Local Run Manager-Analysemodul für die klinische CF-Sequenzierung
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- Jakob Rosenberg
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1 Local Run Manager-Analysemodul für die klinische CF-Sequenzierung Workflow-Anleitung Überblick 3 Eingeben von Laufinformationen 3 Analysemethoden 5 Anzeigen von Lauf und Ergebnissen 5 Ergebnisberichte 5 Technische Unterstützung 9 Oktober 2017 ILLUMINA EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT
2 Dieses Dokument und dessen Inhalt sind Eigentum von Illumina, Inc. und deren Partner-/Tochterunternehmen ( Illumina ) und ausschließlich für den bestimmungsgemäßen Gebrauch durch den Kunden in Verbindung mit dem Gebrauch des hier beschriebenen Produkts (der hier beschriebenen Produkte) und für keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt. Dieses Handbuch und dessen Inhalt dürfen ohne schriftliches Einverständnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw. anderweitig übermittelt, offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden. Illumina überträgt mit diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent, Markenzeichen, Urheberrecht oder bürgerlichen Recht bzw. ähnlichen Rechten an Drittparteien. Die Anweisungen in diesem Dokument müssen von qualifiziertem und entsprechend ausgebildetem Personal genau befolgt werden, damit die in diesem Dokument beschriebene Anwendung der Produkte sicher und ordnungsgemäß erfolgt. Vor der Verwendung dieser Produkte muss der Inhalt dieses Dokuments vollständig gelesen und verstanden worden sein. FALLS NICHT ALLE HIERIN AUFGEFÜHRTEN ANWEISUNGEN VOLLSTÄNDIG GELESEN UND BEFOLGT WERDEN, KÖNNEN PRODUKTSCHÄDEN, VERLETZUNGEN DER BENUTZER UND ANDERER PERSONEN SOWIE ANDERWEITIGER SACHSCHADEN EINTRETEN. ILLUMINA ÜBERNIMMT KEINERLEI HAFTUNG FÜR SCHÄDEN, DIE AUS DER UNSACHGEMÄSSEN VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE (EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE) ENTSTEHEN Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. Illumina, MiSeqDx und das Streaming-Basen-Design sind eingetragene oder angemeldete Marken von Illumina, Inc. und/oder ihren Partner-/Tochtergesellschaften in den USA und/oder anderen Ländern. Alle anderen Namen, Logos und Marken sind Eigentum der jeweiligen Eigentümer. 2
3 Überblick Das Local Run Manager CF Clinical Sequencing Analysis Module (Local Run Manager-Analysemodul für die klinische CF-Sequenzierung) ist für den Einsatz mit dem MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Assay (MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose) von Illumina vorgesehen. Der Assay erkennt Mutationen innerhalb der proteincodierenden Regionen und Intron-Exon-Grenzen des Gens Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einschließlich zweier großer Deletionen und zweier tiefer intronischer Mutationen. Das Analysemodul führt eine Sekundäranalyse und Berichtsgenerierung für Sequenzierungsläufe durch, die das Produkt MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose nutzen. Weitere Informationen hierzu finden Sie in der Packungsbeilage zu MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose (Dokument-Nr ). Das Analysemodul untersucht kurze Regionen von amplifizierter DNA oder Amplikons auf Varianten. Das fokussierte Sequenzieren von Amplikons ermöglicht eine hohe Abdeckung bestimmter Regionen über eine große Anzahl von Proben hinweg. Über diese Anleitung Diese Anleitung enthält Anweisungen zur Konfiguration der Sequenzierungs- und Analyselaufparameter für das Analysemodul für die klinische CF- Sequenzierung. Informationen zu den Dashboard- und Systemeinstellungen für Local Run Manager finden Sie im Software-Referenzhandbuch zu Local Run Manager für MiSeqDx (Dokument-Nr ). Eingeben von Laufinformationen Festlegen von Parametern 1 Melden Sie sich bei Local Run Manager an. 2 Klicken Sie auf Create Run (Lauf erstellen) und wählen Sie CF Clinical (CF Klinisch). 