Untersuhungen zur Slztolernz von Aster tripolium L. und deren Beeinflussung durh erhöhte tmosphärishe CO 2 -Konzentrtion Inugurl-Disserttion zur Erlngung des Grdes Doktor der Nturwissenshften Dr. rer. nt. m Fhereih 8 (Fhgeiet Biologie) der Justus-Lieig-Universität Gießen vorgelegt von Niole Geißler Gießen, im Oktoer 26
D 26 Dekn: Prof. Dr. Peter R. Shreiner 1. Berihtersttter: Prof. Dr. Dr. h.. Hns-Jürgen Jäger 2. Berihtersttter: Prof. Dr. Edwin Phlih
The single most importnt iologil ontriution to world pee will e to produe plnts whih grow effetively in quite slty wter. J. Bronowski (Britisher Wissenshftler und Philosoph) I n see no more importnt development in the ritil re of food needs thn plnts tolernt of slt wter. Dr. N. Borlug (Agrrwissenshftler und Friedensnoelpreisträger 197)
INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Mteril und Methoden 1 2.1 Pflnzenmteril und Pflnzenkulturen 1 2.1.1 Hydrokulturen in Open-Top-Kmmern 1 2.1.2 Gewähshus-Hydrokulturen 11 2.2 Bestimmung der Keimungsrte ei vershiedenen Slinitäten 14 2.3 Ernte der Pflnzen und Bestimmung der Whstumsprmeter 14 2.4 Bestimmung des Blttwsserpotentils 15 2.5 Gswehselmessungen 15 2.6 Bestimmung des Chlorophyll- und Crotinoidgehlts 16 2.7 Bestimmung des osmotishen Potentils 16 2.8 Bestimmung des Gehlts n Alkli- und Erdlklimetllen 16 2.9 Bestimmung des Anionengehlts 17 2.1 Bestimmung des Kohlenstoff-, Stikstoff- und Shwefelgehlts 17 2.11 Bestimmung des Kohlenhydrtgehlts 17 2.11.1 Gehlt n löslihen Gesmt-Kohlenhydrten 17 2.11.2 Gehlt n Shrose, Gluose und Frutose 18 2.12 Bestimmung des Aminosäuregehlts 18 2.13 Bestimmung des Gehlts n löslihem Gesmt-Protein 19 2.14 Anlyse des Proteoms 19 2.14.1 2D-Gelelektrophorese 19 2.14.2 Mtrix ssisted Lser Desorption Ionistion Time-of-flight Mss Spetrometry 21 (MALDI-TOF-MS) 2.15 Bestimmung der Aktivitäten ntioxidtiver Enzyme 21 2.15.1 Enzymextrktion 21 2.15.2 Bestimmung der Superoxid-Dismutse (SOD)-Aktivität 22 2.15.3 Bestimmung der Asort-Peroxidse (APO)-Aktivität 22 2.15.4 Bestimmung der Glutthion-S-Trnsferse (GST)-Aktivität 22 2.16 Bestimmung der Aktivitäten von P-ATPse, V-ATPse und F-ATPse 23 I
INHALTSVERZEICHNIS 2.17 Strukturnlytik 23 2.17.1 Lihtmikroskopie und Trnsmissionselektronenmikroskopie (TEM) 23 2.17.2 Rsterelektronenmikroskopie 25 2.18 Sttistik 25 3 Ergenisse 26 3.1 Whstumsprmeter 26 3.1.1 Keimungsrte, äußeres Ersheinungsild und Biomsseproduktion 26 3.1.2 Üerleensrte 28 3.1.3 Andere Whstumsprmeter 29 3.2 Wsserpotentil 29 3.3 Gswehsel 3 3.4 Chlorophyll- und Crotinoidgehlt 33 3.5. Osmotishes Potentil 35 3.6 Gehlt n Alkli- und Erdlklimetllen 36 3.7 Anionengehlte 4 3.8 Kohlenstoff-, Stikstoff- und Shwefelgehlt 42 3.9 Kohlenhydrtgehlt 44 3.1 Aminosäuregehlt 45 3.11 Osmotishe Bilnz 46 3.12 Gehlt n löslihem Gesmtprotein 47 3.13 Anlyse des Proteoms 48 3.13.1 Prozentule Anteile der spots (Proteinfleken) m Gesmtprotein 48 3.13.2 Identifizierung usgewählter spots 53 3.14 Bestimmung der Aktivität von Enzymen, die eine slzedingt erhöhte Expression 6 ufweisen 3.14.1 Aktivitäten ntioxidtiver Enzyme 6 3.14.1.1 Superoxid-Dismutse (SOD) 6 3.14.1.2 Asort-Peroxidse (APO) 6 3.14.1.3 Glutthion-S-Trnsferse (GST) 6 3.14.2 Aktivitäten von P-ATPse, V-ATPse und F-ATPse 63 3.15 Strukturnlytik 64 3.15.1 Blttntomie 64 3.15.2 Lef Mss to Are Rtio (LMA) 68 II
INHALTSVERZEICHNIS 3.15.3 Ultrstruktur der Blätter 69 4 Diskussion 82 5 Zusmmenfssung 1 6 Literturverzeihnis 13 Dnksgung Anhng 1 (ergänzende Versuhsergenisse zu den Sommerkulturen) Anhng 2 (Versuhsergenisse der Winterkulturen) III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Kulturnsätze [CO 2 ] 38 (52) ntürlih tmosphärishe CO 2 -Konzentrtion (erhöhte CO 2 -Konzentrtion) Kontrolle 38 (52) Kontrolle, ei ntürlih tmosphärisher CO 2 -Konzentrtion (erhöhter CO 2 - Konzentrtion) kultiviert 125 (25, 375, 5) 125 (25, 375, 5) mol m -3 NCl, ei ntürlih tmosphärisher CO 2 - NCl 38 (52) Konzentrtion (erhöhter CO 2 -Konzentrtion) kultiviert Chemiklien ACN DTT EDTA ERL FAA FMOC-Cl HEPES PIPES TCA Tris Aetonitril Dithiotreithol Ethylendimin-Tetressigsäure epoxy resin of low visosity 1,85% Formldehyd / 45% Ethnol / 5% Eisessig 9-Fluorenylmethyl-hloroformit N-2-Hydroxyethylpiperzin-N -2-ethnsulfonsäure Piperzin-N,N -is(2-ethnsulfonsäure) Trihlor-Essigsäure Tris [Hydroxymethyl] Aminomethn Sonstige Akürzungen Al APO Arg Asn Asp ATP B Bj DNA Gln Glu Gly GST HPLC HSP HW IEF Ile IPCC IPG kd Leu LHC LM LMA Alnin Asort-Peroxidse Arginin Asprgin Asprginsäure Adenosin-Triphospht Blttspreite dult Blttspreite juvenil komplementäre Desoxyrionuleinsäure ( omplementry desoyxrionulei id ) Glutmin Glutminsäure Glyin Glutthion-S-Trnsferse Hohdruk-Flüssigkeitshromtogrphie ( high pressure liquid hromtogrphy ) Hitzeshokprotein Huptwurzel Isoelektrishe Fokussierung Isoleuin Intergovernmentl Pnel on Climte Chnge immoilized ph grdient Kilodlton Leuin Lihtsmmelflle ( light hrvesting omplex ) Lihtmikroskop(ie) lef mss to re rtio IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS MALDI-TOF-MS MG NADP NW ODS PEP-Croxylse Phe pi P i PPse ppm Pro PS II REM ROS rpm Ruiso S SDS-PAGE Ser Sj SOD TEM Thr Tyr U UNEP Vl WUE mtrix ssisted lser desorption ionistion time-of-flight mss spetrometry Molekulrgewiht Niotinsäuremid-Adenin-Dinuleotid-Phospht Neenwurzel Otdeyl-Siln Phosphoenolpyruvt-Croxylse Phenyllnin isoelektrisher Punkt norgnishes Phospht Pyrophosphtse prts per million Prolin Photosystem II Rsterelektronenmikroskop(ie) rektive Suerstoff-Spezies ( retive oxygen speies ) rottions per minute Riulose-1,5-Bisphospht-Croxylse/Oxygense Blttstiel dult Ntrium-Dodeylsulft ( sodium dodeyl sulfte )-Polyrylmid- Gelelektrophorese Serin Blttstiel juvenil Superoxid-Dismutse Trnsmissionselektronenmikroskop(ie) Threonin Tyrosin units Umweltprogrmm der Vereinten Ntionen ( United Ntions Environment Progrmme ) Vlin Wssernutzungseffizienz ( wter use effiieny ) der Photosynthese V
