10 min bei 65 C durchgeführt. Die 96-Loch-Platten wurden während aller Inkubationsschritte durch Klebefolien 36

44 abgedichtet. Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die cdna Proben wurden bei 80 C gelagert Einzelzell PCR Mittels Einzelzell PCR lässt sich die Genexpression in individuellen Zellen untersuchen. Bei dem hier verwendeten Verfahren kann die Expression bis hin zu 10 verschiedener Gene in einer einzelnen Zelle analysiert und so ein Genexpressionsprofil erstellt werden. Mit dieser Methode lässt sich eine qualitative, nicht jedoch eine quantitative Aussage über die Genexpression einer einzelnen Zelle treffen. Durch die Untersuchung einer großen Anzahl von Zellen, kann die Häufgkeit der Zellen einer definierten Population bestimmt werden, die ein bestimmtes Genexpressionsprofil aufweisen. Die Einzelzell PCR wurde in einer Zweischritt PCR durchgeführt. Im ersten Schritt (externe PCR) diente die synthetisierte cdna als Matrize. Zum Nachweis der Expression der Gene beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, VpreB oder CD154 wurde jeweils 1,5 μl der cdna in jedes Loch einer neuen 96-Loch- Platte überführt. Anschließend wurden 25 μl eines Mastermixes hinzugefügt (Tab 5). Der Reaktionsansatz wurde mit 25 μl Mineralöl überschichtet und für 5 min bei 780 x g zentrifugiert. Die Inkubation erfolgte mit einem standardisierten Programm in einem Mastercycler. Beim anschließenden zweiten PCR Schritt (nested PCR) diente das zuvor amplifizierte PCR-Produkt als Matrize. Hierzu wurden 5 μl aus der vorherigen PCR Reaktion in jedes Loch einer neuen 96- Loch-Platte überführt und wiederum 25 μl eines Mastermixes hinzugefügt (Tab 5). Der Reaktionsansatz wurde mit 25 μl Mineralöl überschichtet. Es wurden Primer verwendet, die etwas weiter in die zu amplifizierende Sequenz eingerückt sind ( nested ). Bei der Transkription des Gens RAG2 kann dieses entweder an das Exon 1A ( RAG2A ) oder an das Exon 1B ( RAG2B ) gespleißt werden. Für die Analyse der Expression des Genes RAG 2 wurde deshalb im ersten Schritt ein forward Primer verwendet, der exonspezifisch die Transkripte des Exons 1A oder 1B erkennt. Im zweiten PCR Schritt wurden Primer verwendet, die Transkripte beider Exons erkennen (Tab 7). 37

45 Substrat Volumen 25 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 19,875 μl Thermophilic DNA Poly 10X Buffer 2,5 μl 1 X MgCl 2 25mM 1,5 μl 1,5 mm Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,5 μl 0,2 mm 5` Forward Primer 50 mm 0,25 μl 0,5 mm 3` Reverse Primer 50 mm 0,25 μl 0,5 mm Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A 5 U/μl 0,125 μl 0,025 U/μl Tabelle 5: Zusammensetzung des Mastermix für die externe und nested PCR zur Analyse der Expression der Gene beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, VpreB oder CD154 Initiale Denaturierung 95 C 4 min Zyklusbeginn Denaturierung 94 C 1 min Annealing 60 C 1 min Elongation 72 C 3 min Zyklusende Finale Elongation 72 C Tabelle 6: Ablauf der Reaktionsschritte der externen und nested PCR zur Analyse der Expression der Gene beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, VpreB oder CD154 Sowohl in der externen als auch in der nested PCR wurde eine Amplifikation mit 40 Zyklen durchgeführt. 38

46 Bezeichnung Primer ß-actin extern forward ß-actin extern reverse ß-actin nested forward ß-actin nested reverse RAG 1 extern forward RAG 1 extern reverse RAG 1 nested forward RAG 1 nested reverse RAG 2 exon 1A extern forward RAG 2 exon 1B extern forward RAG 2 extern reverse RAG 2 nested forward RAG 2 nested reverse VpreB extern forward VpreB extern reverse VpreB nested forward VpreB nested reverse CD154 extern forward CD154 extern reverse CD154 nested forward CD154 nested reverse Sequenz Primer 5`GTCCTCTCCCAAGTCCACACA 3` 5`CTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAA 3` 5`TGATAGCATTGCTTTCGTGTAA 3` 5`TACATCTCAAGTTGGGGGACA 3` 5`GAGCAAGGTACCTCAGCCAG 3` 5`AACAATGGCTGAGTTGGGAC 3` 5`TTCTGCCCCCAGATGAAATTC 3` 5`TGACCATCAGCCTTGTCCAG 3` 5`GCAGCCCCTCTGGCCTTC 3` 5`GCGGTCTCCAGACAAAAATC 3` 5`TTTCAGACTCCAAGCTGCCT 3` 5`TCTCTGCAGATGGTAACAGTCAG 3` 5`AGCGAAGAGGAGGGAGGTAG 3` 5`TGCACAGTTGTGGTCCTCAG 3` 5`TCTCCCTCTCCTCCTTCTCC 3` 5`AGTTGTGGTCCTCAGCCG 3` 5`GATGTCATGGTCGTTCCTCA 3` 5` CACCATGAGCAACAACTTGG 3` 5` CTTGGCTTGGATCAGTCACA 3` 5` CCCTGGAAAATGGGAAACAG 3` 5` ACAAACACCGAAGCACCTG 3` Tabelle 7: Sequenzen der verwendeten Primer für die Analyse der Expression der Gene beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, VpreB und CD154 Bei der Amplifikation des Vκ Jκ Rearrangements wurde ebenfalls eine Zweischritt PCR verwendet. Zur Analyse der Gensegmente der Vκ Familien Vκ 1 und 2 wurde zunächst eine externe PCR mit Primern, welche die Gensegmente beider Familien erkennen, durchgeführt. Gleiches galt für die Gensegmente der Familien Vκ 4 und 5 sowie der Familien Vκ 6 und 7. Das Amplifikat dieser PCR Reaktionen diente als Matrize im zweiten PCR Schritt, bei der jeweils Vκ familienspezifische Primer verwendet wurden. Für die Analyse der Gensegmente der Vκ Familie 3 wurden sowohl im ersten als auch 39

47 im zweiten PCR Schritt Vκ familienspezifische Primer verwendet. Als reverse Primer wurden in jedem Ansatz zwei Primer verwendet (Jκ2 und Jκ5), mit dem die Bindung an alle Jκ Gensegmente ermöglicht wurde. Im ersten PCR Schritt wurden 3 μl der cdna eingesetzt, im zweiten PCR Schritt 5 μl der ersten PCR Reaktion (Tab 8-13). Substrat Volumen 18,75 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 13,15 μl Thermophilic DNA Poly 10X Buffer 2,0 μl 1,1 X MgCl 2 25mM 2,8 μl 3,7 mm Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,4 μl 0,21 mm 5` Forward Primer Vκ 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ2 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ5 100 mm 0,1 μl 0,53 mm Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A 5 U/μl 0,1 μl 0,027 U/μl Tabelle 8: Zusammensetzung des Mastermix für die externe und nested PCR zur Analyse des Vκ Jκ Rearrangements (Vκ Familien 1 und 2) Substrat Volumen 18,75 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 13,95 μl Thermophilic DNA Poly 10X Buffer 2,0 μl 1,1 X MgCl 2 25mM 2,0 μl 2,7 mm Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,4 μl 0,21 mm 5` Forward Primer Vκ 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ2 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ5 100 mm 0,1 μl 0,53 mm Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A 5 U/μl 0,1 μl 0,027 U/ μl Tabelle 9: Zusammensetzung des Mastermix für die externe und nested PCR zur Analyse des Vκ Jκ Rearrangements (Vκ Familie 3) 40

48 Substrat Volumen 18,75 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 14,35 μl Thermophilic DNA Poly 10X Buffer 2,0 μl 1,1 X MgCl 2 25mM 1,6 μl 2,1 mm Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,4 μl 0,21 mm 5` Forward Primer Vκ 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ2 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ5 100 mm 0,1 μl 0,53 mm Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A 5 U/μl 0,1 μl 0,027 U/ μl Tabelle 10: Zusammensetzung des Mastermix für die externe und nested PCR zur Analyse des Vκ Jκ Rearrangements (Vκ Familien 4 und 5) Substrat Volumen 18,75 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 14,75 μl Thermophilic DNA Poly 10X Buffer 2,0 μl 1,1 X MgCl 25mM 1,2 μl 1,6 mm Deoxynukleotid Mix (dntps) 10mM 0,4 μl 0,21 mm 5` Forward Primer Vκ 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ2 100 mm 0,1 μl 0,53 mm 3` Reverse Primer Jκ5 100 mm 0,1 μl 0,53 mm Taq DNA Polymerase in Storage Buffer A 5 U/μl 0,1 μl 0,027 U/ μl Tabelle 11: Zusammensetzung des Mastermix für die externe und nested PCR zur Analyse des Vκ Jκ Rearrangements (Vκ Familien 6 und 7) Bei den PCR Reaktionen wurde bei allen Vκ Primern ein gleiches Programm für den ersten PCR Schritt und ein weiteres standardisiertes Programm für den zweiten PCR Schritt verwendet. In beiden Schritten wurde eine Amplifikation mit 41 Zyklen durchgeführt. 41