3 Geben Sie einen Namen ein, mit dem der Lauf von der Sequenzierung bis zur Analyse identifiziert werden kann. Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Leerzeichen, Unterstriche oder Bindestriche. 4 [Optional] Geben Sie eine Laufbeschreibung ein, die hilft, den Lauf zu identifizieren. Verwenden Sie alphanumerische Zeichen. Angeben der Proben für den Lauf Geben Sie die Proben für den Lauf an. Nutzen Sie dazu eine der folgenden Optionen: u u Enter samples manually (Manuelles Eingeben der Proben): Verwenden Sie die leere Tabelle auf dem Bildschirm Create Run (Lauf erstellen). Import samples (Importieren von Proben): Navigieren Sie zu einer externen Datei mit kommagetrennten Werten (*.csv). Im Bildschirm Create Run (Lauf erstellen) steht eine Vorlage zum Herunterladen zur Verfügung. Nachdem Sie die Probentabelle ausgefüllt haben, können Sie die Probeninformationen in eine externe Datei exportieren. Diese Datei können Sie bei der Vorbereitung von Bibliotheken als Referenz verwenden oder für einen anderen Lauf importieren. 3
4 Manuelles Eingeben der Proben 1 Geben Sie im Feld Sample Name (Probenname) einen eindeutigen Probennamen ein. Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Bindestriche oder Unterstriche. 2 Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie positive und negative Kontrollproben aus. 3 [Optional] Geben Sie in der Registerkarte Sample Description (Probenbeschreibung) eine Probenbeschreibung ein. Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Bindestriche oder Unterstriche. 4 [Optional] Wählen Sie in der Dropdown-Liste Index 1 (i7) einen Index-1-Adapter aus. Dieser Schritt ist optional, da die i7- und i5-indexkombinationen, die automatisch in die Wells eingetragen werden, bereits die Anforderungen an die Index-Diversität erfüllen. 5 [Optional] Wählen Sie in der Dropdown-Liste Index 2 (i5) einen Index-2-Adapter aus. Dieser Schritt ist optional, da die i7- und i5-indexkombinationen, die automatisch in die Wells eingetragen werden, bereits die Anforderungen an die Index-Diversität erfüllen. 6 Klicken Sie auf das Symbol Print (Drucken), um das Plattenlayout anzuzeigen. 7 Wählen Sie Print (Drucken), um das Plattenlayout auszudrucken, damit es bei der Vorbereitung von Bibliotheken als Referenz zur Verfügung steht. 8 [Optional] Klicken Sie auf Export (Exportieren), um Probeninformationen in eine externe Datei zu exportieren. 9 Klicken Sie auf Save Run (Lauf speichern). Importieren von Proben 1 Klicken Sie auf Import Samples (Proben importieren) und navigieren Sie zum Speicherort der Datei mit den Probeninformationen. Sie können zwei Dateitypen importieren. u Klicken Sie auf dem Bildschirm Create Run (Lauf erstellen) auf Template (Vorlage), um ein neues Plattenlayout zu erstellen. Die Vorlagendatei enthält die korrekten Spaltenüberschriften für den Import. Tragen Sie in jeder Spalte Informationen zu den Proben im Lauf ein. Löschen Sie die Probeninformationen in nicht genutzten Zellen und speichern Sie anschließend die Datei. u Verwenden Sie eine Datei mit Probeninformationen, die mittels der Export-Funktion aus dem Modul für die klinische CF-Sequenzierung exportiert wurde. 2 Klicken Sie auf das Symbol Print (Drucken), um das Plattenlayout anzuzeigen. 4
