Strukturaufklärung organischer Moleküle mit NMR-spektroskopischen Methoden

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1 Fakultät für hemie und Pharmazie Universität Regensburg Strukturaufklärung organischer Moleküle mit MR-spektroskopischen Methoden Vorlesung für das 7. Semester im WS 0304 Prof. Armin Geyer

2 Inhalt In den Kapiteln -7 geht es um die Zuordnung von Spinsystemen. In den Kapitel 8 und 9 steht die Raumstruktur und Dynamik des Moleküls im Mittelpunkt.. Informationsgehalt des MR-Spektrums Logische Verknüpfungsmuster und empirische Korrelationen 2. Strukturaufklärung mit SY-Spektren 2D-Spektroskopie als Verknüpfungsmatrix SY 3. Strukturaufklärung mit -Korrelationen MQ und long-range Korrelationen (MB) 4. Physikalische Grundlagen der Pulsspektroskopie Prinzip der magnetischen Reonanz, Bloch sches Vektormodell, rotierendes Koordiantensystem, Relaxation, Spin-Echo, Inversion Recovery 5. Zustandekommen des 2D-Spektrums Digitalisierung Vom 3 -MR zur invers detektierten -Korrelationen Polarisationstransfer, DEPT, IEPT, Zustandekommen von 2D - Korrelationenen 8. Dynamische MR-Spektroskopie Zeitskalen der Bewegung, Mittelung von MR-Daten. hemischer und konformationeller Austausch, Titration: Komplexierung, Lignad- Rezeptor-Wechselwirkungen 9. E-Spektroskopie ESY, RESY, Spindiffusion Wasserstoffbrücken Seite Ein paar wichtige Bemerkungen vorab: Übungen unter zum Runterladen. Das selbstständige Ausarbeiten von Lösungen ist die beste Kontrolle, ob man den Vorlesungsstoff verstanden hat. Die richtigen Lösungen werden in der Vorlesung vorgestellt. Die Übungen dienen der Klausurvorbereitung. Dieses Skript soll kein Ersatz für den Besuch der Vorlesung oder dem Studium eines Lehrbuches sein. Es ist nur eine knappe Übersicht über die behandelten Themengebiete. Als modernes Lehrbuch parallel zur Vorlesung empfiehlt sich: T. D. W. laridge igh-resolution MR techniques in rganic hemistry, Pergamon Press 999. Wenig moderne Methoden aber schöne Molekülbeispiele, dynamische MR-Spektroskopie finden sich in:. Günther, MR Spektroskopie (Thieme 992). Viele Methoden, leider wenig erklärt: S. Braun, S. Berger,. Kalinowski, 50 and more basic MR experiments V 998. nline: MR-GUIDE der Firma Bruker: Weiterführende Literatur: Protein MR: J.. S. Evans, Biomolecular MR Spektroskopie, xfort Uni Press 995 Vorwissen, Grundlagen Vorlesung 3. Semester Spektroskopie in der. -MR, 3 -MR, chemische Verschiebung, Integrale, chemische bzw. magnetische Äquvalenz, Spinsysteme höherer rdnung. Zur Wiederholung: M. esse, Meier, B. Zeeh, Spektroskopische Methoden in der organischen hemie, Thieme Inhalt der Vorlesung Im Rahmen dieser Vorlesung geht es um die harakterisierung organischer Molekülgerüste. Das heisst Verknüpfung, Substituenten, hiralität, Dynamik und Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Vorlesung werden nur diskrete Moleküle im gelösten Zustand betrachtet. icht behandelt werden können paramagnetische Kerne, Festkörper-MR etc. Abgrenzung zu Lehrverantaltungen der Analytischen hemie: Dort geht es um den achweis oder die Bestimmung der Konzentration bzw. der Verteilung organischer Moleküle in einer komplexen Matrix (Sensorik). Abgrenzung zu Lehrverantaltungen der Physikalischen hemie: Dort geht es um die Prinzipien der Wechselwirkung elektromagnetischer Strahlung mit Materie. äufige Abkürzungen = chemische Verschiebung, = hemische Verschiebungsdifferenz zweier Signale, I = Integral, J = Spin-Spin-Kopplung, 2 J, = 3 - -Kopplung über zwei Bindungen, M = Multiplizität, E = uclear verhauser Effect, c = Korrelationszeit Fehlt noch: 0. Magnetische Feldgradienten, Diffusion, DSY Gedankt sei allen, die durch ihre Moleküle bzw. ihre MR-Fragestellungen zum Inhalt dieses Skripts beigetragen haben. Insbesondere Frau ikola Kastner- Pustet für das Schreiben und die Ausarbeitung vieler Beispiele. Geyer, MR-Spektroskopie

