V 2.6 Molekularbiologie I BIOCHEMISCHES ANFÄNGERPRAKTIKUM FÜR CHEMIKER UND BIOLOGEN PCR Klonierung Transformation Southern Blot Hybridisierung Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Fachbereich Chemie Universität Hamburg
Molekularbiologie I - Inhalt 2 INHALT Seite Zeitplan... 3 Theoretische Grundlagen... 4 Polymerase Kettenreaktion... 4 Agarose Gelelektrophorese... 8 Plasmide... 9 Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren... 11 DNA Minipräparation... 11 Restriktionsendonukleasen... 12 Klonierung von DNA Fragmenten in Plasmide... 14 Transformation... 15 Hybridisierung von Nukleinsäuren... 16 Das PhoA Gen... 18 Aufgabenstellung...... 19 Durchführung... 23 Auswertung...... 44 Anhang...... 45
Molekularbiologie I - Zeitplan 3 ZEITPLAN Montag: 9.15 Uhr Seminarraum BC (Wintersemester)/OC 325 (Sommersemester) - Gentechnische Sicherheitsbelehrung - Einführungsseminar - Ansetzen der PCR Reaktion - Ansetzen von Medien - Analyse der PCR Reaktion - Ethanolfällung der PCR Produkte - Ansetzen von Kulturen Dienstag: 9.15 Praktikumslabor - Herstellung kompetenter Zellen - Klonierung des PCR Produktes - Transformation Mittwoch: 9.15 Praktikumslabor - DNA Minipräparation - Restriktionsverdau - Digoxigenin Markierung der PCR Produkte - Seminar Donnerstag: 9.15 Praktikumslabor - Analyse des Restriktionsverdaus - Southern Blot - Dot Blot - Hybridisierung Freitag: 9.15 Praktikumslabor - Immunfärbung - Auswertung
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 4 THEORETISCHE GRUNDLAGEN In diesem Praktikumsversuch sollen die Grundkenntnisse über die Vermehrung, Klonierung, Reinigung und Nachweis von Desoxyribonukleinsäure (DNA) vermittelt werden. Polymerase Kettenreaktion Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA. Mittels einer speziellen DNA Polymerase kann ein DNA-Segment amplifiziert werden, dass zwischen zwei Regionen bekannter Basensequenzen liegt. Gegen diese beiden Regionen werden komplementäre Oligonukleotide (Primer) eingesetzt, die nach ihrer Bindung an die vorher aufgetrennten DNA Einzelstränge als Starterkennung für die Polymerase dienen. Die Sequenzen der Primer werden so gewählt, dass sie an der einen Seite an den sense-strang und an der anderen Seite an den komplementären Strang hybridisieren. Dabei ist zu beachten, dass die DNA Polymerase den neuen Strang nur von 5' nach 3' synthetisiert. Erfunden wurde die PCR 1983 von Kary B. Mullis. 1993 erhielt er dafür den Nobelpreis in Chemie. Als erster Schritt bei der PCR werden die Doppelstränge der DNA getrennt. Diese Denaturierung erfolgt bei einer Temperatur von 92 o C. Nach dem Abkühlen auf etwa 50-60 o C kommt es zur Anlagerung der Primer (Annealing). Bei einer Temperatur um 72 o C entfaltet die Polymerase ihre maximale Aktivität und die Neusynthese (Elongation) des Doppelstranges beginnt an den Stellen, an denen die Primer gebunden haben. Diese drei Reaktionsschritte, Denaturierung, Annealing und Elongation, werden in der PCR zyklisch wiederholt, wobei in jedem Zyklus der zu amplifizierende DNA Abschnitt verdoppelt wird (Abb.1). Da das Elongationsprodukt eines Zyklus als Template für den nächsten Zyklus dienen kann, wird der von den Primern flankierte DNA Abschnitt exponentiell amplifiziert. Theoretisch könnte man in der PCR von einem einzelnen DNA Molekül ausgehen und nach n Zyklen eine Menge von 2 n Molekülen vorfinden (Abb.2). Dadurch wird die PCR zu einer sehr sensitiven Nachweismethode. Realisiert werden konnte die PCR erst mit der Entdeckung und Isolierung einer thermostabilen DNA-Polymerase, da durch die hohen Denaturierungstemperaturen die meisten DNA Polymerasen inaktiviert werden. Gefunden wurde diese thermostabile DNA Polymerase 1975 in dem Eubakterium Thermophilus aquaticus, welches in den
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 5 heißen Quellen des Yellow Stone National Parks entdeckt wurde. Nach diesem Eubakterium wurde das Enzym Taq-Polymerase genannt. Es handelt sich dabei um ein 94 kda Protein mit einem Temperaturoptimum bei 72 o C. Für ihre Aktivität benötigt die Taq-Polymerase Mg 2+ Ionen. Bei zu hohen Konzentrationen ( 3 mm) wirken diese allerdings eher inhibitorisch. In einer Minute synthetisiert die Taq Polymerase etwa 1000 Basenpaare (1kb), so dass sich die Dauer der Elongation nach der Größe der zu amplifizierenden DNA richtet. Speziell für die PCR wurden Heizblöcke (Thermocycler) entwickelt, die automatisch ein programmiertes Temperaturprofil durchlaufen (Abb.3). Die Anzahl der Zyklen liegt üblicherweise bei 25-35 und sollte 40 nicht überschreiten. Die Aktivität der Taq-Poylmerase ermüdet nach 40 Zyklen und man erhält keine Abb.1: Prinzip der Polymerase Kettenreaktion. 1: Denaturierung der DNA, 2: Anlagerung der Primer, 3: DNA-Synthese, 4: Produkte nach 2 Zyklen.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 1. Zyklus 2. Zyklus 3. Zyklus 6 4. Zyklus 30. Zyklus Ziel-Gen Exponentielle Amplifikation DNA Matrize 1 2 2 Kopien 2 3 4 2 2 2 4 Kopien 8 Kopien 16 Kopien Abb.2: Exponentielle Amplifikation bei der Polymerase Kettenreaktion. Abb.3: Temperaturprofil und Produkte einer Polymerase Kettenreaktion. 30 2 1 Milliarde Kopien
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 7 exponentielle Amplifikation mehr. Außerdem nimmt der Hintergrund zu, d.h. es treten unspezifische Amplifikate auf. Darin liegt einer der Nachteile der PCR. Bei der extremen Varianz in der genomischen DNA kann es vorkommen, dass die Primer nicht nur an die Zielsequenz, sondern auch an zufällig sehr ähnliche Basenfolgen binden und somit zu unspezifischen Amplifikationen führen. Eine optimale Amplifikation ist sehr von der Sequenz der verwendeten Primer und die sich daraus ergebende Schmelztemperatur, welche die Annealing Temperatur im Anlagerungsschritt bestimmt, abhängig. Die Schmelztemperatur hängt von der Zahl der Basenpaare, dem Anteil an G/C Paaren, der Ionenstärke der Lösung und deren eventuellem Gehalt an Lösungsmitteln (Formamid) ab. Näherungsweise kann die Schmelztemperatur über folgende Formel berechnet werden: Tm = [(G + C) x 4] + [(A + T) x 2] (in o C) Die Primer haben in der Regel eine Länge von 18 bis 25 Basen. Ein großer Nachteil der PCR ist ihre Anfälligkeit gegenüber der Erzeugung von Mutationen durch Basenfehleinbau. Die Tabelle 1 zeigt einige Fehlerraten gängiger Polymerasen im Vergleich mit der DNA Polymerase I aus E. coli: Die PCR kann neben der spezifischen Amplifikation in vielfältiger Weise dazu benutzt werden, um DNA zu modifizieren. In einem Primer kann das 5 -Ende frei modifiziert werden um so z.b. Restriktionsschnittstellen anzufügen. Es genügt, wenn der 3 -Teil des Primers eine ausreichende Bindung ermöglicht, da an dieser Seite die Verlängerung durch die Polymerase erfolgt. Auch ein absichtlicher Austausch von einzelnen Basen in der Mitte eines Primers zur zielgerichteten Mutagenese ist möglich. Der Erfolg einer PCR wird üblicherweise mit einer Agarose Gelelektrophorese überprüft. Tab. 1: Fehlerraten einiger thermostabiler Polymerasen. Name Organismus 3-5 Fehlerkorrektur Fehler/bp Taq Thermus aquaticus - 1 x 10-4 Vent (exo-) Vent Pfu Thermococcus litoralis Thermococcus litoralis Pyrococcus - 2 x 10-4 + 4 x 10-5 + 2 x 10-6 furiosus DNA Polymerase I E. coli + 1 x 10-8
