UE Biochemie und Molekularbiologie. Nukleinsäuren 1

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1 UE Biochemie und Molekularbiologie Nukleinsäuren 1 Ass. Univ.-Prof. Dr. Martin Himly

2 Ziele Isolierung von DNA/RNA Agarose-Gelelektrophorese Quantifizierung von DNA/RNA 2

3 DNA 3

4 Genetische/zelluläre Organisation Wrapp around: left-handed 147 nt 1.65x procaryots eucaryots nucleus ER (smooth & rough) Golgi lysosomes peroxisomes cytoskeleton mitochondria 4

5 Plasmid-DNA TurboRFP pil8-rfp 4.4 kb 5

6 Plasmid-DNA Isolierung 6

7 Bsp. I Plasmid-DNA Mini-Prep (Arbeitsanweisungen unvollständig, Details siehe Praktikumsunterlagen) (1) Abzentrifugieren der Bakterien bei rpm, 1 min (2) Abheben des Überstands (3) Resuspendieren des Bakterien-Pellets in 100 µl Lösung I (25 mm Tris-Cl, ph 8, 10 mm EDTA) durch kurzes Vortexen (4) Alkalische Lyse der Bakterien nach Zugabe von 200 µl Lösung II (200 mm NaOH, 1% SDS) durch sorgfältiges über Kopf schwenken (5) Ausfällen der genomischen DNA durch Zugabe von 150 µl Lösung III (3 M K-Acetat ph 4.8; das ist z.b.: 60 ml 5 M KOAc, 11.5 ml HOAc, 28.5 ml H 2 O) (6) Extraktion von genomischer DNA und Protein durch Zugabe von 500 μl PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-25:24:1), Vortexen und Zentrifugieren bei 5 min bei rpm (7) Die wässrige Phase abpipettieren, ohne sie mit der unteren organischen Phase zu kontaminieren. Überstand in vorher eindeutig beschriftetes (!) 1.5 ml Schraubverschluß- Eppendorf Reaktionsgefäß transferieren. 7

8 Wirkung von EDTA (Chelatbildner) komplexiert: Fe, Co, Ni, Mn, Pb, Ca, Mg, etc. Mg Co-Faktor für DNasen PCI Extraktion 8

9 Sicherheitshinweise: Arbeiten mit Phenol Phenol wirkt stark toxisch, sowohl lokal als auch systemisch Schädigt bei Kontakt die Haut, Augenkontakt führt zur Eintrübung der Hornhaut Systemische Aufnahme schädigt die Nieren, die Leber und kann das Erbgut verändern. (Wird auch über die Haut resorbiert) Inhalation führt zu Übelkeit, Kopfschmerz und Schwindelgefühl, Bei häufiger Exposition zu Schädigungen an Nieren, Leber und ZNS Sicherheitsmaßnahmen für die Arbeit mit Phenol: Schutzkleidung: Labormantel, Handschuhe, Schutzbrillen Nur im Abzug pipettieren!!! Ausschließlich SCHRAUB-EPPIS verwenden!!! Abfälle (flüssig wie fest) müssen gesammelt und gesondert entsorgt werden (Eppis, Pipettenspitzen, Phenolreste) 9

10 Bsp. I Plasmid-DNA Mini-Prep (8) Quantitative Phenol-Extraktion der wässrigen Phase mittels Chloroform: Zugabe von 200 μl Chloroform zum wässrigen Überstand der PCI Extraktion, Vortexen und Trennen der Phasen durch Zentrifugation (5 min bei rpm). Transferieren des Überstandes in ein neues Eppendorf - Reaktionsgefäß. Für die nachfolgende Ethanolfällung ist es erforderlich das Volumen des Überstands zu ermitteln. (9) EtOH-Fällung: Zugabe von doppeltem Volumen eisgekühlten Ethanols (100%), bezogen auf das Gesamtvolumen. Kurzes Mischen durch über Kopf Schwenken. Dicht verschraubtes Reaktionsgefäß etwa 10 min auf Eis lagern und Plasmid-DNA ausfällen. (10) Reaktionsgefäße 10 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren. (11) Überstand vorsichtig vollständig ableeren. (12) EtOH-Pellet mit 100 µl 70% eisgekühltem EtOH waschen: Reaktionsgefäße kurz Schwenken und 5 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren, Überstand ableeren. (13) Plasmid-DNA ca. 20 min Lufttrocknen dann in 40 μl Lösung IV (10 mm Tris-Cl, ph 7.5, 1 mm EDTA, 20 µg/ml RNase A lösen. 10

