Modul biol113: Zellbiologie

Transkript

1 Modul biol113: Zellbiologie Prof. Dr. Matthias Leippe Prof. Dr. Thomas Roeder Caenorhabditis elegans (H. Xiong) Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster (T. Roeder) Dictyostelium discoideum (Grimson & Blanton) Übersicht der Kurstage & Drosophila melanogaster 09. & Caenorhabditis elegans 16. & Dictyostelium discoideum

2 Sicherheitshinweise: Sämtliche Laborarbeiten unterliegen den gesetzlichen Sicherheitsbestimmungen. Die entsprechenden Sicherheitshinweise sind zu beachten. Am ersten Kurstag wird eine mündliche Belehrung der Kursteilnehmer erfolgen a. In den Arbeitsbereichen darf nicht getrunken, gegessen, geraucht oder geschnupft werden. Nahrungs- und Genussmittel sowie Kosmetika dürfen nicht im Labor aufbewahrt werden. b. Im Labor sind Laborkittel oder andere Schutzkleidung zu tragen. c. Beim Umgang mit ätzenden, giftigen oder sonst wie gefährlichen Stoffen (z.b. Trockeneis) sind Handschuhe und evt. Schutzbrille zu tragen. d. Schwangere dürfen aufgrund gesetzlicher Bestimmungen nicht mit Gefahrstoffen arbeiten. Aus Sicherheitsgründen ist daher im eigenen Interesse eine Schwangerschaft dem Kursleiter umgehend anzuzeigen. e. Auf die ordnungsgemäße Entsorgung und vor allem die vorsichtige Handhabung der unten angeführten Lösungen und Stoffe ist im besonderen zu achten: i. Gentechnisch veränderte Organismen (GVOs) (siehe Betriebsanweisung) ii. Antibiotika wie Ampicillin, Kanamycin iii. Formaldehyd und Formaldehydhaltige Lösungen iv. Fluoreszenz-Farbstoffe: z. B. Ethidiumbromid f. Alle gentechnischen Arbeiten werden in der Sicherheitsstufe 1 durchgeführt (kein Risiko für Mensch und Umwelt). Dennoch ist bei Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) besonders zu beachten, dass nach Abschluss der Experimente alle verwendeten GVOs inaktiviert werden (aushängende Betriebsanweisung). g. Zentrifugen dürfen nur nach Einweisung selbständig bedient werden. h. Gäste dürfen erst mit praktischen Arbeiten beginnen, wenn sie vom Projektleiter mit den in den Labors geltenden Regelungen vertraut gemacht worden sind. i. Die Unterweisungen sind schriftlich festzuhalten und von den Unterwiesenen durch Unterschrift zu bestätigen. Die hier aufgeführten Vorschriften und Hinweise sind nur ein - wenn auch wichtiger - Teil der Betriebsanweisung für gentechnische Laboratorien der Sicherheitsstufe S1 Weiterführende Informationen finden Sie in der aushängenden Betriebsanweisung. 2

3 Versuchsteil 1 Drosophila melanogaster 1. Einleitung 2. Experimente 2.1 RT-PCR zur Bestimmung der AMP-Expression nach Infektion PCR-Reaktion Gelelektrophorese 2.2 LacZ-Färbung transgener Larven

4 1. Einleitung Die Taufliege Drosophila melanogaster dient als eines der wichtigsten Modelle in der biomedizinischen Forschung. Die kurze Generationszeit, das sequenzierte Genom, eine große Anzahl verfügbarer Mutanten und eine Vielzahl genetischer Interventionsmöglichkeiten machen einige der Vorteile aus, die Drosophila auszeichnen. Ziel dieses Kurstages ist es, einige grundlegende Methoden der Zellbiologie kennen zu lernen. Dazu gehören die Durchführung einer RT-PCR, sowie der Einsatz gentechnisch veränderter Fliegen, um biologisch relevante Prozesse sichtbar zu machen. 2. Experimente Wir werden unterschiedliche Aspekte der Immunantwort der Fruchtfliege analysieren. Aufgrund ihrer Lebens- und Ernährungsweise ist die Taufliege in ihrer natürlichen Umgebung dauerhaft mit Pathogenen wie Bakterien und Pilzen konfrontiert. Die Epithelien der Fliege stehen in dauerhaftem Kontakt mit der Umwelt und bieten als physikalische Barriere die Möglichkeit vor einer Infektion Darstellung der im Fettkörper produzierten AMPs nach einer Konfrontation mit unterschiedlichen Mikroorgansimen (verändert nach Imler und Bulet, 2005 / C. Fink 2012) 4 zu schützen. Dennoch kommt es immer wieder zu einem Eindringen der Pathogene in die Epithelzellen oder die Körperhöhle des Tieres. In diesen Fällen ermöglicht der systemische Teil des angeborenen Immunsystems von Drosophila vielfältige Möglichkeiten zur Abwehr dieser Mikroorganismen.

5 Selbige besteht u. A. aus der Expression anti-mikrobieller Peptide (AMPs) durch immunkompetente Organe wie z.b. dem Fettkörper. Die Produktion von antimikrobiellen Peptiden ist ein wirkungsvoller Mechanismus um die Fliege vor der Vermehrung und Ausbreitung eingewanderter Mikroorganismen zu schützen. Bei antimikrobiellen Peptiden handelt es sich um kleine Peptide mit ca. 12 bis 50 Aminosäuren. Sie haben einen amphipathischen Charakter, was ihnen ermöglicht mit der Zellmembran der Pathogene zu interagieren. Wir werden Larven (vor dem Praktikum!) mit entsprechenden Bakterien infizieren und dann aus den infizierten Larven RNA isolieren. Diese RNA wird eingesetzt um eine cdna (complementary DNA) herzustellen. Gleiches erfolgt mit nicht-infizierten Larven. Diese, von uns vorbereitete cdna, werden Sie im Praktikum einsetzen um die Transkription antimikrobieller Peptidgene zu analysieren. Jede Gruppe wird ein antimikrobielles Peptidgen (drosocin, diptericin, defensin, drosomycin oder attacin) analysieren und als Referenzgen wird das ribosomale Gen rpl32 eingesetzt. Parallel dazu wird eine Drosophila-Reporter-Linie eingesetzt, um die Expression eines antimikrobiellen Peptidgens zu visualisieren. In diesen Fliegen ist das Gen, welches für das Enzym β-galactosidase (LacZ) kodiert, unter transkriptioneller Kontrolle des diptericin-promotors. Dadurch wird lacz immer dann und dort exprimiert, wo das diptericin-gen normalerweise exprimiert wird. LacZ lässt sich sehr einfach durch eine Farbreaktion nachweisen. Luftoxidation Wir werden die entsprechenden Larven am Tage vor dem Praktikum infizieren und Sie werden den Fettkörper aus den Larven (infizierte und nicht-infizierte) entfernen und einen entsprechenden LacZ-Nachweis durch eine X-Gal-Färbung durchführen. 5