1 EINLEITUNG 1 EINLEITUNG Die riden und semiriden Klimzonen der Erde weisen eine geringe glole Kpzität für Photosynthese und Biomsseproduktion uf (Lrher, 21), während gleihzeitig zunehmende Desertifiktion, Lnddegrdtion und nehmende Niedershlgsmengen den Nutzpflnzennu in diesen Regionen immer stärker eshränken (Choukr-Allh & Hrrouni, 1996; Immel, 26). Letzteres ist u.. uf Bodenverslzung zurükzuführen, die heute. 7% der glolen Lndflähe etrifft (Szols, 1994; Ghssemi et l., 1995; Glenn et l., 1998). Bewässertes Akerlnd ist weltweit - je nh Shätzung - sogr zu 2-5% von sekundärer Verslzung etroffen (Flowers, 1999; Tnji, 22; Hu & Shmidhlter, 25), die zumeist durh ungenügende Bewässerungsprktiken hervorgerufen wird (Choukr-Allh, 1996; Pitmn & Läuhli, 22). Als Folge von Desertifiktion und Verslzung nehmen zudem die uf der Erde ohnehin egrenzt vorhndenen Süßwsserreserven weiter (Ben-Asher, 1993; Lieth & Moshenko, 1998; Güth, 21; Hmdy, 22). Gleihzeitig wähst die Weltevölkerung zur Zeit etw lle 14 Jhre um eine weitere Millirde Menshen (Deutshe Stiftung Weltevölkerung, 25; Vereinte Ntionen, 25), ws den Bedrf n kultivierrem Akerlnd und n Süßwsser stetig erhöht. Um diese Proleme lösen zu können, empfiehlt es sih, Böden zu entslzen und sline Stndorte duerhft nutzr zu mhen. Die Erhöhung der Slz- und Trokentolernz konventioneller Nutzpflnzen durh Zühtung und Gentehnik ist islng wenig erfolgreih (Koyro & Huhzermeyer, 1999; Tester & Dvenport, 23; Flowers, 24) und ersheint somit nur sehr edingt geeignet, um ds gennnte Ziel zu erreihen. Es liegt dher nhe, nh Alterntiven zu suhen und ds ntürlihe Potentil von (Xero-) Hlophyten zu nutzen (Boer & Gliddon, 1998; Lieth et l., 1999). Hierei hndelt es sih um slztolernte Pflnzen, die n Stndorten gedeihen, welhe ntürliherweise von Slinität etroffen sind, v.. n Meeresküsten, er uh in riden und semiriden Inlndsereihen. Sie sind in der Lge, ihren gesmten Leenszyklus in NCl-reihen Sustrten zu vollenden (Shimper, 1891; Lieth, 1999). Die nhhltige lndwirtshftlihe Bewirtshftung slzhltiger Böden mit Hlophyten im Rhmen sliner Bewässerungssysteme gelngt zunehmend in ds Interesse der Forshung (Psternk, 199; Lieth et l., 1999; Koyro, 23; Liu et l., 26), denn ds Nutzungspotentil dieser Pflnzen - uh sh-rop -Hlophyten gennnt - ist groß und nur wenig usgeshöpft: Weltweit git es. 25 Hlophytenrten (Lieth et l., 1999; Koyro, 26); is heute wird nur ein Bruhteil dvon in größerem Umfng in einigen Pilotprojekten kultiviert. Dei git es vielfältige ökonomishe und ökologishe Nutzungsmöglihkeiten, z.b.: 1
1 EINLEITUNG ls Nhrungsmittel: z.b. Blätter von Aster tripolium (s.u.), Sprosse und Smen (ölhltig) von Sliorni spe., Frühte von Avienni mrin und Avienni germinns (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22); ls Nhrungspflnzen für Viehherden: z.b. vershiedene Atriplex-Arten, Sprtin lterniflor, Leptohlo fus (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22; Loh et l., 23); für Holz, Fsern und Reet: z.b. vershiedene Mngrovenrten, Tmrix spe., Sprtin lterniflor, Junus mritimus (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22); ls Zierpflnzen: z.b. Aster tripolium, Limonistrum monopetlum, Sesuvium portulstrum, Tmrix spe. (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22); zum Küstenshutz und zur Erhöhung der Biodiversität: z.b. Mngroven: Sie shützen Küstengeiete vor Erosion, Sturmfluten und Tsunmis und stellen ußerdem ein äußerst wertvolles, er uh hohgrdig gefährdetes Ökosystem dr (Hogrth, 1999; Geißler, 2; Rehenurg, 25); zum Shutz der Grund- zw. Süßwsserressouren durh die Nutzung von slinem Wsser (Boer & Gliddon, 1998; Lieth et l., 1999): Dies ist niht nur ökologish von Bedeutung, denn ds Prolem der Wsserknppheit irgt ein niht zu untershätzendes gesellshftlihes Konfliktpotentil (Güth, 21; Bohnnon, 26); zur Begrünung, Desertifiktionsekämpfung und Wiedernutzrmhung von degrdiertem Lnd: Ds Vorhndensein einer Vegettionsdeke ist ein entsheidender Fktor, um Bodenerosion und Desertifiktion zu verhindern (Ll, 21). Viele Hlophyten sind shnell whsende Pflnzen, können in kurzer Zeit unewhsenes Lnd esiedeln (z.b. Sesuvium portulstrum, Btis mritim, Mesemrynthemum rystllinum) und eignen sih dher zur Begrünung, Erosions- und Desertifiktionsekämpfung (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22; Loh et l., 23). Außerdem können sie den Slzgehlt des Bodens verringern und dmit dessen Qulität veressern (Curtero et l., 22; Ghli, 22; Loh et l., 23). Ein vielversprehender sh-rop -Hlophyt ist Aster tripolium. Für die duerhfte Nutzung eignet sih diese Art ls Nhrungsmittelpflnze (Blätter roh ls Slt oder gekoht ls Gemüse), ls Futter- und ls Zierpflnze (Güth, 21, Lieth & Mohthenko, 22). Außerdem git es vereinzelte Hinweise druf, dß die Strndster zur Heilung von Augenkrnkheiten eingesetzt werden knn (Lier Herrium II, 25). A. tripolium wird ereits in Hollnd, Belgien, Portugl und Pkistn profitel genutzt (Güth, 21, Lieth & Mohthenko, 22). In den 2
1 EINLEITUNG Niederlnden werden jährlih. 11 kg vermrktet und ls esondere Deliktesse ngeoten (Güth, 21). In Pkistn kultiviert mn sie esonders erfolgreih im Winter, wenn Ertrgsquntität und qulität nderer Arten wie z.b. Leptohlo fus deutlih sinken (Aslm et l., 1999). Die Strndster zeigt uh verglihen mit konventionellen Nutzpflnzen eine hohe Produktivität (Mrtins et l., 1999, in Güth, 21). Ihr Kohlenhydrt-, Protein- und Fettgehlt mht sie zu einer ernährungsphysiologish sehr wertvollen Pflnze (Güth, 21). Hinsihtlih ihrer duerhften Nutzung esteht llerdings ds Prolem, dß sline Stndorte ein shwer zu regulierendes System drstellen; ds Mß der Bodenentslzung sowie Ernteerträge und Nährwert vriieren ei der Strndster je nh Slinität, Bodenwssergehlt, Bodenzusmmensetzung und Lihtngeot (Mrtins et l., 1999, in Güth, 21; Bogemns, 2). Zur Zeit wird die Kultivierung von A. tripolium versuhsweise n vershiedenen Stndorten erprot, denn es existieren nur wenig Kenntnisse üer ihre Ansprühe n Stndortfktoren und Klimedingungen, üer ihre Slztolernzgrenze und Slztolernzmehnismen sowie üer die Wehseleziehungen zwishen den gennnten Fktoren. Diese Informtionen sind jedoh unverzihtr, um eine nhhltige duerhfte Nutzung zu gewährleisten und eine weitere, durh die Kultivierung hervorgerufene Bodenverslzung zu vermeiden. Während die Ansprühe der Strndster n Stndortfktoren und Klimedingungen empirish leiht zu ermitteln sind, gilt dies niht für ihre Slztolernzgrenze und Slztolernzmehnismen. Die vorliegende Studie soll dher Informtionen üer die eiden letztgennnten Fktoren liefern. Diese werden uf slinen Sustrten v.. durh folgende whstumsegrenzende Fktoren estimmt (Greenwy & Munns, 198; Mrshner, 1995; Koyro, 23): 1. Osmotishe Effekte zw. Wsserdefizit: D sline Sustrte ein niedrigeres Wsserpotentiel ufweisen ls Süßwsseröden, wird die Wsserufnhme ershwert, und es entsteht ein Wsserdefizit in der Pflnze (Kree, 1996). 2. Reduktion des CO 2 -Gswehsels: Als Rektion uf Wssermngel shließen Pflnzen die Stomt, um ihren Wsserverlust durh Trnspirtion möglihst gering zu hlten (Jmes et l., 22; in Tester & Dvenport, 23). Dies führt gleihzeitig zu einer Reduktion der CO 2 -Aufnhme in die Blätter und somit zu einer verminderten Nettossimiltion (Kree, 1996; Huhzermeyer & Koyro, 25). Letztere knn eine erhöhte Gefhr von oxidtivem Streß ewirken (Lovelok & Bll, 22). 3