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 8 Agarose Gelelektrophorese Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten zwischen 500 und 20.000 bp Größe werden Agarosegele verwendet. Die Elektrophorese wird in Flachgelapparaturen durchgeführt, in denen sich ein auf eine Trägerplatte gegossenes Agarosegel befindet. Beim Gießvorgang werden durch einen entsprechenden Kunststoffkamm Taschen zum Probenauftrag erzeugt. Die DNA-Proben werden mit einem Beladungspuffer versetzt, der eine hohe Dichte besitzt und es ermöglicht, die Probe in die Taschen des bereits im Elektrophoresepuffer befindlichen Gels zu unterschichten. In dem Beladungspuffer sind zwei Farbstoffe enthalten, Bromphenolblau und Xylen Cyanol FF. Durch diese Tracking Dyes kann man zum einen das Auftragen der Probe gut überwachen und zum anderen das Fortschreiten der elektrophoretischen Trennung verfolgen. Die Wanderungsgeschwindigkeit von linearen DNA Molekülen ist umgekehrt proportional dem log10 der Anzahl der Basenpaare (bzw. dem Molekulargewicht). Die zu wählende Agarose Konzentration (in der Regel 0,5 bis 2 %) hängt von der Größe der zu trennenden DNA Fragmente ab (Tab.2). Superhelikale zirkuläre DNA, genickte zirkuläre DNA und lineare DNA wandern mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Die Größe unbekannter DNA- Fragmente wird durch Verwendung von DNA-Standards bestimmt. Diese Marker bestehen aus Fragmenten definierter Größen, welche meist durch Restriktionsverdau bestimmter DNA (z.b. λ-phagen DNA) erzeugt wurde. Tab. 2: Trennbereich von Agarose Gelen Agarose Gel (%) Trennbereich von DNA 0,7 800-10.000 bp 1,0 500-7000 bp 1,5 200-3000 bp 2,0 100-2000 bp Die Visualisierung von DNA geschieht durch Verwendung von Ethidiumbromid (Abb.4). Dieser Farbstoff lagert sich in die Doppelhelix der DNA ein (Interkalation) und wird durch UV-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 300 nm zur Fluoreszenz angeregt. Dabei wird gleichzeitig die DNA durch Strangbrüche und Dimerbildung verändert. Deshalb dürfen die Gele nur kurze Zeit illuminiert werden, wenn die DNA weiter kloniert oder in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden soll. Durch die Interkalation in die DNA ist Ethidiumbromid mutagen, da die Replikation der DNA bei
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 9 der Zellteilung gestört wird. Bei Arbeiten mit Ethidiumbromid sind immer Handschuhe zu tragen! Abb.4: Strukturformel von Ethidiumbromid Plasmide Eine Grundvoraussetzung für molekularbiologische Arbeiten ist die Möglichkeit, genetisches Material zu isolieren und so zu amplifizieren, dass biochemische und molekularbiologische Analysen möglich sind. Dies bedingt, dass die DNA möglichst fehlerfrei amplifiziert wird (Tab.1), eine Voraussetzung, welche nur in vivo, d.h. in lebenden Organismen erfüllt wird. Die gängigste Methode ist es daher, das gewünschte DNA-Fragment in ein DNA-Trägermolekül zu integrieren, das in Bakterien extrachromosomal repliziert wird. Dieses Molekül muss die Möglichkeit bieten, selektiv nur solche Bakterien zu vermehren, die dieses DNA-Molekül enthalten. Diese Anforderungen werden von Plasmiden erfüllt, welche zur Familie der DNA-Vektoren gehören. Plasmide sind doppelsträngige, zirkuläre DNA-Moleküle, die in ihrer Größe zwischen 2 und 15 kb variieren. In der Natur werden Plasmide in einer Vielzahl von Bakterien gefunden, wo sie als zusätzliche genetische Einheiten fungieren, die repliziert und unabhängig vom Genom vererbt werden. Oft enthalten Plasmide Gene, die für Enzyme kodieren, die unter bestimmten Lebensbedingungen für das Bakterium vorteilhaft sind. Ohne diesen biologischen Vorteil würde das Plasmid unnötigen Ballast darstellen und das Bakterium würde das Plasmid wieder verlieren. Zu den Phänotypen, die durch Plasmide erzielt werden, gehören u.a. die Resistenzen gegen bestimmte Antibiotika. Zum Beispiel erzielt ein Plasmid welches die β-lactamase kodiert eine Resistenz gegenüber Ampicillin, da das Bakterium in der Lage ist das Antibiotikum
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 10 durch Spaltung zu inaktivieren. In der Molekularbiologie verwendete Plasmide stellen stark modifizierte natürliche Plasmide dar, die im Ursprung fast alle von demselben Plasmid abstammen. Die Veränderungen beziehen sich auf Sicherheits- und Anwendungskriterien. So sind manche Plasmide auf reine DNA-Amplifikation, andere auf Sequenzierungs- oder Expressionsversuche optimiert. Drei Strukturelemente sind in allen molekularbiologisch eingesetzten Plasmiden zu finden: I) Replikationsursprung (ori), damit das Plasmid in Bakterien vermehrt werden kann. II) Resistenzgen, um die Selektion transformierter Bakterien zu ermöglichen. III) Klonierungsstelle, in die Fremd-DNA eingebaut werden kann (Multiple Cloning Site, MCS). Die Klonierungsstelle ist meist so konstruiert, dass dort viele Schnittstellen für gebräuchliche Restriktionsendonukleasen in einem kurzen DNA-Abschnitt liegen, welche sonst im Plasmid nicht vorkommen. In Abb.5 ist puc18, ein genereller Klonierungsund Sequenzierungsvektor dargestellt. Man erkennt die oben genannten Strukturmerkmale (Replikationsursprung, Resistenz-Marker β-lactamase (Amp r ) und die Klonierungsstelle) sowie die Positionen von Restriktionsendonuklease Schnittstellen. Bcg I Sca I Xmn I Bmp I BsrF I Bsa I Ampr Ssp I EcoO109 I Aat II puc18 2686 bp lacz ori Nde I MCS Nar I / Kas I Sap I Afl III Hind III Sph I Pst I Sse8387 I BspM I Sal I Hinc II Acc I Xba I BamH I Ava I Xma I Sma I Kpn I Acc65 I Ban II Ecl136 II Sac I Apo I EcoRI Ahd I AlwN I Abb.5: Vektorkarte puc18
