Der Beginn der menschlichen Entwicklung aus dem Blickwinkel der Embryologie

ZaeFQ 26. SYMPOSION 2002 JURISTEN UND ÄRZTE REPRODUKTIONSMEDIZIN UMSTRITTENE GRENZZIEHUNG Der Beginn der menschlichen Entwicklung aus dem Blickwinkel der Embryologie Henning M. Beier Institut für Anatomie und Reproduktionsbiologie, Medizinische Fakultät, RWTH Aachen ZUSAMMENFASSUNG Die menschliche Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtungskaskade, denn mit der Vereinigung der haploiden Chromosomensätze der Eizelle und der Samenzelle entsteht ein genetisches Programm für eine menschliche Entwicklung. Diese Entwicklung führt indessen in den ersten Tagen nur in 30% aller Entwicklungsanläufe zum Erfolg einer Implantation und Plazentabildung. Diese labile Entwicklung und Differenzierung während der ersten Woche nach der Befruchtung zeigt, dass die menschliche Blastozyste, wenn sie glücklicherweise aus einer Zygote entstanden ist, erst dann die Chance hat, ein Mensch zu werden, wenn die Mutter zum Gelingen der Implantation und der Entstehung einer Plazenta beigetragen hat. Die Hindernisse für eine frühe normale Entwicklung stellen als genetische und epigenetische Basisvorgänge im Zytoplasma und im Genom der Blastomeren naturgesetzliche Ereignisse dar, deren naturwissenschaftliche Kausalzusammenhänge noch längst nicht ausreichend erforscht sind. Dies zu verstehen, scheint besonders Philosophen, Ethikern und Juristen nicht leicht zu fallen. Ein Blick auf die Gesetzeslage in der Bundesrepublik Deutschland zeigt, dass das früheste menschliche Entwicklungsstadium vor der Implantation in vitro strafrechtlich geschützt wird, während in vivo der gleiche strafrechtliche Schutz erst ab der Implantation einsetzt. Aspekte für die Forschung an menschlichen Embryonen und embryonalen Stammzellen werden unter diesem Blickwinkel aufgezeigt. Sachwörter: Vorkernstadien, Furchungsteilung, Blastozyste, Pluripotenz, Totipotenz, Genaktivierung, embryonaler Fruchttod on beginnt die Vorbereitung zur männlichen Vorkernbildung durch eine Schwellung des Spermienkopfs und eine Dekondensation des Chromatins des Spermienzellkerns. Mit dem Eindringen eines Spermiums in die Eizelle fällt eine eminent wichtige biologische Entscheidung. Als Ergebnis der Meiose trägt etwa die Hälfte aller Spermien ein X- Chromosom, die andere Hälfte ein Y-Chromosom. Es hängt allein von diesem Geschlechtschromosom des penetrierenden Spermiums ab, ob das zukünftige Genom der nunmehr befruchteten Eizelle die männliche (XY) oder die weibliche (X X) Chromosomenkonstellation haben wird. Die genetische Geschlechtsbestimmung wird also bereits mit dem Vorgang der Penetration vollzogen. DER BEGINN DER BEFRUCHTUNGSKASKADE Die Imprägnation der Eizelle durch ein Spermium erfolgt in der Pars ampullaris des Eileiters. Wenn eines der Spermien die Zona pellucida durchdrungen hat, bleibt es nicht lange im perivitellinen Raum zwischen Zona und Eizelloberfläche liegen, sondern heftet sich sofort auf der Oozytenoberfläche an. Hierbei kommt es zur Fusion der beiden sich berührenden Zellmembranen. Beim Menschen penetrieren in der Regel mehrere Spermien gleichzeitig die Zona pellucida. Meist gelangen sie auch in den perivitellinen Spalt, jedoch dringt in der Regel nur ein Spermium in die Eizelle ein. Die Fusion der Zellmembranen von Spermium und Eizelle beginnt in der Postakrosomalregion des Spermiums. Wie bei der Akrosomenreaktion geht die Membranvereinigung schnell voran, so dass bald eine völlige Inkorporation von Spermienkopf und Spermienmittelstück in das Zytoplasma der Eizelle erreicht wird. Der Spermienschwanz wird oft mit in das Zytoplasma inkorporiert. Unmittelbar nach dieser Imprägnati- Vorkernbildung (Pronukleus-Stadium) Mit dem Eindringen eines Spermiums wird die Blockade des zellulären, meiotischen Reifungsprogramms in der Eizelle des Menschen aufgehoben. Die Eizelle befindet sich nach der Ovulation in der arretierten Metaphase der 2. Reifeteilung. Nur wenn ein Spermium eindringt, erfolgt die biochemische Aktivierung zum Abschluss der 2. Meioseteilung mit Bildung eines weiteren Polkörperchens und eines haploiden Chromosomensatzes für den weiblichen Pronukleus. 