5 3 Wählen Sie Print (Drucken), um das Plattenlayout auszudrucken, damit es bei der Vorbereitung von Bibliotheken als Referenz zur Verfügung steht. 4 [Optional] Klicken Sie auf Export (Exportieren), um Probeninformationen in eine externe Datei zu exportieren. 5 Klicken Sie auf Save Run (Lauf speichern). Bearbeiten eines Laufs Anweisungen für das Bearbeiten der Informationen in Ihrem Lauf vor der Sequenzierung finden Sie im Software-Referenzhandbuch zu Local Run Manager für MiSeqDx (Dokument-Nr ). Analysemethoden Eine Beschreibung der Analysemethoden für MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose finden Sie in der Packungsbeilage für MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose (Dokument-Nr ). Anzeigen von Lauf und Ergebnissen 1 Klicken Sie im Dashboard von Local Run Manager auf den Laufnamen. 2 Prüfen Sie in der Registerkarte Run Overview (Laufübersicht) die Kennzahlen des Sequenzierungslaufs. 3 [Optional] Klicken Sie auf das Symbol Copy to Clipboard (In Zwischenablage kopieren), um den Pfad des Ausgabeordners des Laufs zu kopieren. 4 Klicken Sie auf die Registerkarte Sequencing Information (Sequenzierungsinformationen), um die Informationen zu Laufparametern und Verbrauchsmaterialien zu prüfen. 5 Klicken Sie auf die Registerkarte Samples and Results (Proben und Ergebnisse), um den Speicherort der Analyseergebnisdatei zu sehen. Darüber hinaus bietet die Registerkarte eine Probenliste, die Call-Rate, Leistung, Koordinaten ohne Call sowie Informationen zu Kontrollproben zusammenfasst. u Falls die Analyse wiederholt wurde, erweitern Sie die Dropdown-Liste Select Analysis (Analyse auswählen) und wählen Sie die entsprechende Analyse aus. 6 [Optional] Doppelklicken Sie auf das Feld Comment (Kommentar), um einer Probe in der Liste Anmerkungen hinzuzufügen. 7 Wählen Sie Proben in der Liste aus, um detaillierte Varianteninformationen anzuzeigen. Die Varianteninformationen werden unterhalb der Probenliste angezeigt. Weitere Informationen zu den Registerkarten Run Overview (Laufübersicht) und Sequencing Information (Sequenzierungsinformationen) sowie dazu, wie Analysen erneut in die Warteschlange gestellt werden, finden Sie im Software-Referenzhandbuch zu Local Run Manager für MiSeqDx (Dokument-Nr ). Ergebnisberichte Wenn die Sekundäranalyse abgeschlossen ist, werden die Analyseergebnisse auf der Registerkarte Samples and Results (Proben und Ergebnisse) zusammengefasst. Darüber hinaus werden die Analyseergebnisse in der tabulatorgetrennten Textdatei (Ausgabedatei) MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt für den Assay aufgeführt. 5
6 Probeninformationen Tabelle 1 Spaltenüberschrift Informationen in der Probenliste Sample Name (Probenname) Sample ID (Proben-ID) Sample Call Rate (Proben-Call- Rate) Performance (Leistung) Control (Kontrollprobe) Comment (Kommentar) Coordinates Not Called (Koordinaten ohne Call) Beschreibung Probenvarianteninformationen Der Probenname, der bei der Erstellung des Laufs angegeben wurde. Die Kombination aus dem bei der Erstellung des Laufs angegebenen Probennamen und der von der Local Run Manager-Software zugewiesenen Analyse-ID. Wenn Sie einen Lauf erneut in die Warteschlange stellen, wird der Probenname als Teil der Proben-ID beibehalten. Nur die Analyse-ID ändert sich. Dieses Feld befindet sich nur in der *.txt-datei. Die Anzahl der Variantenpositionen, die den vordefinierten Konfidenzschwellenwert erfüllen, geteilt durch die Gesamtzahl der analysierten Variantenpositionen. Die Call-Rate wird auf einer Pro-Proben-Basis und als Prozentsatz angegeben, der wie folgt berechnet wird: 1 minus [Anzahl der Variantenpositionen mit unvollständigen Calls geteilt durch die Gesamtzahl der