1 EINLEITUNG 3. Ionentoxizität: Ein Üershuß n N + - und Cl - -Ionen im Protoplsm ewirkt Ntrium- und Chloridtoxizität, die verursht wird durh ionenspezifishe Wirkungen uf Memrneigenshften und Proteine (Kree, 1996; Shulze et l., 22) und/oder durh eine Akkumultion von NCl in der Zellwnd und nhfolgende Deydrierung (Oertli, 1968; Flowers & Yeo, 1986; Flowers et l., 1991). 4. Ionenungleihgewiht: Ein Üershuß n N + und Cl - knn zu einem Ionenungleihgewiht und somit zu Mngelersheinungen führen, d Ionen mit ähnlih hydrtisierten Rdien um Bindungsstellen von Trnsportproteinen n der Plsmmemrn und dmit um die Aufnhme in die Pflnze konkurrieren (Khn et l., 2, ; Koyro, 2; Ullrih, 22; Wyn Jones & Gorhm, 22; Tester & Dvenport, 23; Hu & Shmidhlter, 25; Liu et l., 26). Zur Vernshulihung der Mehnismen, mit deren Hilfe Hlophyten die oen gennnten Proleme ewältigen, werden in der Litertur häufig zwei Huptstrtegien gegenüergestellt, nämlih Slzusshluß (Exkluder) und Slznreiherung (Inkluder) (Mrshner, 1995; Koyro & Huhzermeyer, 23). Exkluder vermindern durh Slzusshluß Ionentoxizität und Ionenungleihgewiht, sind dfür er in esonderer Weise einem Wsserdefizit usgesetzt. Zu den slznreihernden Pflnzen gehören v.. diotyle Hlophyten, drunter lut Litertur uh Aster tripolium (Shennn et l., 1987; Mtsumur et l., 1998; Ued et l., 23). Sie vermindern ds Prolem des Wssermngels durh die Akkumultion größerer Mengen von Slz in Sproß und Blättern und sind deshl esonders geeignet, die Bodenslinität zu reduzieren. NCl dient hier der osmotishen Adpttion und mht den üerwiegenden Teil des osmotishen Potentils us (Flowers & Yeo, 1986; Glenn et l., 1999; Tester & Dvenport, 23). Inkluder sind vermehrt dem Prolem von Ionentoxizität und Ionenungleihgewiht usgesetzt. Dies eheen sie u.. durh vershiedene Prozesse, die in Verindung mit einem erhöhten Ionentrnsport stehen, z.b. durh die selektive Aufnhme essentieller Nährelemente üer Rhizodermis, Rindenprenhym oder Endodermis (Mrshner, 1995; Tester & Dvenport, 23), durh Komprtimentierung des Slzes in den Vkuolen, durh Vermeidung zu hoher NCl-Konzentrtionen in metolish esonders ktiven Geween (Wyn Jones et l., 1977; Hsegw et l., 2; Binzel & Rtjzk, 22; Wyn Jones & Gorhm, 22; Tester & Dvenport, 23) oder durh Retrnsloktion des Slzes üer ds Phloem (Lrher, 21; Tester & Dvenport, 23). Ein osmotishes Gleihgewiht zwishen den Zellkomprtimenten wird ermögliht durh die energieufwendige Synthese von komptilen Sustnzen, die im Cy- 4
1 EINLEITUNG toplsm ngereihert werden (Wyn Jones et l., 1977; Mrshner, 1995; Rhodes et l., 22; Huhzermeyer & Koyro, 25), wie z.b. von Prolin ei Aster tripolium (Gos et l., 1982; Huiskes, 1996; Mtsumur et l., 1998). Die Strndster ist lut Litertur verglihen mit nderen Inkludern mäßig slztolernt (Whstumsoptimum je nh Studie zwishen und 1 mm NCl; Shennn et l., 1987; Huiskes et l., 1991; Huiskes, 1996; Mtsumur et l., 1998). Es ist eknnt, dß ds Wsserpotentil von A. tripolium mit zunehmender Slinität nimmt (Shennn et l., 1987; Huiskes, 1996; Mtsumur et l., 1998; Ued et l., 23). Hohe Ntrium-Konzentrtionen induzieren eine Zunhme des stomtären Widerstndes üer eine Inktivierung der Klium- Einstromknäle der Shließzellen (Perer et l., 1994, 1995, 1997; Roinson et l., 1997; Véry et l., 1998; Kerstiens et l., 22), ws die Wssernutzungseffizienz trotz sinkender Assimiltionsrte veressert (Lorenzen et l., 199; Huiskes, 1996, ; Ued et l., 23). Hierus lssen sih folgende Vermutungen leiten: Die Pflnze knn ei Slinität eine positive Wsserilnz ufrehterhlten; ndererseits könnte die Anhme der stomtären Leitfähigkeit eine Urshe für die reduzierte Assimiltionsrte drstellen und uf diese Weise indirekt oxidtiven Streß hervorrufen. Dies ist insofern nheliegend, ls die Strndster zu den C 3 -Pflnzen gehört, die esonders strk von Photorespirtion und oxidtivem Streß etroffen sind. Hinsihtlih des Minerlstoffhushlts ist eknnt, dß A. tripolium keine morphologishen Merkmle wie Slzdrüsen, Blsenhre oder esonders strk usgeildete Sukkulenz esitzt, um eine üermäßige Slzkonzentrtion im Gewee zu verhindern (Perer et l., 1994). Dies erreiht sie durh NCl-Retrnsloktion in lte Blätter, die geworfen werden (Lrher, 21). Es git vereinzelte Hinweise uf ein slzedingtes Ionenungleihgewiht; im Gegenstz zu Shennn et l. (1987), Mtsumur et l. (1998) und Ued et l. (23) fnden Bogemns et l. (1995) und Huiskes (1996) einen Rükgng essentieller Nährelemente wie Klium, Klzium oder Mgnesium in den Blättern. Üer die oen gennnten Mehnismen des Ionentrnsports ist ei A. tripolium sehr wenig eknnt. Es git lediglih Hinweise uf slzedingte Veränderungen der Memrneigenshften (höherer Sulfolipidnteil; Rmni et l., 24) und uf eine erhöhte P-ATPse-Aktivität (Huhzermeyer et l., 24). Die vorliegende Studie soll die Adpttionsmehnismen von Aster tripolium n NCl- Slinität untersuhen und ermitteln, welhe der whstumseinshränkenden Fktoren (osmotishe Effekte, Reduktion des CO 2 -Gswehsels, Ionentoxizität, Ionenungleihgewiht) die Slztolernz dieses Hlophyten egrenzen. Dei werden lle drei Eenen - Gesmtpflnze, Gewee, zellulär/molekulriologish - etrhtet, uf denen Pflnzen uf NCl-Slinität regieren (Epstein, 198). Zunähst werden ökophysiologishe Prmeter us den Bereihen 5
