Analyse der toxisch induzierten Zelldegeneration in einer organotypischen Kultur der Schweineretina

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1 [Text eingeben] Stiftung zur Förderung der Erforschung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zur Einschränkung von Tierversuchen Projekt Analyse der toxisch induzierten Zelldegeneration in einer organotypischen Kultur der Schweineretina 1 PD Dr. med. Stephanie Joachim, Universitäts-Augenklinik, Ruhr-Universität Bochum Dr. rer. nat. Sven Schnichels, Universitäts-Augenklinik Tübingen 07/ /2016

2 Analyse der toxisch induzierten Zelldegeneration in einer organotypischen Kultur der Schweineretina Das Phänomen der Retinadegeneration betrifft zahlreiche Augenerkrankungen, wie das Glaukom, die Retinitis pigmentosa oder die retinale Ischämie. Da die Entstehungsprozesse dieser Erkrankungen bisher nicht vollständig verstanden sind, benötigen wir Modelle, die dazu beitragen, die pathologischen Veränderungen zu erfassen. Bisher basieren diese Studien meist auf akuten krankheitsinduzierten Tiermodellen, die eigens für die Versuche gezüchtet und getötet werden müssen. Organkulturen aus Explantaten von Retinae, gewonnen aus Augen von geschlachteten Schweinen für die Lebensmittelindustrie, bieten hier eine gute Alternative. Retinale Organkulturen zählen zu den in-vitro-modellen mit der höchsten Aussagekraft, da sich die Zellen noch in ihrem natürlichen Zellverband befinden. Darüber hinaus ist das Schweineauge dem humanen Auge in seiner Größe und Morphologie deutlich ähnlicher als das Auge von den üblichen Labortieren, wie Ratten, Mäuse oder Kaninchen. Ziel dieses Projektes ist es, dieses Modell durch die Nutzung von typischen in-vivo-stressoren so zu modifizieren, dass es als Screening-Modell für neue Therapiemethoden eingesetzt werden kann. Im Rahmen des Projekts werden zuerst drei Stressoren auf ihre Wirkung hinsichtlich des Verlusts der neuronalen Zellen, insbesondere der Ganglienzellen, in der Retina evaluiert. Hierzu werden in der Größe und Form reproduzierbare retinale Explantate histologisch auf degenerative Veränderungen der Ganglienzellen sowie der restlichen retinalen Strukturen untersucht. Zeitverlauf der Stressor-Behandlung: Am Tag 0 werden die Retinae der Schweinaugen präpariert, auf einem Insert platziert und dann in einer 6-Well-Platte kultiviert. Am ersten, vierten und sechsten Tag wird ein Medienwechsel durchgeführt. Am Tag 2 und 3 werden die Retina-Explantate mit der toxischen Substanz (Stressor) behandelt. Die Kultivierung endet am Tag 7, indem die Explantate kryokonserviert werden, um die Strukturen später mittels quantitativer real-time PCR, Western-Blot oder Histologie zu analysieren. Die erste Untersuchung ist eine Hämatoxilin- und Eosin-Übersichtsfärbung der retinalen Querschnitte, welche Veränderungen der Strukturen sichtbar machen kann (Abkürzungen: GCL = Ganglienzellschicht, IPL = innere Plexiformschicht, INL = innere Körnerschicht, OPL = äußere Plexiformschicht, ONL = äußere Körnerschicht; Maßstab = 20µm). 2

