Antibiotikaresistenz Gram-negativer nosokomialer Infektionserreger ESBL, AmpC & Co. Beta-Lactamasen in Enterobacteriaceae Yvonne Pfeifer Bad Honnef Symposium 2008
Enterobakterien (Enterobacteriaceae) als nosokomiale Erreger Escherichia coli Klebsiella ssp. Enterobacter ssp. Citrobacter ssp. Providencia ssp. Klebsiella ssp. Escherichia coli Harnwegsinfektionen, Urosepsis Wundinfektionen, Bakteriämie Sepsis Infektion der Atemwege/ Nosokomiale Pneumonie Therapie: Fluorchinolone (Ciprofloxacin) Beta-Lactam-Antibiotika Aminobenzylpenicilline (Ampicillin) Cephalosporine (Ceftazidim, Cefotaxim) Monobactame (Aztreonam) Carbapeneme (Imipenem, Meropenem) 6-Aminopenicilliansäure
Mechanismen der Beta-Lactam-Resistenz 3. 1. Beta-Lactam Hydrolyse Enterobacteriaceae 2. Abb. sitemaker.umich.edu/.../files/resistance.gif P. aeruginosa
Einteilung der β-lactamasen nach Ambler Serin-β-Lactamasen Metallo-β-Lactamasen A C D TEM-1 SHV-1 ESBL TEM SHV CTX-M Ceftazidim Cefotaxim Cefpodoxim AmpC CMY MOX ACT Cefoxitin Ceftazidim Cefotaxim Cefpodoxim Enterobacteriaceae ESBL OXA Resistenzen Oxacillin Carbapeneme B Carbapenemasen VIM IMP Imipenem Meropenem P. aeruginosa; Enterobacteriaceae
Verbreitung der ESBL-Gene Mobilisierung chromosomaler Vorläufer-Gene über Transposons und Integration in Resistenzplasmide Horizontaler Gentransfer - Übertragung von konjugativen Plasmiden innerhalb der Spezies oder in andere Spezies A B Ausbreitung von Resistenz- Plasmiden zwischen verschiedenen Spezies A Donor B Rezipient Akkumulation von verschiedenen Resistenzgenen auf mehreren Transposons hintereinander möglich: multi-drug resistance regions (MDR) Multiresistenz
Verbreitung der Cephalosporin-Resistenz bei Enterobakterien EARSS - European Antimicrobial Resistance Surveillance System In Deutschland sind derzeit 5% der E. coli resistent gegenüber Cephalosporinen der Gruppe 3
Untersuchungen zu Auftreten und Verbreitung der β-lactamasen in Enterobacteriaceae in Deutschland NS(20) n = 30 NRW(16) n = 36 H (5) n = 7 RP(3) 2 BW(14) n = 29 MVP(2) n = 20 B (1) n = 20 BY(11) 5 Sammlung von klinischen Isolaten mit bundesweitem Einzugsgebiet Enterobacteriaceae 63 Escherichia coli n = 91 Klebsiella pneumoniae n = 37 Klebsiella oxytoca n = 22 Enterobacter cloacae n = 8 Enterobacter aerogenes n = 2 Citrobacter freundii n = 2 Providencia stuartii Phänotypische Resistenzbestimmung Genotypische Charakterisierung: B, Berlin; BW, Baden-Württemberg; BY, Bayern; H, Hessen; MVP, Mecklenburg-Vorpommern; NRW, Nordrhein-Westfalen; NS, Niedersachsen; RP, Rheinland-Pfalz; (x), Anzahl der Kliniken; n = x, Anzahl der Isolate aus den Kliniken des jeweiligen Bundeslandes PCR und Sequenzierung relevanter Resistenz Gene (bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla ampc ) Einsatz schnelldiagnostischer Methoden (Microarray)
Beta-Lactamase-Typ und Phänotypische Resistenz Antibiotika Hemmbarkeit durch β-lactamase AP CPD CTX CAZ FOX SUL, CLV, EDTA TEM ESBL R R V R S SUL, CLV SHV ESBL R R V R S SUL, CLV CTX-M-ESBL R R R V S SUL, CLV K1 (K. oxytoca) R R V S S - AmpC R R R R R - MBL R R R R R EDTA AP, Ampicillin; CPD, Cefpodoxim; CTX, Cefotaxim; CAZ, Ceftazidim; FOX, Cefoxitin; SUL, Sulbactam; CLV, Clavulansäure; Resistent; V, variabel; S, sensitiv Veränderung des Phänotyps durch Kombination von verschiedenen Beta-Lactamasen in einem Isolat Molekulare Diagnostik (Resistenz-Genotyp) erforderlich
Projekt-Ergebnisse: ESBL in Enterobacteriaceae bla TEM n = 76 bla SHV n = 49 bla CTX-M n = 56 TEM-1 TEM-12 TEM-29 TEM-30 TEM-52 n = 57 n = 3 4 SHV-1 SHV-2 SHV-2a SHV-5 SHV-11 SHV-12 SHV-28 SHV-33 SHV-36 SHV-31 SHV-76 n = 9 1 n = 4 n = 5 n = 4 1 CTX-M-1 CTX-M-2 CTX-M-3 CTX-M-9 CTX-M-10 CTX-M-14 CTX-M-15 CTX-M-58 1 n = 4 1 1 n = 5 1 n = 2 ESBL-Typen in E. coli, Klebsiella spp. sowie Enterobacter cloacae Dominanz von CTX-M-Typen (61% aller ESBL-Bildner) Identifikation neuer Varianten SHV-76 und CTX-M-58 Mehr als 1/3 der ESBL-Isolate sind multiresistent
AmpC-β-Lactamasen in Enterobacteriaceae Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen CMY ACC ACT FOX LAT MOX 6 Gen-Familien abgeleitet von verschiedenen Ursprungsspezies High-level Expression z.b. in E. coli ; K. pneumoniae Cefoxitin-resistent Chromosomal-kodierte AmpC-β-Lactamasen Konstitutive o. induzierbare high-level Expression des Wildtyp ampc Gens in E. cloacae, Citrobacter freundii Cefoxitin-resistent Konstitutive low-level Expression des Wildtyp ampc Gens in Escherichia coli Cefoxitin-sensitiv
Cephalosporin-Resistenz verursacht durch AmpC-β-Lactamasen Cefoxitin-Resistenz in E. coli : Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen chromosomal-kodierte AmpC-β-Lactamasen Sequenzierung der chromosomalen ampc Promoter Region -42-35box -18-10box -1 WT AmpC* TCCTGACAGTTGTCACGCTGATTGGTGTCGTTACAATCTAACGCATCGCCAATGTAAATCCGGCCCGCC 108/04 --T-----------------------A----------------T------------------------- 67/04 ------------A---A----------------T----------------------------------- 99/04 -------------------------I---------------------------------------T--- +58 WT AmpC* TATGGCGGGCCGTTTTGTATGGAAACCAGACCCTATGTTCAAAACGACGCTCTGCGCCTTATTAAT 108/04 --------------------------------T--------------------------------- 67/04 ---------D----------------------T----------------------A---------- 99/04 --------------------------------------------T--------------------- Ergebnis: High-level Expression des E. coli ampc durch Promoter-Mutationen
XbaI-Makrorestriktionsanalyse: (PFGE) Pulsfeld-Gelelektrophorese Cefoxitin-resistenter E. coli Isolate Dice (Tol 1%-1%) (H>0.0% S>0.0%)[0.0-100.0%] RKI-Nr. 65/04 109/04 78/04 86/04 66/04 87/04 108/04 15/04 43/04 18/04 21/04 34-2/04 74/04 85/04 17/04 54/04 51/04 56/04 16/04 68/04 36/04 30/04 49/04 99/04 28/04 24/04 67/04 98/04 89/04 62/04 Bundesland BW BY BW NRW BY NRW NRW RP BW BW H n.s. NRW RP RP NRW BY n.s. NRW BW BW BY BW H BW NRW BY H RP n.s. neuer ampc- Promoter Phylogenetische Gruppe A neuer ampc- Promoter Phylogenetische Gruppe A
Projekt Antibiotika-Resistenz-Surveillance in Deutschland (ARS) Cephalosporin-Resistenz in Enterobacteriaceae Molekulare Untersuchung von ESBL Isolaten (Blutkultur) aus mehr als 50 beteiligten Kliniken: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Projekt-Erweiterung: Untersuchung von ESBL Isolaten anderer Herkunft (Urinkultur ambulant/nosokomial) Molekulare Untersuchung von Isolaten mit Cefoxitin-Resistenz (AmpC-β-Lactamasen) und Carbapenem-Resistenz (OXA-, Metallo-β-Lactamasen) sichere Diagnostik und deren Weiterentwicklung Erkennen von Resistenz-Trends, z. B. durch Untersuchungen von Ausbrüchen
Untersuchung von Ausbruchs- Isolaten 23 E. coli aus der Neonatologie/ Neointensivstation mit ESBL-Verdacht RKI-Nr. Herkunft bla-gen (ESBL-MP-PCR) 165/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 166/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 167/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 168/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 169/07 Kind CTX-M-2 170/07 Kind CTX-M-2 CTX-M-15 als häufigste ESBL-Variante Klonale Verbreitung durch Hygienemängel KLUC-1 CTX-M-10 CTX-M-3 CTX-M-28 CTX-M-15 CTX-M-22 CTX-M-23 CTX-M-1 CTX-M-21 CTX-M-17 CTX-M-24 CTX-M-14 CTX-M-9 CTX-M-16 CTX-M-6 CTX-M-7 [AAK08976] [AAF65843] [BAB40925] [AJ549244] [AAL02127] [AAL86924] [AAL99990] [P28565] [CAD08929] [AAM33515] [AAN38836] [AAF72530] [AAF05311] [AAK32961] [CAA06311] [CAA06312] KLUC-1 Gruppe CTX-M-1 Gruppe > 97 % Sequenz-Identität CTX-M-9 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität 171/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 172/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 173/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 174/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 175/07 Kind CTX-M-15 176/07 Kind CTX-M-15 177/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 178/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 179/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 180/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 181/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 182/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15 CTX-M-4 CTX-M-2 CTX-M-20 KLUA-Enzyme [CAA74573] [P74841] [CAC95175] [CAB59824] CTX-M-2 Gruppe > 94 % Sequenz-Identität 183/07 Mutter TEM-1 + CTX-M-1 184/07 Personal TEM-1 + CTX-M-15 KLUG-1 CTX-M-8 CTX-M-25 CTX-M-26 [AF501233] [AAF04388] [AAM70498] [AY157676] CTX-M-8 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität CTX-M-25 Gruppe > 98 % Sequenz-Identität 20/08 (1) Mutter TEM-1 + CTX-M-15 20/08 (2) Mutter TEM-1 + CTX-M-15 21/08 Personal TEM-1 + CTX-M-15
XbaI-Makrorestriktionsanalyse (Pulsfeld-Gelelektrophorese) E. coli ESBL PFGE-Typ CTX-M-15 CTX-M-15 CTX-M-15; TEM-1 CTX-M-9; TEM-1 CTX-M-15 SHV-5; TEM-1 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-14; TEM-1 CTX-M-15 CTX-M-14; TEM-1 CTX-M-3; TEM-1 CTX-M-15; TEM-1 CTX-M-15 CTX-M-15 CTX-M-15 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-15; TEM-1 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-1; TEM-1 CTX-M-65; TEM-1 CTX-M-15 CTX-M-15; TEM-1 1 1 2 3 4 4 6 7 8 9 10 11 12 12 13 14 14 14 15 16 17 18 Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
ESBL in Salmonella 16 humane Isolate Salmonella enterica serovar Typhimurium, Lysotyp DT193 aus fünf Bundesländern Gastroenteritis,Harnwegsinfektion Resistenz gegen Cephalosporine der Gruppe 3 Xba-I-Makrorestriktionsanalyse (PFGE) S 1 2 3 S 4 5 6 7 S S = S. enterica Braenderup universal marker 1 = 6/07 CTX-M-1 + TEM-1 2 = 7/07 CTX-M-1 + TEM-1 3 = 8/07 CTX-M-1 + TEM-1 4 = 9/07 CTX-M-1 + TEM-1 5 = 10/07 CTX-M-1 + TEM-1 6 = 11/07 CTX-M-1 + TEM-1 7 = 12/07 CTX-M-1 + TEM-1 Bayern Bayern Niedersachsen Thüringen Thüringen Sachsen-Anhalt Bayern Nachweis von ESBL-Varianten TEM-52 und CTX-M-1 in Salmonella serovar Infantis (human und aus tierischem Material) Salmonella als mögliches ESBL-Reservoir
Einteilung der β-lactamasen nach Ambler Serin-β-Lactamasen Metallo-β-Lactamasen A C D TEM-1 SHV-1 ESBL TEM SHV CTX-M Ceftazidim Cefotaxim Cefpodoxim AmpC CMY MOX ACT Cefoxitin Ceftazidim Cefotaxim Cefpodoxim Enterobacteriaceae ESBL OXA Resistenzen Oxacillin Carbapeneme B Carbapenemasen VIM IMP Imipenem Meropenem P. aeruginosa; Enterobacteriaceae
Carbapenem-Resistenz und Metallo-Beta-Lactamasen Mobilisierung der Gene bla VIM und bla IMP aus Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa und Transfer in Enterobacteriaceae Phänotyp der Metallo-beta-Lactamases: Hemmbarkeit durch EDTA Variabilität des Resistenz-Levels verursacht durch Kombination der Beta- Lactamase-Bildung mit anderen Resistenzmechanismen: Carbapenem-Resistenz und Porin-Verlust OMP outer mebrane protein (OmpA-Trimer) 1, 2bp-Deletion STOP in ompk-35 2, 384 bp-deletion in ompk-36 3, 600 bp-deletion in ompk-36 Antibiotika K.p. 5 K.p. 54 K.p. 149 Imipenem 16 2 2 Imipenem+EDTA 1 1 1 Meropenem 32 4 2 bla TEM - - - bla SHV 1 5 1 bla CTX-M - - 15 bla ampc - - - bla VIM 1 - - qnr-gen - qnr-b - Porin OmpK35-1 + + Porin OmpK36 + - 2-3
Multiresistente Klebsiellen: ESBL, AmpC- und Metallo-Beta-Lactamasen Antibiotika Ampicillin Mezlocillin K.p. 62 > 16 K.o. 57 > 16 Klonale Verbreitung von Isolaten (Klebsiella spp.) mit Resistenzen gegenüber allen eingesetzten Antibiotika MSU Cefotiam Cefotaxim Ceftazidim > 8 > 16 > 8 > 16 Ursache ist die Kombination unterschiedlicher Beta- Lactamasen sowie Porin-Defekte in den Isolaten: Beta-Lactamase Gene (bla) Cefoxitin K.p. 62 K.o. 57 Gentamicin Kanamycin > 8 2 bla TEM - - Amikacin 2 bla SHV 1 - Streptomycin Nalidixinsäure Oxytetrazyclin Chloramphenicol Ciprofloxacin Sulfameracin SXT Colistin > 64 > 8 > 64 > 512 > 128 0,5 > 64 > 8 64 > 512 > 128 0,5 bla CTX-M 9 - bla ampc CMY-4 - bla VIM 1 1 qnr-gen - qnr-b Porin OmpK35 - a - b Porin OmpK36 + - b a, IS1-Transposase in ompk-35; b, bp-deletionen Imipenem Imipenem+EDTA Meropenem 64 1 32 64 1 128 bla CMY-4 und bla VIM-1 auf einem Plasmid (120 kb) lokalisiert und übertragbar
Danke Prof. Dr. Wolfgang Witte Dr. Guido Werner Dr. Birgit Strommenger Sibylle M.-Bertling Angela Danschke Dr. Rita Prager Dr. W. Rabsch Dr. Anne-Marie Fahr