351

Die Chromosomen des Spermienzellkerns machen innerhalb weniger Stunden eine komplette Dekondensierung durch, zahlreiche Nukleoli formieren sich im expandierten Kern, so dass wir nun vom männlichen Pronukleus sprechen. Dieser ist meist größer als der weibliche Vorkern. Ungefähr 18 20 Std. nimmt die Pronukleusbildung in Anspruch, bevor die Prophase der ersten Furchungsteilung beginnt. Etwa 6 Std. entfallen auf die S-Phase, in der die haploiden Chromosomensätze jedes Vorkerns je für sich identisch redupliziert werden. Jedes Chromosom liegt nach dieser DNA- Replikation als Chromatidenpaar vor (Abb. 1). Nach deutscher Gesetzgebung wird der Zeitpunkt, zu dem der Schutz der Menschenwürde anzuwenden ist, mit dem Abschluss der Befruchtung gleichgesetzt. Da nach unstrittiger wissenschaftlicher Erkenntnis das Entwicklungsstadium der Vorkerne (Pronukleus-Stadium) längst noch nicht den Abschluss der Befruchtungskaskade darstellt, bleibt es ohne strafrechtliche Folgen, das menschliche Pronukleus-Stadium einzufrieren, aufzubewahren oder auch seine Entwicklung zu beenden. Dies ist schließlich auch die Erklärung für die Tatsache, dass in den Kryobehältern und Kryobanken deutscher IVF-Zentren zigtausende, wenn nicht sogar hunderttausende tiefgefrorener Pronukleus-Stadien lagern, ohne dass irgendjemand abschätzen kann, wie viele dieser potentiellen menschlichen Embryonen jemals eine Entwicklungschance in einer Gebärmutter erhalten werden. Der rechtliche Status eines menschlichen Vorkernstadiums ist nach gegenwärtigem deutschen Recht jedenfalls identisch mit dem Status einer menschlichen Keimzelle, einem Spermium oder einer Eizelle, obwohl die Potentialität des Pronukleus-Stadiums, ein menschlicher Embryo oder auch ein geborener Mensch zu werden, offensichtlich signifikant größer ist. Abb. 1a c. Pronukleusstadien der Befruchtung der menschlichen Eizelle. (a) Im lichtmikroskopischen Bild sind die beiden Vorkerne der Eizelle deutlich zu erkennen. Einer der beiden Vorkerne ist geringfügig größer als der andere. Dieser größere Vorkern ist der männliche. Man erkennt in den Vorkernen kleine Kondensierungsprodukte von kontrastiertem Material, welches den Nukleoli entspricht (Vergr. 270:1); (b) Im Normarksi-Phasenkontrast lassen sich Vorkerne und Nukleolen besonders plastisch darstellen (Vergr. 270:1); (c) Pronuklei im elektronenmikroskopischen Bild. Die beiden Pronuklei nähern sich und ihre Membranen zeigen Invaginationen. Der weibliche Pronukleus (FPN) ist etwas kleiner als der männliche (MPN). Die Nukleoli (n) sind als elektronendichte Körper besonders klar zu erkennen. Eine Verschmelzung der Vorkerne findet nicht statt. Vielmehr kommt es zur Auflösung der sich aneinanderlagernden Kernmembranen und zu einer nachfolgenden Einordnung der Chromosomensätze in die Äquatorialplatte (Vergr. 2200:1). Mit freundlicher Genehmigung aus Edwards (8) und Van Blerkom et al. (21). Der Abschluss der Befruchtungskaskade Wenn die beiden Pronuklei ihre maximale Größe erreicht haben (Abb. 1), nähern sie sich einander, ohne zu verschmelzen. Da die nun beginnende Kondensation der Chromosomen nicht völlig synchron abläuft, sieht man bei manchen Arten, z.b. bei der Maus, zwei deutlich verschiedene Chromosomensätze nebeneinander liegen, den paternalen und den maternalen. Da beide Chromosomensätze während der aktiven Vorkernphase jeweils getrennt ihre 352

