Biophysik der Zelle Grundlagen der zellulären Mechanosensitivität - II Carsten Grashoff MPI für Biochemie, Molekulare Mechanotransduktion cgrasho@biochem.mpg.de
Überblick Kurze Wiederholung EZM, Integrine, FAs Wie kann ich mechanische Prozesse in und an Zellen messen? Beispiel aus der Praxis
Die biophysikalische Fragestellung 1. Wie erkennt eine Zelle die mechanische Umgebung? 2. Wie verwandelt eine Zelle mechanische Information in biologische Prozesse? 3. Wie kann ich diese biophysikalischen Prozesse messen?
Rückblick - EZM - die mechanische Umgebung der Zelle ist durch die extrazelluläre Matrix (EZM) charakterisiert - die EZM diktiert die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften des Gewebes
Rückblick - EZM - die EZM besteht aus Proteinen, Glykosaminoglykanen, Proteoglykanen und Glykoproteinen - Kollagene vermitteln hohe Zugfestigkeit - Elastin vermittelt elastische Eigenschaften - GAGs vermitteln hohen Kompressionswiderstand
Rückblick EZM GAG Hydratisierung Elastin Entropisches Elastomer Kollagen Tripel-Helix
Rückblick Integrine α β extrazellulär - Integrine bestehen aus einer α- und einer β-einheit; es sind heterodimere Transmembranproteine - Integrine sind die wesentlichen EZM Rezeptoren und für alle höheren Lebewesen lebenswichtig intrazellulär
Rückblick Fokale Adhäsionen Fokale Adhäsion F-Aktin Kabel
Bildung einer Fokalen Adhäsion F-Aktin-Talin Bindung
Bildung einer Fokalen Adhäsion Kraft durch F-Aktin- Myosin-Kontraktion
Bildung einer Fokalen Adhäsion Vinkulin- Rekrutierung Kraft durch Aktin- Myosin-Kontraktion
Bildung einer Fokalen Adhäsion Vinkulin- Bindung
Bildung einer Fokalen Adhäsion FA Verstärkung
Bildung einer Fokalen Adhäsion FA Clustering
Fokale Adhäsionen haben viele Funktionen - Fokale Adhäsionen erfüllen wichtige biochemische und biophysikalische Funktionen: z.b.: Signaltransduktion Strukturproteine Kinasen, Phosphatasen, Proteasen, etc. Zell-Teilung Zell-Wanderung Zell-Differenzierung
Rückblick Die Integrin-Aktin Bindung - Talin vermittelt die Bindung von Integrinen an das F- Aktin Zytoskelett - die Reifung Fokaler Adhäsionen sind Talin-abhängig - Fokale Adhäsionen sind mechanosensitiv - Fokale Adhäsionen erkennen intrazelluläre Kontraktion sowie extrazelluläre Matrix-Rigidität
3. Wie kann ich diese biophysikalischen Prozesse messen? a) Wie identifiziert man die essentiellen Proteine? b) Wie analysiert man die Funktion neuer Proteine? c) Wie messe ich mechano-biologische Prozesse? d) Wie messe ich mechanische Kräfte an und in Zellen?
Wie identifiziert man die essentiellen Proteine?
Identifikation von Integrin-Bindungspartnern alt bewährt: (Ko)Immunoprezipitation 100s Proteins
Wie identifiziert man die essentiellen Proteine? besser: Massen-Spektrometrie 100s Proteins
Massen-Spektrometrie basierte Analyse Das FA Adhesome 100s Proteins
Wie analysiert man die Funktion neuer Proteine?
Wie analysiert man die Funktion neuer Proteine? Konzept 1: Protein deletieren, Konsequenzen messen Deletion durch knockout oder short-hairpin RNAs Isolation von Zellen Deletion des Talin- Gens in vitro Analyse
Z.B.: Adhäsion von Kontroll-Zellen auf Fibronektin Work of Katharina Austen 100s Proteins
Adhäsion von talin(-/-)-zellen auf Fibronektin Work of Katharina Austen 100s Proteins
Wie analysiert man die Funktion neuer Proteine? Konzept 2: Protein markieren, Funktion messen - durch Live cell imaging lässt sich die Lokalisation und die Dynamik von Proteinen mikroskopisch bestimmen
Mikroskopie und FA Analyse work of Carleen Kluger original image filter with gaussian kernel graylevel thresholding extraction of binary components
Mikroskopie und FA Analyse Size Shape Orientation A = d 2 i e = 1 b2 a 2 θ ε [ 90 ; 90 ] Area Eccentricity Angle Aber wie bestimmt man FA Dynamik?