11 Bsp. I Plasmid-DNA Mini-Prep (10) Reaktionsgefäße 10 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren. (11) Überstand gleich nach Zentrifugieren vorsichtig vollständig ableeren. 11

12 Bsp. I Plasmid-DNA Mini-Prep (14) Photometrische Bestimmung der DNA Konzentration bei 260 nm. Zu 58 µl Waser werden 2 µl der gelösten DNA pipettiert. Man vermisst in UV-durchlässigen Plastik-Mikroküvetten und bestimmt die UV-Absorption bei 230, 260 und 280 nm. (15) ca. 5 μg an gelöster Plasmid-DNA (mit Wasser auf ein Volumen von 15 µl gebracht) werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt (100 V, 20 min). Gelkonzentration 1.5% (w/v). (16) Die Sichtbarmachung der DNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. Referenz ist 1 kb ladder, ca. 2 µl. 1 kb ladder 2.0 µg dsdna 1.0 µg dsdna 0.5 µg dsdna 2.0 µg dsdna 1.0 µg dsdna 0.5 µg dsdna open circle (OC) linear (L) covalently closed circle (CCC) 12

13 Säulchen basierte Plasmid DNA Isolierung (z.b. QIAprep Kit, Qiagen) 13

14 RNA: instabile Schwester der DNA Unterschiedliche Typen der RNA: mrna (messenger RNA, Proteincodierende RNA) nur ca. 3% der Gesamt RNA non-coding RNAs trna (transfer RNA, < 100 nt) rrna (ribosomale RNA; 5S, 5.8S, 18S, 28S in Eukaryoten) mirna (micro RNA RNA silencing, post-transcriptional gene regulation) snrna (small nuclear RNA processing of prerna). 14

15 Unterschiede zwischen DNA und RNA 1 Die Struktur: RNA DNA RNA ist einzelsträngig, bildet aber z.t. komplexe Sekundärstrukturen: mirna trna rrna 15

16 trna Ψ pseudouridine 16

17 Die Unterschiede zwischen DNA und RNA 2 Die Basen: DNA RNA Der Zucker: DNA OD 260 = 1.0 RNA µg/ml DNA µg/ml Desoxyribonukleotid: Desoxy-thymidinmonophosphat RNA Ribonukleotid: Uridinmonophosphat 17

18 RNA Stabilität 1 Alkalische Hydrolyse Cyclic 2,3 phosphodiester intermediate Source: CliffsNotes.com. RNA Information. 28 Oct

19 RNA Stabilität 2 RNA Degradation durch RNasen RNasen sind überall in Zellen und Gewebe in vielen Standardreagenzien im Labor auf unserer Haut, in Atemluft, in Schweiß RNasen sind sehr stabil und benötigen keine Co-Faktoren funktionieren unabhängig von Mg ++ - EDTA ist wirkungslos extrem hitzestabil - werden durch Autoklavieren nicht inaktiviert 19