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 11 Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren Um Proteine aus Nukleinsäurelösungen zu entfernen, wird mit Phenol extrahiert. Phenol ist ein sehr guter Wasserstoffbrückenbildner und kann gleichzeitig hydrophobe Wechselwirkungen mit Aminosäureseitenketten eingehen. Es dissoziiert Protein- Nukleinsäure-Komplexe in die freien Komponenten. Die Proteine werden denaturiert und reichern sich in der Phenolphase an. Vor dem Gebrauch muss das Phenol mit einer wässrigen Pufferlösung auf einen ph-wert größer 7,8 äquilibriert werden, da sonst die DNA in die Phenolphase geht. Um Proteinverunreinigungen aus den Nukleinsäurelösungen zu entfernen, wird ein 1:1 Gemisch aus Phenol:Chloroform verwendet und dieses zu gleichen Volumenteilen mit der Nukleinsäurelösung gemischt. Chloroform denaturiert die Proteine und erleichtert die Phasentrennung, welche durch Zentrifugation erfolgt. Eine breite Interphase bildet sich aus, wenn der Proteingehalt in der Lösung besonders hoch ist. In solchen Fällen wird die Phenol/Chloroform Extraktion wiederholt, bis die Interphase verschwindet. Phenolreste können später enzymatische Reaktionen stören und müssen sorgfältig entfernt werden. Nukleinsäuren können entweder durch Zugabe von 2,5 Volumina 95 % Ethanol oder 1 Volumen Isopropanol gefällt werden. Ethanol fällt sowohl DNA als auch RNA, in 50 % Isopropanol ist RNA besser löslich als die DNA, die quantitativ ausgefällt wird. Die Zugabe von monovalenten Kationen, Na + auf 0,3 M Endkonzentration, K + auf 0,1 M Endkonzentration und NH + 4 auf 3,7 M Endkonzentration als Acetate oder Chloride ändert selektiv die Löslichkeit der DNA und erhöht dadurch die Effizienz der Fällung. Bei geringen Nukleinsäurekonzentrationen empfiehlt sich die Fällung in der Kälte (auf Eis oder bei -20 o C) durchzuführen, um die Ausbeute zu erhöhen. Bei höheren Nukleinsäurekonzentrationen ist die Fällung bei Raumtemperatur durchzuführen, weil in der Kälte neben der Nukleinsäure auch Salze ausfallen können. DNA Minipräparation Unter einer Minipräparation versteht man die Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli Zellen, die über Nacht gewachsen sind und dabei das Plasmid vermehrt haben. Je nach Replikationsursprung können sich die Plasmide unterschiedlich in den E. coli Zellen replizieren. puc Vektoren besitzen z.b. den Replikationsursprung pmb1 und gehören zu den High Copy Plasmiden mit 500-700 replizierten Plasmiden pro Zelle.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 12 Bei einer Minipräparation werden die Zellen zuerst in eine Lösung aus Glucose und Tris/EDTA resuspendiert. Die Glucose hält dabei den osmotischen Druck aufrecht, während Tris die Zellen bei ph 8,0 puffert. EDTA bindet an zweiwertige Metallionen der Lipiddoppelschicht und schwächt dadurch die Zellwand. Bei späterer Lyse verhindert das EDTA die DNA Degradation, da es Mg 2+ bindet, welches ein Kofaktor für bakterielle Nukleasen ist. Die Zellen werden in einer alkalischen Lyse mit NaOH aufgeschlossen. Zusätzlich wird Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben, welches zur Lösung von Lipiden der Zellmenbran und zellulären Proteinen beiträgt. Durch das NaOH wird die Chromosomale- und Plasmid-DNA in die Einzelstränge denaturiert. Die zirkularen DNA- Stränge des Plasmids bleiben jedoch miteinander verknäult. Durch Zugabe von Kaliumacetat und Essigsäure wird der ph neutralisiert, wodurch die DNA Stränge renaturieren. Die langen chromosomalen Stränge können dabei nicht optimal hybridisieren und kollabieren in einem teilweise hybridisierten Knäul. Gleichzeitig wird durch das Kaliumacetat das SDS präzipitiert, an dem Lipide und Proteine gebunden sind. Dadurch bleiben lediglich Plasmid DNA, kleine chromosomale Fragmente und RNA in Lösung. Eine weitere Reinigung der Plasmid DNA erfolgt durch Phenol/Chlorofom Extraktion, Ethanol Fällung und Ribonuklease Verdau. Restriktionsendonukleasen Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die doppelsträngige DNA spezifisch innerhalb von palindromen Erkennungssequenzen spalten. Sie werden von Bakterien hergestellt und bilden einen natürlichen Schutz, da sie eindringende fremde DNA Moleküle abbauen können. Die entsprechenden Erkennungssequenzen im Genom des Bakteriums selbst sind durch Methylierung an einem Adenin- oder Cytosinrest modifiziert, und dadurch vor einem Abbau durch eigene Restriktionsendonukleasen geschützt. Die Namen der Restriktionsenzyme leiten sich von dem Organismus ab, aus dem sie isoliert wurden. EcoRI stammt z.b aus dem Bakterium Escherichia coli. Die zahlreichen Restriktionsenzyme mit ihren vielen verschiedenen spezifischen Erkennungssequenzen haben sich zu dem wichtigsten und vielseitigsten Werkzeug der Molekularbiologen entwickelt. Durch sie ist es möglich, definierte DNA Fragmente herzustellen und zu klonieren. Restriktionsenzyme sind weiterhin nützlich bei der strukturellen Kartierung von DNA. In Kombination mit der Southern Blot Analyse
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 13 erlauben sie die Bestimmung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs). Die Effizienz von Restriktionsenzymen hängt wesentlich von der Reinheit der DNA ab. Verunreinigungen wie Proteine, aber vor allem niedermolekulare Stoffe wie Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, SDS und hohe Salzkonzentrationen können die Enzymaktivität behindern. Diesem kann entgegengewirkt werden durch Erhöhung der Menge an Restriktionsenzym, längere Reaktionszeiten oder größeres Volumen des Reaktionsansatzes (Verdünnung der störenden Komponenten). Häufig ist jedoch ein weiterer Reinigungsschritt der DNA unumgänglich. Jedes Restriktionsenzym benötigt bestimmte Reaktionsbedingungen, um optimal arbeiten zu können. Typische Komponenten, die für viele Enzyme notwendig sind und im Reaktionspuffer enthalten sein sollten, sind MgCl 2, NaCl oder KCl, β- Mercaptoethanol oder Dithiothreitol und Rinderserumalbumin. Um den ph-wert einzuhalten, wird meist Tris-HCl als Puffersystem verwendet. Sulfhydryreagenzien und Albumin helfen, die Enzymaktivität zu stabilisieren. Viele Restriktionsenzyme sind sehr empfindlich gegenüber der Konzentration an Natrium- oder Kaliumionen. Manchmal existiert nur ein begrenzter Konzentrationsbereich, in dem das Enzym aktiv ist. Man verwendet in der Regel ein System aus 4-5 verschiedenen Puffern, die sich in Ihrer Salzkonzentration und ihrem ph-wert unterscheiden. Restriktionsenzyme sind, wie viele andere Enzyme, temperaturlabil. Sie werden bei - 20 o C aufbewahrt und sollten zur Entnahme möglichst nur für kurze Zeit Raumtemperatur ausgesetzt sein. Empfehlenswert ist die Verwendung von Kühlelementen zum Transport und zur Aufbewahrung am Arbeitsplatz. Ein wichtiges Kriterium für die Brauchbarkeit der Restriktionsenzyme ist ihre Spezifität für bestimmte Erkennungssequenzen und die daraus zu ziehenden analytischen Schlüsse. Es kann daher verheerende Folgen haben, wenn beim Arbeiten mit verschiedenen Restriktionsenzymen eine Kreuzkontamination auftritt. Geringe Anteile eines Fremdenzyms, die durch unsauberes Pipettieren verschleppt worden sind, können zu partiellen Spaltungsreaktionen führen, die eine Interpretation der Ergebnisse unmöglich macht. Es ist daher zwingend erforderlich, für jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze zu verwenden. Die Aktivität von Restriktionsenzymen ist definiert als: 1 unit = die Menge an Enzym, die 1 µg Standard DNA pro Stunde umsetzt. Theoretisch sollte es sich gerade für teure Enzyme rentieren, wenn man wenig Enzym einsetzt und die Reaktion längere Zeit, z.b. über Nacht laufen lässt. Viele Enzyme haben aber unter den Inkubationsbedingungen