6 2.1 RT-PCR zur Überprüfung der AMP-Expression nach Infektion PCR-Reaktionen Einzelne Gene können unter Verwendung genspezifischer Oligonukleotide durch die Amplifikation mittels der Reversen Transkriptase-PCR qualitativ nachgewiesen werden. Als Ausgangsmaterial kann man z.b. wie im heutigen Versuch die direkte, in der Erststrangsynthese generierte, ss-cdna verwenden. Durch das Verwenden spezifischer Sense- und Antisense-Primer kommt es zu der Bildung eine Amplifikates mit bekannter Fragmentgröße, meist handelt es sich hier um Größen zwischen 70 und 250 bp. Es werden von jeder Gruppe 6 PCR Reaktionen durchgeführt, in denen cdna bzw. H 2 O (als Negativkontrolle / NTC) als Matrize (Template) verwendet wird. Als Template kommen die beiden cdnas zum Einsatz die Ihnen zur Verfügung gestellt werden: A cdna von Kontrolltieren B cdna infizierter Tiere N - NTC / H 2 O Jede Gruppe analysiert das Referenzgen rpl32 und jeweils das für das AMP Diptericin kodierende Gen dpt. Genereller Mix 1er Reaktion (à 50 µl): 5 µl 10 X-Puffer 2 µl dntps (2,5 µm each) 2 µl Sense-Primer (10 pmol) 2 µl Antisense-Primer (10 pmol) 2 µl Template (cdna) 0,5 µl Taq-Polymerase 36,5 µl H 2 O 6

7 Da Sie insgesamt 6 PCRs durchführen ist es sinnvoll, einen sog. Mastermix herzustellen. In diesem sind die 7-fachen Mengen (1x Pipettierbeigabe) derjenigen Komponenten enthalten, die in allen Reaktionen vorzufinden sind. Mastermix MMx7 (6 Proben + 1 Pipettierzugabe) 35 µl 10 X-Puffer 14 µl dntps (2,5 µm each) 3,5 µl Taq-Polymerase 255,5 µl H 2 O 44 µl MM pro Eppi rpl32 dpt GNr-A-R GNr-B-R GNr-C-R GNr-A-D GNr-B-D GNr-C-D 44 µl MM 44 µl MM 44 µl MM 44 µl MM 44 µl MM 44 µl MM 2 µl RS 2 µl RS 2 µl RS 2 µl DS 2 µl DS 2 µl DS 2 µl RAS 2 µl RAS 2 µl RAS 2 µl DAS 2 µl DAS 2 µl DAS 2 µl A 2 µl B 2 µl N 2 µl A 2 µl B 2 µl N Beschriftung der Tubes: GNr = entsprechende Gruppennummer A = Kontrolle B= Infektion N = No Template Control (NTC) / H 2O RS = rpl32-sense RAS = rpl32-antisense DS = diptericin sense DAS = diptericin -antisense 1-A-R DECKEL auch beschriften 1-A-R 7

8 PCR-Programm: Für die anschließende Amplifikation der Gene wird eine Standard-PCR mit folgenden Parametern durchgeführt: Primer- Denaturierung Elongation Zyklus Annealing Wiederholungen 95 C 72 C 55 C 1 1 min sec 15 sec 20 s min Gelelektrophorese Im Anschluss an alle PCR-Läufe wurde stets eine analytische Gelelektrophorese durchgeführt. Sie dient der Überprüfung und Qualitätsbestimmung der gebildeten Produkte. Zur optischen Darstellung der PCR-Produkte werden die Gele mit einem Nukleinsäure-interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff versetzt. Durch die Bindung kommt es zu einer Änderung des Anregungsbereiches und es kommt zu einem sichtbaren Fluoreszenzsignal, wobei die Fluoreszenzintensität proportional zur vorliegenden Fragmentgröße und-länge ist. 5 µl Amplifikat (PCR-Reaktion) + 2 µl Probenpuffer (LD 10x) auf Parafilm vermischen und anschließend die gesamten 7 µl in eine Tasche des Gels geben. Parallel wird je 2 µl eines Eichstandard 100 bp (M=Marker) aufgetragen. 8

9 Wir arbeiten mit einem Ersatzfarbstoff (gelred oder MidoriGreen, der nicht mutagen oder kanzerogen ist laut Herstellerangaben, dennoch arbeiten Sie bitte vorsichtig und verwenden die extra dafür vorgesehenen Handschulhe (Nitril dunkelblau). Wir verwenden 1,5%ige Gele (, die einige von Ihnen im Kurs selbst gießen können). 50 ml 1,5% iger Agarose + 5 µl des Ersatzfarbstoffes (GelRed oder MidoriGreen). Dies erfolgt bitte ausschließlich unter Anleitung des Kursleiters oder einer der Hiwis!! Schema zur Probenvorbereitung und Beladung des Agarosegels 10 µl LD (10x) LD 1-B-R 1-N-R 1-A-D 1-A-R 1-B-D 1-N-D Je 6 µl des Gemisches (PCR + LD) in die entsprechende Geltasche! M 1-A-R 1-B-R 1-N-R 1-A-D 1-B-D 1-N-D M 3-A-R 3-A-R 3-N-R M 4-A-R 4-B-R 4-N-R 4-A-D 4-B-D 4-N-D M 6-A-R 6-A-R 6-N-R G1 G4 G3 G6 falls vorhanden M 2-A-R 2-B-R 2-N-R 2-A-D 2-B-D 2-N-D M 3-A-D 3-B-D 3-N-D M 5-A-R 5-B-R 5-N-R 5-A-D 5-B-D 5-N-D M 6-A-D 6-B-D 6-N-D G2 G5 Was für ein Ergebnis ist zu erwarten? 9