49 Zyklusbeginn Denaturierung 94 C 1 min Annealing 56 C (extern), 65 C (nested) 30 sek Elongation 72 C 1 min 30 sek Zyklusende Finaler Zyklus Denaturierung 94 C 1 min Annealing 56 C (extern), 65 C (nested) 30 sek Elongation 72 C 5 min Tabelle 12: Ablauf der Reaktionsschritte der externen und nested PCR zur Analyse des Vκ Jκ Rearrangements Bezeichnung Primer V kappa 1+2 extern V kappa 3 extern V kappa 4+5 extern V kappa 6+7 extern V kappa 1 nested V kappa 2 nested V kappa 3 nested V kappa 4 nested V kappa 5 nested V kappa 6 nested V kappa 7 nested J kappa 2 extern J kappa 5 extern J kappa 2 nested J kappa 5 nested Sequenz Primer 5` GCTCAGCTCCTGGGGCT 3` 5` GGAA(AG)CCCCAGC(AGT)CAGC 3` 5` CT(CG)TT(GC)CT(CT)TGGATCTCTG 3` 5` CT(GC)CTGCTCTGGG(CT)TCC 3` 5` CATCCAG(AT)TGACCCAGTCTCC 3` 5` TCCAGTGGGGATATTGTGATGAC 3` 5` GTCT(GT)TGTCTCCAGGGGAAAGAG 3` 5` GACATCGTGATGACCCAGTCTC 3` 5` GGGCAGAAACGACACTCACGCA 3` 5` TCCAGGGGTGAAATTGTG(AC)TGAC 3` 5` GCTGCAATGGGGACATTGTGCT 3` 5` ACGTTTGATCTCCAGCTTG 3` 5` CTTACGTTTAATCTCCAGTC 3` 5` CAGCTTGGTCCCCTGGCCAAA 3` 5` CCAGTCGTGTCCCTTGGCCG 3` Tabelle 13: Sequenzen der Primer zur Analyse des V kappa J kappa Rearrangements Die V kappa extern Primer hybridisieren an die leader sequence, die V kappa nested Primer hybridisieren an das 5`-Ende der framework region 1. Die in Klammern gesetzte Nukleotide stellen gemischte Basen an dieser Position dar. 42

50 2.4.5 Analyse der PCR Produkte Der Nachweis der Spezifität des PCR Produktes bei der Analyse der Expression der Gene beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, VpreB oder CD154 erfolgte durch Southern-Blot der PCR Produkte und anschließendem Nachweis mit markierten Oligonukleotid-Sonden. Die PCR Produkte der Amplifikation des Vκ Jκ Rearrangements wurden in einer Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und anschließend sequenziert Spezifischer Nachweis der PCR Produkte bei der Analyse der Genexpression von beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, CD154 oder VpreB Vakuum Dot-Blot (Southern Blot) Für den spezifischen Nachweis der PCR Produkte wurden diese mittels alkalischem Dot-Blot unter Vakuumapplikation auf eine positiv geladene Nylon- Membran (Zeta-Probe, BioRad, München) transferriert. Hierbei bindet die negativ geladene DNA über elektrostatische Wechselwirkungen an die positiv geladene Membran. Um die DNA-Doppelstränge der PCR Produkte vor dem Blot in einzelne Stränge zu denaturieren, wurde zu den sich in 96-Loch-Platten befindenden PCR-Produkten (17 μl) je 17 μl 1,2 M NaOH-Lösung und 30 mm EDTA-Lösung zugegeben. Die Nukleinsäurestränge wurden für 10 min bei 100 C hitzedenaturiert. Die Nylon-Membran wurde zunächst für 5 min in destilliertem Wasser befeuchtet. Anschließend wurde diese in ein Dot-Blot- Gerät (Bio-Dot Microfiltration Apparatus) eingespannt. In diesem Gerät können 96 Proben, in räumlich voneinander getrennten Kammern, punktförmig ( Dot Blot ) auf eine Membran gebracht werden. Die Probenkammern wurden mit je 0,5 ml destilliertem Wasser durchspült. Ein angelegtes Vakuum sog die Spüllösungen sowie den Mastermix der PCR Reaktion durch die Membran, die DNA-Moleküle blieben auf der Oberfläche der Membran haften. Anschließend wurde jede Kammer mit je 0,5 ml 0,4 M NaOH gespült. Die Membran wurde dem Gerät entnommen und für 5 min in zweifach konzentriertem SSC-Puffer gewaschen. In einem Vakuumofen wurde die Membran für 20 min bei 80 C getrocknet. Die Nukleinsäurestränge wurden durch UV-Bestrahlung in einem 43

51 UV-Cross-Linker kovalent an die Membran gebunden. Die Membranen sind bei 20 C gelagert worden Nachweis mit markierten Oligonukleotid-Sonden Zum spezifischen Nachweis der PCR Produkte wurden der Nukleotidstrang spezifischer Oligonukleotid-Sonden mit Digoxigenin-Desoxyuridintriphosphat (DIG-dUTP) erweitert. Nach einer Hybridisierung konnte das Digoxigenin mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Für die Herstellung und den Nachweis markierter Oligonukleotid-Sonden wurde das DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche Applied Science, Mannheim) verwendet Herstellung DIG-dUTP gekoppelter Oligonukleotid-Sonden Die Markierung der Oligonukleotid-Sonden am 3`-Ende mit DIG-dUTP erfolgte durch enzymatischen Anbau mittels Aktivität des Enzyms Terminale Transferase. Substrat Volumen 20 μl Ansatz Endkonzentration Molecular Grade Water 8 μl Oligonukleotid-Sonde 50 mmol 2 μl 5 mm Reaction Buffer 5X 4 μl 1 X CoCl 2 25mM 4 μl 5 mm DIG-dUTP 1mM 0,9 μl 0,045 mm datp solution 10mM 0,1 μl 0,05 mm Terminale Transferase 50U/μl 1 μl 2,5 U/μl Tabelle 14: Reaktionsansatz für die DIG-dUTP Markierung von Oligonukleotid- Sonden Die Reaktionsansätze wurden kurz gemischt und anschließend für 15 min bei 37 C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Ansatz auf Eis gestellt und die Reaktion mit 2 μl EDTA-Lösung (0,2 M; ph 8,0) gestoppt. Um die Effizienz der Markierungsreaktion bestimmen zu können, wurde zusätzlich zu der spezifischen Oligonukleotid-Sonde ein Kontroll-Oligonukleotid 44

52 markiert. Der Anteil markierter Kontroll-Oligonukleotide an allen in die Reaktion eingesetzten Kontroll-Oligonukleotiden wurde durch Vergleich mit einer vom Hersteller gelieferten DIG-markierten Kontroll-DNA, die als Standard diente, quantifiziert. Bei einer durchschnittlich ermittelten Markierungseffizienz von 60% lagen nach der Markierungsreaktion in jedem Reaktionsansatz ungefähr 60 pmol markiertes Oligonukleotid vor. Name ß-actin Oligonukleotid Sonde RAG1 Oligonukleotid Sonde RAG 2 Oligonukleotid Sonde VpreB Oligonukleotid Sonde CD154 Oligonukleotid-Sonde Sequenz 5`TTGAATGATGAGCCTTCGTG 3` 5`TCTCTGGAGCAATCTCCAGCA 3` 5`TTCCTGGATGTAAAGCAT 3` 5`CTTGGAACCACAATCCGC 3` 5`TTATGAGGAGTGGGCAGGCTCAG3` Tabelle 15: Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis der PCR Produkte im Southern Dot Blot Hybridisierung der Membranen mit DIG-dUTP markierten Oligonukleotid-Sonden In einer Hybridisierungsreaktion konnten die markierten Oligonukleotide spezifisch an die auf eine Nylon-Membran transferrierten PCR Produkte binden. Zur Blockierung unspezifischer Bindungen wurden die Membranen vor der Hybridisierung mit einer DNA- und proteinhaltigen Prähybridisierungslösung für ungefähr 6 Stunden bei 50 C in einer Hybridisierungsflasche unter ständiger Rotation inkubiert. Es wurden 20 ml Prähybridisierungslösung pro 100 cm 2 Membranfläche eingesetzt. 45

53 Substrat Volumen 1l Ansatz Endkonzentration Aqua bidest 565 ml SSC Puffer 20X 300ml 6 X SDS 20% 25 ml 6 % Geschertes Lachssperma 10 ml 1 % Tabelle 16: Zusammensetzung der Prähybridisierungslösung Für die Hybridisierung der Membranen mit dem spezifischen Oligonukleotid wurden 2 pmol des DIG-dUTP markierten Oligonukleotids pro ml Hybridisierungslösung eingesetzt. Als Hybridisierungslösung diente die schon verwendete Prähybridisierungslösung, zu der das markierte Oligonukleotid hinzugefügt wurde. Die Membranen wurden in Hybridisierungsflaschen unter ständiger Rotation für 12 Stunden bei 50 C inkubiert Nachweis der spezifisch gebundenen, DIG-dUTP markierten Oligonukleotid-Sonden Das Digoxigenin der spezifisch an die PCR-Produkte gebundenen, DIG-dUTP markierten Oligonukleotid-Sonden (und damit indirekt das PCR Produkt) wurde in einer anschließenden Immunolumineszenzreaktion mit einem Enzymgekoppelten DIG-spezifischen Antikörper nachgewiesen. Nach der Hybridisierung und dem Entfernen der Hybridisierungslösung wurden die Membranen zunächst für eine Minute mit 2X SSC Puffer bei Raumtemperatur und anschließend für 30 Minuten mit 0,5X SSC Puffer bei 50 C gewaschen. Ein letzter Waschschritt mit einem Waschpuffer (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl; 0,3% Tween 20; ph 7,5) wurde für eine Minute bei Raumtemperatur durchgeführt. Vor der Antikörperreaktion wurden unspezifische Bindungsstellen der Membran mit einer Blockierungslösung (1X blocking solution, Roche Applied Science, Mannheim; 0,1M Maleinsäure; 0,15 M NaCl; ph 7,5) blockiert. Es wurden 30 ml Blockierungslösung pro 100 cm 2 Membranoberfläche eingesetzt. Die Blockierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur für 30 min durchgeführt. 46