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 14 relativ kurze Halbwertszeiten. Daher werden in der Regel Inkubationszeiten von 1-2 Stunden gewählt. Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmide Bei DNA-Fragmenten aus Restriktionsverdauen entstehen, je nach Enzym, unterschiedliche Überhänge. Grundsätzlich lassen sich 3 Typen unterscheiden (Abb.6): A) 3 -Überhang B) Stumpfe Enden ("Blunt-End") C) 5 -Überhang 3 - und 5 -Überhänge werden auch als Sticky-Ends bezeichnet. Sie können komplementäre Basenpaarungen mit anderen DNA Fragmenten ausbilden, die durch das gleiche Enzym geschnitten worden sind. Verwendet man an beiden Seiten Restriktionsenzyme die unterschiedliche Überhänge erzeugen, können DNA-Fragmente gezielt in die Klonierungsstelle von Plasmiden eingebaut werden. Bei PCR Produkten würde man als Überhang stumpfe Enden erwarten. Die Taq Polymerase fügt bei der PCR jedoch unspezifisch einen 3 -da-überhang an. Bei der Klonierung von PCR Produkten kann man diesen Überhang ausnutzen, indem ein Plasmid mit dt Überhang verwendet wird. Alternativ kann der da Überhang entfernt werden und das PCR-Produkt in ein Plasmid mit stumpfen Enden kloniert werden. Das Entfernen des Überhanges kann mit der Mungobohnen-Nuklease erfolgen, welche einzelsträngige DNA verdaut, oder die 3-5 -Exonuklease Funktion des Klenow- Fragments wird benutzt. A) B) C) 5 3 5 3 5 3 Sense-Strang komplementärer Antisense-Strang Abb.6: DNA-Überhänge nach Restriktionsverdau.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 15 Die PCR-Fragmente tragen an ihren 5 -Enden die integrierten Primer. Wurden diese nicht bei ihrer Synthese schon phosphoryliert, so müssen die Amplifikate vor dem Klonieren phosphoryliert werden, damit die eingesetzte T4-DNA Ligase die Bindung zum Plasmid knüpfen kann. Diese Phosphorylierung mit ATP wird durch das Enzym T4 Polynukleotidkinase katalysiert (Beide Enzyme wurden aus dem T4 Phagen isoliert und tragen daher ihre Bezeichnung). Das Plasmid wird hingegen mit einer Phosphatase oft dephosphoryliert (meist alkalische Phosphatase aus Kälbermagen, Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP) damit eine Rezirkularisierung unterdrückt wird. Transformation Das Einschleusen von Fremd-DNA in Bakterien wird Transformation genannt, wobei es zwei generelle Methoden gibt. Die klassische Methode ist die Hitzeschock-Methode. Bakterien werden kultiviert bis sie ihre maximale Vervielfältigungsgeschwindigkeit erreicht haben (logarithmische Phase). In dieser vitalen Phase werden sie auf Eis gekühlt und somit das Wachstum gestoppt. Es folgen mehrere Waschschritte mit kalten Puffern, die zweiwertige Calciumionen enthalten. Die so behandelten Bakterien werden als kompetent bezeichnet, da sie die Fähigkeit haben, DNA aufzunehmen. Kompetente Bakterien sind sehr empfindlich gegenüber mechanischer Beanspruchung und Wärme und müssen immer auf Eis aufbewahrt werden. Die kompetenten Bakterien werden dann mit DNA versetzt und auf Eis inkubiert. Man nimmt an, dass sich in dieser Zeit ein Calcium-DNA Präzipitat auf den Bakterien bildet. Bei kurzzeitiger Hitzeeinwirkung (90 sec, 42 o C) wird nun die DNA in das Bakterium aufgenommen. Der genaue Mechanismus dieser Aufnahme ist nicht genau aufgeklärt. Mit dieser Methode ist es möglich bis zu 10 6 transformierte Bakterien/µg DNA zu erhalten. Die zweite und effizientere Methode ist die Elektroporation. Bakterien werden hierbei wiederum bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und anschließend möglichst salzfrei gewaschen. Sehr reine DNA wird hinzugefügt und die Suspension in einem speziellen Gerät für kurze Zeit in ein sehr hohes Spannungsfeld gebracht (ca. 5 msec bei 1,8 kv). Hierbei bilden sich Poren in den Bakterien durch die die DNA hineinwandert. Mit dieser Methode sind bis zu 10 9 Transformanten/ µg DNA möglich. Die Selektion der Transformanten von Bakterien ohne Plasmid geschieht durch die Antibiotikaselektion.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 16 Die Klonierungsstelle von puc18 liegt am Anfang eines modifizierten lacz Gens (Teil des Lactose-Operon), welches den N-terminalen Teil der β-galaktosidase kodiert (siehe Abb. 4). Wird keine Fremd-DNA insertiert und nur puc18 allein transformiert, so wird bei Induktion mit dem Lactose-Analog Isopropyl-β-D-Thiogalaktosid (IPTG) die kodierte Domäne der β-galaktosidase exprimiert. Wählt man den E. coli Stamm so aus, dass dieser die C-terminale Domäne exprimiert (z.b. DH5α), so kommt es zu der sogenannten α-komplementierung. Die beiden separaten Domänen der rekombinanten β-galaktosidase lagern sich zu einem funktionellen Enzym zusammen. Bietet man diesen transformierten und induzierten Bakterien das Substrat X-Gal (5- Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galaktosid) an, so wird dieses zu einem blauen Farbstoff umgewandelt. Wird jedoch ein DNA-Fragment in die Klonierungsstelle eingefügt, so wird die Galaktosidase-Domäne als Fusionsprotein mit der klonierten Proteinsequenz exprimiert. Dies stört in der Regel die Komplementierung so stark, dass keine funktionelle Galaktosidase gebildet wird. D.h. ein Bakterium bzw. eine Kolonie, die ein nicht-rekombinantes puc18 trägt, ist blau, eine Kolonie mit rekombinantem puc18 bleibt weiß. Dieses Prinzip ist die Grundlage eines einfachen Screenings von transformierten Bakterien und wird Blau-Weiß Screening genannt. Hybridisierung von Nukleinsäuren Wenn man einzelsträngige DNA oder RNA mischt, die spezifische Nukleotidsequenzen gemeinsam besitzen, werden diese sich in Bereichen genetischer Homologie zusammenlagern und Duplexe bilden. Diese Hybridisierung kann dazu benutzt werden, um z.b. spezifische Gene in einem Nukleinsäurefragment zu lokalisieren. Bei vielen Hybridisierungsreaktionen wird die DNA oder RNA zuerst elektrophoretisch auf Flachgelen getrennt und auf einen Membranfilter transferiert. Die Moleküle werden auf der Membranmatrix als exakte Replikas der Gel-Trennung immobilisiert. Allgemein hängt die Wahl der für den Transfer und die Hybridisierung benutzten Membran von Parametern wie der Art und Größe der Nukleinsäure sowie die Anzahl der Hybridisierungsschritte und der angestrebten Empfindlichkeit ab. Als Southern-Blot wird der Transfer von DNA auf Membranen bezeichnet, eine Methode die 1975 von E. M. Southern publiziert wurde. In Anlehnung an diese Methode wurden andere Transfer Techniken als Northern-Blot (RNA) und Western-Blot (Proteine) bezeichnet.