DNA-Replikation durchlaufen, liegt nach Kondensation der Chromosomen und nach Auflösung der Vorkernmembranen nun der reduplizierte Chromosomensatz des neuen Genoms vor. Die Chromosomen ordnen sich in der Metaphaseplatte an, die sich in der Teilungsspindel der Oozyte formiert. Die Zentriolen dieser Teilungsspindel stammen bei Säugetieren und Menschen aus der Organellenausstattung der Eizelle. Da der Ablauf der Befruchtung insgesamt als eine Folge von zellbiologischen Interaktionen und stufenartig aufeinanderfolgenden Reaktionen angesehen werden muss, ist es sinnvoll, den zusammenhängenden Vorgang als Befruchtungskaskade zu bezeichnen (2). FURCHUNGSTEILUNGEN Das embryonale Entwicklungsprogramm hat mit der ersten Furchungsteilung noch nicht begonnen. Es folgen weitere mitotische Teilungen der jetzt als Blastomeren bezeichneten Zellen, bei denen die zytoplasmatische Gesamtmasse des Keims nicht zunimmt. Statt dessen wird das zu Beginn der Furchungsteilungen relativ voluminöse Zytoplasma der Eizelle auf die immer kleiner werdenden Blastomeren aufgeteilt (Abb. 3). Diese frühen Teilungen benötigen eine normale DNA-Synthese (DNA-Replikation) und eine begrenzte Proteinsynthese. Es findet jedoch zunächst noch keine eigene RNA-Synthese, d.h. noch keine Gentranskription des neu entstandenen embryonalen Genoms statt. Dies ist ohne Probleme möglich, weil die Oozyte vor der Befruchtungskaskade beträchtliche Reserven an mütterlicher mrna, an Ribosomen, trna sowie Präkursormolekülen für die Proteinsynthese angelegt hatte, insbesondere die speziellen mrna-moleküle, die für die wichtigsten Proteine kodieren, welche die Aufgabe einer Steuerung der ersten Blastomerenfunktionen übernehmen. Erst wenn die 3. Furchungsteilung abgelaufen und das 8-Zell-Stadium erreicht ist, beginnt in der menschlichen Embryonalentwicklung die Translation embryonaler mrna, d.h. die Expression der individuellen Gene des neu entstandenen Individuums (Abb. 2). Die Blastomeren scheinen mit Erreichen des 8-Zell- Stadiums ein embryonalspezifisches Proteinmuster zu exprimieren, das sich in der SDS-PAGE-Analyse im Gesamtvergleich deutlich vom Oozyten- und Zygotenmuster unterscheidet. Mit zunehmender eigener Genaktivität differenzieren sich die Blastomeren nun deutlich. Sie produzieren mannigfaltige Strukturproteine, Oberflächenantigene und Enzyme. Zwar nimmt der sich weiterentwickelnde Keim Peptide und Proteine aus den umgebenden mütterlichen Sekreten der Tube und des Uterus auf, es steht jedoch außer Frage, dass er auch Peptide und Proteine oder andere Moleküle sezerniert, die als embryonale Signale besondere Bedeutung haben. Während dieser frühen Entwicklungsphase wird das neugeschaffene embryonale Genom durch Demethylierung und Remethylierung auch einer epigenetischen Revision und Kontrolle unterworfen, deren Bedeutung noch längst nicht ausreichend erforscht ist (18). BLASTOZYSTENENTWICKLUNG Morphologisch vollzieht sich während der Furchungsteilungen nach Beginn der embryonalen Genexpression als auffälligste Erscheinung die Differenzierung der äußeren Blastomeren der Morula zu einem echten epithelialen Zellverband. Die äußeren Blastomeren der Morula bilden apikal-laterale Membranspezialisierungen aus, das Entwicklungsstadium der Compaction ist erreicht (Abb. 3). Im lichtmikroskopischen Bild erscheint die äußere