54 Anschließend wurde der DIG-spezifische, mit Alkalischer Phosphatase gekoppelte Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000 hinzugefügt. Die Inkubation wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. In einem anschließendem Waschschritt (2 mal 15 Minuten mit Waschpuffer, siehe oben) wurden die ungebundenen Antikörper entfernt. Für die Lumineszenzreaktion wurde das ph-milieu der Membran optimal für die an den Antikörper gekoppelte Alkalische Phosphatase eingestellt. Hierzu wurden die Membranen bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit einem Detektionspuffer (0,5 M Tris-HCL; 0,1 M NaCL; ph 9,5) inkubiert. Für die Lichtreaktion wurde Disodium 3-(4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3,2`-(5`chloro)tricyclo( ,7 )decan)-4-yl)phenol phosphate (CSPD) verwendet. CSPD wird durch die Alkalische Phosphatase dephosphoriliert und in ein metastabiles Substrat umgewandelt. Bei Zerfall dieses Substrates wird Licht emittiert, welches auf einem Röntgenfilm nachgewiesen werden kann. Für die Lichtreaktion sind die Membranen in eine Plastikfolie überführt worden. Zu jeder Membran wurde 1ml 0,25 M CSPD zugefügt. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde das CSPD aus der Plastikfolie ausgestrichen und die Folie luftdicht verschlossen. Die Membranen wurden dann für 30 Minuten auf einen Röntgenfilm (Lumi-Film, Roche Applied Science, Mannheim) gelegt. Nach der Entwicklung des Films war die Lichtemission an den Stellen der Membran, an denen spezifische PCR-Produkte vorhanden waren, als Punkt sichtbar. Die Filme wurden digitalisiert (Gel Documentation System, BioRad) und mit einer Software (Quantity One, BioRad) analysiert Analyse der PCR Produkte zur Untersuchung des Vκ Jκ Rearrangements Ziel der Analyse des Vκ Jκ Rearrangements war die Untersuchung der verwendeten Vκ und Jκ Gensegmente sowie der Vergleich der Sequenzen mit der bekannten Keimbahnsequenz der Gensegmente. Hierfür wurden die PCR Produkte aufgereinigt und sequenziert. 47

55 Aufreinigung der PCR Produkte Die PCR Produkte wurden in einem mit Ethidiumbromid (ETBR) gefärbten, 1,5% Agarose Gel (1,5% Agarose in 0,5% TBE-Puffer) von den übrigen Bestandteilen der PCR Reaktion getrennt. Mit diesem Verfahren können Nukleotidstränge nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Nukleinsäuren werden durch ETBR angefärbt und können unter UV-Licht als Banden sichtbar gemacht werden. Diese Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten. In weiteren Schritten wurden die PCR-Produkte aufgereinigt. Hierzu wurde der QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Die herausgeschnittenen Gelblöcke wurden in 300 μl eines Puffers (QG Puffer) für 10 min bei 50 C unter mehrmaligen Vortexen gelöst. Nach Zugabe von 100 μl Isopropanol (100%) wurde die Lösung auf eine Säule überführt (QIAquick spin column) und diese zentrifugiert. Unter den zugeführten Puffern binden die Nukleinsäurestränge an eine Silika-Gel Membran der Säule. Nach mehrmaligen Waschen der Membran mit QG- und PE-Puffer wurden die PCR Produkte mit 50 μl eines DNA-stabilisierenden Puffers (EB-Puffer; 10 mm Tris-Cl; ph 8,5) von der Membran gelöst und eluiert. Unter den Eigenschaften dieses Puffers (niedrige Salzkonzentration, basischer ph-wert) wird die Bindung der Nukleinsäurestränge an die Silika-Gel Membran gelöst. Die aufgereinigten PCR Produkte wurden in einer Vakuumzentrifuge bei 37 C eingetrocknet Sequenzierung der PCR Produkte Die Sequenzierung der PCR Produkte erfolgte nach der Didesoxymethode nach Sanger mittels Kapillarelektrophorese durch die Firma MWG Biotech (Ebersberg). Bei der Methode nach Sanger wird ein Primer zu dem zu sequenzierenden Nukleotidstrang hinzugegeben, der als Startpunkt einer DNA- Polymerase dient. Durch dieses Enzym wird wie bei der PCR-Reaktion ein vom Primer ausgehender Komplementärstrang gebildet. Durch Zugabe von Didesoxynukleotidtriphosphaten (ddntps) (ddatp, ddgtp, ddttp oder ddctp) kann ein Kettenabbruch induziert werden, wobei komplementäre Stränge verschiedener Länge entstehen, die mit dem jeweils hinzugefügten 48

56 ddntp enden und sich in ihrer Länge um ein Nukleotid unterscheiden (Sequenzleitern). Durch Zugabe verschiedentlich fluoreszenzmarkierter ddntps und kapillarelektrophoretischer Längenauftrennung der Sequenzierungsprodukte kann die Sequenz des PCR-Produktes zusammengesetzt werden Analyse der Sequenzen des Vκ Jκ Rearrangements Durch Vergleich der Vκ und Jκ Sequenzen mit Keimbahnsequenzen (V BASE Sequenzverzeichnis) wurde das jeweilige Vκ oder Jκ Gensegment identifiziert und die Länge der CDR 3 Region, die Anzahl von N- oder P-Nukleotiden sowie die Exonukleaseaktivität des Vκ Jκ Rearrangements untersucht. Hierzu wurde die Software Sequencher (Gene codes, Ann Arbor, MI, USA) verwendet. 2.5 Immunmagnetische Sortierung von Zellpopulationen mit der MACS- Technologie Mit der MACS-Technologie (Magnetic Cell Seperation) können Zellpopulationen mit hoher Reinheit und geringem Zellverlust aufgereinigt werden. Hierzu werden Zellen ähnlich wie bei der Durchflusszytometrie mit Antikörpern markiert. Diese Antikörper sind mit supramagnetischen Partikeln gekoppelt, die in einem Magnetfeld eine magnetische Eigenschaft entwickeln. Die Zellsuspension wird über eine mit Eisenkügelchen/Eisenwolle gefüllte Säule gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befindet. Die markierten Zellen verbleiben in dieser ferromagnetischen Matrix und werden von den unmarkierten Zellen getrennt. Wird das magnetische Feld aufgehoben, können die markierten Zellen aus der Säule eluiert werden. Zur Sortierung von B-Zellen in Populationsgröße wurden CD19-MicroBeads und MS-Säulen (Miltenyi-Biotech, Bergisch-Gladbach) verwendet. Bei den CD19- MicroBeads handelt es sich um anti-cd19-antikörper, die mit supramagnetischen Partikeln gekoppelt sind. Mittels Ficoll Dichtezentrifugation vorgereinigte mononukleäre Zellen wurden nach Herstellerangaben mit den CD19-MicroBeads inkubiert und anschließend über die Separierungssäule gegeben. Nach mehreren Waschschritten wurde die Säule aus dem Magnetfeld 49

57 entfernt und die CD19+ B Zellen eluiert. Eine durchflusszytometrische Analyse der Sortierreinheit ergab eine durchschnittliche Reinheit von > 90%. vor CD19 MACS nach CD19 MACS CD19 CD19 FL-2 FL-2 Abbildung 8: Beispielhafte Darstellung einer durchflusszytometrischen Analyse der Reinheit einer Isolierung CD19+ B Zellen mittels MACS Technologie PBMC eines Spenders wurden mit anti-cd19 MicroBeads und PE-Alexa Fluor gekoppeltem anti-cd19 Antikörper inkubiert. Anschließend erfolgte die Separierung CD19+ B Zellen mittels MACS-Technologie. Dargestellt sind die Zellpopulationen vor und nach Sortierung. 2.6 RNA Isolierung aus Zellpopulationen Aus Zellpopulationen (Mononukleäre Zellen oder CD19+ B Zellen) wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden) RNA aufgereinigt. Ähnlich dem Aufreinigen von PCR Produkten werden bei diesem Verfahren Säulen mit Silikat-Gel Membranen verwendet, auf der je nach Salzkonzentration und ph- Wert des Puffers die Nukleinsäure an die Membran adsorbiert oder von ihr gelöst wird. Die Zellen wurden zunächst mit β-mercaptoethanol und RLT-Puffer (Qiagen, Hilden) lysiert und das Lysat anschließend in einem QIAshredder (Qiagen, Hilden) homogenisiert. Das homogenisierte Zell-Lysat wurde dann auf die Membranen der Säulen überführt. Genomische DNA wurde in einem DNA- Verdau mit DNAse enzymatisch zerstört (RNAse free DNAse, Qiagen, Hilden, 50

58 20min bei Raumtemperatur). Nach mehreren Waschschritten wurde die RNA mit RNAse freiem Wasser von der Membran eluiert und bei 80 C gelagert. 2.7 Reverse Transkription der aus Zellpopulationen isolierten RNA Die Umschreibung der gesamten mrna einer Zellpopulation in cdna erfolgte mit dem iscript TM cdna Synthesis Kit (Bio Rad, Hercules, USA). Ausgangspunkt für die Umschreibung bildeten bei diesem Kit oligo(dt) Primer, die an den polya-schwanz der mrna binden, sowie random hexamers, welche an beliebiger Stelle der mrna binden. Als Enzym wurde die iscript reverse transcriptase verwendet. Die Primerbindung erfolgte für 5 min bei 25 C, anschließend folgte die Reverse Transkription für 30 min bei 42 C. 2.8 Quantitative Real-Time PCR Mit der PCR lassen sich Nukleinsäuresequenzen amplifizieren und so einer Analyse zugänglich machen. Durch Bestimmung der Endproduktmenge einer PCR (z.b. im Southern Blot) und Vergleich zu den Produktmengen anderer Reaktionsansätze kann auf die relative Ausgangsmenge der Nukleinsäure zurückgeschlossen werden. Bedingung für diese Analysemethode ist die gleichbleibende Effizienz der Reaktion in allen Zyklen. In jeder PCR nimmt jedoch die Effizienz der Reaktion zum Ende hin ab, die PCR läuft in die Plateauphase. Somit muß bei der herkömmlichen PCR, die auf der Mengenbestimmung der Endprodukte beruht, die Reaktion vor Erreichen der Plateauphase abgebrochen werden. Üblicherweise geschieht die Erkennung des optimalen Endpunktes durch Ansatz multipler Reaktionen mit ansteigender Zykluszahl. Diese aufwendigen Versuchsansätze werden bei der Methode der quantitativen Real Time PCR durch Echtzeitmessung der Produktmengen in den verschiedenen Zyklen umgangen. Hierbei wird nach jedem Zyklus die angefallene Produktmenge gemessen. Die für die Analyse der Produktmenge optimale Zykluszahl kann im Nachhinein ermittelt werden. Zur Analyse der RAG1 und RAG2 mrna Expression wurden die Gene Expression Assays der Firma ABI für RAG1 und RAG2 eingesetzt (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland). Als housekeeping gene wurde die 51