3 MR-spektroskopische Strukturaufklärung in der. Informationsgehalt des MR-Spektrums, Verknüpfungsmatrix IR, Raman, UV, MR-Spektroskopie, Kristallstrukturanalyse, etc..., zahlreiche Methoden stehen uns heute für die Strukturaufklärung unbekannter neuer Moleküle zur Verfügung. Darunter gibt keine beste Methode, es kommt immer nur auf die Fragestellung an, die man (frau oder student) beantworten will. Ein paar wichtige Punkte vorab, die die MR- Spektroskopie ganz grundsätzlich von anderen Methoden unterscheidet. Im MR-Spektrum kann jedem Resonanzsignal genau ein Atom zugeordnet werden (bzw. chemisch äquivalente Atome). Das ist ein enormer Vorteil bei der Aufklärung von -Gerüsten, da man die Resonanzlinien abzählen kann. In der IR- bzw. UV- Spektroskopie gibt es keinen vergleichbaren einfachen Zusammenhang zwischen der Anzahl der Atome und der Anzahl der Linien im Spektrum. Bei sehr großen Molekülen beobachtet man jedoch sehr viele Linien im MR-Spektrum und der Vorteil kehrt sich ins Gegenteil um. Zahlreiche Resonanzlinien sind überlagert und können nicht mehr separiert (aufgelöst) werden. Da kommt uns die zweite Besonderheit der MR zu ilfe, nämlich die Langlebigkeit der angeregten Zustände. Sie erlaubt uns die Beobachtung von Kernpaaren (zweidimensionale Spektroskopie). Ein solches Paar kann beispielsweise aus einem und dem daran gebundenem bestehen. Die Wahrscheinlichkeit, dass es zufällig gleiche Frequenzpaare gibt, ist gering. Erst bei Proteinen muss man auf die dreidimensionale Spektroskopie erweitern, die "Frequenztrios" verknüpft. In dieser Tabelle nimmt nach unten die Qualität der Information von oben nach unten zu. Gleichzeitig spiegelt sie auch die historische Entwicklung des Molekülbegriffs wieder. Strukturaufklärung MR Parameter Elementaranalyse Kernisotop ur ½-Spin-Kerne:, 3, 3 P, 5, 9 F Summenformel Integral Jedes Atom erscheint genau einmal Funktionelle Gruppen Ringstrom etc. Konstitution J Atomverknüpfungen, Spinsysteme Stereostruktur Karplus etc. Topizität Konformation E Globales Minimum Dynamik Relaxation von Picosekunden bis Echtzeitmessung Wechselwirkung Titration Komplexierung Funktion Protein-MR regelbare Mehrkomponentensysteme Möglichkeit : -MR als Fingerabdruck. Identifizierung des Moleküls durch Vergleich mit Spektrenkatalog, Das funktioniert aber nur für bereits bekannte Moleküle. Möglichkeit 2: Mit Zusatzinformationen (Masse, -Analyse) zur eindeutigen Strukturaufklärung, Strukturbeweis, d. h. zu diesem Spektrum kann nur eine Molekülstruktur passen und umgekehrt..) Signallage hemische Verschiebung in ppm 2.) Relative Signalintensität (Integral) : 2 : 3 : 2 : 3 3.) Multiplizität: J-Kopplung 2 J, geminal X 3 3 J, vicinal J, heteronuclear Jedes Atom erscheint genau einmal imspektrum mit festgelegter Signalintensität und informiert über die benachbarten Atome. Geyer, MR-Spektroskopie 2 Geyer, MR-Spektroskopie 3