Oberfläche der Morula glatt, Zellgrenzen sind nicht mehr deutlich erkennbar. Spezialisierte Zellverbindungen, die besonders der interzellulären Signaltransduktion dienen, wie Gap junctions, bilden sich offensichtlich artspezifisch früher oder später aus. Im Innern des Furchungskeims bildet sich der Embryoblast aus, auch als Innere Zellmasse bzw. inner cell mass bezeichnet. Aus diesen inneren Blastomeren entsteht der spätere Embryo. Mit dem Differenzierungs- Abb. 2. Transkription und Translation des embryonalen Genoms. Beginn der Transkription und Translation des neu entstandenen embryonalen Genoms. Von der Befruchtung an werden ständig Proteine im Zytoplasma der Zygote und der Blastomeren synthetisiert. Diese Translation erfolgt aus den Vorräten maternaler RNA, d.h. der mütterlichen Mitgift jedes Ooplasmas. Mit der dritten Furchungsteilung zum 8-Zeller beginnt die Transkription und damit auch die Translation embryonaler RNA. 353

beschriebenen Studien an Maus, Kaninchen, Rind und Schaf erfolgten, sind an Blastomeren des Menschen nicht durchgeführt worden. Die ethischen und unterschiedlichen nationalen strafrechtlichen Schranken sind seit Bestehen der prinzipiellen klinischen Möglichkeiten für derartige Studien von den wenigen Instituten und Kliniken, die weltweit solche Forschungsarbeiten hätten durchführen können, stets respektiert worden. Nur in außergewöhnlichen, von Ethikkommissionen genehmigten wissenschaftlichen Projekten sind vereinzelte Analysen vorgenommen worden, die wir für unsere Diskussion als stichhaltige Argumente heranziehen können. Aus den Untersuchungen der Arbeitsgruppe um Hall, Mottla und Stillman (13) der Georgetown Uniprozess der Blastomeren in Embryoblast- und Trophoblastzellen sowie dem morphogenetischen Prozess der Blastozystenbildung (Abb. 4) geht eine einzigartige Fähigkeit der ersten Blastomeren der Furchungsentwicklung schrittweise verloren, die Totipotenz. Es ist experimentell erwiesen, dass bis zum 8-Zell-Stadium gerade noch aus einer einzelnen Blastomere ein harmonisch gebildetes, ganzes Individuum entstehen kann (Abb. 5). STUDIEN ZUR TOTIPOTENZ AN BLASTOMEREN DES MENSCHEN Identische embryologisch-experimentelle Untersuchungen wie sie an Säugetieren, z.b. in den weltweit Abb. 3a c. Furchungsstadien der menschlichen Embryonalentwicklung. (a) Embryo im 4-Zell-Stadium mit gleichmäßig runden Blastomeren. Für die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme wurde die Zona pellucida entfernt. Der oberflächliche Mikrovillibesatz ist noch spärlich. Die Fixierung dieses in vitro entwickelten Stadiums erfolgte am Tag 2 post inseminationem. (b) Embryo im 10-Zell-Stadium mit unterschiedlich großen Blastomeren. Für die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme wurde zuvor die Zona pellucida entfernt. Der Mikrovillibesatz ist dicht. Zwischen den Blastomeren befinden sich noch tiefe interzelluläre Spalten; nur feine Mikrovilliverbindungen halten die Blastomeren zusammen. (c) Embryo im 10- Zell-Stadium am Tag 3 post inseminationem. Einige Blastomeren zeigen bereits eine enge Verbindung ihrer lateralen Zellmembranen (Pfeile). Diese Veränderung ist der Beginn der Kompaktierung der Furchungsstadien. Mit freundlicher Genehmigung aus Nikas et al. (16). Abb. 4a d. Entwicklung menschlicher Blastozysten unter in-vitro-bedingungen im serumfreien Medium. (a) Eine frühe Blastozyste mit einer deutlich ausgebildeten Blastozystenhöhle, die von flachausgezogenen Trophoblastzellen umsäumt wird. Embryoblastzellen liegen im Zentrum der Aufnahme. (b) Expandierte Blastozyste, die bereits eine deutlich stärkere Flüssigkeitsfüllung der Blastozystenhöhle zeigt. Der Embryoblast liegt nun dezentral unmittelbar unter dem Trophoblasten (links unten). (c) Voll expandierte Blastozyste unmittelbar zu Beginn der ersten ausschlüpfenden Trophoblastzellen. (d) Schlüpfende Blastozyste, deren Trophoblast sich bereits etwa zur Hälfte aus der geöffneten Zona pellucida hervorwölbt. Mit freundlicher Genehmigung aus Jones et al. (15). 354