20 RNA Stabilität 3 Vorsichtsmaßnahmen für Arbeiten mit RNA RNasen müssen inaktiviert werden Denaturierung mit chaotropen Agens/Phenolextraktion Wasser für RNA Arbeiten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) aufbereiten (leads to H/L/C/Y carboxylation) kommerziell erhältliche RNase Inhibitoren (RNasin, RNase Inhibitor) niedrige Temperatur (Arbeiten auf Eis, rasches Arbeiten) Möglichst RNase-freie Arbeitsumgebung schaffen Einweghandschuhe, Filter-tips, RNase-freie Chemikalien und Puffer Reinigung der Arbeitsfläche (EtOH, RNase away NaOH) sofern möglich: eigener RNA Arbeitsplatz, RNA Pipetten 20

21 Isolierung von RNA aus Zellen/Gewebe Saure Phenolextraktion nach Chomczynski and Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Chemistry 1987 Nonidet P40 Lyse / GITC Phenolextraktion Säulchen basierte RNA Isolation (z.b. RNeasy-Kit Qiagen) 21

22 RNA Isolierung mit Trizol 1 Trizol ist ein kommerzielles Reagens (Invitrogen) und basiert auf dem ursprünglichen Protokoll von Chomczynki: Enthält: chaotropes Agens GITC und Phenol. Direkte Lyse von Zellen und Gewebe (Ultra-Turrax) Durch Chloroform wird die Phasentrennung induziert Da in Trizol saures Phenol Verwendung findet, geht DNA in die organische Phase. Die wässrige Phase enthält ausschließlich RNA. Wässrige Phase: RNA Organische Phase: DNA, Proteine 22

23 RNA Isolierung mit Trizol 2 Die RNA kann einfach aus dem wässrigen Überstand gefällt werden Aus der organischen Phase können nach Bedarf auch Protein und DNA aus derselben Probe isoliert werden. TRIzol user manual (Invitrogen) 23

24 HEK 293 Zellen HEK... human embryonic kidney Zelllinie seit 1970 als Wirt für Entwicklung von viralen Impfstoffen und Vektoren, sowie zum Testen von Chemotherapeutika verwendet Harvey Shein (Harvard University): Transformation embryonaler Nierenzellen mit 4,5 kb DNA-Fragment von Adenovirus 24

25 Bsp. II Isolierung von RNA aus HEK 293-Zellen Vor Beginn: Vorbereiten des Arbeitsplatzes (gem. mit DNA 6) Klären der Trizol-Proben, Zentrifugation für 5 Minuten bei rpm Überführen des Überstands in Schraubeppis (gem. mit DNA 8) Zugabe von 100 µl Chloroform (CHCl 3 ) pro 500 µl Trizol Mischen der Proben am Vortex für ca. 10 sec. Danach 5 Minuten bei rpm zentrifugieren Abheben der wäßrigen Phase (ca. 200 µl) (gem. mit DNA 9) Fällen der RNA durch Zugabe von 250 µl Isopropanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur (gem. mit DNA 10) 10 Minuten bei max. rpm zentrifugieren. 25

26 Bsp. II Isolierung von RNA aus HEK 293 (gem. mit DNA 11) Abheben des Überstands. Waschen der Pellets in 180 µl Ethanol (70%) (gem. mit DNA 12) 5 Minuten bei max. rpm zentrifugieren. (gem. mit DNA 13) Ableeren des Überstands (quantitativ) und Trocknen des RNA Pellets Lösen des RNA Pellets in 30 µl RNase-freiem Wasser 2 µl 1 kb ladder 2 µg total RNA 1 µg total RNA 0.5 µg total RNA (gem. mit DNA 14) Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration bei 260 nm. Man vermisst in UV-durchlässigen Plastik-Mikroküvetten und bestimmt die UV-Absorption bei 230, 260, 280 nm. (gem. mit DNA 15) ca. 2 μg RNA (mit Wasser auf ein Volumen von 15 µl gebracht) werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt (gem. mit DNA 16) Die Sichtbarmachung der RNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. 26