4 3 Ein Spinsystem besteht aus einer Gruppe von Kernen, die miteinander Koppeln. Das gezeigte Dipeptid besteht aus drei Protonenspinsystemen Probleme: - Spinsysteme höherer rdnung J AB > AB - Molekülsymmetrie gleiche / ungleiche Gruppen - Dynamische Prozesse zeitliche Mitteilung von MR-Parametern Rotation um Einfachbindungen chemischer Austausch etc. chemische Äquivalenz Isochrone Kerne mit unterschiedlicher J-Kopplung zu achbarkernen F AA'XX' F Zuordnungsstrategie Ein einfaches Beispiel: Diisopropylether magnetische Äquivalenz isochrone Kerne mit gleicher Spin-Spin-Wechselwirkung zu achbarkernen F F A 2 X 2 arte Information Logisches Verknüpfungsmuster, Ja/ein-Entscheidungen - Intensität : 6 - Multiplizität Septett 6 gleiche achbarn Weiche Information Empirische Zusammenhänge, Vergleich mit anderen Spektren ca. ppm Alkyl im -MR Je komplexer das Molekül, desto wichtiger wird die harte Information. Empirische Daten sind fehleranfällig Wenn 00 Resonanzsignale mit jeweils 99%iger Sicherheit zugeordnet werden, dann ist die Zuordnung mit 65%iger Wahrscheinlichkeit falsch. Wir wollen eine sichere Strategie der Signalzuordnung entwickeln. Diese muss auf möglichst wenig empirischer Korrelation und auf maximal viel harter Verknüpfungsinformation beruhen. Wir stellen Moleküle gewöhnlich durch über Bindungsstriche verknüpfte Atome dar. Man kann jedoch auch die Atomnummern in einer Kolonne (senkrecht) und daneben nochmal in einer Reihe (waagrecht) anordnen, um dann die Atombindungen in den jeweiligen Matrixelementen einzutragen. Genauso funktioniert die Datenbankrecherche über den omputer. Die aufgezeichnete Struktur wird in eine Verknüpfungsmatrix zerlegt und mit gespeicherten Matrizen verglichen. Eine Teilmatrix wird erstellt, wenn einige Substituenten nicht festgelegt sind. (ier z. B. Rest R) Aufgabe: Aufstellen der Verknüpfungsmatrix der aller Protonen, die über zwei oder drei Bindungen voneinander getrennt sind. Es soll nur die Abfolge der festgelegt werden. (X = Verknüpfung, leer = mehr als 3 Bindungen voneinander entfernt.) X X 6 X X D D 5 X X X 4 X X R 3 X X 2 X [ppm] 3.6. Int. 6 M Septett Dublett Die moderne MR gibt uns viele Möglichkeiten nicht nur Signale zu zählen, sondern Korrelationen (Verknüpfungen) zwischen Atomen aufzustellen. Geyer, MR-Spektroskopie 4 Die Diagonalelemente verlaufen von rechts oben nach links unten, also gespiegelt zur Matrix, wie sie uns aus der Mathematik vertraut ist (l. o. nach r. u.) Toll wäre eine experimentelle Methode, die uns von einem unbekannten Molekül eine derartige Informationsmatrix liefert. Unbekanntes Molekül Spektroskop. Experiment Verknüpfungsmatrix Gibt es dieses Messung? Ja! Geyer, MR-Spektroskopie 5