lenden Blastomeren alle aus 2-Zellern stammten. Die Untersuchungen erfolgten sämtlich an polyploiden (aneuploiden) Entwicklungsstadien, was für die wissenschaftlich-ethische Argumentation interessant, indessen für die allgemein-embryologischen Schlussfolgerungen nicht einschränkend gesehen werden muss. In einer weiteren wichtigen In-vitro- Studie zur Proliferation menschlicher Blastomeren, die aus biopsierten Furchungsstadien gewonnen wurden, konnten englische Wissenschaftler demonstrieren, dass diese Entwicklung ausschließlich zu Trophoblastblasen führt (12). In 26 Fällen entwickelten sich aus isolierten Blastomeren, die insgesamt 47 drei Tage alten Embryonen im Stadium zwischen 6 und 10 Zellen entnomversity, Washington, D.C., haben wir erfahren, dass die Furchungsteilungen und die Entwicklungspotenz der sich bildenden Blastomeren des Menschen sich von denen bekannter Säugetierblastomeren nicht unterscheiden. In den enormes Aufsehen erregenden Klonierungsexperimenten hatten Hall und Mitarbeiter demonstriert, dass isolierte menschliche Blastomeren von 2-, 4- und 8- Zellern in der Lage sind, sich unter In-vitro-Bedingungen erneut zu teilen. Wenn diese isolierten Blastomeren in einer künstlichen Zona pellucida, d.h. einer künstlichen Alginathülle von anderen Blastomeren separiert wurden, teilten sie sich 3- bis maximal 5-mal. Bei diesen Versuchen fiel auf, dass die sich nur 3-mal teilenden Blastomeren sämtlich aus 8-Zellern, jedoch die sich 5-mal tei- Wie bereits Friedrich Seidel (20) in seiner Interpretation der Entwicklungskapazitäten von isolierten Furchungszellen des Kaninchens postulierte, sollten im Säugetierei gleiche molekulare oder strukturelle Gradienten existieren wie beim Seeigel und beim Molch. Seidel nannte diese Gradienten Faktorenbereiche und Bildungszentrum für die Säugetierkeimscheibe, und er erinnerte dabei an die Polarisierung der Eizelle in der klassischen Betrachtungsweise der Embryologie, bei der ein animaler und ein vegetativer Pol unterschieden wird. In seiner bahnbrechenden Arbeit über die Entwicklungsfähigkeiten der isolierten Blastomeren des Kaninchens schrieb Seidel (1960): Die isolierten Blastomeren müssen Eigebieten mit unterschiedlicher Entwicklungsbefähigung entstammen. Das ungefurchte Ei enthält einen bestimmten plasma- men wurden, innerhalb von 3 Tagen in der Kultur blastozystenähnliche Blasen, sog. cavitated embryos. Schließlich wurde mit der lagespezifischen Polynukleotidfluoreszenzmarkierung mit Propidiumjodid gezeigt, dass die 16 am weitesten entwickelten Embryonalstadien ausschließlich Trophoblastzellen gebildet hatten. Die Zellen zeigten in allen Fällen orange fluoreszierende Nuklei, ein eindeutiges Zeichen für Trophoblastzellen (außen liegende trophectoderm cells), wie schon früher in einer umfangreichen und grundlegenden Studie von Hardy et al. (14) analysiert worden war. Aus dieser bisher erfolgreichsten weltweit publizierten Untersuchung zur Entwicklung von isolierten Blastomeren menschlicher Furchungsstadien ergibt sich eindeutig, dass jene isolierten Blastomeren vom 3. Tage nach IVF aus 6- bis 10-Zell-Stadien nicht totipotent waren, da aus ihnen ausschließlich Trophoblastzellen entstanden. POLARITÄT IN EIZELLE UND FRÜHEN