27 Säulchen basierte RNA Isolierung (z.b. RNeasy-Kit Qiagen) Der RNeasy Kit folgt dem Grundprinzip aller Silica Säulchenbasierten Nukleinsäure Reinigungskits. Lyse der Zellen in GITC Puffer Binden der RNA mittels EtOH Waschen mit Hochsalz-Puffern Entsalzen mit EtOH Puffern Eluieren der RNA von der Säule (H 2 O, TE) Zusätzlich kann sehr einfach ein DNase Verdau auf dem Säulchen inkludiert werden. Vorsicht! Säulchen binden keine RNA <200 nt Qiagen RNeasy Handbook 27

28 Quantifizierung von DNA und RNA hypochromer Effekt von dsdna gute Qualität: UV 260 /UV 280 > UV 260 /UV 230 >

29 Elektrophorese: Die Auftrennung von Molekülen im elektrischen Feld Kriterien für die Trennung sind: - Ladung - Größe - Konformation - (Matrixinteraktionen) Nukleinsäuren haben bei neutralem ph eine homogen negative Ladung. Das verbleibende Kriterium für lineare DNA ist die Fragmentlänge. Da RNA Sekundärstrukturen ausbildet, kann unter nicht-denaturierenden Bedingungen keine direkte Größenkorrelation hergestellt werden. RNA kann mit Formamid oder Formaldehyd denaturiert werden. 29

30 Agarose Gelelektrophorese 1 Agarose ist ein Polysaccharid und wird aus der Zellwand von Rotalgen gewonnen. Die durchschnittliche Molekülmasse der linearen Ketten beträgt ca (n = +/- 400) source: Durch Erhitzen und Abkühlen bilden die linearen Agaroseketten Helices aus, die sich wiederum zu Suprafasern polymerisieren. Das resultierende 3-dimensionale Netzwerk hat eine durchschnittliche Porengröße von ca nm. 30

31 Elektroendosmose: (EEO) Elektroendosmose (oder: Elektroosmotischer Fluß EOF) ist ein Problem bei qualitativ minderwertigen Agarosen. Mit Sulfat- und Carboxylgruppen in der Agarosematrix sind (bei neutralem ph) Anionen in der Matrix immobilisiert. Die Gegenionen sind jedoch weiter mobil und führen zu einem Fluß des Puffers in Richtung der Kathode. Dieser Effekt tritt vorwiegend in Kapillaren aber auch in engmaschigen Siebmatrizes auf. Kathode Anode Der EOF wirkt in entgegengesetzter Richtung zur Wanderungsrichtung der DNA und verschlechtert die Trennleistung und Trennschärfe des Gels. 31

32 Agarose Gelelektrophorese 2 Die Elektrophoresekammer: source: Die Probe wird mit sample loading buffer * vermischt und in die Geltaschen pipettiert. ( * enthält Glycerin und Farbstoffe) Als Puffer kommt ein Tris-Acetat-EDTA Puffer zum Einsatz. Alternative Puffer System: TBE source: biotrek.rdrake.org 32

33 Agarose Gelelektrophorese 3 Visualisierung der DNA-Banden mit interkalierenden Farbstoffen im UV-Licht Ethidium-Bromid sources: chemgapedia.de / wikipedia.org 33

34 Agarose Gelelektrophorese 3 Bestimmung der Größe und der Menge von DNA im Agarosegel 2006, Mühlhardt, Molekularbiologie Datasheet, Fermentas 34

35 Elektrophorese Die Agarosekonzentration bestimmt die Trennleistung in unterschiedlichen Größenbereichen Agarosekonzentration: Optimale Trenneffizienz Agarosekonzentration (in % w/v) Bromphenolblau Xylencyanolblau 1 kb 30 kb 0.6 % 1000 bp 10 kb 800 bp 12 kb 0.7 % 700 bp 6 kb 500 bp 7 kb 1.0 % 300 bp 3 kb 400 bp 6 kb 1.2 % 200 bp 1.5 kb 200 bp 3 kb 1.5 % 120 bp 1 kb 100 bp 2 kb 2.0 % <100 bp 800 bp 1000bp 1000bp source: 35

36 Viel Erfolg! 36