5 2. SY orrelated Spectroscopy Die Projektion entspricht dem D-Spektrum. SY-Spektren sind symmetrisch bezüglich der Diagonale. Diagonalsignale haben in beiden Dimensionen die gleiche chemische Verschiebung. Kreuzsignale haben unterschiedliche. Diese sind die Verknüpfungen auf denen die Zuordnung der Spinsysteme basiert. Technische Voraussetzung war die Entwicklung der Fouriertransform MR Puls-Spektroskopie (obelpreis R.R. Ernst, 99) A B F2 Schematische Darstellung: F: Senkrechte sog. Indirekte Dimension K AB D BB B F F2: Aquisitionsdimension D AA K AB A schematische Darstellung SY-Spektrum zum obigen Beispiel: Strategie der Signalzuordnung am Beispiel von sec. Butanol Die häufigste Problemstellung sieht so aus. Man hat einen Strukturvorschlag und die Verknüpfungsmatrix der SY-Messung. Gesucht sind die Diagonalelemente,2,3,4,5 Dabei ist nicht zu erwarten, dass die umerierung der Struktur der Abfolge der Signale im Spektrum entspricht. Diagonale Strukturvorschlag Vorgehensweise: Experiment: X 4 X X 3 X X 2 X X 5 X 2-Butanol ist ein verzweigtes Spinsystem, die Verzeigung (2) wird im SY identifiziert. 2 hat drei Kopplungspartner, daher muss es eine Spalte (Reihe) der Matrix geben, die drei Kreuzsignle hat. Damit ist 2 eindeutig zugeordnet. Zwei der drei Kreuzsignale verknüpfen 2 mit Endpunkten des Spinsystems ( und 5). Deren Unterscheidung gelingt über die Signalhöhen (Integrale) im MR. Das dritte Kreuzsignal verknüpft 2 über 3 nach 4. Geyer, MR-Spektroskopie 6 Geyer, MR-Spektroskopie 7

6 Strategie der Signalzuordnung im SY.) Bevorzugt beginnt man am Ende eines Spinsystems und folgt den Verknüpfungen bis zur nächsten Verzeigung. 2.) / / 3 Diag Kreuz Diag Kreuz etc. 3.) Vorsicht bei kleinen J, Kopplungs- konstanten. Diese zeigen nur sehr schwache Kreuzsignale im SY Vorsicht vor Artefakten (Geistersignalen) im 2D Spektrum. Diese sind in der Regel nicht symmetrisch zur Diagonale Meist wird die sog. phasensensitive Darstellung verwendet: Der Vorzeichenwechsel in der Mitte des Kreuzsignals erlaubt die präzise Bestimmung der Signallage. atürlich kann man das -MR von sec. Butanol oder der Zuckeraminosäure auch ohne SY zuordnen. Unerlässlich wird das SY aber, wenn im Molekül zweimal das selbe Spinsystem vorhanden ist. Die beiden Spinsysteme können eindeutig unterschieden werden. Beispiel: In MeD sind alle X-Protonen (X =,) gegen D ausgetauscht. Im 2D-Spektrum ist eine sichere Sequenzierung der beiden Spinsysteme möglich. Solche wiederkehrenden Spinsysteme finden sich oft bei Biopolymeren wie DA, Zuckern, Peptiden. Welche anderen Verknüpfungsmatrizen kann man messen? 3. --Korrelationen Waagrecht Protonen: Zuordnung bekannt aus SY X X 3 X 2 X Senkrecht Kohlenstoffe: 5 x 4 unsymmetrische Matrix ohne Diagonale zweidimensionale Korrelation über die heteronukleare Einfachbindungskopplung: J. Auch das Fehlen einer Korrelation ist Information. Signal 5 im -MR muß X sein (X ). Es gibt prinzipielle Unterschiede zwischen homonuklearen und heteronuklearen Verknüpfungsmatrizen: 400 Mz 400 Mz D z. B. 2 R 400 Mz n J, Diagonale 3 00 Mz n J, keine Diagonale D omonuclear eteronuclear D D D 3 Das MQ enthält viele strukturell wichtige Informationen und ist daher für unbekannte Moleküle in der Regel das erste 2D-Spektrum, das man zur and nimmt. Als erstes wird zusammen mit den Integralen aus dem -MR bilanziert, ob alle n und X (X = eteroatom) da sind. z.b.: Glucitolderivat 6 3 -Gruppen: Jeweils Integral, kein Kreuzsignal im MQ 4 - Gruppen: Jeweils Integral, Boc 3 Kreuzsignal im MQ 3 2 diastereotope 2 -Gruppen: Jeweils zweimal Integral, zwei Kreuzsignale im MQ zur selben 3 -Verschiebung 3 3 -Gruppen: Jeweils Integral 3, Kreuzsignal im MQ tert.butyl-gruppe: Integral 9, Kreuzsignal im MQ Abwesend sind auch alle, die keine tragen (, q etc.) Geyer, MR-Spektroskopie 8 Geyer, MR-Spektroskopie 9

7 Auch gelingt über das MQ die Identifizierung funktioneller Gruppen anhand ihrer charakteristischen Kohlenstoffverschiebungen, z. B. Zucker. Acetal: ~ 00 ppm ( 3 ) / 5 ppm ( ) sek. Alkohol: ~ 70 ppm ( 3 ) / 4 ppm ( ) klare Trennung keine eindeutige Unterscheidung im -MR Übersicht: Die vier wichtigsten 2D MR-Methoden SY: orrelation Spectroscopy n J, 3 J, Voraussetzung ist die über 2 oder 3 (Ausnahme 4) Bindungen vermittelte skalare Kopplung (J-Kopplung) zwischen 2 Protonen Verwendete Technik: DQF-SY (DQF = double-quantum filtered) z.b.: Teilentschütztes Galactosederivat -Korrelationen n J, J, Direkte -Korrelation. Kreuzsignale identifizieren x -Gruppen Verwendete Technik: MQ SQ single eteronuclear multiple quantum coherence 2,3 J, Long-range -Korrelation Kreuzsignale zwischen und, die über 2 oder 3 Bindungen getrennt sind Verwendete Technik MB (eteronuclear multi-bond correlation) 2D E-Spektroskopie < 4 Å Korrelation durch den Raum Verwendete Technik: ESY (uclear verhauser effect spectroscopy) RESY (Rotating frame ESY) Geyer, MR-Spektroskopie 0 Geyer, MR-Spektroskopie

8 Direkte -Korrelation Messtechnik: MQ Long-range -Korrelation Messtechnik: heteronuclear multi-bond correlation MB Das MB liefert komplementäre Informationen zu den aus homonoklearen Spektren zugänglichen Strukturinformationen. Beispiel Galactose: Im DQF-SY muss man entlang der umerierung das Spinsystem aufklären. Im MB sieht man über den Ringsauerstoff hinweg. 3 J 3 3 2,3 J Galactose 2 DQF-SY ,6' 3 J Abkürzung im MB z.b heterocyclische Ringe: SY Mes ! Das MB erlangt seine Bedeutung bei der Verknüpfung von Spinsystemen! z. B. Zucker: Man sieht die Kopplung über den glycosidischen Sauerstoff hinweg in das nächste Spinsystem hinein. Maximal über drei Bindungen. Spinsystem Spinsystem 2 Bis zu 5 Kreuzsignale! Geyer, MR-Spektroskopie 2 Geyer, MR-Spektroskopie 3

9 z.b Schutzgruppen: z.b Peptide: 3 ca. 72 ppm ( 3 ) ca. 70 ppm ( 3 ) 3 Jedes sieht die beiden zweier benachbarter Aminosäuren Sequenzierung von Proteinen / Peptiden 3 Spinsystem Spinsystem Acetonid q bei ca. 00 ppm ( 3 ) Im MQ macht man eine ganz ähnliche Entkopplung, was das Dublett des 3 Spinsystems (die beiden Satelliten) auf die Position der im MQ nicht sichtbaren 2 - gebundenen Protonen zusammenfallen läßt. 3 3 BB-Entkopplung Das heteronukleare 3 Spinsystem hat große Analogie zu dem Spinsystem zweier koppelnder Protonen (homonuklear). omonuklear: J = 0 z J = 0 z 3 Grundlage aller Kohlenstoffmessungen ist das zu einem Prozent vorhandene Isotop 3 (99% 2 haben keinen Kernspin, MR-blind). -MR: 3 -MR: Spin Spin 2 0,5% 99% - 2 Satelliten: - 3 0,5% Die 3 -Signale haben nur /64 der Signalintensität der Satelliten im -MR! eteronuklear: J = 50 z J = 50 z 50 z J 50 z Spin Spin 2 -MR: -entkoppeltes 3 -MR: -Breitbandentkopplung Singulett! Es gibt Fälle, in denen es Sinn macht, die J -Kopplungen zu messen. So besteht ein guter (empirischer) Zusammenhang zwischen der Größe der anomeren -Kopplung und der anomeren Konfiguration der Mannose. Dies ist die sicherste Methode der Konfigurationsanalyse bei Mannosiden! Im eindimensionalen 3 -MR-Spektrum beobachtet man ein Multiplett mit der selben Kopplung, die die Satelliten im -MR zeigen. Dieses wird aber in der Regel durch die sog. Breitbandentkopplung (eine schnelle Abfolge von Radiofrequenzpulsen ) im - Kanal zum Singulett entkoppelt. Geyer, MR-Spektroskopie 4 Geyer, MR-Spektroskopie 5

10 Im Unterschied zu D-Spektren, wo schwache Signale langsam im Rauschen verschwinden, bzw. schwache Kopplungen graduell nicht mehr aufgelöst werden können, gibt es bei MB-Spektren einen "Schwellenwert" oberhalb dessen Signale "plötzlich" im Spektrum erscheinen. Das hängt mit der elektronischen Prozessierung dieses 2D-Spektrums zusammen. Signal / Rauschen = S / oise Je größer S / desto eindeutigere Signale Im -MR: gradueller Übergang S ~ z Kopplungen im bereich von einem z werden zwar nicht mehr aufgelöst, sie können aber trotzdem zu einem Kruezsignal im DQF-SY führen. Diese Entkopplung ist im MB nicht durchführbar Restsignale. Im 2D-Spektrum führt die Kontourliniendarstellung zum plötzlichen Verschwinden schwacher Kreuzsignale. 3 Ja ein Die Klammer kennzeichnet die J -Korrelation im MB Der Grund dafür ist die elektronische Digitalisierung der Spektren. 3 -MR: 2 6 (65536) Datenpunkte -MR: 2 4 (6384) Datenpunkte Die Intensität des Kreuzsignals im MB ist von der Stärke der long-range-kopplung abhängig ( 2-3 J -0 z ). 2D: 2 0 oder 2 (2048) Datenpunkte in der direkten (waagrechten) Dimension 2D: 2 8 oder 2 9 (52) Datenpunkte in der indirekten (senkrechten) Dimension Beispiele: J klein, - 3 z J groß, ~ 9 z J klein, - 3 z J groß, 0 z 2048 = TD 256 oder 52 schlechtere digitale Auflösung in der senkrechten Dimension: Mehrere z Signale im 2D sind in Richtung der schlechteren digitalen Auflösung verzerrt. Geyer, MR-Spektroskopie 6 Geyer, MR-Spektroskopie 7

11 Unterscheidung zweier tetrasubstituierter Benzole als Beispiele für "-arme" -Gerüste: von Die vier geschweiften Klammern kennzeichnen die Positionen im 2D-Spektrum, an denen man die direkte -Korrelation (MQ) erwarten würde. Dort erscheint im MB das Doublett der 3 -Satelliten. Warum? Das führt uns zu einer viel elementareren Frage: Warum sieht man überhaupt ein Kreuzsignal im 2D, wenn doch das Signal im -MR nur durch die an das Isotop 2 gebundene Proton zustande kommt? Geyer, MR-Spektroskopie 8 Geyer, MR-Spektroskopie 9