Nachweis der Effekte von Endokrinwirksamen
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- Bernhard Fuhrmann
- vor 6 Jahren
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1 Nachweis der Effekte von Endokrinwirksamen Stoffen Leane Lehmann Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie Universität Würzburg Berlin
2 Endokrine Effekte Klassisches endokrines System (systemisch) Zelle A ormon Blut ormon Zelle B Parakrine Zelle A ormon Zelle B Autokrine Zelle A ormon Zelle A Neurotransmitter Zelle A AP Zelle A ormon Zelle B
3 ormone des klassischen endokrinen Systems ypothalamus-regulierende ormone ypophysenhormone Pankreashormone Gastrointestinale ormone Peptidhormone Calciumregulierende ormone Nebennierencorticoide Schildrüsenhormone Andogene Steroidhormone Estogene Progestine
4 Nachweis der Wechselwirkung 5 Proliferation/ Differenzierung 3 Co-Aktivator-/Repressorbindung Phänotyp 1 Rezeptorbindung Co-A CBP/p300 P Proteine R2 R1 mrna 2 DNA-Bindung RE TATA 4 Zielgen Reportergenexpression
5 Rezeptorbindungstests Prinzip/Varianten Radioaktiv markierter Ligand Fluoreszenzmarkierter Ligand Unmarkierter Ligand R R Einflussfaktoren Temperatur Zeit E2, 25, 0 C E1, 0 C E1, 25 C Rezeptor EPA-Guidelines für ER und AR The Journal of Biological Chemistry 258, , 1983
6 Rezeptorbindungstests Prinzip/Varianten Radioaktiv markierter Ligand Fluoreszenzmarkierter Ligand Unmarkierter Ligand R R Einflussfaktoren Temperatur Zeit E2, 25, 0 C E1, 0 C E1, 25 C Rezeptor Toxicology Letters, 158, 72-86, 2005
7 Bindung Rezeptor-Ligand DNA Prinzip/Varianten Plasmonresonanz R1 R2 R1 R2 ELISA o.ä. Electromobility shift RE RE Biochemistry 43, , 2004
8 Bindung Co-Aktivator/-repressor Prinzip/Varianten Co-A FRET Markierter Rezeptor +Markiertes Peptid R Co-A R Molecular Endocrinology,17, , 2003
9 Reportergenassays: Testsysteme Transgen Natürlich Einzeller Säuger, transient Säuger, stabil Säuger efe h,r,merα und h,r,merβ Ishikawa herα und herβ ela9903 (herα), MDA-kb2 (AR, GR) Ishikawa ER+ MCF-7 EPA-/OECD- Guidelines Einflussfaktoren Transgen Sub-Zelllinie Kulturbedingungen Art des Konstrukts Effizienz Stabilität Rezeptoren Co-Aktivatoren FKS,... Mycoplasmen Environmental ealth Perspectives 103, , 1995
10 Reportergenassays: Endpunkt mrna Prinzip/Varianten qrt-pcr Zieltranskript/PRT in MCF-7 BUS Zellen K (0,1% DMSO) 0,1 µm GEN 1 µm GEN Einflussfaktoren RNA-Qualität Quantifizierung ousekeeping-gen qpcr-methode Katja Schmalbach, unpublizierte Daten Methode: TaqMan TDLA 48 ausgewählte Transkripte Auswertung: Berechnung N0 ausgehend von NCT Darstellung: 3 unabhängige Zellkulturexperimente
11 Reportergenassays: Endpunkt Protein Prinzip/Varianten Proteinaktivität Proteinmenge E2 Plateau 1-10 nm E2 DAI Einflussfaktoren siehe Testsysteme Variabilität durch Sublinien methodisch ähnlich mrna EC50 Benchmark 4-O-E2 EQU Toxicology Letters, 158, 72-86, 2005
12 Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition Plateau 100 pm E2 Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Carcinogenesis, 29, , 2008
13 Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition DMSO Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Methods in Molecular Biololgy, 176, , 2001
14 Veränderter Phänotyp Prinzip/Varianten Zellzahl elektronisch durchflusszytometrisch photometrisch Zellzyklusverteilung Kontaktinhibition DMSO Plateau 100 pm E2 Einflussfaktoren Zellpopulation Kulturbedingungen 1 nm E2 Methods in Molecular Biololgy, 176, , 2001
15 Achtung Kinetik! andere Zelle p Bindeprotein Blut K Zielzelle K K Phänotyp R2 Co-A CBP/p300 P R1 Proteine mrna Blut RE TATA Zielgen
16 Achtung Kinetik! Beispiel Estrogene Blut Nebennieren EPA-Guidelines für Test Steroidogenese DEA SULT 3β-SD SBG DEA E2 S E2 Sulfatase DEA 3β-SD Ovarien ANDR 17β-SD E2 E1 SULT Brustdrüsenepithel Sulfatase E2 diverse 17β-SD E2-M EPA-Guidelines für Test Aromataseaktivität E1 E1 S ANDR ANDR CYP19A1 Brustdrüsenstroma E1
17 JSBMB 69, , 1999 Katja Schmalbach unveröffentlichte Ergebnisse UNI Achtung Kinetik! Beispiel Estrogene Proteinbindung Rezeptorbindungsassay E2-Kinetik in MCF-7 Zellen Steroidsulfatase-Transkript/PRT in MCF-7 BUS Zellen K (0,1% DMSO) E2 GEN GEN 0,1 µm GEN 1 µm E2 GEN Details Folie 10
18 Beispiel E2-Kinetik in MCF-7 Zellen K GEN 0,1 µm GEN 1 µm z.t. ohne Beteiligung des ER unveröffentlichte Ergebnisse Details Folie 10
19 Achtung Crosstalk! Aktivierung anderer Signalwege beeinflusst... Genexpression/Stabilität von R, CoA/R... Phosphorylierung Partner Co-A CBP/p300 P P R2 R1 Phänotyp Proteine mrna RE TATA Zielgen
20 erzlichen Dank! Fragen?
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