Real-time PCR. Die Real-Time PCR wird in vielen Bereichen der Forschung und Diagnose eingesetzt.

Transkript

1 Fluoreszeszenzstrhlun Rel-time PCR Die Rel-Time PCR wird in vielen Bereihen der Forshun und Dinose einesetzt. Bei der Rel-Time PCR wird die Erbsubstnz (DNA oder RNA) eines Erreers nhewiesen. Sie ist n der Byerishen Lndesnstlt für Lndwirtshft (LfL) eine Routinemethode beim Nhweis von Pflnzenkrnkheiten. Imptiensflekenvirus n Host PCR-Zyklus

2 In ller Kürze Rel-time PCR Erreerspezifishe Tqmn -Gensonde und (PCR-Strter) binden ezielt n einen bestimmten Bereih der DNA des nhzuweisenden Shderreers. Die Gensonde trät einen fluoreszierenden frbstoff und einen Quenher, der zunähst, bedint durh die räumlihe Nähe, die Strhlun des s bfänt. Quenher Gensonde Erreer-DNA

3 In ller Kürze Rel-time PCR Erreerspezifishe Tqmn -Gensonde und (PCR-Strter) binden ezielt n einen bestimmten Bereih der DNA des nhzuweisenden Shderreers. Die Gensonde trät einen fluoreszierenden frbstoff und einen Quenher, der zunähst, bedint durh die räumlihe Nähe, die Strhlun des s bfänt. Dnn setzt ds Enzym Polymerse n den n n und füt DNA-Busteine n. Dbei wird leihzeiti die Gensonde nh und nh bebut. Der wird dbei vom Quenher etrennt: Der Quenher knn die Strhlun des s niht mehr bfnen Fluoreszenzstrhlun wird frei. Polymerse Polymerse Gensone Quenher

4 In ller Kürze Rel-time PCR Erreerspezifishe Tqmn -Gensonde und (PCR-Strter) binden ezielt n einen bestimmten Bereih der DNA des nhzuweisenden Shderreers. Die Gensonde trät einen fluoreszierenden frbstoff und einen Quenher, der zunähst, bedint durh die räumlihe Nähe, die Strhlun des s bfänt. Dnn setzt ds Enzym Polymerse n den n n und füt DNA-Busteine n. Dbei wird leihzeiti die Gensonde nh und nh bebut. Der wird dbei vom Quenher etrennt: Der Quenher knn die Strhlun des s niht mehr bfnen Fluoreszenzstrhlun wird frei. Polymerse Gensone Polymerse Quenher

5 Fluoreszenz In ller Kürze Rel-time PCR Erreerspezifishe Tqmn -Gensonde und (PCR-Strter) binden ezielt n einen bestimmten Bereih der DNA des nhzuweisenden Shderreers. Die Gensonde trät einen fluoreszierenden frbstoff und einen Quenher, der zunähst, bedint durh die räumlihe Nähe, die Strhlun des s bfänt. Dnn setzt ds Enzym Polymerse n den n n und füt DNA-Busteine n. Dbei wird leihzeiti die Gensonde nh und nh bebut. Der wird dbei vom Quenher etrennt: Der Quenher knn die Strhlun des s niht mehr bfnen Fluoreszenzstrhlun wird frei. Polymerse Gensone Polymerse Quenher Die Fluoreszenzstrhlun zeit die Anwesenheit des Shderreers n. Je früher die Strhlun messbr ist, desto höher ist die Shderreerkonzentrtion in der Probe. Die Freisetzun der Strhlun wird in Ehtzeit ( Rel-Time ) verfolt, über eine spezielle Geräteusstttun und Softwre emessen und ufezeihnet. Probenverdünnunen NTC = Netivkontrolle Shwellenwert PCR-Zyklus