Fluorescence recovery after photobleaching - durch fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) lässt sich die interne Dynamik von Proteinen mikroskopisch bestimmen
Wie messe ich mechano-biologische Prozesse?
Messung von Adhäsionkraft (spinning disc) ω r 1. Glass 100s coverslip Proteins 2. Spinning Disk 3. Fluid Chamber 4. Shaft connected to Motor Shear stress in [dyne/cm 2 ]
Messung von Adhäsionkräften work of Carleen Kluger vinc f/f 100s Proteins vinc -/-
Zelluläre Antwort auf Dehnung (cell stretcher) - Zellen werden auf elastischen Membranen ausgesäht und mechanisch gedehnt, z.b. um den Herzschlag zu simulieren - viele Zellen (z.b. Zellen der glatten Muskulatur) orientieren sich senkrecht zur stretch-richtung
Zelluläre Antwort auf Scherkräfte (shear flow) - Simulation der Scherkräfte des Blutstromes - Endothelzellen orientieren sich parallel zur Fluss-Richtung
Antwort auf Kräfte durch micro-beads - mit EZM beschichtete micro-beads werden an Zellen adheriert - wird am micro-beads gezogen so wird Vinkulin rekrutiert
Wie messe ich mechanische Kräfte an und in Zellen?
Traktionskraft-Mikroskopie - durch traction force microscopy lässt sich die von Zellen generierte Traktionskraft mikroskopisch bestimmen - hier wurden elastische Nano-Pillars verwendet, deren Verbiegung mikroskopisch gemessen und in Traktionskraft umgerechnet werden kann Fu et al., Nat Methods, 2010
Traktionskraft-Mikroskopie - Alternativ können die Bewegungen von nano-beads in Polyacrylamid-Gelen, von definiertem elastischen Modulus, mikroskopisch gemessen und Kräfte berechnet werden
Weitere (mechanische) Messverfahren an und in Zellen
Zusammenfassung - Methoden - durch Massenspektrometrie können eine Vielzahl von Proteinen in kurzer Zeit identifiziert werden aber: die traditionellen biochemische Methoden sind unerlässlich - zur Analyse eines Proteins werden unterschiedliche Strategien verfolgt: direkt: Markierung des Proteins, direkte Beobachtung der Proteinfunktion (biochemisch, mikroskopisch, ) indirekt: Deletion des Proteins und Messung der Auswirkung
Zusammenfassung - Methoden - Zellen konnen je nach Zelltyp unterschiedlich mechanisch stimuliert werden: Cell stretcher (z.b. Hautzellen, Muskelzellen) Shear flow (z.b. Endothelzellen) Aber auch: spinning disc assays, magnetische beads, mikro-pipetten, optische Fallen, etc.
Beispiel aus der Praxis Entwicklung einer Methode zur Messung mechanischer Kraft entlang einzelner Proteine in Zellen
Mechanische Aspekte der Zellwanderung Fokale Adhesionen schrumpfen Fokale Adhesionen wachsen
Mechanische Aspekte der Zellwanderung in Zell- Protrusionen: Traktionskraft hoch, FAs bilden sich oder wachsen Beningo et al., JCB, 2001 in zuruckziehenden Regionen: Traktionskraft hoch, FAs werden kleiner oder verschwinden
Mechanische Aspekte der Zellwanderung
Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
Prinzip eines molekularen Kraftsensors - das Linker-Peptid muss klein (<10nm) und elastisch sein, und auf piko-newton Kraft reagieren
Remember entropic elastomers?
Ein genetisch verschlusselter Kraftsensor flagelliform (spider silk protein) Becker et al., Nat Mater, 2003 Grashoff et al., Nature, 2010
Kalibration mit Einzelmolekul-Spektroskopie TJ Ha, University of Illinois, USA
Anwendung: ein Vinkulin-Kraftsensor Vinkulin
Charakterisierung des Vinkulin-Kraftsensors Der Kraftsensor wird stabil exprimiert zeigt normale Lokalisierung und normale FA Dynamik FRAP
Vinkulinkräfte in lebenden Zellen
Vinkulinkräfte in wandernden Zellen Grashoff et al., Nature, 2010
Automatische Quantifizierung
Statistische Auswertung Hohe Kraft entlang Vinkulin wenn sich FAs bilden Geringe Kraft entlang Vinkulin wenn FAs sich auflosen
Interpretation traction force high FA stability low vinculin forces low traction force high FA stability high vinculin forces high
Zusammenfassung Methoden und Praxis - es gibt verschiedene Möglichkeiten, um Kräfte an oder in Zellen zu messen: - traction force microscopy - atomic force microscopy - Rheologische Verfahren - Biosensoren - etc.
Moderne Zellbiologie ist interdisziplinär!