sequenzierten Variantenpositionen]. Pass - oder Fail - Bewertung auf Basis der Call-Rate. Für eine positive Kontrollprobe: PASS (Bestanden): mit einer Call-Rate 99 % FAIL (Fehlgeschlagen): mit einer Call-Rate < 99 % Für eine negative Kontrollprobe: PASS (Bestanden): mit einer Call-Rate 10 % FAIL (Fehlgeschlagen): mit einer Call-Rate > 10 % Für eine Probe, die nicht als positive oder negative Kontrollprobe gekennzeichnet ist: PASS (Bestanden): mit einer Call-Rate 99 % FAIL (Fehlgeschlagen): mit einer Call-Rate < 99 % Die Art der Kontrollprobe, die bei der Erstellung des Laufs angegeben wurde. Die Werte sind positiv oder negativ. Ein leeres Feld bedeutet, dass es sich um eine reine Probe handelt. Ein optionales Textfeld für Kommentare. Doppelklicken Sie in das Feld Comment (Kommentar), um Anmerkungen einzugeben. In dieses Feld eingegebene Kommentare werden in der Analyseberichtsdatei MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt gespeichert. Wenn die Analyse erneut in die Warteschlange gestellt wird, wird eine neue Berichtsdatei erstellt. Kommentare aus dem vorherigen Analyselauf werden nicht in den nächsten Analyselauf übernommen. Genomische Koordinaten innerhalb der Zielregion, in der ein Call aufgrund niedriger Konfidenzwerte nicht gemeldet wurde. Tabelle 2 Spaltenüberschrift Varianten-Tabelle Variant Type (Variantentyp) Position Coordinate (Koordinate) Beschreibung Der Typ der Variante. SNV Single Nucleotide Variant (Einzelnukleotid-Variante) DIV Deletion Insertion Variant (Deletions-/Insertionsvariante) DEL Große Deletion PolyTGPolyT PolyTG/PolyT-Genotyp im CF-Gen Die genomische Position, an der die Variante gefunden wurde. Der Name des Feldes in der *.txt-datei lautet Coordinate (Koordinate). 6
7 Spaltenüberschrift Chr Chromosome (Chromosom) Frequency (Häufigkeit) Depth (Tiefe) cdna Name (HGVS) (cdna- Name (HGVS)) Protein Name (HGVS) (Protein- Name (HGVS)) dbsnp dbsnp ID (dbsnp-id) RefGene Reference (Referenz) Call Result (Ergebnis) Interpretation Filter Beschreibung Die ID des Referenz-Chromosoms. Der Name des Feldes in der *.txt-datei lautet Chromosome (Chromosom). Der Anteil der Reads der Probe, die die Variante enthalten. Wenn beispielsweise die Referenzbase an einer bestimmten Position A ist und Probe 1 60 A-Reads und 40 T-Reads hat, dann hat SNV eine Variantenhäufigkeit von 0,4. Die Anzahl der Reads einer Probe, die eine bestimmte Position abdecken. Beschreibung einer Variante auf DNA-Ebene unter Verwendung der Nomenklatur für cdna-sequenzen (codierende DNA), die von der Human Genome Variation Society (HGVS) empfohlen wird. Beschreibung einer Variante auf Proteinebene unter Verwendung der Nomenklatur für Proteinsequenzen, die von der Human Genome Variation Society (HGVS) empfohlen wird. Die dbsnp- ID der Variante. Der Name des Feldes in der *.txt-datei lautet dbsnp ID (dbsnp-id). Die Referenzbase an der genomischen Koordinate, an der die Variante vorkommt. Reference (Referenz) in der *.txt-datei. Varianten- Genotyp. SNV oder DIV: Die beiden beobachteten Allele werden beschrieben. Beispielsweise beschreibt A/T eine heterozygote SNV, bei der beide Allele, A und T, beobachtet wurden. Das Wildtyp-Allel wird zuerst aufgelistet, gefolgt von dem Varianten-Allel. Small Deletions (Kleine Deletionen): Das Varianten-Allel beschreibt das Allel mit der Deletion, zum Beispiel ATCT/A. Insertions (Insertionen): Das Varianten- Allel beschreibt das Allel mit der Insertion, zum Beispiel C/CT. DEL: Ergebnis wird als Het Deletion (Heterozygote Deletion) oder Hom Deletion Homozygote Deletion) gemeldet. PolyTGPolyT: Der tatsächliche Genotyp wird gemeldet. Der Name des