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 17 Zur permanenten Fixierung der DNA auf die Membran wird diese entweder durch UV- Strahlung oder durch Backen bei 120 o C für 15-30 Minuten behandelt. Die Detektion der immobilisierten DNA erfolgt durch eine DNA-Sonde, welche an die immobilisierte DNA hybridisiert. Die DNA-Sonde trägt eine Markierung. Die klassische Markierung ist die radioaktive mit 32 P. Diese im Nachweis sehr sensitive Methode hat jedoch den Nachteil, dass sie sehr aufwendig (Sicherheit im Umgang mit radioaktiven Substanzen) und relativ teuer ist (keine lange Lagerung aufgrund von Halbwertszeiten, hohe Entsorgungskosten). Heutzutage gibt es eine Reihe nicht-radioaktiver Markierungen, die einen ausreichend sensitiven Nachweis erlauben. Ein Beispiel ist die Markierung mit Digoxigenin (DIG). DIG ist ein Steroid-Hapten welches aus der Pflanze Digitalis purpurea isoliert wurde. Es wird in die DNA als Konjugat mit dutp eingebaut (Abb.7). Es existiert ein monoklonaler Antikörper gegen DIG, welcher eine sehr hohe Affinität zu diesem Antigen aufweist und somit eine ideale Basis für ein Detektionssystem bietet. Dieses Hapten wird verwendet, da es kaum in der Natur vorkommt und somit keine unspezifischen Bindungen zu erwarten sind. Das im Praktikum verwendete DIG-11- dutp wird mittels der sogenannten Random-primed Markierungs-Methode in die DNA eingebaut. Hierbei wird die Template-DNA denaturiert und die Einzelstränge durch das Klenow Fragment (C-terminale Domäne der DNA-Polymerase I) synthetisiert. Als Primer dienen Hexanukleotide mit zufälliger Sequenz. Ein DIG-11-UTP wird dabei statistisch alle 20-25 Basen in die neu synthetisierten Stränge eingebaut. Vor der Hybridisierung der Sonde mit der immobilisierten DNA wird ein Prähybridisierungsschritt durchgeführt, bei dem alle unspezifischen Bindungsstellen der Membran blockiert werden. Nukleinsäuren hybridisieren sehr effizient etwa 25 o C unterhalb der Schmelztemperatur, bei der sie zu 50% denaturiert (einzelsträngig) sind. Für DNA in wässrigen Lösungen werden die Hybridisierungen bei 65-70 o C durchgeführt. Da Formamid die Schmelztemperatur erniedrigt, werden Hybridisierungen in Gegenwart von Formamid (50 %ige Lösungen) bei 37-42 o C durchgeführt. Nachgewiesen wird die markierte DNA über die Bindung eines Antikörper-Enzym Konjugates und nachfolgende enzymatische Reaktionen. Im Praktikum wird ein anti-dig Antikörper-Konjugat mit alkalischer Phosphatase verwendet, welches durch die Farbstoffreaktion mit den Substraten NBT/BCIP nachgewiesen wird.
Molekularbiologie I - Theoretische Grundlagen 18 Abb.7: Strukturformel von DIG-11-dUTP Das PhoA Gen In dem Praktikumsversuch wird das Plasmid pbaphis6 (Abb.8) untersucht, welches für die rekombinante Expression der bakteriellen alkalischen Phosphatase aus E. coli konstruiert wurde. Dieses Protein wird von dem Gen PhoA kodiert. Es ist ein sehr gut untersuchtes ca. 50 kda Protein, das Phosphorsäureestergruppen abspaltet (E.C. 3.1.3.1.). Es wurde kloniert (Shuttleworth et al., Nucleic Acid Res., 14, 8689ff, 1986) und Abb.8: Restriktionskarte des Vektors pbaphis6
Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 19 die dreidimensionale Struktur aufgeklärt (Brookhaven Protein Datenbank, Name: 1ALK). Alkalische Phosphatasen sind aufgrund ihrer potentiellen Verwendung in enzymatischen Nachweisen (Farbreaktion mit den Substraten NBT/BCIP) von Interesse. Das PhoA- Protein wurde erfolgreich mit anderen Proteinen als Fusionsprotein rekombinant exprimiert und in enzymatischen Nachweisen verwendet. Das Protein wird in der Zelle zuerst mit einer Signalsequenz exprimiert, welche das Molekül in das Periplasma (Raum zwischen den beiden äußeren Zellmembranen von E. coli) leitet. Hier wird die Signalsequenz abgespalten und das eigentlich funktionelle Dimer gebildet. Zusätzlich zu den schon bekannten Strukturmerkmalen von Plasmiden erkennt man das Vorhandensein einer Promotor-Region, welche für Expressionsvektoren entscheidend ist. Die Promoter-Region wird durch den lac-repressor blockiert und verhindert somit eine basale Expression des Proteins durch den lac-promotor. Der lac-repressor wird über das laci q -Gen von dem Plasmid selber kodiert. Bei der Induktion mit IPTG wird die Inhibition aufgehoben und das rekombinante PhoA Protein als Fusionsprotein mit einem C-terminalen Histidinhexamer (His-Tag) exprimiert. Dieses His-Tag besitzt eine Affinität zu zweiwertigen Metallionen und kann zur Affinitätsaufreinigung des rekombinanten Proteins an Nickel-Chelat-Säulen verwendet werden. AUFGABENSTELLUNG Im Labor sind zwei Primerpaare mit unkenntlicher Beschriftung gefunden worden. Es konnte nur festgestellt werden, welche Primer zusammengehören und das sie ein etwa 300 bp großes Fragment der Randbereiche des PhoA-Gens aus dem Plasmid pbaphis6 über PCR amplifizieren (Abb.9). Welches Primerpaar das 5 - und welches das 3 -Ende amplifiziert ist jedoch unbekannt. Ziel dieser Praktikumswoche ist es, mittels molekularbiologischer Methoden die Primerpaare zuzuordnen. Die eine Hälfte der Praktikumsgruppen erhält dafür das eine Primerpaar (X1 und X2) und die andere Hälfte das zweite Primerpaar (Y1 und Y2), d.h. jede Gruppe untersucht ein Primerpaar. Zuerst wird mit den Primerpaaren mittels PCR ein 300 bp Fragment aus dem Plasmid pbaphis6 amplifiziert (Abb.10). Der Erfolg der PCR wird mit einer Agarose Gelelektrophorese überprüft. Ein Teil des Amplifikats wird anschließend zur Herstellung einer Digoxigenin markierten Sonde gefällt (Abb.11) und ein anderer Teil wird in den Vektor puc19t kloniert. Nach Transformation in kompetente E. coli werden Kolonien mit Insert über das Blau-Weiss Screening identifiziert.
Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 20 Abb. 9: Schematische Darstellung der Primer Hybrididsierung. Die Zellen werden vermehrt und die Plasmid DNA über eine DNA Minipräparation aus den Zellen isoliert. Die Plasmid DNA sowie der Vektor pbaphis6 werden anschließend mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und der Verdau gelelektrophoretisch überprüft (Abb.10). Anschließend erfolgt ein Southern Blot und die Hybridisierung mit der DIG markierten Sonde. Die Detektion des Digoxigenins erfolgt schließlich in einem Immunprint.
Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 21 Abb. 10: Übersicht zur Klonierung der PCR Fragmente in puc18.
Molekularbiologie I - Aufgabenstellung 22 Abb. 11: Übersicht zur Analyse der PCR Fragmente.
Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 23 DURCHFÜHRUNG Ansetzen der PCR Reaktion Jede Gruppe setzt eine PCR Reaktionen an, wobei die eine Hälfte des Kurses mit dem Primerpaar A und die andere Hälfte mit dem Primerpaar B arbeitet. Das 0,5 ml Tube mit dem Puffer (enthält 10 µl PCR Puffer) wird auf dem Deckel mit dem Namen/Gruppennummer o.ä. beschriftet. Das Tube wird auf Eis gestellt und folgender Ansatz dazu pipettiert: Puffer 10 µl MgCl 2 (50 mm) 3 µl H 2 O 26 µl dntps 20 µl Template pbaphis6 20 µl Primer 1 10 µl Primer 2 10 µl Taq-Polymerase 1 µl Endvolumen 100 µl Notieren Sie, welches Primerpaar Sie verwendet haben: Der Ansatz wird kurz anzentrifugiert, um Tröpfchen von der Gefäßwand zu entfernen. Als Kontrolle wird ein Ansatz zusammenpipettiert, bei dem kein Template enthalten ist. Das fehlende Volumen wird mit H 2 O ausgeglichen. Diese Kontrolle wird nur einmal im Kurs angesetzt. Im Thermocycler wird nun das PCR Programm Prakt gestartet: Schritt Temperatur Zeit 1. Primärdenaturierung 94 o C 1 min 2. Denaturierung 94 o C 10 sec 3. Hybridisierung 55 o C 30 sec 4. DNA-Synthese 72 o C 30 sec 5. Goto 2, Repeat 29x 6. DNA-Synthese 72 o C 10 min Für die PCR-Reaktion werden etwa 2,5 h benötigt.
Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 24 Ansetzen von Medium und Agarplatten Im Laufe der beiden kommenden Versuchswochen werden sowohl Flüssigmedien (LB Medium, Luria Broth) als auch feste Medien (LB Agarplatten) zum Wachstum von E. coli Zellen benötigt. Für den gesamten Kurs werden 3 l LB Medium und 3 l LB Agar benötigt. Zum ansetzen des Mediums werden in sechs 500 ml Flaschen jeweils 12,5 g LB Pulver gegeben und auf 500 ml mit H 2 O aufgefüllt. Für den LB Agar werden wiederum in sechs 500 ml Flaschen 20 g LB Agar gegeben und auf 500 ml mit H 2 O aufgefüllt. Die Flaschen werden auf dem Deckel mit Autoklavierband versehen und beschriftet. Die Flaschen gut schütteln, so dass keine Rückstände am Boden kleben. Das Autoklavieren (Sterilisieren für 20 Minuten bei 120 C unter Druck) wird von dem Assistenten übernommen und dauert etwa 3 h. Analyse der PCR Reaktion Die Analyse der oben angesetzten PCR-Reaktion erfolgt mit einem 2 %igen Agarosegel, wobei ein Gel für den gesamten Kurs angesetzt wird. 4 g Agarose in einem 500 ml Erlenmeyerkolben abwiegen. 200 ml TAE-Puffer (1x) dazugeben und in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht überkocht! 20 µl Ethidiumbromid dazugeben. Da Ethidiumbromid mutagen ist, unbedingt Handschuhe anziehen! Die Gelgießkammer wird mit den Gießsperren und einem Kamm zusammengebaut (Handschuhe!) und die Agaroselösung in die Kammer gegossen, wenn sie sich auf etwa 50 o C abgekühlt hat. Die Polymerisation erfolgt während der Mittagspause. TAE-Puffer (50x): 121 g Tris, 28,5 ml HOAc, 50 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 ad 500 ml H 2 O Mittagspause
Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 25 Nach Beendigung der PCR werden die DNA Fragmente bei 150 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gießsperren und die Kämme werden von dem Agarosegel entfernt (Handschuhe) und das Gel in die Laufkammer mit den Taschen nach links gelegt. Die Kammer wird mit TAE-Puffer (1x) gefüllt, bis das Gel gerade eben bedeckt ist (etwa 1 l). 10 µl der PCR Reaktion werden mit 2 µl Beladungspuffer (6x) auf einem Streifen Parafilm vermischt und 10 µl davon auf das Gel aufgetragen. Als Standard werden 10 µl puc19/mspi aufgetragen. Notieren Sie sich, welche Bahnen Sie belegt haben, in der folgenden Tabelle. Die Fragmente werden bei 150 V getrennt. Bahn Probe 1. puc19/mspi Standard 2. Kontrolle 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 15. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel unter UV Licht betrachtet und dokumentiert.
Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 26 Fällung des PCR-Produktes Zur Herstellung der DIG Sonde wird ein Teil des PCR Produktes gefällt. Ein 1,5 ml Tube wird auf dem Deckel mit "F Gruppennummer" beschriftet. Von dem PCR Ansatz werden 65 µl in das 1,5 ml Tube pipettiert. Anschließend werden 1/10 Volumen (6,5 µl) 3 M NaAcetat, ph 5,2 zugegeben. Schließlich wird das 2,5 fache Volumen (170 µl) kaltes 100 %iges Ethanol zugegeben und kurz gevortext. Der Ansatz wird über Nacht bei -20 o C gelagert. Das Tube mit dem restlichen PCR Ansatz wird ebenfalls bei -20 o C gelagert. Ligation des PCR Produktes Das PCR Produkt soll in den Vektor puc19-t kloniert werden. Dieser Vektor entspricht puc19, enthält jedoch zwei zusätzliche Schnittstellen für das Restriktionsenzym XcmI. Durch Schneiden mit XcmI entstehen an beiden Enden T-Überhänge, die eine direkte Klonierung des PCR Produktes erlauben. Für die Reaktion wird folgender Ansatz in einem 1,5 ml Tube zusammenpipettiert: puc19-t Vektor 10 µl H 2 O 7 µl Puffer NEB2 2 µl XcmI 1 µl Der Ansatz wir über Nacht bei 37 o C im Wasserbad inkubiert. Analyse des Restriktionsverdaus Die Analyse des Restriktionsverdaus erfolgt mit einem 1 %igen Agarosegel, wobei ein Gel für den gesamten Kurs angesetzt wird.