10 2.2 LacZ-Färbung transgener Larven Durchführung der Färbung Sie erhalten 3 Typen transgener Larven, erstens oral infizierte Larven, zweitens Larven, die durch Injektion von Bakterien infiziert wurden und drittens Kontrolllarven, die nicht infiziert wurden. Diese Larven werden aus dem Medium entnommen (kleiner Spatel) und in eine mit 1xPBS gefüllte Petrischale überführt. Jede Gruppe nimmt sich 5-10 Tiere (je nach vorhandener Menge) pro Behandlung (infiziert oral, infiziert systemisch, nicht infiziert), gibt diese in mit 1x PBS gefüllte Blockschälchen und lässt diese Schälchen bis zur Präparation auf Eis, um die Larven zu betäuben. Anschließend wird der Fettkörper entfernt bzw. die Tiere werden geöffnet (siehe Protokoll zur Färbung S.11). Abb. 1: Schematische Darstellung der Organe einer Drosophila-Larve. mit den immunkompetenten Organen. Das Hauptimmunorgan der Fliege, der Fettkörper, (gelb) durchzieht lateral als 2-lappiges Organ den gesamten Körper und angeordnet lässt sich sehr leicht herauspräparieren. (orange Darm; grün Malpighische Gefäße; rot Speicheldrüsen; blau Tracheen (hier primäre Äste)). LÖSUNGEN: Färbelösung: Fixierlösung (0,75% GA): 30 µl Glutaraldehyd Stammlösung auf 1 ml PBS (1x) X-Gal Stammlösung (10%): 8,9 mg in 890 µl DMSO (Lagerung 20 C) X-Gal-Staining: 25 µl X-Gal-Stammlösung pro ml Färbelösung 10

11 ACHTUNG: Sie arbeiten hier mit Glutaraldehyd; es handelt sich um einen GIFTIGEN Gefahrstoff!!! Daher erfolgt die Entsorgung dieses Gefahrstoffes bitte in den am Platz vorliegenden Extra-Röhrchen. Hier hinein können Sie den gesamten Flüssigabfall der Färbereaktion entsorgen! FÄRBUNG: VOR der Präparation bereitet JEDE Gruppe 2 Eppis mit je 1 ml der vorbereiteten X-Gal-Staining-Lösung (S.10) Färbelösung vor. Beschriften Sie diese gut (Gruppennummer & Kontrolle A bzw. Infektion B) und stellen Sie die Eppis zum vorwärmen in den Schüttler. Mit Hilfe feiner Pinzetten erfolgt die Präparation unter dem Binokular (verwenden Sie die Pinzetten bitte vorsichtig sie sind ausgesprochen empfindlich). Danach werden die Fettkörperfragmente bzw. die geöffneten Larven in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und in 250 µl 0,75 % GA (s.o.) fixiert. Anschließend werden die Proben 3 x mit 1 x PBS gewaschen (jeweils 5 min mit 500 µl). Nach dem letzten Waschschritt entfernen Sie das PBS und ersetzen es durch die vorgewärmte Färbelösung (s.o.). Die Reaktionsgefäße werden dann wieder in den Schüttler gestellt. Die Färbung sollte sich innerhalb weniger Minuten entwickeln, i.d.r. innerhalb von 15 Minuten. Was für ein Ergebnis ist zu erwarten? 11

12 Versuchsteil 2 Caenorhabditis elegans 1. Einleitung 1.1 Caenorhabditis elegans als Modellorganismus 1.2 GFP als Reportergen für die Lokalisation der Genexpression 2. Mikroinjektion 3. Knock-out-Mutationen (Phäno- und Genotypanalyse) 4. Material 5. Experimentelles Vorgehen 5.1 Wurmlyse 5.2 Single-Worm-PCR 5.3 Agarosegelelektrophorese 5.4 Auswertug 6. Literatur

13 1. Einleitung 1.1 Caenorhabditis elegans als Modellorganismus Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans gehört durch seine Verwendung als Modellorganismus zu den berühmtesten Vertretern der Tierwelt. Sein vollständig sequenziertes Genom bietet Grundlagen für vielseitige Forschungsansätze. Die Relevanz von C. elegans zeigte sich 2006 bei der Nobelpreisvergabe, als zum zweiten Mal die Forschungen an C. elegans ausgezeichnet wurde, diesmal für die Einführung des RNAi-Verfahrens. Der zu der Klasse der Nematoden gehörende Wurm ist ein freilebender Bewohner von Kompost und verwesenden Früchten, ist von ca. 1 mm Länge und relativ durchsichtiger Statur (Durchmesser ca. 70 µm). Er ernährt sich von Mikroben, hauptsächlich Bakterien, und sein natürliches Verbreitungsgebiet erstreckt sich über die ganze Welt. Er besitzt einen drehrunden, unsegmentierten Körperbau, obwohl er bilateralsymmetrisch organisiert ist. C. elegans ist diploid. Er besitzt fünf Paare autosomaler Chromosomen (I, II, III, IV, V) und ein Paar Geschlechts-Chromosomen (X). Es gibt zwei Geschlechter, die durch die Geschlechts-Chromosomen festgelegt werden, und zwar selbstbefruchtende Hermaphroditen (Zwitter) mit XX und Männchen mit X0, welche aber nur zu 0,05 % in normalen Laborpopulationen vorkommen. Sie sorgen für die regelmäßige Rekombination des Genoms. Beide Geschlechter weisen eine nahezu gleiche Größe (Männchen sind nur geringfügig kleiner und dünner) und sehr ähnliche Anatomie auf (Abb. 1). A B Abb. 1: Morphologie von C. elegans. A. Anatomie eines adulten Hermaphroditen. B. Anatomie eines adulten Männchens (Quelle: 13

14 C. elegans zählt zu den derzeit wichtigsten Modellorganismen, da er zahlreiche Vorteile aufweist: wenige Zellen mit konstanter Zellzahl (`Eutelie ) transparente Embryonen, bei denen man die Entstehung der einzelnen Zellen verfolgen kann einfache Anatomie und geringe Größe einfache Haltung in Petrischalen, in denen er Bakterien frisst Einfrieren und Lagerung bei 80 C und späteres Auftauen möglich Fortpflanzung hauptsächlich durch Selbstbefruchtung der erwachsenen Hermaphroditen, dadurch erhält man sehr leicht homozygot mutante Nachkommen aus einem heterozygoten erwachsenen Tier schnelle Embryonalentwicklung (die Larve schlüpft bei 20 C nach 15 h, bis zum erwachsenen Tier vergehen nochmals 50 h) 1.2 GFP als Reportergen für die Lokalisation der Genexpression im Gewebe Das Green Fluorescent Protein (GFP) stammt ursprünglich aus der pazifischen Qualle Aequorea victoria. Diesem Organismus ermöglicht das GFP Biolumineszenz mit hoher Energieausbeute, indem es Anregungsenergie aus der weniger effizienten Chemolumineszenz-Reaktion des Photoproteins Aequorin strahlungsfrei absorbiert und mit hoher Quantenausbeute abstrahlt. GFP kann rekombinant in eukaryotischen (z.b C. elegans) und bakteriellen Zellen (z.b. E. coli) exprimiert werden und zeigt direkt sichtbare Fluoreszenz, wofür es keine exogenen Substrate oder Kofaktoren benötigt. Es lässt sich somit hervorragend Chromophor als biologische Sonde zur Erforschung der Genexpression und der Proteinlokalisation in lebenden Zellen verwenden. Fusioniert man gfp mit dem Promotor des zu untersuchenden Gens und injiziert dieses Konstrukt in das Tier, so wird gfp nun unter der Kontrolle des interessierenden Promotors exprimiert. Das Protein GFP befindet sich also nur an den Orten an denen die Transkription an diesem Promotor aktiviert wird. Abb. 2: 3D-Struktur des GFP 14

15 2. Mikroinjektion Mikroinjektion ist eine effektive Methode um transgene Tiere zu erzeugen. Dabei wird DNA in den distalen Arm der Gonade injiziert (Mello et al und Mello & Fire 1995). Die distale Keimbahn von C. elegans enthält einen zentralen Kern von Cytoplasma mit vielen Keimzellnuklei (Syncytium). Später wird in der proximalen Region des Ovars eine Membran jeweils einen Kern und einen Teil des Plasmas umschließen und so eine Oocyte bilden (Abb. 3). Auf diese Weise kann DNA, welche hierhin injiziert wird, an viele Nachkommen weitergegeben werden. Das für die Injektion vorgesehene Promotor-gfp-Konstrukt besteht aus dem Promotorbereich des zu untersuchenden Gens gekoppelt an das Reportergen gfp in dem Vektor (ppd95.77). Neben diesem Konstrukt wird zusätzlich das Plasmid prf4 mit dem Selektionsmarkergen rol-6 injiziert, welches für eine veränderte Form des Kollagens kodiert (Kramer et al., 1990). Erfolgreich injizierte Würmer werden bedingt durch das Selektionsmarkergen rol-6 rollen, dadurch dass ein dominanter roller -Phänotyp hervorruft wird, bei dem die Tiere sich korkenzieherartig im Kreis drehen. Abb. 3: Optimale Position für die Injektionsnadel bei der Mikroinjektion (Mello & Fire 1995) Im Kurs soll ein aus einer Mikroinjektion hervorgegangener Stamm DH1336 untersucht werden. Dieser trägt sowohl ein elt-2::gfp-konstrukt als auch das Selektionsmarkergen rol-6. ELT-2 ist ein darmspezifischer Transkriptionsfaktor, welcher die Transkription im Darm reguliert. Deshalb wird dieser Stamm aufgrund der Promotor-Gen-Fusion im Darm fluoreszieren und aufgrund des Selektionsmarkers rollen. Das Vorhandensein der beiden Plasmide ppd95.77 und prf4 soll mittels Single-Worm-PCR nachgewiesen werden. Nur wenn diese Plasmide vorhanden sind, kann mit den entsprechenden genspezifischen Oligonukleotiden für gfp und rol-6 ein Amplifikat erzeugt werden. 15

16 3. Knock-out-Mutationen (Phäno- und Genotypanalyse) Der häufigste Laborstamm wird als "Wildtyp" oder N2 bezeichnet und stammt ursprünglich von einem Komposthaufen in der Nähe von Bristol, England. In diesem Praktikum sollen Wildtyp-Würmer und Mutanten phänotypisch und genotypisch überprüft werden. Beim Caenorhabditis Genetics Center (CGC) kann man zahlreiche Gen-Knockout-Mutanten kostenfrei beziehen. Mit Hilfe von Knock-out-Würmern können Gen- und Proteinfunktionen, sowie Interaktionen zwischen Proteinen und gar ganze Stoffwechsel- und Signaltransduktionswege aufgeklärt werden. Im Kurs werden sowohl der Wildtyp als auch eine Mutante zur Verfügung stehen, wobei die Platten auf denen sich die Würmer befinden nur mit Buchstaben beschriftet sind. Die Aufgabe besteht darin, durch Beobachtung des Phänotyps und durch genetische Analyse, die Würmer richtig zuzuordnen. Die im Kurs verwendete spp-12-mutante besitzt einen spezifischen Knock-out eines Gens, welches für ein antimikrobielles Peptid kodiert. Da dieses Gen auf dem Allel tm2963 liegt, wird der homozygote Mutanten-Stamm auch so geführt. Bei der Mutation handelt es sich um eine Deletion, einem Verlust von Nukleotiden im Gensequenzbereich (300 Basenpaare). Isoliert man die genomische DNA eines Wurms und amplifiziert mit spezifischen Oligonukleotiden den Bereich des Gens, in dem man die Mutation erwartet, lässt sich durch anschließende gelelektrophoretische Auftrennung überprüfen, ob eine Mutation (Deletion) vorliegt. Genspezifische Oligonukleotide eines Gens umspannen dann nur noch einen kleineren Bereich in der genomischen DNA und somit entsteht bei einer PCR (Polymerasekettenreaktion) ein kleineres Amplifikat, also ist im Agarosegel eine Bande auf Höhe eines niedrigeren Molekulargewichts sichtbar. Für die Genotypisierung müssen die Würmer einzeln lysiert werden, um die genomische DNA für eine PCR freizusetzen. Bei der Lyse wird zunächst die Cuticula der Würmer aufgebrochen und anschließend die Gewebe aufgeschlossen, wodurch die genomische DNA freigesetzt wird. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA durch das Enzym DNA-Polymerase zwischen zwei entgegengesetzt ausgerichteten Oligonukleotiden (Primern) in mehreren Zyklen. Jeder Zyklus besteht wiederum aus 3 Phasen mit unterschiedlichen Temperaturen. In der ersten Phase wird der DNA-Doppelstrang bei hohen Temperaturen aufgeschmolzen (Denaturieren), gefolgt von der Anlagerung der Primer bei einer Temperatur abhängig von ihrer Schmelztemperatur in der zweiten Phase 16

17 (Annealing). Die Temperatur der dritten Phase entspricht der optimalen Arbeitstemperatur der Polymerase, welche nun den komplementären DNA- Strang synthetisiert (Elongation). Als DNA-Ausgangsmaterial (Template) ist die DNA eines einzigen Wurmes ausreichend. Bei der PCR wird ein Bereich des zu untersuchenden Gens mit spezifischen Primern amplifiziert. Die entstandenen PCR-Produkte werden anschließend in einem 1,5 %igen Agarosegel (mit Ethidiumbromid) ihrer Größe nach aufgetrennt und die Banden sichtbar gemacht. In einem Agarosegel können Nukleinsäure-Fragmente elektrophoretisch proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts aufgetrennt werden. Die im elektrischen Feld zur Anode gewanderten Nukleinsäuren können durch die Einlagerung von Ethidiumbromid unter UV- Licht sichtbar gemacht werden. Mit Hilfe eines DNA-Größenstandards wird die Größe der amplifizierten DNA-Fragmente bestimmt. Anhand der Größe der Fragmente kann verifiziert werden, ob es sich bei dem lysierten Wurm um Wildtyp oder Mutante gehandelt hat. Bei der Phänotyp-Analyse werden die Würmer unter dem Binokular betrachtet und gegebenenfalls Auffälligkeiten notiert. Dazu erhalten Sie jeweils Würmer auf kleinen Petrischalen mit NGM-Medium, die mit A, B, oder C bezeichnet sind. Vergleichen Sie den Phänotyp (anatomische Merkmale oder Verhalten) der verschiedenen Stämme miteinander. 17

18 4. Material NGM-Medium (Nematode Growth Medium): (Brenner, 1974) 1 Liter - NaCl - 3 g - Agar - 17 g - Pepton /Trypton - 2,5 g - ddh 2 O - auf 972 ml auffüllen - Cholesterol in EtOH (5 mg/ml) - 1 ml..autoklavieren - 1 M CaCl 2 (autoklaviert) - 1 ml - 1 M MgSO 4 (autoklaviert) - 1 ml - 1 M Kalium-Phosphat-Puffer (autoklaviert) - 25 ml 1 M Kalium-Phosphat-Puffer, ph 6,0 1 Liter - 1 M K 2 HPO ml - 1 M KH 2 PO 4-50 ml auf ph 6,0 einstellen Wurm-Lyse: 20 µl dh 2 O 6x DNA-Lade-Puffer: - Glycerin - 50 % - EDTA - 60 mm - SDS - 6 % - Bromphenolblau - ~0,9 % - Xylencyanol - ~0,9 % eingestellt auf ph 8,0 C. elegans-stämme: - Wildtyp - N2 Bristol - spp-12(tm2963) bp Deletion im spp-12-gen - DH rme-1::gfp, rol-6 Primersequenzen: - spp-12_fwd - 5 -AACCCTATGACATCATGGAG-3 - spp-12_rev - rol-6_fwd - rol-6_rev - gfp_fwd - gfp_rev - 5 -CCCTACCTTCCACAATTAAC GCTCTCCTGTTCCGACCCTG CTTTAGATTGATTTAAAACTTC AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG GCATCACCTTCACCCTCTCCAC-3 18

19 5. Experimentelles Vorgehen Jede Gruppe erhält einen Stamm ohne zu wissen, um welchen es sich handelt. Als erstes soll durch Betrachten mit dem Binokular herausgefunden werden, ob ein roller -Phänotyp zu erkennen ist. Hierbei handelt es sich um den transgenen Stamm DH1336. Von diesem werden im Anschluss nur die rollenden Tiere gepickt und in der darauffolgenden PCR müssen dann die gfpbzw. rol-6-primer verwendet werden. Wenn keine Roller vorhanden sind, die Tiere sich also nur schlängelnd fortbewegen, so handelt es sich entweder um den Wildtyp oder die spp-12-mutante. Diese können dann mit Hilfe der Single- Worm-PCR unter Verwendung der spp-12-primer unterschieden werden. 5.1 Wurmlyse Reinigen Sie ein Mikropistill mit 70% Ethanol und trockenen Sie es mit einem Papiertuch. Nehmen Sie 5-10 adulte Würmer mit dem Wurmpicker auf und lassen Sie die Würmer in 20 µl dh 2 O gleiten. Zerkleinern Sie die Tiere mit dem Mikropistill, vergewissern Sie sich mit einem Stereomikroskop, dass alle Tiere zerkleinert sind, so dass die genomische DNA für die PCR freigesetzt ist. 5.2 Single-Worm-PCR Mit der gewonnenen DNA kann nun die PCR erfolgen. Hierfür werden die erforderlichen Bestandteile nach diesem Pipettierschema in ein Reaktionsgefäß gegeben. PCR-Ansatz: 16,5 µl ddh 2 O 2,5 µl 10 x PCR-Reaktionspuffer (-MgCl 2 ) 1 µl MgCl 2 [25 mm] 1 µl dntp-mix [je 5 mm] 0,5 µl Primer forward [10 mm] 0,5 µl Primer reverse [10 mm] 1 µl Taq-DNA-Polymerase [2,5 U/µl] 2 µl genomische DNA 25 µl 19

20 PCR-Programm: Primerkombination spp-12_fwd/rev gfp_fwd/rev rol-6_fwd/rev Fragmentlänge Wildtyp 740 bp, Mutante 440 bp 240 bp 610 bp 5.3 Agarosegelelektrophorese Zum PCR-Ansatz werden 5 µl 6x DNA-Ladepuffer gegeben und anschließend 15 µl auf ein Agarosegel aufgetragen. Dieses enthält Ethidiumbromid, welches erbgutverändernde (mutagene) Eigenschaften hat, und erfordert besondere Umsicht bei der Handhabung. Sämtliche Arbeiten dürfen nur mit Nitrilhandschuhen durchgeführt werden. Kontaminationen sind ausdrücklich zu vermeiden. Ethidiumbromid-enthaltende Substanzen sind gesondert zu entsorgen. In einer Randspur werden 5 µl des DNA- Größenstandards aufgetragen (DNA-Ladder-Mix). Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgt bei 150 V für 30 Minuten. Anschließend werden die Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht (Schutzmaßnahmen beachten!). Die Bilderfassung erfolgt durch die Kursleiter und Kopien der Gelbilder werden am Ende des Praktikums ausgegeben. 20

21 5.4 Auswertung Probe Bandengröße (bp) N2, spp-12-mutante oder DH1336? A B C Gelbild: Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse. Warum wandert DNA unter angelegter Spannung im Agarosegel? Können Sie prinzipiell jede Mutation mit der dargestellten Methodik nachweisen? 6. Literatur Mello CC, Kramer JM, Stinchcomb D, Ambros V(1991): Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10(12): Mello C, Fire A (1996): DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48: Kramer JM, French RP, Park EC, Johnson JJ (1990): The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol Cell Biol. 10(5):

22 Versuchsteil 3 Dictyostelium discoideum 1. Einleitung 1.1 Einführung in den Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum 1.2 Endocytose Phagocytose Pinocytose 1.3 Der endocytotische Transit in D. discoideum 1.4 Chemotaxis in D. discoideum 2. Experimente 2.1 Material 2.2 Chemotaktische Untersuchungen in D. discoideum 2.3 Bestimmung der Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer

23 1. Einleitung 1.1 Einführung in den Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum Die Amöbe Dictyostelium discoideum wurde 1935 im Waldboden North Carolinas entdeckt und von Raper beschrieben. In ihrem natürlichen Habitat vermehren sich die Organismen vegetativ und ernähren sich über Phagocytose von Bakterien. Sobald diese Nahrungsquelle erschöpft ist, beginnen die Einzelzellen den Botenstoff camp abzugeben, wodurch wiederum andere Zellen zur camp-abgabe stimuliert werden. Es baut sich ein Gradient auf, an dem die Zellen entlang wandern. Dieser Entwicklungszyklus (Abb. 1) führt zunächst zur Aggregation der Zellen sowie später zur Bildung eines Fruchtkörpers, in welchem die Zellen in Form von Sporen die Nahrungsknappheit überdauern können. Laborstämme, wie der im Kurs verwendete Ax2-214 (im folgenden als Ax2 oder Wildtyp bezeichnet), lassen sich, im Gegensatz zu ihren frei lebenden Verwandten, axenisch (d.h. ohne andere Lebewesen) kultivieren. Sie tragen Mutationen, welche die Pinocytose-, nicht aber die Phagocytosefähigkeit beträchtlich steigern. Abb. 1: Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum A) Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus von D. discoideum (Gerisch, 1965). B) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der einzelnen Stadien des Zyklus (Grimson & Blanton; Texas Technical University). 23

24 1.2 Endocytose Die Plasmamembran einer Zelle ist eine dynamische Struktur, deren Aufgabe es ist, die chemischen Unterschiede zwischen Cytoplasma und umgebendem Milieu aufrecht zu erhalten. Sie reguliert die Aufnahme bzw. Abgabe kleiner und großer Moleküle. Einige Moleküle wie Aminosäuren, Kohlenhydrate oder Ionen können die Plasmamembran mittels integraler Pumpen und Kanäle überwinden. Andere Makromoleküle werden über Vesikel aufgenommen, die sich von der Membran abschnüren. Dieser Vorgang wird allgemein als Endocytose bezeichnet. Endocytose geschieht durch verschiedene Mechanismen (Abb. 2), die sich in zwei Kategorien aufteilen lassen: Die als Phagocytose bezeichnete Aufnahme großer Partikel und die Pinocytose genannte Aufnahme von Flüssigkeit und darin gelösten Substanzen. Abb. 2: Unterschiedliche Formen der Endocytose Die Abbildung zeigt die wichtigsten, in D. discoideum vorkommenden endocytotischen Mechanismen (modifiziert aus: Conner & Schmid, 2003). 24

25 1.2.1 Phagocytose Phagocytose ist typischerweise bei spezialisierten Säugerzellen wie neutrophilen Granulocyten, Makrophagen und dendritischen Zellen zu beobachten. Aber auch Dictyostelium discoideum besitzt eine hohe Phagocytoserate, die sogar über der von Granulocyten liegt. Nachdem ein aufzunehmender Partikel an den entsprechenden Rezeptor gebunden hat, wird eine durch GTPasen regulierte Signalkaskade in Gang gesetzt. Hieraus resultiert eine Umlagerung des F-Aktins im Zellcortex, was zur Ausbildung von Pseudopodien führt. Diese umschließen den Partikel, verschmelzen an den Enden miteinander und entlassen so das Phagosom ins Cytoplasma der Zelle. Neben diversen GTPasen und Aktin sind noch viele andere Proteine an diesem Prozess beteiligt. So führt etwa ein Knock-out des Genes für das F-Aktin-bindende Protein Talin zu einer verminderten Phagocytoserate. Auch das Ausschalten der Synthese von Coronin, einem F- Aktin-vernetzenden Protein, vermindert die Aufnahme von Partikeln. In Säugerzellen sind weitere für die Phagocytose essentielle Proteine, namentlich Amphiphysin und Dynamin 2 bekannt Pinocytose Pinocytose ist ein in allen Zellen vorkommender Prozess, dem zwei unterschiedliche Mechanismen zugrunde liegen: die Clathrin-abhängige Pinocytose und die Clathrin-unabhängige Pinocytose. Die Endocytose über Clathrin coated vesicles (CCV) erfolgt rezeptorvermittelt (Abb. 3). In Säugerzellen werden auf diesem Weg etwa Cholesterol über LDL- Rezeptoren oder Eisen über Transferrinrezeptoren aufgenommen. Zusätzlich wird auch die Zahl von Oberflächenrezeptoren für die Zell-Zell Kommunikation auf diesem Weg reguliert. Nachdem Liganden an ihre jeweiligen Rezeptoren gebunden haben, bilden sich so genannte coated pits, die aus cytosolischen Hüllproteinen, vor allem Clathrin und Adaptorproteinen, geformt werden. Durch eine fortschreitende Ausbildung des Clathrin coats wird die Membran zunehmend gekrümmt. Die Rekrutierung von Amphiphysin und Dynamin führt schließlich zur Abschnürung des Vesikels. 25

26 Neben diesen Funktionen an der Plasmamembran können CCVs auch am Trans-Golgi-Netzwerk gefunden werden, wo sie an Transportprozessen zwischen Golgi-Apparat und Lysosomen bzw. sekretorischen Vesikeln beteiligt sind. In Dictyostelium ist Clathrin hauptsächlich am Membrantransport zwischen Kompartimenten beteiligt. Abb. 3: Bildung von Clathrin coated vesicles (CCV) Das Binden von Liganden an Rezeptoren führt zur Bildung der Clathrinhülle, wodurch eine zunehmende Membrankrümmung hervorgerufen wird. Mit Hilfe von Dynamin wird schließlich ein Vesikel abgeschnürt, dessen recycelbare Hülle aus Clathrin und Adaptorproteinen abdissoziiert und weiter prozessiert wird. (Alberts et al., 2002) Für die Clathrin unabhängige Pinocytose sind unterschiedliche Mechanismen bekannt, von denen die Makropinocytose die am ausführlichsten beschriebene Form ist. Sie ist ein konstitutiver, nicht von Rezeptoren abhängiger Vorgang. In spezialisierten Immunzellen liegt ihre Hauptaufgabe in der Aufnahme von Antigenen. In axenisch wachsenden Dictyostelium-Zellen macht die Makropinocytose den Hauptteil der Nährstoffaufnahme aus. Wie auch die Phagocytose, hängt die Makropinocytose vom subcorticalen Aktin- Cytoskelett ab. Die Filamente werden durch Aktin-modifizierende Proteine wie Cofilin oder DAip1 umstrukturiert, wodurch die Membran spezielle Strukturen für die Endocytose ausformen kann. In Dictyostelium werden Pinosomen gebildet, die sich von trichterartigen Einstülpungen der Membran abschnüren. In 26

27 Säugerzellen kann man wie in Dictyostelium circular ruffles finden, oder es bilden sich so genannte membrane ruffles aus, deren Ränder die Flüssigkeit wie eine Welle umschließen und ein Pinosom bilden. Neben Aktin, Cofilin und DAip1 sind noch zahlreiche andere, Aktin-bindende sowie regulatorische Proteine an Phago- und Makropinocytose beteiligt. 1.3 Der endocytotische Transit in Dictyostelium discoideum Die Reifung von Phago- und Pinosomen in der Dictyostelium-Zelle weist kaum Unterschiede auf. Aus diesem Grund kann deren Prozessierung hier in einem gemeinsamen Modell beschrieben werden (Abb. 4). Abb. 4: Schematische Darstellung des endocytotischen Transits in D. Discoideum (Maniak, 2003) Nach der Internalisation stellt sich das Endosom assoziiert mit F-Aktin und Coronin dar. Diese Hüllproteine dissoziieren innerhalb der ersten Minute vom Endosom ab, und es kommt zur Fusion mit Vesikeln, welche die vakuoläre H + - ATPase mit sich bringen (#2). Dies führt zu einer Ansäuerung des Lumens. Die richtige Verteilung der Protonenpumpe wird durch RabD reguliert. Ihre Inhibition durch pharmakologisch aktive Substanzen oder Mutationen führt zu einem Rückgang der Endocytoserate. Während der sauren Phase kommt es zu Fusions- und Fissionsereignissen von Vesikeln (#3). Sie dienen zum einen dem Membranrecycling, zum anderen 27

28 werden unterschiedliche Sets an lysosomalen Enzymen angeliefert. Da es zu keiner Vermischung dieser Enzymsets kommt, kann man auch hier von Recyclingprozessen (#5 und #6) ausgehen. Diese stehen unter der Kontrolle von Rab7. Etwa 30 min nach der Internalisation wird die Protonenpumpe durch Vesikel von den Endosomen abtransportiert (#7), womit eine Neutralisierung einhergeht. Erst nach der Neutralisation kommt es erneut zu Fusionsereignissen (#7, #8), die durch Proteinkinase B (PKB) und Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PIK3) reguliert werden. Nach einigen Minuten finden keine Fusionen mehr statt, was vermutlich auf die Rekrutierung einer neuen Proteinhülle zurückzuführen ist (#8). Diese besteht aus F-Aktin und Coronin sowie den Aktin-bindenden Proteinen Scar und Arp2/3. Nach und nach wird das Coronin der Hülle durch Vacuolin ersetzt. Ungefähr 60 Minuten nach der Internalisation wird der Transit durch die Exocytose nicht verwertbaren Materials abgeschlossen. Zunächst verharren die Endosomen eine Zeit lang an der Plasmamembran, erst dann folgt die Exocytose, die in Dictyostelium ein aktinabhängiger Prozess ist. Nachdem der Inhalt der Vesikel an die Umgebung abgegeben wurde, verschwindet die Proteinhülle der Endosomen vollständig. 1.4 Chemotaxis in Dictyostelium discoideum Als Chemotaxis wird die gerichtete Bewegung einer Zelle (oder eines Organismus) entlang eines chemischen Gradienten bezeichnet. So können sich etwa Bakterien und einige amöboide Zellen in Richtung einer Nahrungsquelle bewegen. Im menschlichen Körper bewegen sich Immunzellen wie Makrophagen oder Neutrophile auf Krankheitserreger zu. Auch andere, an Wundheilung und Immunantwort beteiligte Zelltypen, werden durch Signalstoffe zum entsprechenden Ziel geführt. Zusätzlich sind auch an zahlreichen morphogenetischen Veränderungen während der Entwicklung Zellbewegungen beteiligt, die durch chemische Gradienten gesteuert werden. Im Kurs wird die Amöbe Dictyostelium discoideum als Modell verwendet, um chemotaktische Bewegungen zu untersuchen. Sowohl cyclisches AMP (camp) als auch Folat führen zu einer Motilitätsänderung bei den Amöben, da beide 28

29 Botenstoffe in derselben Signalkaskade münden. Die Bedeutung von extracellulärem camp ist in 1.1 erwähnt. Folat ist ein Stoff, der von Bakterien und Hefen abgegeben wird, von denen sich Dictyostelium normalerweise ernährt. Vegetativ wachsende Zellen können Folat erkennen und so einem zur Nahrungsquelle führenden Gradienten folgen, während hungernde Zellen ausschließlich auf camp reagieren. Um auf einen chemotaktischen Reiz ansprechen zu können, müssen die Zellen entsprechende Rezeptoren auf der Zelloberfläche besitzen. Dieser Rezeptor muss wiederum an eine intrazelluläre Signalkaskade gekoppelt sein, dessen Komponenten über die letzten 20 Jahre erforscht wurden. Im Fall von camp interagiert der membranständige camp-rezeptor mit einem heterotrimeren G-Protein (D. discoideum besitzt verschiedene camp- Rezeptoren, car1-car4, die zu unterschiedlichen Zeiten bzw. Zelltypen exprimiert werden). Sobald camp am Rezeptor gebunden hat, dissoziiert das G- Protein in seine α- bzw. β,γ-untereinheiten. Freie β,γ Untereinheiten spielen eine Rolle bei der Aktivierung von Ras-Proteinen und PIK3 (Phosphatidylinositol-3-Kinasen), einer Kinase die Phosphatidylinositol-4,5- bisphosphat (PIP2) der inneren Plasmamembran phosphoryliert. Durch PIK3 akkumuliert Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphat (PIP3), welches wiederum Proteine mit einer Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH) am Zellcortex rekrutiert. Diese PH-Proteine führen zu einer Aktinpolymerisation und der Formierung eines Pseudopodiums am Vorderende der nun polarisierten Zelle (Abb. 5). Die Bindung von Folat an die Zelloberflächen-Rezeptoren aktiviert ähnliche Signal-Transduktionswege wie extrazelluläres camp, inklusive der Phosphatidylinositol-3-Kinasen und daraus resultierender Aktinpolymerisation, aber die Rezeptormoleküle für Folat und camp sind nicht identisch. Während der Rezeptor für camp mit der Gα2-Untereinheit gekoppelt ist, wird beim Folatrezeptor die Gα4-Untereinheit aktiviert. Des Weiteren konnte in Studien mit Gβ-Null-Mutanten gezeigt werden, dass bei einem externen Stimulus mit Folat es zwar zu einer spontanen Aktivierung von PIK3 kommt, allerdings erfolgte keine Aktivierung von PIP3 oder PH-Proteinen. Dadurch bleibt eine Aktinpolymerisation und eine daraus folgende Polarisation der Zelle aus. 29

30 Abb. 5: Schematische Darstellung der intrazellulären Signaltransduktionswege bei der camp-induzierten Chemotaxis in hungernden Dictyostelium discoideum. (siehe Text) (verändert nach Jin et al., 2009) 30

31 2. Experimente 2.1 Material Soerensen-Phosphatpuffer ph 6,0 2 mm Na2HPO4 14,6 mm KH2PO4 Folat-Stammlösung 100 mm Folat in 0,1 M NaOH Folat-Arbeitslösung 1 mm Folat in Soerensen-Phosphatpuffer, ph 8,0 mit 100 mm NaHCO 3 eingestellt; bei -20 C lagern camp-stammlösung 100 mm in Soerensen-Phosphatpuffer camp-arbeitslösung 1 µm in Soerensen-Phosphatpuffer Phosphat-Agarose-Platten 2% (w/v) Agarose in Soerensen- Phosphatpuffer Kulturstämme: Ax2, Gα4 -, Gβ - 5 x 10 7 bis 1 x 10 8 Zellen/mL in Soerensen- Phosphatpuffer 2.2 Chemotaktische Untersuchungen in D. discoideum In dem Versuch wird das Verhalten von nicht-hungernden, vegetativwachsenden Ax2, Gα4 - untersucht. und Gβ - Zellen gegenüber dem Lockstoff Folat Markieren Sie am Boden der Petrischale die Positionen der zu testenden Lösungen sowie die Positionen der Kulturstämme, wobei der Abstand zwischen der Zellkultur und der jeweiligen Testlösung 2 mm beträgt (siehe Abb. 6). Entlassen Sie 1 µl der Zellkultur aus der Pipette und berühren Sie die markierte Position nur mit dem Tropfen. Entlassen Sie anschließend jeweils 1 µl von 1 mm Folat bzw. 1 µl 1 µm camp und berühren Sie die Positionen nur mit dem Tropfen (siehe Abb. 6). Wechseln Sie bei jeder Zellkultur bzw. Lösung die Pipettenspitze. Tipp: Vermeiden Sie die Phosphat-Agarose-Platte mit Ihrer Pipettenspitze zu berühren, damit keine Löcher auf der Plattenoberfläche entstehen, die die Chemotaxis verlangsamen. Die Chemotaxis-Platten werden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert, Auswertung der Platten erfolgt nach 2,5 bis 3 Stunden. 31

32 Abb. 6: Versuchsaufbau des Chemotaxis-Experiments. A: Aufsicht auf die Positionen der Proben auf der Phosphat-Agarose-Platte. B: Seitenansicht der Phosphat-Agarose-Platte. Die Positionen der zu testenden Lösungen und der Kulturstämme werden am Boden der Petrischale markiert (schwarze Punkte), die Testlösungen sowie die verschiedenen Kulturstämme werden auf die entsprechenden Markierungen getropft (jeweils 1 µl). Auswertung Untersuchen Sie die Chemotaxis-Platte am Mikroskop mit dem 10x- bzw. 20x- Objektiv und dokumentieren Sie Ihre Ergebnisse in der untenstehenden Tabelle. Welche Rolle spielen die Gene, gα4 und gβ, bei der Chemotaxis? Lockstoff Ax2 Gα4 - Gβ - 1 mm Folat 1 µm camp 32

33 2.3 Bestimmung der Zellzahl mittels Neubauer-Zählkammer Aufschieben des Deckglases Die Außenstege werden mit destilliertem Wasser befeuchtet (Kammer anhauchen) und dann wird das Deckglas mit sanftem Druck von vorn auf die Zählkammer aufgeschoben (Abb. 7A). Vorsicht: Bruchgefahr des Deckglases! Die Ausbildung von Interferenzlinien (Newton'sche Ringe) zwischen den Außenstegen und dem Deckglas zeigt, dass das Deckglas richtig aufgesetzt ist. A B Abb. 7: Neubauer-Zählkammer. A. Schematische Darstellung einer Zählkammer. B. Aufsicht auf ein Zählfeld einer Zählkammer. Großquadrate sind mit 1-4 gekennzeichnet. Jedes Großquadrat umfasst 16 Kleinquadrate. Die Fläche eines Großquadrates beträgt 0,04 mm 2. Die Kammertiefe beträgt 0,1 mm. Beschicken der Zählkammer Mit einer Pipette werden ca. 15 µl der Zellsuspension aus dem Kulturkolben entnommen. Einen Tropfen der Suspension bringt man an die Stelle zwischen Deckglas und Zählkammer. Durch Kapillarwirkung füllt sich der Spalt zwischen Deckglas und Kammerboden. Noch bevor die Suspension an den Rändern des Kammerteils überquellen kann, muss die Pipettenspitze bereits wieder beiseite gezogen werden. Sind Luftblasen sichtbar oder ist die Flüssigkeit über die Ränder in die Rinnen geflossen, so muss die Kammer gereinigt und erneut beschickt werden! 33

34 Auszählen Bestimmen Sie die Zellzahl der Ax2-Kultur, indem Sie die Zellzahl in 4 Großquadraten zählen (Abb. 7B) und die Zellzahl pro ml Kultur berechnen: Zellzahl in gezählten Quadraten Fläche gezählter Quadrate [mm 2 ] x Kammertiefe [mm] = Zellen/[mm 3 ] = Zellen/[µl] Nachdem Sie die Zellzahl bestimmt haben, bereiten Sie die Ax2-Zellen für einen Chemotaxis-Versuch vor. Entnehmen Sie das entsprechende Volumen aus der Ax2-Kultur, um 5 x 10 7 Zellen zu erhalten. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 rpm für 1 min und entfernen Sie das Medium. Anschließend waschen Sie die Zellen mit 1 ml Soerensen-Phosphatpuffer, zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 3000 rpm für 1 min und entfernen Sie den Soerensen-Phosphatpuffer. Welches Volumen von Soerensen-Phosphatpuffer schlagen Sie vor, um die Zellzahl auf 1 x 10 8 Zellen/mL einzustellen? 34