59 Expression des Genes beta-aktin mit dem ABI Human ACTB endogenous control Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) analysiert. Die Visualisierung der Produktmenge erfolgte bei diesem Verfahren mittels TaqMan-Sonden an einem 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland). Hierbei handelt es sich um Oligonukleotid-Sonden, die mit zwei verschiedenen Fluorochromen gekoppelt sind. Die beiden Fluorochrome binden jeweils am 5`- oder am 3`-Ende der Sonde. Bei Bindung der Sonde liegen die beiden Fluorochrome in räumlicher Nähe. Die Fluorochrome sind so gewählt, dass bei deren Anregung der Emmissionsimpuls des einen Fluorochroms (reporter) das andere Fluorochrom (quencher) anregt (FRET, fluorescence resonance energy transfer). Somit lässt sich bei räumlicher Nähe nur der Emmissionsimpuls des quencher messen. Bei Voranschreiten der Taq-Polymerase wird der reporter der Sonde durch die 5`- 3`-Nukleaseaktivität dieses Enzyms entfernt. Dieser gibt den Emmissionsimpuls nun nicht mehr an den quencher ab sondern setzt ihn als Licht einer charakteristischen Wellenlänge frei. Diese kann gemessen werden und korreliert mit der aktuellen Produktmenge. Da die Gene RAG1 und RAG2 in B Zellen des peripheren Blutes gewöhnlich gar nicht oder nur schwach exprimiert werden, erfolgte zur Analyse deren Expression mit Real Time PCR eine Voramplifikation mit einer konventionellen PCR. Die Primer waren bei dieser Voramplifikation so gewählt, dass das entstehende PCR Produkt durch die Primer der Gene Expression Assay Kits für RAG1 und RAG2 weiter amplifiziert werden konnte. Durch Analyse der Expression von RAG1 und RAG2 in B Zellen der Tonsille (Gewebe mit hoher RAG Expression), wurde eine optimale Zykluszahl der Voramplifikation bestimmt, bei der trotz zwei hintereinander geschalteter Amplifikationsschritte eine relative Aussage über die Ausgangsmenge des Amplifikats noch möglich war (RAG1: 14 Zyklen; RAG2: 16 Zyklen), und die sich sogar annähernd linear im Vergleich Ausgangsprodukt/Endprodukt verhielt. Die Expression der Gene RAG1 und RAG2 in den analysierten Proben wurde als ein Vielfaches der Expression in B Zellen der Tonsille angegeben. 52

60 Bezeichnung Primer RAG1 forward RAG1 reverse RAG2 forward RAG2 reverse Sequenz Primer 5` GCAAGGAGAGAGCAGAGAACAC 3` 5` AGGTCCGGCCAGGAAGTAG 3` 5` CAGCCTTCTGCTTGCCACAG 3` 5` CCAAGTCTTTCTCTGTGCAGCG 3` Tabelle 17 : Sequenzen der Primer für die Voramplifikation von RAG1 und RAG2 Initiale Denaturierung 95 C 4 min Zyklusbeginn Denaturierung 94 C 1 min Annealing 64,5 C 1 min Elongation 72 C 3 min Zyklusende Tabelle 18: Ablauf der Reaktionsschritte der PCR zur Voramplifikation von RAG1 und RAG2 2.9 Statistische Auswertungen Alle relativen Werte wurden, wenn nicht anders beschrieben, als Prozent +/- Standardfehler des Mittels (SEM) angegeben. Die Daten der Untersuchung zur Genexpression von beta-aktin, RAG1, RAG2A, RAG2B, CD154, VpreB sowie des Vκ Jκ Rearrangements in individuellen Zellen wurden mit dem chi-square Test analysiert. Für den Vergleich der durchflußzytometrischen Messungen von Zellpopulationen und deren Aktivierungsmarkern zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern wurde der Mann-Whitney Test verwendet. Für den Vergleich der durchflusszytometrischen Messungen zwischen den B Zellen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit wurde der Wilcoxon matched pairs test verwendet. Signifikanzwerte p<0,05 wurden als statistisch signifikant gewertet. Für die statistische Auswertung und zur Erstellung von Grafiken wurde die Software GraphPad Prism 4 verwendet. 53

61 2.10 Materialien und Geräte Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland SSC-Puffer Eppendorf, Hamburg, Deutschland (3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; ph 7,0) TBE-Puffer Selbstherstellung (0,45 M Trissäure; 0,1 M EDTA) Ethylendiamintetraacetessigsäure (EDTA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Borsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Tris Base Merck, Darmstadt, Deutschland Isotonische Kochsalzlösung Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland Maleinsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Igepal/CA-630 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Natriumhydroxid Plätzchen (NaOH) Merck, Darmstadt, Deutschland Dodecylsulfat (SDS) Serva Feinchemie, Heidelberg, Deutschland Molecular Grade Water Eppendorf, Hamburg, Deutschland Desoxynukleotidtriphosphate (dntps) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Taq Polymerase in Storage Buffer A Promega, Mannheim, Deutschland Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) Promega, Mannheim, Deutschland Sheared Salmon Sperm Eppendorf, Hamburg, Deutschland Deinhardt`s Solution Eppendorf, Hamburg, Deutschland RPMI Kulturmedium + L-Glutamine Gibco/invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Rinderserumalbumin (BSA) Boehringer, Ingelheim, Ingelheim, Deutschland Fetales Kälberserum (FCS) Gibco/invitrogen, Karlsruhe, Deutschland peqgold Universal Agarose Peqlab, Erlangen, Deutschland Ethidiumbromid (ETBR) Merck, Darmstadt, Deutschland Ethanol Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande Isopropranolol Apotheke Universitätsklinikum Würzburg, Würzburg, Deutschland Beta-Mercaptoethanol Serva Feinchemie, Heidelberg, Deutschland 54

62 Mineral Öl Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Dimethylsulfoxid (DMSO) Serva Feinchemie, Heidelberg, Deutschland 15ml und 50ml Falcon Röhrchen Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland 1,5ml Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg, Deutschland 96-Loch PCR-Platten Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland Hybridisierungsflaschen Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Hybridisierungsofen Shake`n`Stake ThermoHybaid, Dreieich, Deutschland UV-Crosslinker UV Stratalinker 1880 Sratagene, La Jolla, USA Vakuumofen Binder, Tuttlingen, Deutschland Centrifuge 5804R Eppendorf, Hamburg, Deutschland Centrifuge 5415R Eppendorf, Hamburg, Deutschland Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Deutschland Mastercycler PCR Maschine Eppendorf, Hamburg, Deutschland Mastercycler Gradient PCR Maschine Eppendorf, Hamburg, Deutschland Mastercycler Personal PCR Maschine Eppendorf, Hamburg, Deutschland 7500 Real Time PCR System Applied Biosytems, Darmstadt, Deutschland Lichtmikroskop Hund, Wetzlar, Deutschland 55

63 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Die B Zellpopulationen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis sind bislang nur sehr wenig charakterisiert. Es wurde deshalb eine Analyse der B Zellpopulationen des peripheren Blutes sowie der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis durchgeführt Durchflusszytometrische Analyse der B Zellen des peripheren Blutes In einer durchflusszytometrischen Analyse der B Zellpopulationen des peripheren Blutes ließ sich bei den Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis keine veränderte Verteilung der B Zellpopulationen im Vergleich zu gesunden Kindern beobachten. Die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) sowie des MHC-II Moleküls HLA-DR war auf den B Zellen der kranken Kinder gleich der auf den B Zellen gesunder Kinder. Mittels Durchflusszytometrie wurde die Verteilung verschiedener B Zellpopulationen im peripheren Blut von 23 Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis sowie von 15 gesunden, altersentsprechenden Kindern gemessen und mittels Mann-Whitney Test miteinander verglichen. Das Durchschnittsalter +/- SEM bei den Erkrankten betrug 6,9 +/- 0,9 Jahre (78% Mädchen), das bei den gesunden Kindern 8,2 +/- 1,4 Jahre (50% Mädchen). Das Durchschnittsalter der beiden Gruppen war signifikant nicht unterschiedlich (p=0,45, Mann-Whitney Test). Es wurde die relative Häufigkeit der IgD+ sowie der CD27+ B Zellen verglichen (Abb. 9). Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die Häufigkeit der naiven B Zellen (IgD+CD27-) war bei beiden untersuchten Gruppen annähernd gleich (Abb 9). Sowohl die Gedächtnis B Zellen, die einen Immunglobulinklassenwechsel vollzogen haben (IgD-CD27+), als auch die IgD+ Gedächtnis B Zellen 56

64 (IgD+CD27+) waren mit gleicher Häufigkeit bei Gesunden als auch bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis zu finden (Abb 9). Bei der durchgeführten Untersuchung konnte im Vergleich zu gesunden Kindern keine veränderte Häufigkeit der CD5+ B Zellen innerhalb der B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis festgestellt werden (Abb 9). 57

65 IgD+ CD27+ CD5+ p=0,16 p=0,4 p=0,37 Oligoarthritis Gesund Oligoarthritis Gesund Oligoarthritis Gesund IgD+CD27- IgD+CD27+ IgD-CD27+ p=0,08 p=1,0 p=0,27 Oligoarthritis Gesund Oligoarthritis Gesund Oligoarthritis Gesund Abbildung 9: Verteilung verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Mittels Durchflusszytometrie wurde die relative Verteilung (Prozent) verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=23) mit der von gesunden Kindern (n=15) verglichen (Mann-Whitney Test). Es ist der Anteil der verschiedenen Populationen an der Gesamtpopulation CD19+ B Zellen dargestellt (Prozent). 58