Feldes in der *.txt-datei lautet Result (Ergebnis). Dieses Feld ermöglicht es dem Medizingenetiker, eine klinische Interpretation der Mutation für jede Probe anzubieten. Doppelklicken Sie auf die Spalte Interpretation, um den Wert zu bearbeiten. Wählen Sie das Symbol Save changes (Änderungen speichern), um die an der Spalte Interpretation vorgenommenen Änderungen zu speichern. Die folgenden Optionen sind in der Dropdown-Liste Interpretation verfügbar: CF CF causing (CF verursachend) MVCC Mutation of Varying Clinical Consequence (Mutation mit variierender klinischer Konsequenz) MOUS Mutation of Unknown Significance (Mutation mit unbekannter Signifikanz) NCFCM Non CF Causing Mutation (Mutation, die nicht CF verursacht) Unknown (Unbekannt) Die Kriterien für eine gefilterte Variante. Dieses Feld ist in der *.txt-datei nicht vorhanden. 7
8 Analyseergebnisdatei Die Ergebnisse in der Analyseergebnisdatei sind identisch mit dem Inhalt der Registerkarte Sample and Results (Proben und Ergebnisse). Siehe Probeninformationen auf Seite 6 und Probenvarianteninformationen auf Seite 6. 1 Wählen Sie eine der folgenden Optionen, um die Analyseergebnisdatei MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt anzuzeigen. u Klicken Sie in der Registerkarte Sample and Results (Proben und Ergebnisse) auf Export Data (Daten exportieren). u Öffnen Sie die Datei im Alignment-Ordner. Der Pfad zum Alignment-Ordner wird auf der Registerkarte Samples and Results (Proben und Ergebnisse) im Feld Analysis Folder (Analyseordner) angezeigt. Nach Abschluss der Analyse wird die Analyseergebnisdatei im Alignment-Ordner des Laufs gespeichert. Beispiel: MiSeqAnalysis\<Laufordnername>\Alignment_N\JJJJMMTT_X. X steht für die Lauf-ID. JJJJMMTT ist das Datum der Ausführung. N ist eine fortlaufende Nummer, die sich erhöht, wenn die Analyse wiederholt oder erneut in die Warteschlange gestellt wird. Tabelle 3 Spaltenüberschrift Test Run ID (Lauf-ID) Dateivorspann von MiSeqDxCF139VariantAssay.txt Run Date (Laufdatum) Analysis Version (Analyseversion) Beschreibung Beschreibt den durchgeführten Test. Lauf-ID, die zu Beginn des Sequenzierungslaufs von der MiSeq Operating Software (MOS) generiert wurde. Datum (TTMMJJ), an dem der Sequenzierungslauf in MOS gestartet wurde. Version des Local Run Manager-Analysemoduls für die klinische CF- Sequenzierung, das für die Analyse verwendet wurde. 8
9 Technische Unterstützung Wenn Sie technische Unterstützung benötigen, wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina. Website: Telefonnummern des Illumina-Kundendiensts Region Gebührenfrei Regional Nordamerika Australien Belgien China Deutschland Dänemark Finnland Frankreich Großbritannien Hongkong Irland Italien Japan Neuseeland Niederlande Norwegen Schweden Schweiz Singapur Spanien Taiwan Österreich Andere Länder Sicherheitsdatenblätter (SDS, Safety Data Sheets) sind auf der Illumina-Website unter support.illumina.com/sds.html verfügbar. Die Produktdokumentation steht auf der Illumina-Website im PDF-Format zum Herunterladen zur Verfügung. Gehen Sie zu support.illumina.com, wählen Sie ein Produkt und wählen Sie anschließend Documentation & Literature (Dokumentation und Literatur). 9
10 Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Kalifornien 92122, USA ILMN (4566) (außerhalb von Nordamerika) Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. Illumina Cambridge Limited Chesterford Research Park, Little Chesterford Saffron Walden, CB10 1XL GROSSBRITANNIEN Australischer Sponsor: Illumina Australia 1 International Court Scoresby, Victoria, 3179 Australien
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