Molekularbiologie I - Durchführung (Montag) 27 Es werden 2 g Agarose abgewogen und analog zu der Vorschrift auf S.24 verfahren. Nach dem Erkalten wird das Gel mit etwas TAE Puffer überschichtet, damit es über Nacht nicht austrocknet. Gießen der Agarplatten Das Medium muss vor Zugabe des Antibiotikums auf etwa 50 o C abgekühlt werden. Zwei Flaschen werden mit Ampicillin (50 µg/ml Endkonzentrartion) und die anderen beiden mit Kanamycin (15 µg/ml Endkonzentration) und versetzt. Pro 500 ml LB Agarmedium werden 1,25 ml Ampicillin oder 300 µl Kanamycin zugegeben. Nach vorsichtigem Umschütteln (Vermeiden Sie Luftblasen zu erzeugen) werden die Platten im Schutz des Flammenkegels eines Bunsenbrenners gegossen. Die Platten mit dem Ampicillin werden an der Seite mit einem Strich, die Platten mit dem Kanamycin mit einem Doppelstrich markiert. Zum Erkalten werden die Platten über Nacht auf der Arbeitsplatte stehen gelassen und am nächsten Tag invertiert bei 4 o C gelagert. Ansetzen von Über-Nacht Kulturen (ÜNK) Am nächsten Tag sollen kompetente E. coli Zellen (Stamm: DH5α) hergestellt werden. Dazu müssen die Zellen über Nacht vermehrt werden. Von dem LB Medium werden 3 ml in ein steriles Kulturröhrchen gefüllt und dieses beschriftet. Dazu werden sterile 5 ml Pipetten benutzt und neben einem Bunsenbrenner gearbietet. Eine 200 µl Pipette wird an dem Schaft mit einem Ethanol getränkten Tuch gereinigt und eine Pipettenspitze aufgesetzt. Mit der Pipettenspitze wird von einer LB Platte mit DH5α Zellen eine Kolonie abgestreift und die Spitze in das Kulturröhrchen abgeworfen. Die Kultur wird über Nacht bei 37 o C und 220 rpm inkubiert.
Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 28 Herstellung kompetenter Zellen Um das später klonierte PCR Produkt in E. coli zu transformieren, müssen die Zellen kompetent gemacht werden, d.h. sie besitzen dann die Fähigkeit, Plasmid DNA aufzunehmen. Dazu werden die Zellen bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und anschließend mit einem Magnesiumchlorid-haltigen Puffer gewaschen. Das Wachstum der Zellen wird photometrisch bei 600 nm verfolgt und die Inkubation bei einer OD 600 von 0,3 abgebrochen. Es ist darauf zu achten, dass das Wachstum der Zellen exponentiell erfolgt. Die kompetenten Zellen müssen nach dem Waschen immer auf Eis bleiben, da sie sonst ihre Kompetenz verlieren! In einem sterilen Erlenmeyerkolben werden 50 ml LB Medium gefüllt. Von der Über-Nacht Kultur werden 500 µl in den Kolben gegeben. Die Kultur wird bei 37 o C und 220 rpm geschüttelt. Zur photometrischen Messung wird 1 ml der Kultur mit einer sterilen Pasteurpipette entnommen und die OD 600 bestimmt. Wenn eine OD 600 von 0,3 erreicht ist, wird die Kultur für 20 min auf Eis gestellt. Die Zellen werden in ein vorgekühltes 50 ml Tube überführt und für 10 min bei 3.000 rpm und 4 o C zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig in den Erlenmeyerkolben abgegossen und die Zellen in 2 ml eiskalter TSS Lösung durch auf- und abpipettieren resuspendiert. Bis zur Transformation werden die Zellen auf Eis gelagert. TSS Lösung: 85 ml LB Medium, 5 ml DMSO, 10 g PEG 8000, 50 mm MgCl 2 ad 100 ml, ph 6,5 Analyse des Restriktionsverdaus Der Ansatz mit dem Restriktionsverdau wird kurz anzentrifugiert. Der Ansätze wird mit 4 µl Beladungspuffer (6x) versetzt, erneut kurz anzentrifugiert und die gesamte Menge auf das Gel aufgetragen. Als Standard werden 10 µl λdna/eco 130I aufgetragen. Notieren Sie sich in der unten stehenden Tabelle, welche Bahnen Sie belegt haben. Die Fragmente werden bei 150 V getrennt.
Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 29 Bahn Probe 1. λdna/eco 130I 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 15. Nach der Elektrophorese wird das Gel unter UV Licht betrachtet und das DNA Fragment aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Ein 1,5 ml Tube wird auf dem Deckel mit der Gruppennummer beschriftet. Der geschnittene Vektor wird mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten Dabei ist darauf zu achten, dass der Anteil an Agarose möglichst gering gehalten wird. Isolierung der DNA aus dem Agarosegel Um die DNA aus dem Agarosegel zu isolieren, wird das Agarosestück über einem Filter zentrifugiert und so die DNA abgetrennt: In dem Boden eines 0,5 ml Tubes wird mit einer heißen Kanüle ein Loch gestochen. Mit einer sterilen (abgeflammten) Pinzette wird etwas Glaswolle in das 0,5 ml Tube gestopft. Das Agarosestück wird auf die Glaswolle gelegt und das Tube in ein 1,5 ml Tube gestellt.
Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 30 Es wird für 1 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Im Durchlauf befindet sich die DNA. Ligation des PCR Produktes Für die Ligation wird in einem 0,5 ml Tube folgender Ansatz auf Eis zusammen pipettiert: puc19-t/xcmi verdaut 2 µl PCR Produkt 15 µl T4 Ligations Puffer 2 µl T4 DNA Ligase 1 µl Die Ligation wird für 3 h bei 16 o C inkubiert. Mittagspause Transformation Das in puc19-t ligierte PCR Fragment wird nun in die kompetenten E. coli DH5α Zellen mittels Hitzeschock transformiert. Drei 1,5 ml Tubes werden mit "L", "+" und "-" beschriftet und auf Eis gestellt. Durch kurzes Anschnippen mit dem Finger werden die E. coli Zellen resuspendiert und je 100 µl davon in die vorgekühlten 1,5 ml Tubes pipettiert. Von dem Ligationsansatz werden 10 µl zu den Zellen in dem Tube "L" pipettiert. Zusätzlich werden 1 µl (10 ng) puc19 als positiv Kontrolle zu dem Ansatz "+" gegeben. In die negativ Kontrolle wird keine DNA pipettiert. Die Ansätze werden für 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden für 90 sec bei 42 o C inkubiert und anschließend für 2 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 ml LB Medium wird für 45 min bei 37 o C inkubiert. Dabei etwa alle 10 min die Zellen durch Schütteln des Tubes resuspendieren.
Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 31 Vier LB Amp Platten werden mit 20 µl IPTG und 40 µl X-Gal beschichtet. Von 3 Ansätzen werden jeweils 100 µl auf LB Amp Platten ausplattiert. Der Ansatz "L" wird für 2 min bei 4.500 rpm zentrifugiert, der Überstand bis auf 100 µl abgesogen, die Zellen resuspendiert und der gesamte Ansatz auf eine LB Amp Platte ausplattiert. Die Platten werden invertiert bei 37 o C über Nacht inkubiert. IPTG: 100 mm in H 2 O X-Gal: 20 mg/ml in DMF Einfrieren von Zellen Die kompetenten E. coli werden zur Lagerung eingefroren: Es werden vier 1,5 ml Tubes auf dem Deckel mit der Gruppennummer beschriftet und auf Eis 1-2 min vorgekühlt. In die gekühlten Tubes werden jeweils 400 µl der Zellen gegeben und die Zellen in flüssigem Stickstoff gekühlt. Die Lagerung erfolgt bei -80 o C. Fällung der PCR-Produkte Die gestern angesetzte Fällung des PCR Produktes muss noch abgeschlossen werden. Die Ansätze (lagern bei -20 o C) werden für 20 min bei 14.000 rpm und 4 o C zentrifugiert. Dabei auf die Orientierung des Tubes in der Zentrifuge achten! Der Überstand wird vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe abgesogen. Auf das Ende des Schlauches wird dabei eine frische, sterile Pipettenspitze gesetzt. Es werden 100 µl kaltes 70%iges Ethanol zugegeben und der Ansatz kurz gevortext. Der Ansatz wird für 2 min bei 14.000 rpm und 4 o C zentrifugiert. Dabei wiederum auf die Orientierung des Tubes in der Zentrifuge achten.
Molekularbiologie I - Durchführung (Dienstag) 32 Der Überstand wird vollständig abgesogen, auch Tröpfchen von der Gefäßwand müssen entfernt werden. Die DNA mit geöffnetem Deckel 10 min an der Luft trocknen lassen. Die DNA wird schließlich in 5 µl H 2 O aufgenommen. Das gefällte PCR Produkt wird bei -20 o C gelagert.
Molekularbiologie I - Durchführung (Mittwoch) 33 Auswertung der Transformation Zählen Sie die blauen Kolonien der puc19 Kontroll-Platte aus. Berechnen Sie die Transformationseffizienz in cfu/µg DNA (Colony Forming Units). Diese kann mit der benutzten Methode bis zu 2 10 6 betragen. Vermehrung von Plasmid DNA Mit drei Kolonien von dem Transformationsansatz der Ligation werden nun Kulturen angesetzt, um die Zellen und somit auch die Plasmid DNA zu vermehren. Drei Kulturröhrchen werden mit 2 ml LB Medium gefüllt. Das Medium wird mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt. Mit einer Pipettenspitze wird eine weiße Kolonie von der Platte genommen und die Kultur damit angeimpft. Die Zellen werden bei 37 o C und 220 rpm inkubiert. DNA Minipräparation Die Isolierung des Plasmids erfolgt mittels einer DNA Minipräparation. Die Zelle wird dabei über eine alkalische Lyse aufgeschlossen. Jede Gruppe fertigt parallel drei Minipräparationen von den angesetzten Kulturen an. Die Zellsuspension wird in ein 2,0 ml Tube überführt und für 1 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird mit der Wasserstrahlpumpe abgesogen. Das Zellpellet wird in 100 µl Lösung I vollständig durch auf- und abpipettieren resuspendiert. Zu der Suspension werden 200 µl frisch angesetzte Lösung II zugegeben und zum Durchmischen das Tube kurz geschüttelt. Der Ansatz wird 5 min bei RT inkubiert. Anschließend werden 150 µl Lösung III zugegeben, kurz geschüttelt und für 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert.
Molekularbiologie I - Durchführung (Mittwoch) 34 Der Überstand (etwa 450 µl) wird abgenommen und in ein neues 1,5 ml Tube überführt. Ein leichtes Mitschleppen des weißen Niederschlages ist unproblematisch. Unter dem Abzug werden 450 µl Phenol/Chloroform (Handschuhe!) dazugegeben. Zur Extraktion der Proteine wird das Tube für 1 min gevortext. Zur Phasentrennung wird 2 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wird abgenommen (etwa 400 µl) und in ein neues 1,5 ml Tube gegeben. Nach Zugabe von 1 ml kaltem abs. Ethanol wird die Lösung gevortext und zur Fällung der DNA 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wird 10 min bei 14.000 rpm und 4 o C zentrifugiert. Der Überstand wird von dem Pellet abgesogen, 400 µl kaltes 70 %iges Ethanol zugegeben und 5 sec gevortext. Nach 2 min Zentrifugation bei 14.000 rpm und 4 o C wird der Überstand erneut abgesogen und die DNA bei geöffnetem Tube für 10 min an der Luft getrocknet. Schließlich wird die DNA in 12 µl TE Puffer/RNAse aufgenommen. Lösung I: 25 mm Tris, 50 mm Glucose, 10 mm EDTA, ph 7,9 Lösung II: 0,2 M NaOH, 1 % SDS (nicht auf Eis lagern!) Lösung III: 3 M KOAc, ph 5,2 Lösung II ist frisch anzusetzen aus 1 M NaOH und 10 % SDS Stocklösungen TE Puffer/RNAse: 10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 7,4 mit 0,025 mg/ml RNAse Entsorgung: Phenol/Chloroform Abfälle werden in dem roten Kanister für halogenhaltige Lösungsmittel entsorgt. Mit Phenol/Chloroform kontaminierte Gefäße werden geöffnet unter dem Abzug gesammelt. Restriktionsverdau Sowohl die drei DNA Minipräparationen, in denen sich die in puc19-t klonierten PCR Produkte befinden, als auch der Vektor pbaphis6, werden mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten. Fünf 1,5 ml Tubes werden auf dem Deckel beschriftet. In Tube 1 wird der Mastermix nach folgendem Pipettierschema angesetzt.
Molekularbiologie I - Durchführung (Mittwoch) 35 In die restlichen vier Tubes werden je 25 µl Mastermix pipettiert und anschließend die DNA (Kloniertes PCR Produkt oder pbaphis6) zugegeben. Mastermix H 2 O 105µl Puffer EcoRI 15,0 µl EocRI 5,0 µl Restriktionsverdau 1 2 3 4 5 Mastermix 125 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl pbaphis6 5 µl / / / puc19/pcr / 5 µl 5 µl 5 µl Endvolumen 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Die vier Ansätze werden kurz anzentrifugiert und über Nacht bei 37 o C im Wasserbad inkubiert. Herstellung der Digoxigenin Sonde Die Markierung des PCR Fragmentes mit Digoxigenin erfolgt mit dem Random Primed DIG DNA Labeling Kit der Firma Roche. Dabei wird die DNA durch Aufkochen denaturiert. Nach Anlagerung von unspezifischen Hexanukleotiden als Primer erfolgt die DNA Synthese und Einbau des DIG 11'dUTP mit dem Klenow Fragment. Alle Gruppen, die das selbe Primerpaar untersuchen, vereinigen ihre gefällten PCR Produkte, so dass in dem Kurs lediglich zwei Labeling Reaktionen zur Herstellung der Sonden A und B angesetzt werden. Die Fällungsansätze von den PCR Reaktionen der gleichen Primerpaare werden vereinigt. In den Deckel des Tubes wird mit einer heißen Kanüle ein Loch gestochen. Der Ansatz wird 10 min im Wasserbad aufgekocht. Anschließend wird der Ansatz sofort auf ein Eis/Kochsalz Gemisch gestellt. Ein 0,5 ml Tube wird ebenfalls in das Eis/Kochsalz Gemisch gestellt und 15 µl der denaturierten DNA hineingegeben. Es wird folgender Ansatz auf dem Eis/Kochsalz Gemisch zusammen pipettiert: