Userguide No 033 I BioPhotometer plus Kolorimetrische Bestimmung von Fructose über Standardkurven bei 490 nm im Eppendorf BioPhotometer plus Martin Armbrecht, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Zusammenfassung In diesem Userguide wird gezeigt, wie die Konzentration von Fructose über einen einfachen Farbtest im Eppendorf BioPhotometer plus bestimmt werden kann. Dieser kolorimetrische Nachweis erfolgt durch den Farbstoff Resorzin und wird u.a. bei Fertilitätsuntersuchungen von Sperma eingesetzt, wobei die nachweisbare Menge an Fructose im Seminalplasma ein wichtiges Kriterium für die Nährstoffversorgung der Spermatozoen darstellt. Die Bestimmung der Fructose erfolgt im BioPhotometer plus über eine programmierte Standardreihe mit definierten Fructosemengen. Die Fructosekonzentration in der Probe kann anschließend direkt abgelesen und mit entsprechenden Referenzwerten verglichen werden. Einleitung Neben der einfachen und übersichtlichen Bestimmung von Nukleinsäure- oder Proteinkonzentrationen bietet das BioPhotometer plus auch die Möglichkeit, kolorimetrische Tests oder Enzymassays einfach und bequem durchzuführen. Die Konzentrationsbestimmung der Proben erfolgt dabei über eine sogenannte Endpunktbestimmung. Hierfür werden Standards mit aufsteigender Konzentration her-gestellt und nacheinander im BioPhotometer plus gemessen. Die daraus resultierende Standardkurve wird direkt im Gerät gespeichert. Ein Beispiel hierfür ist die kolorimetrische Bestimmung von Fructose, welche bei vielen biochemischen, medizinisch-diagnostischen oder lebensmittelchemischen Untersuchungen angewendet wird. In Rahmen einer Fertilitätsuntersuchung von menschlichen Seminalplasma (Spermatogramm) dient die Menge an Fructose als Indikator, ob eine genügende Versorgung der Spermatazoen während der Befruchtung gewährleistet ist. Der Gehalt an Fructose im Sperma sollte laut WHO mindestens bei 13 µmol in mindestens 2 ml Ejakulat liegen [1]. Ist die Menge geringer, kann auf eine Unterversorgung der Spermien geschlossen werden, was auf eine Fehlfunktion der Samenbläschen zurückzuführen ist. Für ein vollständiges Spermatogramm sind aber weitere biochemische Tests notwendig, wie beispielsweise die Bestimmung von alpha-glucosidase-aktivität, des Citratsowie des Zinkgehaltes im Seminalplasma. Zusätzlich müssen zahlreiche mikroskopische Untersuchungen hinsichtlich der Spermienzahl, der Morphologie und Motilität der Spermien durchgeführt werden [2]. In diesem Artikel soll nur auf den Fructose-Nachweis eingegangen werden [3]. Die Färbungsreaktion beruht im Prinzip auf der Seliwanow-Reaktion, welche zum Nachweis von Fruchtzucker angewendet wird. Die Zuckerlösung wird dabei mit konzentrierter Salzsäure (37 %) angesäuert, mit einer ethanolischen Resorzinlösung (96 % Ethanol) versetzt und anschließend erhitzt. Dabei entsteht Hydroxymethylfurfural, das in Anwesenheit von Resorzin zu einem roten Farbstoff-Komplex reagiert (Abbildung 1). Die Konzentration des Farbkomplex ist proportional zu der in der Reaktion eingesetzten Fructose und kann im BioPhotometer plus bei 490 nm gemessen werden.
Userguide No 033 Seite 02 Abbildung 1: Seliwanow-Reaktion. Der Farbstoff-Komplex zur Bestimmung der Fructose wird bei 490 nm gemessen. Die Seliwanow - Reaktion wird benutzt, um bei Zuckern zwischen Ketosen und Aldosen zu unterscheiden. So entsteht nach der Probenanalyse bei vorhandener Fructose (Ketose) eine Rotfärbung. Bei Glucose (Aldose) hingegen wird keine Rotfärbung ausgelöst. Material und Methoden Material Geräte und Verbrauchsmaterial von Eppendorf: BioPhotometer plus UVette 2 ml Safe-Lock Tubes Thermomixer comfort MixMate Reagenzien von anderen Anbietern: 0,1 %ige Resorzin-Stammlösung in 96 % Ethanol 37 % Salzsäure 1 % Fructose-Stammlösung Methoden 1) Standardreihe Zur Herstellung der 0,1 %igen Resorzin-Stammlösung werden 100 mg Resorzin in 100 ml Ethanol (96 %) gelöst. Für die 1 %ige Fructose-Stammlösung [10 mg/ml] müssen 100 mg Fructose in 10 ml Wasser gelöst werden. Um die Standardkurve im BioPhotometer plus zu programmieren, muss zunächst eine Verdünnungsreihe mit definierten Fructosekonzentrationen hergestellt werden (Tabelle 1). Alle Standards werden anschließend im Verhältnis 1:40 hergestellt. Dazu werden 50 µl Standard mit 1950 µl Wasser verdünnt. 50 µl Probe mit unbekannter Fructosekonzentration wird ebenfalls mit 1950 µl Aqua bidest. verdünnt. Soll Fructose in Seminalplasma nachgewiesen werden, müssen die darin enthaltenen Spermien abgetötet werden, um den Gehalt an Fructose zu konservieren. In diesem Fall werden 50 µl Ejakulat mit 1950 µl Aqua bidest. versetzt und anschließend für 5 min bei 99 C im Thermomixer comfort inaktiviert. Danach bleibt der Gehalt an Fructose in der Probe konstant. Alle Verdünnungen erfolgen im Eppendorf 2 ml Safe-Lock Tubes. Tabelle 1: Standardreihe für die Herstellung der Fructose-Standards Bezeichnung Lösung + Aqua bidest. Konzentration [mg/ml] Konzentration [µmol/ml] Standard 6 A 750 µl Stammlsg. + 250 µl 7,5 41,25 Standard 5 B 1 ml Stammlsg + 1 ml 5 27,5 Standard 4 C 1 ml B + 1 ml 2,5 13,75 Standard 3 D 1 ml C + 1 ml 1,25 6,88 Standard 2 E 1 ml D + 1 ml 0,63 3,44 Standard 1 F 1 ml E + 1 ml 0,31 1,72
Userguide No 033 Seite 03 2) Messungen Für die Messung der Proben und der Standards wird das in der Tabelle 2 gezeigte Pipettierschema verwendet. Alle einzelnen Komponenten werden in 2 ml Eppendorf Safe- Lock Tubes unter dem Abzug pipettiert und zum Beispiel mit einem Eppendorf MixMate durchmischt. Es wird empfohlen, eine positive Kontrolle mit bekannter Fructose- Konzentration mitzubestimmen. Für die Farbreaktion werden die Proben und die Standards für 8 min bei 80 C inkubiert. Da diese Temperatur genau eingehalten werden muss, empfiehlt es sich, dafür einen programmierbaren Heizblock wie den Eppendorf Thermomixer comfort zu verwenden. Einstellungen am BioPhotometer plus Für die Kalibrierung der Standardreihe am BioPhotometer plus müssen zunächst alle erforderlichen Parameter im Gerät programmiert werden. Dazu wählt man die Methodengruppe Assay 490 aus (s. Abbildung 3). Alle drei jetzt sichtbaren Methoden sind vorprogrammiert mit einer Auswertung über Faktor (Assay 490/1), Standard- oder Einpunktkalibrierung (Assay 490/2) oder Standardkurve (Assay 490/3). Tabelle 2: Pipettierschema für die Proben- und Standardmessungen Standard 1-6 Verdünnte Standards 300 µl Probe Kontrolle (optional) Verdünnte Probe 300 µl Kontrolle 300 µl + 0,1 %ige Resorzin-Lsg 300 µl 300 µl 300 µl + 37 %ige Salzsäure 1200 µl 1200 µl 1200 µl Die erstellte Standardkurve sollte einen linearen Verlauf haben, wie es in Abbildung 2 gezeigt ist. Vor den Messungen sollten Proben und Standards kurz zentrifugiert werden. Abbildung 2: Kalibrationsgerade für Fructose-Standards 1-6. Die Extinktion sollte linear zur gemessenen Fructose-Konzentration steigen. Abb. 3: Auswahl der Methode Assay 490 Da Fructose über eine Standardkurve bestimmt werden soll, wird mit Hilfe der Cursor-Tasten die Methode Assay 490/3 ausgewählt. Zunächst werden die Parameter bestimmt, wie es sukzessive in Abbildung 4 dargestellt ist. Zur Programmierung muss die Taste "parameter/dilutions" betätigt werden. Durch Betätigung der Pfeiltasten am BioPhotometer plus erreicht man die jeweiligen Methoden in verschiedenen Auswahldisplays. Zunächst wird die Einheit auf [µmol/ml] festgelegt (Abbildung 4A). Die Auswertung erfolgt über Standard (Abbildung 4B). Für die Standardkurve sollen hier 6 verschiedene Standards gemessen werden. Jeder Standard einer bestimmten Fructose-Konzentration wird hier nur einmal gemessen, es sind aber maximal drei Messungen pro Standard möglich (Abbildung 4C). Die Extinktion verhält sich wie in Abbildung 2 zu sehen linear zum Fructosegehalt im Standard. Aus diesem Grund wird für die Auswertung die lineare Regression verwendet (Abbildung 4D). Zur Definition der Standardkonzentrationen müssen die Fructose-Konzentrationen der einzelnen Standards (s. Tabelle 1) über die Zahlentastatur des BioPhotometer plus eingegeben werden (Abbildung 4E). Alle Parameter für die Kalibrierung mit den Fructose- Standards sind nun im BioPhotometer plus festgelegt. Vor der Messung der Standardkurve wird zur Überprüfung der festgelegte Kalibrationsbereich noch einmal angezeigt (Abbildung 4F), um ggf. Änderungen vorzunehmen zu können.
Userguide No 033 Seite 04 A B D E C F Abbildung 4: Parametereinstellung der Methode 490/3. D) Wahl der linearen Regression A) Bestimmung der Einheit für die Konzentrationsbestimmung E) Eingabe der zu messenden Standard-Konzentrationen B) Evaluation über Standard F) Eingangsdisplay vor der Messung der Kontrolle (Blank). C) Anzahl der Standardkonzentrationen und Messungen pro Standard Nach der Messung der Kontrolle (Blank, Abbildung 5A) werden die 6 Standards hintereinander gemessen (Abbildung 5 B-G). Im Display erscheint jeweils die bei dem Standard gemessene Extinktion. Oben rechts in der Anzeige erscheint dabei die zugeordnete Konzentration des gemessenen Standards und unten rechts die Konzentration des anschließend zu messenden Standards. Jede Messung wird über die Taste Standard ausgelöst und Der Bereich der Standardkurve wird angezeigt das Ergebnis für die Berechnung der Standardkurve automatisch gespeichert. Nachdem alle Standards gemessen wurden, kann direkt mit der Bestimmung der Fructosekonzentration begonnen werden. Eine erneute Blankmessung muss vorher nicht durchgeführt werden. Vor Beginn der Messung werden automatisch im Display der Kalibrationsbereich und der Zeitpunkt der zuletzt erstellten Standardkurve angegeben (Abbildung 5H). A B C D E F H G Abbildung 5: Erstellung der Standardkurve durch Messung der Blank und Fructose-Standards mit der Methode Assay 490/3. A) Blankmessung B) Standard 1: 1,72 µmol/ml Fructose C) Standard 2: 3,44 µmol/ml Fructose D) Standard 3: 6,88 µmol/ml Fructose E) Standard 4: 13,75 µmol/ml Fructose F) Standard 5: 27,5 µmol/ml Fructose G) Standard 6: 41,25 µmol/ml Fructose H) Anzeige der zuletzt gespeicherten Standardkurve
Userguide No 033 Seite 05 Ergebnisse und Diskussion In Abbildung 6 A-D sind 4 Messergebnisse von Fructose- Proben gezeigt, bei denen die Konzentration an Fructose über die oben programmierte Standardkurve ermittelt wurde. Neben der errechneten Konzentration wird auch immer die zugehörige Extinktion mit angegeben. Das ist wichtig, da sichergestellt werden muss, dass die Nachweisgrenze des BioPhotometer plus (0,03 E) nicht unterschritten wird und somit die Ergebnisse unbrauchbar werden. In Falle der Fructose-Bestimmung im Seminalplasma mit dem typischen Referenzwert von 13 µmol Fructose in ca. 2 ml Ejakulat (WHO-Werte) würde Probe 6A eine deutliche Unterversorgung zeigen (ca. 8 µmol Fructose in 2 ml), wohingegen in den Proben B - D eine ausreichende Menge an Fructose vorhanden wäre. Um eine endgültige Aussage zur Fertilität bzw. Infertilität zu treffen, müssen für alle Seminalplasmaproben in jedem Falle weitere Untersuchungen im Rahmen des Spermatogramms durchgeführt werden (z.b. Morphologie, Motilität und Anzahl der Spermien). Natürlich kann die hier dargestellte Methode der Fructosebestimmung auch mit anderen Proben durchgeführt werden, in denen der Fructosegehalt wichtig ist, wie zum Beispiel in Blut oder Lebensmitteln. Es zeigt sich, dass das BioPhotometer plus für diese Art von kolorimetrischen Bestimmungen hervorragend geeignet ist, da die Standardkurven sehr leicht programmiert werden können, eine hohe Flexibilität bei der Auswahl der Parameter besteht und die Ergebnisse übersichtlich dargestellt werden. Die erstellten Standardkurven werden sofort gespeichert und können für weitere Fructose-Bestimmungen verwendet werden. Die Standardkurven bleiben dauerhaft gespeichert und müssen nicht vor jeder Probenbestimmung neu erstellt werden. Eine Neuerstellung der Standardkurve ist erst notwendig, wenn die gespeicherten Parameter in einer Methode verändert werden. A B C D Abbildung 6 A-D: Ermittlung der Fructose- Konzentration in 4 unterschiedlichen Proben Literatur 1) Praktische Spermatologie, Vasterling, Stuttgart, Thieme, 1960 2) WHO Laborhandbuch zur Untersuchung des menschlichen Ejakulates und der Spermien-und Zervikalschleim Interaktion, 1999 3) Jin-Chun Lu, Fang Chen, Hui-Ru Xu, Yu-Feng Huang, Nian-Qing Lu: Standardization and Quality Control for Determination of Fructose in Seminal Plasma Journal of Andrology, Vol. 28, No. 2, March/April 2007
Userguide No 033 Seite 06 Bestellinformationen Bezeichnung Bestell-Nr. BioPhotometer plus, 230 V / 50-60 Hz 6132 000.008 Thermodrucker DPU 414 6131 011.006 Thermopapier, 5 Rollen 0013 021.566 UVette, einzeln verpackt, 80 Stück 0030 106.300 UVette routine pack, 200 Stück 0030 106.318 Küvettenständer, für 16 Küvetten 4308 078.006 Thermomixer comfort, Grundgerät ohne Wechselblock 5355 000.011 Wechselblock für 2,0 ml Reaktionsgefäße 5362 000.019 Safe-Lock Reaktionsgefäße, 2,0 ml, 1.000 Stück 0030 120.094 MixMate, 230 V / 50-60 Hz 5353 000.014 Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH Deutschland Tel: +49 2232 418-0 Fax: +49 2232 418-155 E-mail: vertrieb@eppendorf.de Eppendorf Austria Österreich Tel: +43 1 890 13 64 0 Fax: +43 1 890 13 64 20 E-mail: office@eppendorf.at Vaudaux-Eppendorf AG Schweiz Tel: +41 61 482 1414 Fax: +41 61 482 1419 E-mail: vaudaux@vaudaux.ch eppendorf ist eine eingetragene Marke. Copyright 2009 by Eppendorf AG. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich der Graphiken und Abbildungen der Eppendorf AG. AU033WW010/DE1/WEB/1209/KW Application Support Tel: +49 1803 666 789 E-mail: support@eppendorf.com