66 CD27 CD5 CD27 Oligoarthritis Gesund IgD IgD CD5 Abbildung 10: Beispielhafte Darstellung der durchflusszytometrischen Analyse von B Zellpopulationen des peripheren Blutes Die Expression verschiedener Marker auf CD19+ B Zellen des peripheren Blutes eines Kindes mit frühkindlicher Oligoarthritis und eines gesunden Kindes ist beispielhaft dargestellt. Das Fadenkreuz wurde an Hand von Isotypenkontrollen ausgerichtet. 59

67 Wir untersuchten zudem mittels Durchflusszytometrie die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) sowie des MHC II Moleküls HLA-DR auf der Oberfläche naiver (CD19+CD27-) und Gedächtnis B Zellen (CD19+CD27+) des peripheren Blutes von 11 Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und 7 gesunden Kindern (Tab 19 und 20, Abb 11-13). Sowohl bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis als auch bei gesunden Kindern wurden CD80 und CD86 nur auf wenigen B Zellen exprimiert. Anteil CD80+ Zellen (%) in Frühkindliche Oligoarthritis Gesunde Kinder CD 19+ B Zellen 10,0 (+/- 1,3) 11,1 (+/- 1,4) CD19+CD27- B Zellen 3,3 (+/- 0,6) 3,0 (+/- 0,6) CD19+CD27+ B Zellen 33,9 (+/- 3,5) 36,4 (+/- 4,1) Tabelle 19: Relative Häufigkeit CD80 (B7.1) exprimierender B Zellen Mittels Durchflusszytometrie wurde der Anteil CD80+ B Zellen innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=11) und gesunden Kindern (n=7) ermittelt und miteinander verglichen (Mann- Whitney Test). Die Werte sind als % +/- SEM dargestellt. Anteil CD86+ Zellen (%) in Frühkindliche Oligoarthritis Gesunde Kinder CD 19+ B Zellen 6,8 (+/- 1,0) * 3,3 (+/- 0,5) CD19+CD27- B Zellen 2,8 (+/- 0,6) 1,3 (+/- 0,3) CD19+CD27+ B Zellen 16,1 (+/- 3,5) * 9,8 (+/- 1,9) Tabelle 20: Relative Häufigkeit CD86 (B7.2) exprimierender B Zellen Mittels Durchflusszytometrie wurde der Anteil CD86+ B Zellen innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=11) und gesunden Kindern (n=7) ermittelt und miteinander verglichen (Mann- Whitney Test; *, p=0,02). Die Werte sind als % +/- SEM dargestellt. Es konnte kein Unterschied hinsichtlich der Häufigkeit CD80+ B Zellen zwischen den untersuchten Gruppen festgestellt werden (Mann-Whitney Test). Bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis war die Häufigkeit CD86+ B Zellen 60

68 in der gesamten B Zellpopulation und in der CD27+ Gedächtnis B Zellpopulation im Vergleich zu gesunden Kindern erhöht. Sowohl bei den Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis als auch bei gesunden Kindern waren CD80 und CD86 hauptsächlich auf der Oberfläche von Gedächtnis B Zellen, nicht aber auf naiven B Zellen zu finden (p<0,001 für CD80 und p<0,01 für CD86; Mann-Whitney Test) (Tab 19 und 2, Abb 11 und 12). 40 Expression von CD80 (B7.1) Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität Oligoarthritis Gesund 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 11: Expressionsstärke von CD80 (B7.1) innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Die Expressionsstärke von CD80 wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes gemessen. Die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=11) wurde mit der von gesunden Kindern (n=7) verglichen. Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Maximal- und Minimalwert als Balken. 61

69 40 Expression von CD86 (B7.2) Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität * Oligoarthritis Gesund 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 12: Expressionsstärke von CD86 (B7.2) innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Die Expressionsstärke von CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes gemessen. Verglichen wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=11) mit der von gesunden Kindern (n=7). Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Maximal- und Minimalwert als Balken (*, p=0,03; Mann-Whitney Test). Bei allen untersuchten B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis unterschied sich die Expressionsstärke der Marker CD80 (gemessen als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) nicht von der gesunder Kinder. Die Expressionsstärke von CD86 war bei den B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis im Vergleich zu gesunden Kindern erhöht. 62

70 Nahezu alle B Zellen exprimierten das MHC II Molekül HLA-DR (>99,5 %). Bei beiden Gruppen zeigte die Expressionsstärke von HLA-DR zwischen den verschiedenen B Zellpopulationen (CD19+ CD27- bzw CD27+) keine Unterschiede. Die Expressionsstärke war bei den B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis gleich stark wie bei den B Zellen von gesunden Kindern (Abb. 13). Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität Expression von HLA-DR (MHC II) Oligoarthritis Gesund 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 13: Expressionsstärke von HLA-DR innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Die Expressionsstärke von HLA-DR wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes gemessen. Verglichen wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=11) mit der von gesunden Kindern (n=7). Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Maximal- und Minimalwert als Balken. 63

71 3.1.2 Molekulare Analyse der B Zellen des peripheren Blutes Untersuchung des Vκ Jκ Rearrangements Es erfolgte mittels Einzelzell-PCR eine Analyse des V kappa J kappa Rearrangements individueller B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern. In den B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis fanden die V kappa Gensegmente der distalen Kassette signifikant häufiger Verwendung als in den B Zellen gesunder Kinder. Die proximalen V kappa Gensegmente fanden in den B Zellen der gesunden Kinder häufiger Verwendung. In den B Zellen der erkrankten Kinder zeigte sich im Vergleich zu Gesunden eine Dominanz des J kappa Gensegmentes 2. Eine vermehrte Verwendung von N-Nukleotiden sowie häufigere Zeichen von 3` Exonukleaseaktivität konnten in den B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis beobachtet werden. Mittels durchflusszytometrischer Einzelzellsortierung, Einzelzell PCR und anschließender Sequenzierung der PCR Produkte wurde das Vκ Jκ Rearrangement in individuellen CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3) und gesunden Kindern (n=2) untersucht. Hierbei wurden nur solche Rearrangements analysiert, bei denen die Rekombination der Gensegmente zu keiner Verschiebung des Leserasters geführt hat (produktives Rearrangement). Insgesamt konnten 77 produktive Sequenzen aus B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und 46 produktive Sequenzen aus B Zellen von gesunden Kindern isoliert werden. 64

72 Alter (Jahre) Geschlecht Krankheitsaktivität EOPA 1 4,5 weiblich ja 1:320 NSAID MTX Steroide ANA Therapie Anzahl der analysierten Sequnenzen EOPA 2 10 männlich ja <1.80 NSAID 31 EOPA 3 16 weiblich ja 1: Gesund 1 14 männlich nein Gesund 2 11 weiblich nein Tabelle 21: Charakterisierung der untersuchten Patienten und gesunden Kinder für die Analyse des Kappa Leichtketten Repertoires EOPA (Early onset pauciarticular arthritis/frühkindliche Oligoarthritis); ANA (Antinukleäre Antikörper); NSAID (Non-steroidal antiinflammatory drugs); MTX (Methotrexat) Vκ Familien Sowohl bei den B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis als auch bei denen von gesunden Kindern wurden am häufigsten Gensegmente der Vκ Familien 1 und 3 verwendet. Es konnten bei der durchgeführten Untersuchung keine Gensegmente der Vκ Familien 6 und 7 gefunden werden. Die relative Häufigkeit einzelner Vκ Familien in den CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes zeigte keine Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Gruppen (chi-square Test) (Abb 14). 65

73 in % aller produktiven Rearrangements Oligoarthritis Gesund V kappa 1 V kappa 2 V kappa 3 V kappa 4 V kappa 5 V kappa 6 V kappa 7 Abbildung 14: Verteilung der Vκ Familien in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Die relative Häufigkeit der Verwendung von Gensegmenten der Vκ Familien 1-7 innerhalb von CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes wurde zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen) verglichen (chi-square Test) Vκ Gensegmente In den CD19+IgD+ B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis wurden die Gensegmente O12/O2 (16,9%), A27 (13%), A19/A3, L2, L6 (jeweils 10,4%) und L12a (9,1%) am häufigsten gefunden. Die vorherrschenden Gensegmente der gleichen B Zellpopulation im Blut von gesunden Kindern waren O12/O2 (19,6%), L12a (15,2%), L6 (13%) und O8/O18, A27 sowie B3 mit jeweils 10,9%. Eine unterschiedliche Häufigkeit einzelner Gensegmente konnte zwischen Gesunden und Kranken nicht gefunden werden (chi-square Test) (Abb 15). Die vermehrte Verwendung Jκ distaler Vκ Gensegmente kann ein Hinweis auf eine häufiger abgelaufene, sekundäre V(D)J-Rekombination darstellen. Es wurde deshalb die Häufigkeit der Verwendung von Gensegmentgruppen mit unterschiedlicher Position im Kappa Lokus analysiert. In den B Zellen von gesunden Kindern konnte die Gruppe der Jκ proximalen Vκ Gensegmente B2, 66

74 B3, L12a, L11, L10 und L9 signifikant häufiger als in den B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis gefunden werden (32.7% versus 14,3%, p=0,01, chi-square Test). Umgekehrt wurden die Gensegmente distal dieser Region in B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis signifikant häufiger verwendet. In 9,1% der B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis konnten Gensegmente gefunden werden, die eindeutig der Jκ distalen Vκ Kassette zugeordnet werden können. Diese Gensegmente fanden sich nicht in den B Zellen von gesunden Kindern (p=0,03; chi-square Test) (Abb 15). 67

75 Gesund > Oligoarthritis p=0.01 Oligoarthritis > Gesund p= % Oligoarthritis > Gesund p= % Oligoarthritis Gesund 10% 5% 0% J kappa proximale Kassette J kappa distale Kassette Abbildung 15: Verteilung der V kappa Gensegmente in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Verglichen wurde die relative Häufigkeit der Verwendung von V kappa Gensegmenten in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen) (chi-sqaure Test). % aller produktiven Rearrangements B3 B2 B1 L13 L12 L11 L10 L9 L8 L6 L5/L19a L2 L1 A30 A27 A26/A10 A23 A20 A19/A3 A18 A17 O18/O8 O14/O4 O12/O2 O11/O1 A1 A2 A4 A5 A7 A10 A11 A13 L14 L15 L16 L18 L19 L20 L22 L23 L24 L25 68

76 Jκ Gensegmente In den untersuchten B Zellen der gesunden Kinder konnten alle 5 Jκ Gensegmente mit annähernd gleicher Häufigkeit gefunden werden. In den untersuchten B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis fanden sich vor allem die Gensegmente Jκ1 und Jκ2 (81,8% aller untersuchten B Zellen). Die Verwendung von Jκ3 wurde nicht beobachtet. Ein Vergleich der Verwendung der einzelnen Gensegmente Jκ2, Jκ3 und Jκ5 in B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis mit der gesunder Kinder erbrachte einen signifikanten Unterschied. Kein signifikanter Unterschied konnte für die Verwendung der einzelnen Gensegmente Jκ1 oder Jκ4 gefunden werden (Abb 16). p=0,0004 (J kappa 1 und 2) p=0,0004 (J kappa 3, 4 und 5) in % aller produktiven Rearrangements p=0,15 p=0,004 p=0,003 p=0,26 p=0,05 Oligoarthritis Gesund JK1 JK2 JK3 JK4 JK5 Abbildung 16: Verteilung der Jκ Gensegmente in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen) wurde die relative Häufigkeit der Verwendung von J kappa Gensegmenten in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes verglichen (chisquare Test). Zudem wurde die Häufigkeit der Verwendung der Gruppe der proximalen J kappa Segmente 1 und 2 und die der Gruppe der distalen Segmente J kappa 3, 4 und 5 zwischen Gesunden und Kranken verglichen. 69

77 Hinsichtlich der Verwendung von Jκ Gensegmenten mit einer bestimmten Lage innerhalb des Kappa Lokus konnte eine unterschiedliche Verwendung zwischen den B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und denen von gesunden Kindern festgestellt werden. In den B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis war die Gruppe der Vκ proximalen Jκ Gensegmente 1 und 2 im Vergleich zu den B Zellen gesunder Kinder überrepräsentiert, die Gruppe der Vκ distalen Jκ Segmente 3, 4 und 5 unterrepräsentiert (Abb 16) CDR 3 Länge der Vκ Jκ Verbindung Die durchschnittliche Länge der CDR 3 Region der untersuchten B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis betrug 27,2+/-0,33 Nukleotide, die der untersuchten B Zellen von gesunden Kindern 27,9+/-0,37 Nukleotide. Es konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der durchschnittlichen Länge (p=0,24, Mann-Whitney Test) oder der Häufigkeit der Verwendung bestimmter CDR 3 Längen (chi-square Test) gefunden werden. CDR 3 Länge in % aller produktiven Rearrangements Oligoarthritis Gesund Anzahl der Nukleotide Abbildung 17: CDR 3 Länge der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit der Verwendung bestimmter Längen der CDR 3 Region des Kappa Lokus in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). 70

78 Exonukleaseaktivität am 5` und 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung Während des Vκ Jκ Rearrangements kann es durch Exonukleaseaktivität an den Enden des eröffneten DNA Stranges zu Nukleotidverlusten kommen. Die Aktivität dieser Enzyme am Ende des 3` Endes des Vκ Gensegmentes wird als 5` Exonukleaseaktivität in Relation zur Vκ Jκ Verbindung bezeichnet (5` Ende der Vκ Jκ Verbindung), die am 5` Ende des Jκ Gensegmentes als 3` Exonukleaseaktivität (3` Ende der Vκ Jκ Verbindung). 79,2 % der B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und 73,9% der B Zellen von gesunden Kindern zeigten Anzeichen für 5` Exonukleaseaktivität. Bei beiden untersuchten Gruppen wurden am häufigsten 3 Nukleotide entfernt, gefolgt von 2 Nukleotiden bei Kindern mit Oligoarthritis und 1 Nukleotid bei gesunden Kindern. Es konnte bei den untersuchten Gruppen kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Entfernung einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden durch 5` Exonukleaseaktivität gefunden werden. Die durchschnittliche Anzahl entfernter Nukleotide durch 5` Exonukleaseaktivität betrug bei den untersuchten B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis 2,7+/-0,3 Nukleotide und bei den gesunden Kindern 2,3+/-0,3 Nukleotide (p=0,47, Mann-Whitney Test) (Abb 18). 71

79 50 Exonukleaseaktivität am 5` Ende der V kappa J kappa Verbindung in % aller produktiven Rearrangements Oligoarthritis Gesund > 9 Anzahl der entfernten Nukleotide Abbildung 18: Exonukleaseaktivität am 5` Ende der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit der Entfernung einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden am 5` Ende der Vκ Jκ Verbindung durch 5` Exonukleaseaktivität in B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). 72

80 50 * Exonukleaseaktivität am 3` Ende der V kappa J kappa Verbindung 40 Oligoarthritis in % aller produktiven Rearrangements * Gesund > 9 Anzahl der entfernten Nukleotide Abbildung 19: Exonukleaseaktivität am 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit der Entfernung einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden am 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung durch 3` Exonukleaseaktivität in B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). Signifikante Unterschiede in der Häufigkeit der Entfernung einer bestimmten Anzahl von Nukleotiden zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern sind mit * gekennzeichnet (p<0,05; chi-square Test). Bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis konnte in 76,6% der untersuchten B Zellen Anzeichen für 3` Exonukleaseaktivität gefunden werden, jedoch nur in 54,3% der untersuchten B Zellen von gesunden Kindern (p=0.01, chi-square Test). Bei beiden Gruppen wurde am häufigsten 1 Nukleotid entfernt. In den untersuchten B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis wurden signifikant mehr Sequenzen gefunden, bei denen es durch 3` Exonukleaseaktivität zum Verlust von 5 Nukleotiden gekommen war (14,5% versus 2,2%, p=0.03, chi-square Test). Ein ähnlicher Trend zeigte sich beim 73

81 Verlust von 8 Nukleotiden am 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung (6,5% versus 0%, p=0,07, chi-square Test). Die durchschnittliche Anzahl entfernter Nukleotide durch 3` Exonukleaseaktivität betrug bei den untersuchten B Zellen der Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis 2,6+/-0,28 Nukleotide und bei den gesunden Kindern 1,2+/-0,24 Nukleotide (p=0,0011; Mann-Whitney Test). Zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern betrug die Differenz der durchschnittlich entfernten Nukleotide duch 3 Exonukleaseaktivität 1,4 Nukleotide. 74

82 N-Nukleotide innerhalb der Vκ Jκ Verbindung Durch Aktivität des Enzyms TdT kann es zum Einfügen von N-Nukleotiden während des Vκ Jκ Rearrangements kommen. In 58,4% der untersuchten B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und in 39,1% der untersuchten B Zellen von gesunden Kindern konnten N-Nukleotide identifiziert werden (p=0.04, chi-square Test). Unterschiede in der Häufigkeit des Einfügens einer bestimmten Anzahl von N-Nukleotiden konnten nicht gefunden werden. 100 N-Nukleotide innerhalb der V kappa J kappa Verbindung in % aller produktiven Rearrangements * Oligoarthritis Gesund Anzahl der N-Nukleotide Abbildung 20: N-Nukleotide innerhalb der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit des Einfügens einer bestimmten Anzahl von N- Nukleotiden an der Vκ Jκ Verbindung durch Aktivität des Enzyms Terminale Desoxynukleotid Transferase (TdT) innerhalb von B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). Signifikante Unterschiede sind mit * gekennzeichnet (p<0,05; chi-square Test). 75

83 P-Nukleotide am 5` und 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung P-Nukleotide am 5` Ende der Vκ Jκ Verbindung konnten in 18,2% der untersuchten B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und in 23,9% der untersuchten B Zellen von gesunden Kindern gefunden werden. 100 P-Nukleotide am 5` Ende der V kappa J kappa Verbindung in % aller produktiven Rearrangements Oligoarthritis Gesund Anzahl der P-Nukleotide Nukleotide Abbildung 21: P-Nukleotide am 5` Ende der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit des Einfügens einer bestimmten Anzahl von P- Nukleotiden am 5` Ende der Vκ Jκ Verbindung in B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). 76

84 100 P-Nukleotide am 3` Ende der V kappa J kappa Verbindung in % aller produktiven Rearrangements Oligoarthritis Gesund Anzahl der P-Nukleotide Nukleotide Abbildung 22: P-Nukleotide am 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung in CD19+IgD+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern Dargestellt ist die Häufigkeit des Einfügens einer bestimmten Anzahl von P- Nukleotiden an der Vκ Jκ Verbindung in B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=3, 77 Sequenzen) und gesunden Kindern (n=2, 46 Sequenzen). 11,7% der B Zellen von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und 21,7% der B Zellen von gesunden Kindern zeigten P-Nukleotide am 3` Ende der Vκ Jκ Verbindung. 77

85 Analyse der RAG und VpreB mrna Expression Zur Analyse von Anzeichen einer in peripheren B Zellpopulationen stattfindenden sekundären V(D)J-Rekombination wurde die Expression der Gene RAG1, RAG2A, RAG2B und VpreB in individuellen B Zellen des peripheren Blutes analysiert. In den B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis zeigte sich in einer Analyse mit Einzelzell-PCR nur vereinzelt ein vermehrtes Vorkommen von RAG 1 und 2 positiven Zellen. Auch mittels quantitativer Real Time PCR ließen sich keine Hinweise auf eine vermehrte RAG Expression in den B Zellen des peripheren Blutes der erkrankten Kinder beobachten. Alter Geschlecht ANA Therapie P1 13 Jahre weiblich < 1:80 NSAID P2 5 Jahre weiblich >/= 1:80 NSAID P3 12 Jahre weiblich 1:80 MTX P4 11 Jahre weiblich 1:640 NSAID P5 7 Jahre weiblich < 1: P6 6 Jahre weiblich >/= 1:80 NSAID K1 10 Jahre weiblich K2 12 Jahre männlich Tabelle 22: Charakterisierung der untersuchten Patienten und gesunden Kinder für die Analyse der RAG und VpreB Expression mittels Einzelzell PCR 78

86 Es wurde zunächst die Häufigkeit RAG1 und RAG2A/B positiver B Zellen (RAG+) in IgD+ und IgD- B Zellen des peripheren Blutes von zwei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis untersucht. Bei beiden Patienten (P1 und P2) war der Anteil RAG+ Zellen an der IgD+ im Vergleich zur IgD- B Zellpopulation erhöht. Dieser Unterschied erreichte bei einem Patienten (P1) ein signifikantes Niveau (p=0,008, chi-square Test) (Tab 23, Abb 23). Absolute Anzahl der Zellen P1 P1 P2 P2 Relative Anzahl (%) IgD+ IgD- IgD+ IgD- Beta-Aktin (BA) RAG1+ (abs) RAG1+/BA (%) 69,1 39,4 56,1 13,6 RAG2A + (abs) RAG2A+/BA (%) 16,4 18,2 13,6 18,2 RAG2B + (abs) RAG2B+/BA (%) 16,4 6,1 9,1 10,6 RAG1+2A/B+ (RAG+) (abs) RAG+/BA (%) 20 4,5 12,1 4,5 VpreB+ (abs) VpreB+ (%) 37,9 39,4 37,9 39,4 VpreB+RAG+ (abs) VpreB+RAG+/BA 5,5 0 4,5 1,5 VpreB+/RAG+ (%) 27,3 0 37,5 33,3 VpreB+/RAG- (%) 27,3 34,5 37,9 39,7 Tabelle 23: Absolute Anzahl (abs) untersuchter Zellen und relative Häufigkeit (%) der Expression der Gene RAG1, RAG2A, RAG2B und VpreB in individuellen CD19+ IgD+ und IgD- B Zellen des peripheren Blutes von zwei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis. 79

87 RAG1 + 2A/B Expression in CD19+ IgD+ bzw. IgD- B-Zellen In % aller beta-aktin positiven Zellen p=0,003 (IgD+ vs. IgD- P1 und P2) p=0,008 p=0, P1 IgD+ P1 IgD- P2 IgD+ P2 IgD- Abbildung 23: RAG Expression in CD19+ IgD+ und IgD- B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Verglichen wurde die Häufigkeit RAG+ Zellen ((RAG1+ und RAG2A+ oder RAG2B+ / beta-aktin+) x100) zwischen CD19+ IgD+ und IgD- B Zellpopulationen des peripheren Blutes von zwei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (chi-square Test). Hinsichtlich der Expression von VpreB mrna zeigte sich kein Unterschied in den beiden Zellpopulationen. Sowohl in den IgD+ als auch in den IgD- B Zellen wurde VpreB mit gleicher Häufigkeit in RAG+ als auch in nicht RAG+ B Zellen exprimiert. Die Häufigkeit RAG+VpreB+ B Zellen war jedoch sehr gering (0 5,5% aller untersuchten B Zellen) (Tab 23). Bei 4 Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (P3 P6) und 2 gesunden Kindern (K1 und K2) wurde die Häufigkeit RAG+ Zellen in der CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellpopulation des peripheren Blutes analysiert. 80

88 RAG1+ (abs) RAG1+/BA (%) 43,9 50,8 9,1 36,5 RAG2A + (abs) RAG2A+/BA (%) 13,6 23,1 0 0 RAG2B + (abs) RAG2B+/BA (%) 10,6 12,3 7,7 11,5 RAG1+2A/B+ (RAG+) (abs) RAG+/BA (%) 13,6 18,5 1,2 5,8 Absolute Anzahl der Zellen P3 P3 P4 P4 Relative Anzahl (%) CD5+ CD5- CD5+ CD5- Beta-Aktin (BA) Absolute Anzahl der Zellen P5 P5 P6 P6 Relative Anzahl (%) CD5+ CD5- CD5+ CD5- Beta-Aktin (BA) RAG1+ (abs) RAG1+/BA (%) RAG2A + (abs) RAG2A+/BA (%) RAG2B + (abs) RAG2B+/BA (%) RAG1+2A/B+ (RAG+) (abs) RAG+/BA (%) VpreB+ (abs) VpreB+ (%) VpreB+RAG+ (abs) VpreB+RAG+/BA VpreB+/RAG+ (%) VpreB+/RAG- (%) 12 26,1 3 6,5 2 4,3 1 2, ,9 3 6, ,0 11,5 10, , ,0 0 4, , ,8 33,3 Tabelle 24: Absolute Anzahl (abs) untersuchter Zellen und relative Häufigkeit (%) der Expression der Gene RAG1, RAG2A, RAG2B und VpreB in individuellen CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellen des peripheren Blutes von vier Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis. 81

89 Absolute Anzahl der Zellen K1 K1 K2 K2 Relative Anzahl (%) CD5+ CD5- CD5+ CD5- Beta-Aktin (BA) RAG1+ (abs) RAG1+/BA (%) 12,7 16,1 6,9 3,6 RAG2A + (abs) RAG2A+/BA (%) 3,2 1,6 20,7 23,2 RAG2B + (abs) RAG2B+/BA (%) 3,2 1,6 1,7 3,6 RAG1+2A/B+ (RAG+) (abs) RAG+/BA (%) 0 1,6 0 3,6 VpreB+ (abs) VpreB+ (%) 4,8 4,8 6,9 1,8 VpreB+RAG+ (abs) VpreB+RAG+/BA VpreB+/RAG+ (%) VpreB+/RAG- (%) 3 4,8 3 4,9 4 6,9 1 1,9 CD154+ (abs) CD154+/BA (%) ,9 5 8,9 CD154+RAG+ (abs) CD154+RAG+/BA (%) CD154+/RAG+ (%) CD154+/RAG- (%) 0 0 6,9 9,3 Tabelle 25: Absolute Anzahl (abs) untersuchter Zellen und relative Häufigkeit (%) der Expression der Gene RAG1, RAG2A, RAG2B, CD154 und VpreB in individuellen CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellen des peripheren Blutes von zwei gesunden Kindern. 82

90 Hinsichtlich des Anteils RAG+ B Zellen zeigte sich weder bei den Patienten noch bei den gesunden Kindern ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellpopulation. Wurden jedoch sämtliche analysierten B Zellen einer jeden Population (CD5+ oder CD5-) als Gruppe betrachtet, war die Häufigkeit RAG+ B Zellen bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis in der CD5- Population gegenüber der CD5+ tendenziell erhöht (p=0,05, chi-square Test). Bei den gesunden Kindern erreichte dieser Trend kein signifikantes Niveau (p=0,08, chi-square Test). Sowohl in der CD5+ als auch in der CD5- B Zellpopulation war die Häufigkeit RAG+ B Zellen bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis im Vergleich zu gesunden Kindern tendenziell erhöht. Dieser Trend erreichte jedoch nur bei einem Patienten (P3) ein signifikantes Niveau (p<0,001, chi-square Test) (Tab 24 und 25, Abb 24). Die Expression von VpreB mrna wurde in CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellen bei Patient 6 und bei beiden gesunden Kindern auf Einzelzellebene analysiert. Bei allen untersuchten Personen zeigten CD5+ und CD5- B Zellen kein unterschiedliches Expressionsverhalten von VpreB mrna. Die Häufigkeit VpreB+ B Zellen war bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis sowohl in der CD5+ als auch in der CD5- B Zellpopulation im Vergleich zu gesunden Kindern erhöht (p<0.0001, chi-square Test). Bei keiner dieser untersuchten Personen konnten VpreB+RAG+ B Zellen gefunden werden (Tab 24 und 25). 83

91 25 RAG1 + 2A/B Expression in CD19+IgD+CD5+B Zellen in % aller beta-aktin positiven Zellen * Oligoarthritis Gesund 0 P3 P4 P5 P6 K RAG1 + 2A/B Expression In CD19+IgD+CD5- B Zellen 20 * Oligoarthritis Gesund in % aller beta-aktin positiven Zellen P3 P4 P5 P6 K1+2 Abbildung 24: Analyse der RAG Expression in CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern mittels Einzelzell PCR Dargestellt ist die Häufigkeit RAG+ B Zellen ((RAG1+ und RAG2A+ oder RAG2B+ / beta-aktin+) x100) in CD19+IgD+ CD5+ und CD5- B Zellen des peripheren Blutes von vier Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (P3-6) und zwei gesunden Kindern (K1 und K2). Verglichen wurde die Häufigkeit RAG+ Zellen innerhalb einer bestimmten Population zwischen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern (chi-sqare Test, *: p<0,01). 84

92 Mit der Einzelzell-PCR wurde die Häufigkeit der B Zellen einer Population ermittelt, die positiv für die Expression von RAG1 und RAG2 mrna waren. Mittels Voramplifikation und anschließender Real Time PCR wurde zusätzlich die relative Menge der RAG1 und RAG2 mrna in der CD19+ B Zellpopulation (Aufreinigung durch MACS) des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern ermittelt. Eine ähnlich hohe RAG1 oder RAG2 Expression wie in den CD19+ B Zellen der Tonsille zeigte sich bei wenigen Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis aber auch bei wenigen gesunden Kindern. Es konnte kein offensichtlicher Unterschied hinsichtlich der relativen Menge an RAG1 oder RAG2 mrna zwischen Kranken und Gesunden beobachtet werden. Alter (Jahre) weiblich ANA+ Aktiv NSAID MTX Oligoarthritis (n=11) 8,6 +/- 1,6 81,8 % 72,7 % 100 % 81,8 % 27,3 % Gesund (n=7) 10,2 +/- 2,1 57,1 % Tabelle 26: Charakterisierung der Patienten und gesunden Kinder für die Analyse der Expression von RAG1 und RAG2 mittels Real Time PCR 85

93 log10 der relativen Quantifizierung a Relative RAG1 mrna Expression Oligoarthritis Gesund -5 X X X b 1 Relative RAG2 mrna Expression Oligoarthritis Gesund log10 der relativen Quantifizierung X X X X X X X X X X X Abbildung 25: Relative Quantifizierung der RAG1 und RAG2 mrna Expression in CD19+ B Zellen des peripheren Blutes von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und gesunden Kindern mit quantitativer Real-Time PCR Dargestellt ist die relative Expression der Gene RAG1 (a) und RAG2 (b) in CD19+ B Zellen des peripheren Blutes von 11 Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis und 7 gesunden Kindern. Die Expression der spezifischen Gene wurde auf die Expression des house-keeping Genes beta-aktin normalisiert. Die normalisierten Expressionswerte sind in logarithmischer Darstellung als ein Vielfaches der Expression von CD19+ B Zellen der Tonsille dargestellt. Das Expressionsniveau der B Zellen der Tonsille wurde auf log 1 (=0) gesetzt. Proben, in denen keine Expression detektiert werden konnte, wurden graphisch als log 10-5 dargestellt und mit X gekennzeichnet. 86

94 3.1.3 Durchflusszytometrische Analyse der B Zellen der Synovialflüssigkeit Mittels durchflusszytometrischer Analyse wurde bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis die Verteilung von B Zellpopulationen der Synovialflüssigkeit mit der des Blutes verglichen. Während sich die B Zellen des peripheren Blutes vor allem aus CD19+CD27- naiven B Zellen zusammensetzten, fanden sich in der Synovialflüssigkeit vor allem aktivierte CD19+CD27+ Gedächtnis B Zellen und in einzelnen Fällen auch CD19+CD20-CD27++CD38++ Plasmablasten. Die aktivierten B Zellen der Synovialflüssigkeit wiesen eine stärkere Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) sowie das MHC-II Moleküls HLA-DR auf. Patient Alter Krankheits- Geschlecht (Jahre) dauer (Jahre) ANA Titer Therapie 1 10 wbl 0,5 1:2560 NSAID 2 9 wbl 8 >/= 1: 80 MTX 3 10 wbl 5 1:160 NSAID 4 16 wbl 3 < 1:80 NSAID 5 13 wbl 2 1:2560 NSAID 6 9 wbl 5 < 1: wbl 5 < 1:80 MTX 8 7 wbl 4 1: wbl 5 1:320 MTX wbl 3 < 1:80 NSAID 11 3 wbl 0,2 1: wbl 11 1:320 NSAID 13 4 wbl 1 1:320 NSAID, MTX, Steroid Tabelle 27: Charakterisierung der Patienten für die durchflusszytometrische Untersuchung der B Zellen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit ANA (Antinukleäre Antikörper), NSAID (Non-steroidal antiinflammatory drugs), MTX (Methotrexat). Bei allen Patienten wurde Synovialflüssigkeit des Kniegelenkes untersucht. 87

95 Der Anteil der B Zellen an den Lymphozyten war in der Synovialflüssigkeit deutlich vermindert (2,1% +/- 0,6 versus 21,4% +/- 3,7; p<0.0002; Wilcoxon matched pairs test). Die Zusammensetzung der B Zellpopulation der Synovialflüssigkeit unterschied sich deutlich von der des Blutes. Den Hauptanteil der B Zellen des Blutes bildeten naive B Zellen (CD19+CD27-), die B Zellen der Synovialflüssigkeit gehörten überwiegend der Gedächtnis B Zellpopulation an (CD19+ CD27+). 100 p=0,0002 p=0,0002 in % aller CD19+ B Zellen CD19+CD27- CD19+CD27+ Oligoarthritis, Blut Oligoarthritis, Synovialflüssigkeit Abbildung 26: Verteilung verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Mittels Durchflusszytometrie wurde die relative Verteilung verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) verglichen (Wilcoxon matched pairs test). Es ist der Anteil der verschiedenen Populationen an der Gesamtpopulation CD19+ B Zellen dargestellt. Weiterhin wurde die Oberflächenexpression der kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) sowie des MHC II Moleküls HLA-DR durchflusszytometrisch untersucht. 88

96 In der Synovialflüssigkeit war der Anteil CD80+ Zellen an den B Zellen gegenüber dem Blut deutlich erhöht (63,9% +/- 4,9 versus 10,0% +/- 1,3; p<0,0002; Wilcoxon matched pairs test). Gleiches galt für den Anteil CD86+ Zellen (78,0% +/- 4,7 versus 6,8% +/- 1,0; p<0,001; Wilcoxon matched pairs test). Die Expressionsstärke von CD80 und CD86 (gemessen als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) war in der Synovialflüssigkeit verglichen mit dem Blut sowohl bei den gesamten CD19+ B Zellen als auch innerhalb der Subpopulationen (naive CD27- und Gedächtnis CD27+ B Zellen) stark erhöht. HLA-DR wurde von nahezu allen B Zellen des peripheren Blutes sowie der Synovialflüssigkeit exprimiert (>99,5%). Die Expressionsstärke von HLA-DR war in den B Zellen der Synovialflüssigkeit deutlich erhöht. Dies galt sowohl für die naiven (CD19+CD27-) als auch für die Gedächtnis B Zellen (CD19+CD27+). CD19+ Blut CD19+ Gelenk CD86 Anzahl der Zellen CD80 HLA-DR Intensität Abbildung 27: Beispielhafte Darstellung der durchflusszytometrischen Analyse von CD80, CD86 und HLA-DR auf CD19+ B Zellen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit einer Patientin mit frühkindlicher Oligoarthritis 89

97 Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität 75 p=0,0002 p=0,0002 p=0, Oligoarthritis Blut Oligoarthritis Gelenk 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 28: Expressionsstärke von CD80 (B7.1) innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Die Expressionsstärke von CD80 wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen gemessen. Verglichen wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen zwischen B Zellen des peripheren Blutes und denen der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) (Wilcoxon matched pairs test). Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Minimal- und Maximalwert als Balken. 90

98 175 p=0,0005 p=0,0005 p=0,0005 Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität Oligoarthritis Blut Oligoarthritis Gelenk 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 29: Expressionsstärke von CD86 (B7.2) innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Die Expressionsstärke von CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen gemessen. Verglichen wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen zwischen B Zellen des peripheren Blutes und denen der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) (Wilcoxon matched pairs test). Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Minimal- und Maximalwert als Balken. 91

99 Durchschnittliche Fluoreszenz Intensität p=0,001 p=0,001 p=0,001 Oligoarthritis Blut Oligoarthritis Gelenk 0 CD19+ CD19+CD27- CD19+CD27+ Abbildung 30: Expressionsstärke von HLA-DR innerhalb verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Die Expressionsstärke von HLA-DR wurde mittels Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von B Zellen verschiedener B Zellpopulationen gemessen. Verglichen wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) verschiedener B Zellpopulationen zwischen B Zellen des peripheren Blutes und denen der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) (Wilcoxon matched pairs test). Die Ergebnisse sind als box plots dargestellt mit Median, 25. und 75. Perzentile als Kasten und Minimal- und Maximalwert als Balken. 92

100 In der Synovialflüssigkeit befanden sich bei einigen Patienten zudem Plasmazellen (CD19+/-CD20-CD27++CD38++) (0-26,4%), welche sowohl im Blut von gesunden Kindern (0-0,2%) als auch im Blut von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis kaum zu finden sind (0-1%). a Blut Gelenk CD27 CD19 b CD27 CD27 CD38 CD20 CD27 CD27 CD138 IgD Abbildung 31: Beispielhafte Darstellung der durchflusszytometrischen Analyse von B Zellpopulationen der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis Die Abbildung a) zeigt die Expression von CD27 auf CD19+ B Zellen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit einer Patientin. Die Expression von CD27 sowie von CD20, CD38, CD138 und IgD auf CD19+ B Zellen der Synovialflüssigkeit dieser Patientin ist in Abbildung b) dargestellt. 93

101 30 p=0,0005 in % aller CD19+ B Zellen Blut Synovialflüssigkeit Abbildung 32: Relative Häufigkeit von CD19+CD27++ Plasmazellen/ Plasmablasten im peripheren Blut und in der Synovialflüssigkeit von Kinder mit frühkindlicher Oligoarthritis Mittels Durchflusszytometrie wurde die relative Häufigkeit CD19+CD27++ B Zellen des peripheren Blutes mit der der Synovialflüssigkeit bei Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) verglichen (Wilcoxon matched pairs test). Es ist der Anteil CD19+CD27++ Zellen an der Gesamtpopulation CD19+ B Zellen dargestellt. CD19+CD20+CD27- CD19+CD20+CD27+ CD19+CD20-CD27++ CD80 26,3 ± 2,4 38,7 ± 2,6 24,4 ± 2,6 CD86 97,0 ± 10,5 108,0 ± 12,4 139 ± 25,9 HLA-DR 1317 ± ± ± 108 Tabelle 28: Expression von CD80, CD86 und HLA-DR auf der Oberfläche von naiven B Zellen, Gedächtnis B Zellen und Plasmazellen der Synovialflüssigkeit Mittels Durchflusszytometrie wurde die Expressionsstärke (dargestellt als Mittlere Fluoreszenz Intensität, MFI) von CD80, CD86 und HLA-DR auf der Oberfläche von naiven B Zellen (CD19+CD20+CD27-), Gedächntnis B Zellen (CD19+CD20+CD27+) und Plasmazellen (CD19+CD20-CD27++) der Synovialflüssigkeit von Kindern mit frühkindlicher Oligoarthritis (n=13) ermitelt. 94

102 Blut Synovialflüssigkeit CD19+ CD20+CD27- CD19+ CD20+CD27+ CD19+ CD20-CD27++ Pappenheim Färbung, 1000x Abbildung 33: Mikroskopische Darstellung verschiedener B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit eines Kindes mit frühkindlicher Oligoarthritis Verschiedene B Zellpopulationen des peripheren Blutes und der Synovialflüssigkeit wurden mittels durchflusszytometrischer Sortierung aufgetrennt und auf Glasträger (Zytospins) gebracht. Die Zellen wurden durch eine Pappenheim Färbung angefärbt und mit einem konventionellen Lichtmikroskop fotografiert (Originalvergrößerung 1000x). 95