6 Rel-time PCR Die TqMn -Rel-time PCR erfolt meist in 2 Shritten, die 30 bis 45 Ml wiederholt werden. 1) Denturierun bei. 95 C: Die beiden DNA-Sträne werden voneinnder etrennt. 2) Anheften (= Annelin) von n und Gensonde n den erreerspezifishen DNA-Bereih und Kopieren dieses Bereihs durh ds Enzym Polymerse bei. 60 C. Am Ende von Shritt 2 liet eine Verdopplun der Zhl der ursprünlih vorhndenen DNA-Abshnitte vor. 1 PCR 2 Abluf Durh ds Wiederholen von Shritt 1 und 2 (= Polymerse-Kettenrektion, PCR) kommt es zur millionenfhen Vermehrun der erreertypishen DNA-Abshnitte. D im Idelfll bei jeder Wiederholun eines PCR- Zyklus eine Verdoppelun der DNA-Abshnitte stttfindet, kommt es im Idelfll nh Wiederholunen zu einer 2 30 bis fhen Anreihun der ursprünlih vorhndenen DNA-Abshnitte.

7 Rel-time PCR Shemtishe Drstellun Vor der PCR DNA-Doppelstrn Zusmmenhlt durh Wsserstoffbrükenbindunen t t t t t t t t t t t

8 Rel-time PCR Shemtishe Drstellun Vor der PCR DNA-Doppelstrn Zusmmenhlt durh Wsserstoffbrükenbindunen t t t t t t t t t t t

9 Rel-time PCR Denturierun 95 C Durh Hitzeeinwirkun lösen sih die Wsserstoffbrükenbindunen zwishen den beiden DNA-Stränen die DNA-Sträne werden voneinnder etrennt t t t t t t t t t t t

10 Rel-time PCR Die beiden und die Gensonde lern sih n erreerspezifishe DNA-Bereihe,. 60 C t Quenher Gensonde t t t t t Der Quenher fänt die Fluoreszenzstrhlun b t t t t t t Rükwärts-

11 Rel-time PCR DNA-Synthese Die Polymerse setzt sih n die und füt DNA-Busteine n,. 60 C / 1 min Quenher Quenher t Polymerse Gensonde t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

12 Rel-time PCR DNA-Synthese Die Polymerse setzt sih n die und füt DNA-Busteine n,. 60 C / 1 min Quenher t Polymerse Gensonde t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

13 Rel-time PCR DNA-Synthese Die Polymerse setzt sih n die und füt DNA-Busteine n,. 60 C / 1 min Quenher t Polymerse Gensonde t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

14 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Gensonde wird bebut und Quenher werden etrennt Fluoreszenzstrhlun wird frei Quenher t t Gensonde Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

15 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Gensonde wird bebut und Quenher werden etrennt Fluoreszenzstrhlun wird frei Quenher t t Gensonde Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

16 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Gensonde wird bebut und Quenher werden etrennt Fluoreszenzstrhlun wird frei t Quenher t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

17 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Gensonde wird bebut und Quenher werden etrennt Fluoreszenzstrhlun wird frei Quenher t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

18 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Polymerse verlänert den DNA-Strn bis zum Ende des Strnes Quenher t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse Rükwärts-

25 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Polymerse verlänert den DNA-Strn bis zum Ende des Strnes Quenher t t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse t Rükwärts-

26 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Polymerse verlänert den DNA-Strn bis zum Ende des Strnes Quenher t t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse t Rükwärts-

27 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Polymerse verlänert den DNA-Strn bis zum Ende des Strnes Quenher t t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse t t Rükwärts-

28 Fluoreszenzstrhlun =Messsinl Rel-time PCR Die Polymerse verlänert den DNA-Strn bis zum Ende des Strnes Quenher t t t t t Polymerse t t t t t t t t t t t Polymerse t t Rükwärts-

29 Rel-time PCR Am Ende des 1. PCR-Zyklus: 2 identishe DNA-Doppelsträne t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

30 Rel-time PCR 2. PCR-Zyklus Erneute Denturierun und Trennun der DNA-Sträne 95 C t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

31 Rel-time PCR Erneute -, Gensondennlerun und Polymersektivität, Fluoreszenzstrhlun t t t t t t t t Polymerse Gensonde Quenher Polymerse t t t t t Rükwärts- t t t t t t t t Polymerse Gensonde Quenher Polymerse t t t t t Rükwärts-

32 Rel-time PCR Nh dem 2. Zyklus: 4 identishe DNA-Doppelsträne Nh n Zyklen: 2 n identishe DNA-Doppelsträne t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t

33 Rel-time PCR Durh weiteren Abbu der Gensonde während der Rel-time PCR kommt es bei Anwesenheit des Shderreers zu einer kontinuierlihen Freisetzun von Fluoreszenzstrhlun Fluoreszenzstrhlun

34 Fluoreszenzstrhlun Rel-time PCR Die Fluoreszenzstrhlun ist bhäni von der Erreerkonzentrtion: Je mehr Erreer desto früher steit die Strhlun n. Mß für die Erreerkonzentrtion ist der Cq-Wert = PCR-Zyklus, bei dem die Fluoreszenzstrhlun den Shwellenwert übersteit

35 Rel-time PCR Menenbestimmun: Durh Verleih der Cq-Werte der Proben mit denen von Stndrds beknnter Erreerkonzentrtion knn die Erreerkonzentrtion in der Probe berehnet werden Effizienz der Rel-time PCR = E Im Idelfll: E = 100 %: Verdoppelun der Zhl der DNA-Sträne bei jedem PCR-Zyklus = Amplifiktionsfktor von 2 Stndrderde Der Amplifiktionsfktor lässt sih us der Steiun der Stndrderden ( slope ) berehnen: Amplifiktionsfktor = 10-1 /Steiun Eine Steiun von nnähernd -3,32 entspriht bei dezimlen Probenverdünnunen einem Amplifiktionsfktor von 2 und einer idelen Effizienz von 100 %: E = 100 % = idele Effizienz E > 100 % = mölihe PCR-Hemmun E < 100 % = reduzierte Effizienz Probe Lo Stndrdkonzentrtion des Erreers Bestimmtheitsmß = R 2 Gibt n, wie ut die Korreltion zwishen den ermittelten Cq-Werten und der Erreerkonzentrtion ist: Mximlwert = 1 E = 99,4 % ; R2 = 0,992; Steiun = -3,336 Stndrd Probe ußerhlb des Stndrdbereihs (korrekte Menenbestimmun nur innerhlb des Stndrdbereihs)

36 Rel-time PCR Vorteile Hohe Spezifität durh Einstz von erreerspezishen n und Gensonde Hohe Sensitivität = Nhweis erinster Erreermenen durh millionenfhe DNA-Vervielfältiun Robuster und stbiler Nhweis durh kurze PCR-Produkte Exkte Quntifizierun Durh Menenbestimmun in einer frühen Phse der PCR, wenn die rößte Abhänikeit des Messwerts von der Erreerkonzentrtion eeben ist Über weiten Bereih linere Abhänikeit von der Erreerkonzentrtion Durh Verleih mit Proben (Stndrds) beknnter Konzentrtion Menenbestimmun nur im lineren Bereih der Stndrdkurve Multiplexfähikeit Mehrere Erreer werden leihzeiti in einem PCR-Anstz detektiert Ausshluss flsh netiver PCR-Erebnisse durh interne Kontrolle uf Pflnzen-DNA im selben PCR-Anstz Erkennen von PCR-Hemmunen Cq-Wert-Differenzen von eriner ls -3,3 bei dezimlen Probenverdünnunen weisen uf PCR-Hemmun hin Keine nhfolenden Anlysen - keine Elektrophorese Gerinerer Zeitbedrf Gerinere Kontmintionsefhr