1 EINLEITUNG Wsserhushlt, Gswehsel und Minerlstoffhushlt sowie dmit einhergehende ntomish-morphologishe Merkmle erfßt. Ds Pflnzenwhstum, welhes durh die vier gennnten Fktoren eeinflußt wird, dient ls zentrler Prmeter, um die Slztolernzgrenze zu definieren. Aufuend uf diesen Bsisdten werden folgende weiterführende Untersuhungen durhgeführt: D ei Aster tripolium uffällige morphologish-dptive Merkmle fehlen (s.o.), sollen feinere Strukturen is hin zur Ultrstruktur studiert werden. Angesihts der slzedingten Photosynthese-Reduktion sind Veränderungen n den Chloroplsten zu vermuten (Stärkelgerungen, oxidtive Shädigung der Thylkoidmemrnen), wie ereits für ndere Pflnzenrten eshrieen (Rhmn et l., 22; Mitsuy et l., 23; Fidlgo et l., 24; Prmnov et l., 24). Auh könnte es z.b. Auswirkungen geen uf die Zellwnd- und Cutiulstruktur (Shutz vor Trnspirtion und zu strker Strhlung) oder die Ausildung von Trnsferzellen (zur Ionen-Retrnsloktion) (Koyro, 22; Boughnmi et l., 23). Außerdem lssen die Rektionen von Aster tripolium uf NCl-Slinität (z.b. Assimiltionsrükgng und mögliherweise Belstung durh oxidtiven Streß, Notwendigkeit eines vermehrten Ionentrnsports) vermuten, dß die Genexpression slzedingt verändert wird. Dvon etroffen sein könnten z.b. Gene, welhe Photosyntheseenzyme, ntioxidtive Enzyme oder Ionentrnsportproteine odieren. Umgekehrt lssen sih üer qulittive und quntittive Änderungen der Genexpression Rükshlüsse uf die Bedeutung hlophytisher Awehr- zw. Adpttionsmehnismen ziehen. Dher ersheint es sinnvoll, uh ds Proteom - ds Muster der exprimierten Proteine - zu untersuhen. Aufuend uf den Ergenissen der Proteomnlyse ergänzen Aktivitätsestimmungen von Enzymen, deren Expression slzedingt hohreguliert wurde, ds Bild von den iohemishen Grundlgen der Slztolernz. Gerde hinsihtlih der molekulriologishen Regultion der Slztolernz können Hlophyten wertvolle Modelle drstellen, um Slztolernzmehnismen zu verstehen (Lisk et l., 24). D sie ntürliherweise uf slinen Stndorten gedeihen, eignen sie sih dzu esser ls eispielsweise die klssishe, er glykophytishe Modellpflnze Aridopsis thlin. So weisen z.b. Gene, die nur ei Hlophyen, niht er ei Glykophyten exprimiert werden, uf spezifish hlophytishe Eigenshften hin, die für ds Üerleen uf slinen Stndorten von großer Bedeutung sind. Mit diesem Wissen könnte uh die Erhöhung der Slztolernz konventioneller Nutzpflnzen mehr Erfolg ringen ls isher. A. tripolium ist eine Pflnze mit kleinem Genom und geringem Sekundärstoffwehsel, die keine speziellen strukturellen Adpttionen n Slinität ufweist und den C 3 -Stoffwehsel esitzt, welher uf slinen Stndorten - verglihen mit dem C 4 -Stoffwehsel - einen Nhteil drstellt. Dennoh ist die Strndster slztolernt. Dies mht sie ls eine möglihe hlophytishe Modellpflnze interessnt, die zum Vergleih mit 6
1 EINLEITUNG konventionellen C 3 -Nutzpflnzen herngezogen werden knn. Die vorliegende Studie könnte einen ersten Grundstein für die Entwiklung von A. tripolium zur C 3 -Modellpflnze legen. Bei Pflnzen dieses Stoffwehseltyps spielt unter slinen Bedingungen die Regultion des Gswehsels eine esonders große Rolle, d sie weniger wsserökonomish sind ls C 4 - Pflnzen und ein slzedingtes Shließen der Stomt die CO 2 -Aufnme stärker egrenzt. Die Regultion des Gswehsels wiederum wird u.. vom CO 2 -Konzentrtionsgrdienten zwishen der Außenluft und den Interzellulren des Blttes eeinflußt. Aufgrund der Auswirkungen von CO 2 uf Gswehsel und Wsserhushlt von C 3 -Pflnzen (s.u.) liegt es nhe, dß eine Erhöhung der tmosphärishen CO 2 -Konzentrtion die Slztolernz von Hlophyten mit C 3 -Stoffwehsel - lso uh diejenige von A. tripolium - positiv eeinflussen knn. Dies ist insofern von großer Bedeutung, ls die Konzentrtion des klimrelevnten Spurengses CO 2 in der Atmosphäre ufgrund nthropogener CO 2 -Emissionen seit Beginn der Industrilisierung um 31% von. 28 ppm uf. 37 ppm zugenommen ht und lut vershiedener Modelle is zum Jhr 21 uf 49 is 126 ppm nsteigen wird (IPCC, 21). Erhöhte CO 2 -Konzentrtion führt ei C 3 -Pflnzen zu einem steigenden CO 2 /O 2 -Prtildruk- Verhältnis im Blttinnern, zu einer reduzierten Photorespirtion und in der Regel zu einer erhöhten Netto-Assimiltionsrte (Urn, 23; Kirshum, 24; Long et l., 24; Hikosk et l., 25; Igntov et l., 25). Ddurh wird ds Risiko von oxidtivem Streß verringert. Außerdem findet mn sehr häufig eine Reduktion der stomtären Leitwerte (Hsio & Jkson, 1999; Li et l., 23; Mrhi et l., 24; Rogers et l., 24), ws zusmmen mit der höheren Assimiltionsrte uh eine gesteigerte Wssernutzungseffizienz der Photosynthese ewirkt (Amthor, 1999; Morgn et l., 21; Urn, 23). Dher sind insesondere C 3 - Pflnzen unter erhöhter CO 2 -Konzentrtion eher in der Lge, trokene und sline Stndorte zu esiedeln (Bll & Munns, 1992; Rozem, 1993; Drke et l., 1997; Fngmeier & Jäger, 21; Wullshleger et l., 22; Urn, 23). Auh im Fll von A. tripolium git es in der Litertur Hinweise druf, dß erhöhtes CO 2 den Wsserhushlt veressert (Erhöhung des Wsserpotentils); llerdings mhen die Autoren untershiedlihe Angen üer die drus resultierende Whstumsrektion dieser Pflnze (Lenssen & Rozem, 199; Rozem et l., 199; Lenssen et l., 1995). Ein CO 2 -edingter veresserter Wsserhushlt wird jedoh nur dnn ds Pflnzenwhstum erhöhen, wenn genügend Ruiso zw. Stikstoff zur Verfügung steht. D der N-Hushlt unter slinen Bedingungen oft durh eine Hemmung der Nitrtufnhme (Arshi et l., 22; Hu & Shmidhlter, 25) strk enspruht ist und erhöhte CO 2 - Konzentrtionen eenflls meistens eine N-Anhme ewirken (Idso & Idso, 21; Pl et l., 23; Tingey et l., 23; Long et l., 24; Oksnen et l., 25), könnte erhöhtes CO 2 in 7
1 EINLEITUNG dieser Hinsiht einen Nhteil für Pflnzen uf Slzstndorten drstellen. Andererseits sinkt der N-Bedrf im Zuge einer steigenden Stikstoffnutzungseffizienz CO 2 -edingt n (Fngmeier & Jäger, 21), ws die Slztolernz von Hlophyten erhöhen könnte. Fßt mn die oige Betrhtung zusmmen, ergit sih drus folgende Hypothese: Wenn der Prolemereih Wsserhushlt/Gswehsel/oxidtiver Streß die Biomsseproduktion von Aster tripolium uf slinen Stndorten egrenzt und für die Pflnze genügend Stikstoff verfügr ist, wird dieser Hlophyt von einer Zukunft mit steigendem tmosphärishen CO 2 - Gehlt profitieren. Ds wäre im Hinlik uf seine duerhfte Nutzung von großer Bedeutung. Eine erfolgreihe nhhltige Kultivierung der Strndster würde sih ndererseits dzu eignen, den negtiven Auswirkungen des glolen Klimwndels, der eine Folge des steigenden tmosphärishen CO 2 -Gehlts und des drus resultierenden Treihuseffekts drstellt (für genuere Informtionen s. IPCC, 21; Mx-Plnk-Institut für Meteorologie, 25), entgegenzuwirken. D Pflnzen CO 2 us der Luft fixieren und ls orgnishes Mteril speihern, ieten lle größeren Pflnzenpopultionen ein erhelihes Kohlenstoff- Bindungspotentil (IPCC, 21; Arnlds, 24). Die Shffung von Kohlenstoffsenken durh neu ngelegte größere Pflnzenpopultionen mindert dher den Treihuseffekt (Güth, 21; Lieth & Mohthenko, 22). D Slzmrshen ls esonders geeignet gelten, um CO 2 üer längere Zeit zu inden (Cdor et l., 22), stellen neu geshffene Hlophytenestände wirksme C-Senken dr. Ds UN-Umweltprogrmm (UNEP) ht ereits 1993 vorgeshlgen, Hlophyten zu nutzen, um CO 2 lngfristig zu sequestrieren und so den Treihuseffekt zu mindern (UNEP, 1993). Die een drgestellten Zusmmenhänge verdeutlihen, dß der Themenkomplex Interktion Slinität-CO 2 äußerst zukunftsrelevnt ist, zuml der glole Klimwndel ds Ausmß von Bodenverslzung und Desertifiktion in riden Klimzonen zunehmend vergrößert (West et l., 1994; Feddem, 1999; Yeo, 1999; IPCC, 21; O et l., 21; De Wrhien et l., 22; Zho & Zeng, 22; vn Ittersum et l., 23; Oki & Kne, 26). D isher nur wenige Untersuhungen zu diesem Them vorliegen, esteht ein hoher Bedrf n weiteren Studien, insesondere n speziellen physiologishen, molekulriologishen oder ultrstrukturellen Untersuhungen. Diese Areit soll die Hypothese, dß Aster tripolium von steigenden tmosphärishen CO 2 -Konzentrtionen profitieren wird, üerprüfen und dmit gleihzeitig die estehende Wissenslüke verkleinern. Dzu wird nhnd der uf S. 6 erläuterten Vorgehensweise (Erfssung von ökophysiologishen Prmetern sowie druf ufuende Untersuhungen der Ultrstruktur und des Proteoms) der Einfluß von NCl-Slinität uf Aster tripoli- 8
1 EINLEITUNG um unter ntürlih tmosphärisher (. 38 ppm) und erhöhter CO 2 -Konzentrtion (. 52 ppm) verglihen. 9
2 MATERIAL UND METHODEN 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Pflnzenmteril und Pflnzenkulturen Die Aster-tripolium-Pflnzen wurden us Smen herngezogen, die in der Wesermrsh in der Nähe von Cuxhven gesmmelt und nshließend üer einige Genertionen im Gewähshus vermehrt worden wren. Die Smen wurden zur Erhöhung der Keimungsrte im Kühlshrnk ufewhrt (Strtifiktion) und nshließend im Gewähshus uf feuhter Aussterde (LD 8 ls Grundsustnz; Mishung us 45% Erde, 45% Vermiulit und 1% Snd) usgelegt. Nh. zwei is drei Wohen erfolgte eine Pikierung der Pflnzen und nh. zwei Monten eine Üerführung in die endgültigen Kulturedingungen (s. Kp. 2.1.1 und 2.1.2). 2.1.1 Hydrokulturen in Open-Top-Kmmern Zur Untersuhung der Interktion zwishen Slinität und erhöhter tmosphärisher CO 2 - Konzentrtion wurden die Pflnzen in den Sommerhljhren 21 is 23 in Open-Top- Kmmern gezogen (Fngmeier et l., 1992; A. 1, ), wo sie zu einem Teil mit ntürliher CO 2 -Außenluftkonzentrtion (. 38 ppm), zum nderen Teil mit einer um. 14 ppm erhöhten CO 2 -Konzentrtion versorgt wurden. Die genuen CO 2 -Konzentrtionen in den Kmmern während der Kulturzeiträume 22 und 23 sind us A. 2 zu entnehmen. Die eiden CO 2 -Vrinten sind im folgenden durh die tiefstehenden Kürzel 38 zw. 52 gekennzeihnet. Zudem erfolgte eine Aufzeihnung der Klimdten innerhl der Open-Top-Kmmern jeweils während des Kulturzeitrums. A. 3 zeigt eispielhft die Dten der Jhre 22 und 23; ds Jhr 21 wr hinsihtlih des Klims vergleihr mit dem Jhr 23. Die Pflnzen wurden in Hydrokulturen in einem Shnelltestsystem kultiviert (modifiziert nh Koyro & Huhzermeyer, 1999). Sie stnden in Plstiktöpfen, die je 6 Liter elüftete Nährlösung enthielten und mit einer Styroporsheie gedekt wren (A. 1). Die Nährlösung (modifiziert nh Epstein, 1972) htte folgende Zusmmensetzung: 1
2 MATERIAL UND METHODEN 1 mm KNO 3 1 mm C(NO 3 ) 2 1 mm NH 4 H 2 PO 4 1 mm (NH 4 ) 2 HPO 4 1 mm MgSO 4,2 mm Fe-EDTA,25 mm H 3 BO 3,5 mm KCl,2 mm MnSO 4,2 mm ZnSO 4 Spurenelemente,5 mm CuSO 4,5 mm MoO 3 (lles gelöst in Osmosewsser). Nh einer Wohe Adpttionszeit erfolgte die Aufslzung der Pflnzen. Jeweils morgens und ends wurde der Nährlösung 5 mol m -3 NCl in fester Form zugefügt, is die erwünshten Slinitäten von 125, 25, 375 und 5 mol m -3 NCl erreiht wren (dies entspriht 25%, 5%, 75% und 1% Meerwsserslinität). Außerdem wurden Kontrollpflnzen ohne NCl-Zustz kultiviert. Eine Wohe nh Ende der Aufslzung erfolgte ein einmliger Nährlösungswehsel. Zur Vereinfhung sind die vershiedenen Slinitätsstufen im folgenden niht mit ihrer kompletten Einheit ennnt, sondern ls 125, 25, 375 zw. 5 NCl ezeihnet. 2.1.2 Gewähshus-Hydrokulturen In den Winterhljhren 21/22 und 22/23 wurden die Pflnzen im Gewähshus unter definierten Klimedingungen kultiviert. Diese Pflnzen dienten usshließlih zur Untersuhung der Slztolernz, v.. zur Kontrolle der vrileren Sommerkulturen. Die Lihtphse im Gewähshus etrug 16 Stunden ei einer Tgestempertur von 25 C (1 klx von 6 Uhr is 22 Uhr, woei sih die Lmpen ei einer ntürlihen Lihtstärke von üer 1 klx usshlteten). Während der Dunkelphse wurde die Tempertur uf 18 C hergesetzt. Die reltive Luftfeuhte etrug 65±5%. 11
2 MATERIAL UND METHODEN Die Kultivierung und Aufslzung der Pflnzen erfolgte wie in den Open-Top-Kmmern (s. Kp. 2.1.1). ) ) ) Kontrolle 125 NCl 25 NCl 375 NCl 5 NCl A. 1. Open-Top-Kmmern und Shnelltestsystem der Sommerkulturen. ) und ) Open-Top- Kmmern des Instituts für Pflnzenökologie in Gießen; ) Aster tripolium im Shnelltestsystem. Die Slinität steigt von links nh rehts. 7 6 5 [ppm] CO 2 4 3 2 1 CO 2[38], 22 CO 2[52], 22 CO 2[38], 23 CO 2[52], 23 Kultureginn 1. Erntetg A. 2. CO 2 -Konzentrtion innerhl der Open-Top-Kmmern während des Kulturzeitrumes für die Jhre 22 und 23. 12
2 MATERIAL UND METHODEN ) 35 Tempertur [ C] 3 25 2 15 1 22,9±4,2 C 25,8±3,6 C 5 Kultureginn 22 23 ) reltive Luftfeuhte [%] 9 8 7 6 5 4 3 2 53,±13,3% 5,8±8,8% 1 1. Erntetg Kultureginn 22 23 1. Erntetg ) 4 35 1279,2±84, W m -2 3 Strhlung [W m -2 ] 25 2 15 1 5 Kultureginn 22 23 181,6±98,1 W m -2 1. Erntetg A. 3. Klim innerhl der Open-Top-Kmmern während des Kulturzeitrumes für die Jhre 22 und 23. ) Tgesmittelwerte der Tempertur; ) Tgesmittelwerte der reltiven Luftfeuhte; ) Tgesmittelwerte der Strhlungsintensität. Die Zhlen geen die jeweiligen Mittelwerte üer den gesmten Kulturzeitrum n. 13 5 NCl 375 NCl
2 MATERIAL UND METHODEN 2.2 Bestimmung der Keimungsrte ei vershiedenen Slinitäten Je 1 Smen wurden im Gewähshus in Petrishlen uf Filterppier usgelegt und regelmäßig mit folgenden Lösungen efeuhtet: qu idest, qu idest. + 125 mol m -3 NCl, qu idest. + 25 mol m -3 NCl, qu idest. + 375 mol m -3 NCl, qu idest. + 5 mol m -3 NCl. Alle 1-2 Tge wurde die Anzhl der gekeimten Smen estimmt. 2.3 Ernte der Pflnzen und Bestimmung der Whstumsprmeter Nh Erreihen des stedy stte. ht Wohen nh Kultureginn wurden die drei kräftigsten Pflnzen jeder Slinitätsstufe geerntet. Nh dem Aspülen und Atroknen der Wurzeln mit qu idest. wurden ds Frishgewiht von dulten und juvenilen Blättern, von Sproß, Hupt- und Neenwurzeln sowie die Anzhl und die Flähe von dulten und juvenilen Blttspreiten ermittelt. Für die Bestimmung von Troken- und Ashegewiht, Chlorophyll, osmotishem Potentil, Anionen, C-, N- und S-Gehlt, löslihem Gesmtprotein, Kohlenhydrten und Aminosäuren wurden von dulten und juvenilen Blttspreiten (us dem Bereih der Interkostlfelder), von dulten und juvenilen Blttstielen sowie von Hupt- und Neenwurzeln Proen entnommen und eingefroren. Die Bestimmung des prozentulen Troken- und Ashegewihtsnteils und des Wssergehlts erfolgte nh Steuing und Fngmeier (1992). Außerdem wurden die orgnishe Mtrix (OM = prozentuler Anteil orgnisher Sustnz m Frishhgewiht; s. Doud et l., 23) und die lef mss to re rtio (LMA = Verhältnis Blttgewiht/Blttoerflähe; s. Koyro, 2) erehnet. 14
2 MATERIAL UND METHODEN 2.4 Bestimmung des Blttwsserpotentils Nh Erreihen des stedy stte. ht Wohen nh Kultureginn wurde ds Blttwsserpotentil junger, voll entwikelter Blätter mit einem Wesor HR 33T dew point mirovoltmeter (WESCOR In., USA) nh der Tupunktmethode estimmt. 2.5 Gswehselmessungen Die Gswehselmessungen erfolgten mit einem Porometer ( 62 portle photosynthesis system, LI-COR In., Linoln, NE, USA; von Willert et l., 1995) nh Erreihen des stedy stte. ht Wohen nh Kultureginn. Die Messungen wurden n jungen, voll entwikelten Blättern unter den jeweils herrshenden Außenedingungen durhgeführt. Es wurden Lihtsättigungskurven ei einer photosynthetish ktiven Strhlung von is 2 µmol m -2 s -1 ufgenommen. Ds Meßgerät ermittelte ei Lihtsättigung (. 15 µmol Photonen m -2 s - 1 ) die Photosyntheserte, den stomtären Widerstnd, die Trnspirtion und die CO 2 - Konzentrtion in der Außenluft und im Blttinnern (Formeln zur Berehnung s. LI-COR, 199). Die Berehnung des Lihtkompenstionspunktes (I ), der Lihtstärke, ei der die Photosynthese gesättigt wr (I s ), und der photosynthetishen Effizienz ( pprent quntum yield of photosyntheti CO 2 ssimiltion, Φ, = mol ssimiliertes CO 2 /mol sorierte Qunten) erfolgte mit Hilfe folgender Exponentilfunktion (Shulte et l., 23): f(x)=-exp[*(-x)]* woei: f(x)=nettophotosyntheserte [µmol CO 2 m -2 s -1 ]; x=photosynthetish ktive Strhlung [µmol m -2 s -1 ]; =mximle Nettophotosyntheserte ei Lihtsättigung (A mx) in [µmol CO 2 m -2 s -1 ]; und =Prmeter der oigen Exponentilfunktion. I, I s und Φ lssen sih folgendermßen erehnen: I =ln(/)*(-1/) [µmol m -2 s -1 ] I s =ln(,1*/)*(-1/) [µmol m -2 s -1 ] Φ =exp[(-i )]* = Steigung der Lihtsättigungskurve m I [mol CO 2 mol -1 Qunten] 15
2 MATERIAL UND METHODEN 2.6 Bestimmung des Chlorophyll- und Crotinoidgehlts Die Bestimmung des Chlorophyll--, Chlorophyll-- und Crotinoidgehlts erfolgte mittels Aeton-Extrktion nh Lihtenthler & Wellurn (1983) mit folgender Modifiktion: Nh eiden Extrhierungsshritten wurden die Üerstände üer eine Vkuumpumpe in ein großes Regenzgls filtriert und uf 2 ml ufgefüllt. Ein DU-6 Spetrophotometer (Bekmn Coulter In., Fullerton, USA) diente zur Messung der Extinktion ei 663, 646 und 47 nm. Die Pigmentgehlte wurden nh Lihtenthler (1987) erehnet. 2.7 Bestimmung des osmotishen Potentils Aus den Proen wurde zunähst nh der von Koyro (2) eshrieenen Methode Preßsft gewonnen, der zur Messung diente. Die Bestimmung des osmotishen Potentils erfolgte mit einem Kryoskop (Osmomt 3, Gonote GmH, Berlin). 2.8 Bestimmung des Gehlts n Alkli- und Erdlklimetllen Zur quntittiven Bestimmung von Ntrium, Klium, Klzium und Mgnesium mittels Flmmen-Atomsorptionsspektrometrie wurde dsjenige Pflnzenmteril verwendet, ds zuvor der Bestimmung von Troken- und Ashegewiht gedient htte. Die Proen wurden mit 32%iger Slpetersäure ufgeshlossen (Steuing & Fngmeier, 1992) und mit einem Flmmen-Atomsorptionsspektrometer (PE 21, Perkin Elmer, Wellesley, USA) nlysiert. Aus den Ntrium- und Kliumgehlten ließ sih die K/N-Selektivität nh folgender Formel erehnen: K K/N-Selektivität = K innen ußen N * N innen ußen (Pitmn, 1965) 16
2 MATERIAL UND METHODEN 2.9 Bestimmung des Anionengehlts Der Gehlt n Chlorid, Nitrt, Phospht und Sulft wurde per Anionenhromtogrphie (Ionenustush-Chromtogrphie) estimmt. Als Proen dienten eingefrorene Preßsäfte (s. Kp. 2.7), die mit Reinstwsser verdünnt und durh,45 µm Cellulose-Aett-Filter (OE 67, Shleiher & Shuell, Dssel) filtriert wurden. Die Anlyse erfolgte in einem 69 Ion Chromtogrph (mit 697 IC Pump und 698 Autosmpler, Metrohm, Herisu, Shweiz) üer eine Anionensäule PRP X-1 (Hmilton Compny, Reno, USA) nh der Methode von Högy (22). Dvon weihend diente ein p- Hydroxyenzoesäure/Benzot-Eluent (2,5 mm p-hydroxyenzoesäure + 1 mm Ntriumenzot + 2,5% Methnol, ph 8,5) ls moile Phse, dessen Flußrte 2,5 ml pro Minute etrug. Die Chromtogrmme wurden mit Hilfe des Computerprogrmms Str Chromtogrphy Worksttion, Version 5.5 (Vrin In., USA) usgewertet. 2.1 Bestimmung des Kohlenstoff-, Stikstoff- und Shwefelgehlts Ds getroknete und zu feinem Pulver gemhlene Pflnzenmteril wurde in Tiegel eingewogen und mit einer äquivlenten Menge Wolfrmoxid üershihtet, um den Verrennungsprozeß zu erleihtern. Die Anlyse der Proen erfolgte im Elementrnlystor vrio MAX CNS (Elementrnlysensysteme GmH, Hnu) nh dem Prinzip der ktlytishen Rohrverrennung. 2.11 Bestimmung des Kohlenhydrtgehlts 2.11.1 Gehlt n löslihen Gesmt-Kohlenhydrten Es wurde eine Gesmtzukerestimmung (Phenol-Shwefelsäure-Methode nh Kleer et l., 1987 und Wegmnn, 1998) durhgeführt, woei zur Anlyse verdünnter Preßsft (s. Kp. 2.7) diente. Die Messung der Extinktion ei 49 nm erfolgte in einem DU-6 Spetrophotometer (Bekmn Coulter In., Fullerton, USA). 17
2 MATERIAL UND METHODEN 2.11.2 Gehlt n Shrose, Gluose und Frutose Zunähst wurden die Kohlenhydrte nh der von Günther (24) eshrieenen Methode in qu idest. extrhiert. Anshließend erfolgte die Bestimmung des Gehlts n Shrose, Gluose und Frutose mit Hilfe der Test-Komintion Shrose/D-Gluose/D-Frutose (Boehringer Mnnheim GmH) nh Günther (24; modifiziert nh Boehringer Mnnheim GmH, o.j.; s. uh Wgener et l., 1983). Zur Messung der Asorption ei 34 nm diente ein EIA-Reder ( Benhmrk Miroplte Reorder, BIO-RAD Lortories In., Herules, USA). Die Berehnung der Kohlenhydrt-Konzentrtionen erfolgte lut Anleitung der Boehringer Mnnheim GmH (o.j.). 2.12 Bestimmung des Aminosäuregehlts Zunähst erfolgte die Extrktion der Aminosäuren mit Sulfosliylsäure und die Derivtisierung mit 9-Fluorenylmethyl-hloroformit (FMOC-Cl; Einrsson et l., 1983) nh Högy (22). Je 1 µl Proe wurden mittels Umkehrphsen-HPLC im Vrin Pro Str- Chromtogrph (mit Vrin Autosmpler 41, Vrin In, Plo Alto, USA und Fluoreszenzdetektor RF 535, Shimdzu Europ GmH, Duisurg) üer eine Amino Tg TM Aminosäure- Anlysensäule (TSK gel ODS-8 TM; 4,6 mm x 15 m, Vrin In., Plo Alto, USA) nlysiert, vor die eine Vrin-Vorsäule (PR-8, 1 x 3,2 mm) geshltet wr. Die moile Phse estnd us folgenden Komponenten: Lösung A:,15 M Ntriumitrt +,1 M Tetrmethylmmonium-Chlorid + 4 ml Methnol, ph 3,84; Lösung B: Aetonitril. Bei einer Flußrte von 1,4 ml pro Minute wurde folgender Grdient erzeugt: Zeit [min:se] % Lösung A % Lösung B : 75, 25, 1: 75, 25, 5:46 72, 28, 9:41 69 31 15: 55 45 18:3 5 5 22: 45 55 27: 3 7 3: 5 95 32: 5 95 33: 75 25 35: 75 25 18
2 MATERIAL UND METHODEN Die Chromtogrmme wurden mit Hilfe des Computerprogrmms Str Chromtogrphy Worksttion, Version 5.5 (Vrin In., Plo Alto, USA) usgewertet. 2.13 Bestimmung des Gehlts n löslihem Gesmt-Protein Zur Bestimmung des löslihen Gesmtproteins nh Brdford (1976) diente unverdünnter Preßsft (s. Kp. 2.7). Die Extinktion ei 595 nm wurde in einem DU-6 Spetrophotometer (Bekmn Coulter In., Fullerton, USA) gemessen. 2.14 Anlyse des Proteoms 2.14.1 2D-Gelelektrophorese Die 2D-Gelelektrophorese wr nfänglih mit erhelihen Shwierigkeiten verunden, d sie zu keinen uswertren Ergenissen führte [nur wenige spots (Proteinfleken), zu strker Hintergrund, usgeprägte horizontle Streifen uf dem Gel]. Dher wurde die Methode in vielen kleinen Shritten modifiziert, is sie zufriedenstellende Ergenisse lieferte. Es wird im folgenden diejenige Methode eshrieen, die shließlih m erfolgreihsten wr und nh der die zur Auswertung herngezogenen Gele hergestellt wurden. Von eiden CO 2 -Ansätzen wurden jeweils ds zweite und dritte voll entwikelte Bltt von drei Kontrollpflnzen und von drei Pflnzen des 375 NCl-Anstzes untersuht. Ds Blttmteril wurde in flüssigem Stikstoff shokgefroren, und lle Blätter eines Anstzes wurden zusmmen unter flüssigem Stikstoff zu Pulver gemörsert. Aus dem gefrorenen Blttmteril wurden die Proteine nh der von Zör et l. (24) eshrieenen Methode mittels DTT-TCA-Aeton extrhiert, mit folgenden Modifiktionen: Der Lysepuffer enthielt zusätzlih 5mM DTT, und nh dem ersten Aufnehmen des Proteinpellets in Puffer A erfolgte eine erneute Proteinfällung für eine Stunde, um die Proteinkonzentrtion in der Proe zu erhöhen. Der Proteingehlt der Extrkte wurde nh Brdford (1976) estimmt. 19
2 MATERIAL UND METHODEN Anshließend erfolgte die isoelektrishe Fokussierung (IEF) innerhl eines immoilisierten ph-grdienten (Bjellqvist et l., 1982; Görg et l., 1985; Görg et l., 1988) mit Hilfe von Immoiline DryStrip-Gelen (= IPG strips ; ph-bereih 4-7, Länge 7 m; Amershm Biosienes AB, Uppsl, Shweden). Auf diese wurden je 2 µl Proteinlösung ufgetrgen, die 15 µg Protein enthielt. Die IPG strips wurden in einem IPGphor Isoeletri Fousing System (Amershm Biosienes AB, Uppsl, Shweden) unter folgenden Bedingungen rehydriert und fokussiert: llgemeine Prmeter: 2 C; 5 µa pro IPG strip 1 Stunden Rehydrierung 2 Stunden 1 V 1 Stunde 5 V IEF 1 Stunde 1 V 5 Stunden 8 V. Nh der Equilirierung der IPG strips (nh Berkelmn & Stenstedt, 22) erfolgte die SDS-Polyrylmid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Die verwendeten Gele enthielten 12,5% (v/v) Arylmid (Zusmmensetzung nh Berkelmn & Stenstedt, 22; s. uh Lemmli, 197; Lufpuffer eenflls nh Berkelmn & Stenstedt, 22). Als Mrker diente ein Rinow TM RPN 756 Mrker (Amershm Biosienes AB, Uppsl, Shweden). Die Gele liefen ei 4 C zunähst 15 Minuten lng ei einer Stromstärke von 15 ma pro Gel und dnh. 3,5 Stunden lng ei 45 ma pro Gel ei einer mximlen Spnnung von 3 V. Anshließend wurden sie für eine Stunde in 5% Ethnol/1% Eisessig fixiert und üer Nht in Coomssie Brillint Blue R 25 (,5% in Fixierlösung) gefärt (Neuhoff et l., 1985). Die Gele wurden ei 6 dpi eingesnnt und mit Hilfe der Geluswertesoftwre Delt 2D, Version 3.1.2 (Deodon GmH, Greifswld) usgewertet. Es wurden jeweils zwei Gele der Sommerkulturen 22 und 23 zu je einem Mittelwert-Gel vereinigt. Die Softwre quntifizierte die spots üer ihre Flähenintegrle und Grutöne und ermittelte ihre reltiven Volumenprozente. Mit Hilfe der Swiss-Prot/TrEMBL-Dtennk (http://www.expsy.org) wurde versuht, Proteine, die in eiden Kulturen unter Slzstreß neu oder deutlih verstärkt exprimiert wurden, üer ihren isoelektrishen Punkt und ihr Molekulrgewiht zu identifizieren. 2
2 MATERIAL UND METHODEN 2.14.2 Mtrix ssisted Lser Desorption Ionistion Time-of-flight Mss Spetrometry (MALDI-TOF-MS) Einige der spots, deren Expression in eiden Kulturen unter Slzstreß deutlih verstärkt wr, wurden mittels MALDI-TOF-MS nlysiert. Die Aufreitung und die Anlyse der Proen wurden dnkenswerterweise von Herrn Steffen Phlih (Biohemishes Institut der Universität Zürih) durhgeführt. Aus Kostengründen konnten so leider nur sieen Proteine untersuht werden. Die us den Gelen usgeshnittenen spots wurden nh Wilm et l. (1996) und Shevhenko et l. (1996) ufgereitet, mit folgenden Modifiktionen: Nh dem Entfären und Dehydrieren der Gelstüke erfolgte direkt die Reduktion für 3 Minuten. Drufhin wurden die Proen erneut mit Aetonitril dehydriert und nshließend eine Stunde lng rmidomethyliert, woruf drei weitere Dehydrierungsshritte folgten. Nh der Troknung im Vkuum wurden die Gelstüke mit 5 µl Verduungslösung (,5 mm Tris-HCl, ph 8, + 2 µg Trypsin/ml) und nh 5 Minuten mit 1-15 µl,5 mm Tris-HCl (ph 8,) versetzt. Die Verduung fnd üer Nht ei Rumtempertur sttt. Die Lösung der verduten Peptide wurde im Verhältnis 1:3 mit Mtrixlösung (gesättigte Lösung von α-cyno-hydroxy-zimtsäure in 4% ACN +,1% Trifluor-Essigsäure) gemisht und uf ds MALDI-Trget ufgetrgen. Die Anlyse der Proen erfolgte in einem Biflex MALDI-TOF-Mssenspektrometer (Bruker Dltoni GmH, Bremen) im Reflektor-Modus, woei ein gepulster Lser zur Ionenerzeugung verwendet wurde (Shrttenholz, 21). Zur Identifizierung der Proteine dienten die Msot-Dtennk (http://www.mtrixsiene.om) und die Swiss-Prot/TrEMBL-Dtennk (http://www.expsy.org). 2.15 Bestimmung der Aktivitäten ntioxidtiver Enzyme 2.15.1 Enzymextrktion Zur Enzymestimmung diente dssele Blttmteril wie zur Gelelektrophorese (s. Kp. 2.14.1). Die Extrktion der Enzyme mit Klium-Phospht-Puffer erfolgte nh Rios-Gonzlez et l. (22) mit folgenden Modifiktionen: Der Extrktionspuffer htte den ph-wert 7,4 und enthielt zusätzlih 1 mm Asort ls Reduktionsmittel. Üer Nht wurde der Extrkt ei 4 21
2 MATERIAL UND METHODEN C gegen 7 ml Extrktionspuffer dilysiert (Dilyseshluh: Spetrpore MWCO 6-8 kd). 2.15.2 Bestimmung der Superoxid-Dismutse (SOD)-Aktivität Die Bestimmung der SOD-Aktivität sierte uf der Methode von Beuhmp & Fridovih (1971; s. uh Flohé & Ötting, 1984; Keetmnn, 2) und erfolgte nh Rios-Gonzlez et l. (22) mit folgenden Modifiktionen: 1 ml des Rektionsgemishes, welhes 5 mm Klium- Phospht-Puffer (ph 7,8) enthielt, wurde in kleinen Glsshälhen mit 1 µl Enzymextrkt gemisht und uf einem Shüttler 25 Minuten lng mit einer UV-Lmpe estrhlt (Wellenlänge 35 nm). Die Menge n reduziertem Nitrolu-Tetrzoliumhlorid (NBT) wurde spektrlphotometrish ei 56 nm estimmt (DU-6 Spetrophotometer, Bekmn Coulter In., Fullerton, USA). 2.15.3 Bestimmung der Asort-Peroxidse (APO)-Aktivität Die Bestimmung der APO-Aktivität erfolgte spektrlphotometrish üer die Asort- Anhme nh Nkno & Asd (1981), woei 9 ml Rektionsgemish mit 34 µl Enzymextrkt versetzt wurden. Die Extinktion ei 29 nm wurde 4 Minuten lng lle 15 Sekunden gemessen (DU-6 Spetrophotometer, Bekmn Coulter In., Fullerton, USA). 2.15.4 Bestimmung der Glutthion-S-Trnsferse (GST)-Aktivität Die GST-Aktivität wurde spektrlphotometrish üer die Zunhme von S-2,4-Dinitrophenyl- Glutthion estimmt (Hig & Jkoy, 1981; Jkoy, 1985). Die von Rede & Co (1999) eshrieene Methode wurde folgendermßen verändert: 91 µl des Rektionsgemishes, welhes 5 mm Klium-Phospht-Puffer enthielt, wurden mit 4 µl Enzymextrkt versetzt. Die Extinktion ei 34 nm wurde 5 Minuten lng lle 3 Sekunden gemessen (DU-6 Spetrophotometer, Bekmn Coulter In., Fullerton, USA). 22
2 MATERIAL UND METHODEN 2.16 Bestimmung der Aktivitäten von P-ATPse, V-ATPse und F-ATPse Zur Messung der ATPse-Aktivitäten diente dssele Blttmteril wie zur Gelelektrophorese (s. Kp. 2.14.1). Die Bestimmung erfolgte nh Rmni (24) nhnd der Menge n freigesetztem rdioktiv mrkierten Phospht, woei die verwendeten Lösungen folgendermßen modifiziert wurden: Extrktionsmedium: 25 mm HEPES/KOH, ph 7,4, 4 mm Soritol, 2 mm MgCl 2. Inkutionsmedium: 25 mm HEPES/KOH, ph 7,4 4 mm Soritol, 1 mm KCl, 2 mm MgCl 2,,5 mm ATP,,5 mm [γ 32 P i ] ATP. Zur Anlyse der Proen diente ein Szintilltionszähler (LS 181, Bekmn Instruments, Fullerton, USA). 2.17 Strukturnlytik 2.17.1 Lihtmikroskopie und Trnsmissionselektronenmikroskopie (TEM) Zur liht- und trnsmissionselektronenmikroskopishen Untersuhung dienten Quershnitte durh Blätter mittleren Alters im Bereih der Leitündel dritter Ordnung. D es v.. ei den eslzenen Ansätzen sehr shwierig wr, Ojekte guter Qulität d.h. turgeszente, niht plsmolysierte Zellen und gute Kontrstierrkeit - zu erhlten, wurde die Proenpräprtion in vershiedener Hinsiht von Stndrdprotokollen (s. Plttner & Zingsheim, 1987; Bozzol & Russell, 1999; Ruzin, 1999) weihend modifiziert. 23
2 MATERIAL UND METHODEN Zur Erstfixierung wurden Blttstükhen in folgende Lösungen üerführt, woei die Proen der Hohslzvrinten vorher für. 3 Sekunden in qu idest. geshwenkt wurden, um ds Eindringen des Fixiermediums in die Proe zu erleihtern: Kontrollen: 2,5% Glutrdildehyd in,5 M PIPES-Puffer, ph 6,8. Beslzene Proen: 2% Glutrdildehyd + 1,5% Formldehyd in,5 M PIPES-Puffer (verändert nh Krnovski, 1965). Dei wurde ds Fixiermedium den Proen durh NCl-Zuge osmotish ngeglihen, um osmotish edingte Alösungen des Plsmlemms zu verhindern. Nh einer Vkuuminfiltrtion (1 Minute ei,53 MP, 1 Minute ei,26 MP, 5 Minuten ei,53 MP Unterdruk) wurden die Blttstükhen 4 Stunden lng ei Rumtempertur fixiert. Anshließend wurde ds Fixiermedium stufenweise durh,5 M PIPES-Puffer ersetzt, indem dreiml je ein Drittel des Glsinhltes und zweiml fst der gesmte Glsinhlt usgetusht wurde. Auf diese Weise wurde ds osmotishe Potentil des Außenmediums shonend erniedrigt, ws osmotish edingte Alösungen des Plsmlemms verhinderte. Es erfolgte eine Nhfixierung mit 1%igem Osmiumtetroxid in,5 M PIPES-Puffer für 3,5 Stunden ei Rumtempertur. Nh mehrmligem Wshen mit qu idest. wurden die Proen stufenlos üer eine Aetonreihe (1%, 25%, 5%, 75%, 95%, 1% üer Molekulrsie) entwässert (Sitte, 1962). Die Ojekte wurden üer Nht mit Spurr-Hrz ERL-426 (Spurr, 1969) infiltriert und nshließend in dieses eingeettet. Von den so präprierten Proen wurden n einem Ultrmikrotom (Ultrut E, Reihert-Jung) zunähst Semidünnshnitte ngefertigt, die mit,5% Toluidinlu +,5% Borx gefärt wurden. Die lihtmikroskopishe Untersuhung dieser Shnitte erfolgte n einem Olympus CHBund einem Olympus BH-2-Mikroskop. Die horizontle Ausdehnung der Blttquershnitte und der einzelnen Gewee, die Zellusdehnung sowie der Interzellulrennteil pro Quershnittsflähe wurden mit Hilfe der Auswertesoftwre nlysis, Version 3.2 (Soft Imging Systems) ermittelt. Von denjenigen Ojekten, die für die TEM- Untersuhung geeignet ershienen, wurden Ultrdünnshnitte hergestellt. Die Kontrstierung der Shnitte erfolgte teilweise mit Urnylett und Bleiitrt nh Reynolds (1963) und teilweise mit 1%igem wäßrigen Kliumpermngnt und Bleiitrt (Bry & Wgenr, 1978). Die Proen wurden im TEM LEO 912 AB OMEGA (Zeiss/Lei) untersuht. 24
2 MATERIAL UND METHODEN 2.17.2 Rsterelektronenmikroskopie Im Rsterelektronenmikroskop wurde die Unterseite von Blättern mittleren Alters im Bereih der Interkostlfelder neen der Mittelrippe untersuht. Zunähst wurden Blttstükhen für einige Wohen in FAA (45% Ethnol + 5% Eisessig + 1,85% Formldehyd) fixiert. Anshließend wurden die Proen üer eine Ethnolreihe (je 15 Minuten 5%, 7%, 8%, 9%, 96%, 1% und 1% üer Molekulrsie) entwässert, in einem Critil Point Dryer (Blzers Union, Blzers, Liehtenstein) getroknet und nshließend in einer Metlleshihtungskmmer (Leitz) zwei Minuten lng ei einer Stromstärke von,6 ma esputtert. Die Ojekte wurden im Philips Rsterelektronenmikroskop XL 2 untersuht. 2.18 Sttistik Die sttistishe Auswertung der Dten erfolgte mit Hilfe der Softwre SPSS (Version 11). Die Dten wurden durh den Kolmogorov-Smirnov-Test uf Normlverteilung getestet und, flls diese niht gegeen wr, mittels Wurzel- oder Logrithmusildung trnsformiert. Die normlverteilten Dten wurden mittels einfktorieller Vrinznlyse oder - flls sih die einzelnen Vrilen gegenseitig direkt eeinflußten mittels mehrfktorieller Vrinznlyse usgewertet. Auf signifiknte Untershiede zwishen den Mittelwerten (Signifiknzniveu p,5) wurde getestet durh den Post-Ho-Test nh Tukey (Untershiede zwishen mehreren Slinitäten ei Vrinzgleihheit zwishen den Stihproen), den Gmes-Howell-Post- Ho-Test (Untershiede zwishen mehreren Slinitäten, keine Vrinzgleihheit zwishen gleih großen Stihproen), den Dunnet-T3-Post-Ho-Test (Untershiede zwishen mehreren Slinitäten, keine Vrinzgleihheit zwishen untershiedlih großen Stihproen) oder den t- Test nh Student (Untershiede zwishen nur zwei Slinitäten oder zwishen den CO 2 - Ansätzen). 25