3 Bei der Degeneration spielen apoptotische und immunologische Prozesse eine Rolle. Zur Quantifizierung der Veränderung verschiedener Prozesse wie Caspasen und Gliazellen werden diese auf mrna-ebene mit Hilfe einer quantitativen real-time PCR-Analyse und auf Proteinebene unter Verwendung der Western-Blot-Methode analysiert. Mittels histologischer Analysen ist zusätzlich eine Lokalisation der Zellveränderungen in der Retina möglich. Erst wenn die Schädigungen und Veränderungen bekannt sind, die durch die Stressoren hervorgerufen worden sind, kann die optimale Wirkung für die im Anschluss geplanten Therapie-Studien bestimmt werden. Im Rahmen der Therapie-Studien werden zwei mögliche Neuroprotektiva gegen diese Stressoren exemplarisch getestet werden. Es werden mit den gleichen Methoden die RNA- Expression (quantitative real-time PCR) und die Protein-Expression (Histologie und Western-Blot) untersucht, um festzustellen welche durch die Stressoren verändert wurden. Somit ist die Auswirkung der Neuroprotektiva auf die degenerierten Retinae analysierbar. Dieses Modell kann in Zukunft als erstes Analyse-Modell für pathologische Veränderungen bei retinalen Erkrankungen wie z.b. dem Glaukom dienen. Es soll für zukünftige Untersuchungen neuer therapeutischer Substanzen sowie zur Analyse der Patho- und Wirkmechanismen eingesetzt werden und so zu einer deutlichen Verminderungen der Tierversuchszahlen beitragen. Es handelt sich folglich bei diesem Modell um den Ersatz eines Tierversuchs (Replace). Durch die Größe der Schweineaugen bietet sich noch ein entscheidender Vorteil, da aus einem Schweineauge vier vergleichbare Proben entnommen werden können. Bei Mäusen und Ratten würde die Größe und damit die Menge des Materials (Proteine, DNA und RNA) nur für eine Probe ausreichen. Die Anzahl der benötigten Tiere kann damit, gegenüber Mäusen und Ratten, um den Faktor vier reduziert werden (Reduce). Durch die Nutzung des Schweineretina-Organkultur-Modells für das Screening neuer Therapeutika lassen sich die Dosen dieser Substanzen in der Organkultur optimieren, bevor sie im Tiermodell in-vivo eingesetzt werden (Refine). 3

4 Projektleiter PD Dr. Stephanie Joachim Studium der Humanmedizin in Ulm und Mainz , Promotion Post- Doc Fellowship Alcon Laboratories Inc., Fort Worth, TX, USA Wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Experimentellen Ophthalmologie der Universitäts-Augenklinik, Universitätsmedizin Mainz Seit 2010 Leiterin des Forschungslabors der Universitäts-Augenklinik der Ruhr-Universität Bochum am Knappschaftskrankenhaus. Habilitation in Experimenteller Ophthalmologie Dr. Sven Schnichels Studium der Biologie an der Universität Hohenheim , Diplom-Biologe Anschließend Promotion zum Dr. rer. nat. an der Universität Tübingen Post-Doc an der Universitätsaugenklinik Tübingen Laborleiter für präklinische Forschung Laborleiter der Universitätsaugenklinik Tübingen seit Mitarbeiter Sandra Kühn, Dipl. Biochem. Biochemie-Studium an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald , Diplom-Biochemikerin Seit 2011 Doktorandin im Forschungslabor der Augenklinik, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum. Gesa Stute, B.Sc. Biologie-Studium an der Ruhr-Universität Bochum , Bachelor of Science Seit 2013 Mitarbeiterin im Forschungslabor der Augenklinik, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum. 4

5 Dr. José Hurst Studium Humanbiologie an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald von , Diplom in Humanbiologin Promotion in der medizinischen Virologie an der Universität Tübingen von zum Dr. rer. nat. Von Angestellte bei der Firma Life Technologies im Bereich ELISA und PCR für Diagnostik. Seit 03/2014 Post-Doc an der Universitätsaugenklinik Tübingen. Johanna Hofmann, Dipl. Ing. (FH) Studium Umwelt- und Verfahrenstechnik mit Schwerpunkt Biotechnologie an der Fachhochschule Furtwangen von , Diplom-Ingenieurin (FH) Biotechnologie. Seit 2009 angestellt an der Universitätsaugenklinik Tübingen als technische Assistentin im Forschungslabor und in der Hornhautbank. Ausführende Institution Forschungslabor, Universitäts-Augenklinik, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum, In der Schornau 23-25, Bochum Forschungslabor, Universitäts-Augenklinik Tübingen, Schleichstr 12/1, Tübingen Förderlaufzeit 07/ /2016 5