EMBRYONALSTADIEN Abb. 5. Totipotenzraten von Blastomeren und verschiedenen Furchungsstadien. Gegenüberstellung der Totipotenzrate von isolierten Blastomeren aus verschiedenen Furchungsstadien dreier Säugetierarten mit dem prozentual dargestellten, stufenweise abnehmenden Anteil der Zellmasse, welche von Furchungsteilung zu Furchungsteilung für jede einzelne Blastomere auf die Hälfte abnimmt.hier wird ersichtlich, dass die Totipotenzrate bei allen ausgewählten Säugetierarten Kaninchen, Schaf und Schwein von Furchungsteilung zu Furchungsteilung gravierend sinkt. Für eine Blastomere aus einem 8- Zeller ist die Wahrscheinlichkeit, sich zu einem ganzen Individuum zu entwickeln, etwa gleich groß wie der Anteil der Zellmasse dieser Blastomere am ganzen 8-Zeller. Es erscheint unter diesen Gegebenheiten nicht wahrscheinlich, dass eine isolierte Blastomere eines 16-Zellers für sich allein noch die Potenz zur harmonischen Gesamtentwicklung eines Individuums besitzt. Tatsächlich ist bis heute auch kein Experiment geglückt, welches eine solche Totipotenz einer Blastomere eines 16-Zellers demonstrieren konnte. 355

Abb. 6a c. Polare Verteilung von STAT3 Molekülen während der Entwicklung der Furchungsstadien der Maus. (a) Eizelle im Pronukleusstadium. (b) 2- Zell-Stadium. (c) 8-Zell-Stadium. Die Immunfluoreszenz stellt die Verteilung der STAT3-Moleküle in der roten und gelben Farbe in besonders hoher Konzentration dar. Der Gradient der Konzentration nimmt zur Blaufärbung hin ab. Auf diese Weise entstehen im Lauf der Furchungsteilungen einzelne Blastomeren, die immer weniger bzw. schließlich keine STAT3-Moleküle mehr enthalten. Konfokale Laser-Scanning- Mikroskopie. Mit freundlicher Genehmigung aus Antczak und Van Blerkom (1) tischen Faktorenbereich, ohne den die Bildung einer Embryonalanlage nicht möglich ist. Die Basis für diese Interpretation war bereits durch einige auffällige histochemische Befunde am Zytoplasma der Eizelle der Ratte vorbereitet worden (7), andere Wissenschaftler hatten intensiv weitere Argumente dafür gesucht und teils auch als stützende Ergebnisse in anderen Säugetierarten gefunden, z.b. beim Kaninchen (20). Jedoch gab es danach mehr als 20 Jahre lang keinen entscheidenden Durchbruch auf diesem embryologischen Forschungsfeld. Allein Richard Gardner (10, 11) arbeitete ständig an dieser Problematik weiter. Sein jüngerer Übersichtsartikel aus dem Jahr 1996 stellte schließlich die entscheidende Frage: Können die Säugetiere für ihre Entwicklung auf die räumliche Polarisierung ihrer Eizellen verzichten? Eine wissenschaftliche Antwort hierauf lag bis zum November 1997 noch nicht vor. Im Dezember jedoch legten Michael Antczak und Jonathan Van Blerkom (1) überraschende und überzeugende Befunde vor, welche die Hypothesen Dalcqs (7) und Seidels (20) brillant zu bestätigen scheinen. Mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie ist es gelungen, phantastische Bilder der Frühentwicklung der Maus und des Menschen vorzulegen (Abb. 6). Als Markermoleküle dienen Leptin und STAT3, zwei gut charakterisierte Proteine. Leptin, ein Molekül mit einem MG von 16000, wird vom obese-gen exprimiert und wirkt als Hormon und Zytokin. STAT3 gilt als gut definiertes Molekül in der Familie von Aktivatoren der Signaltransduktion und Transkription. Beide Proteine, Leptin und STAT3, wurden mit Immunzytochemie und konfokaler Lasermikroskopie in räumlicher und in zeitlicher hochspezifischer Lokalisierung in Eizellen und Blastomeren dargestellt. Sowohl bei der Maus, als auch bei den Furchungsstadien der menschlichen Entwicklung, lässt sich bereits im 4-Zell- und im 8-Zell-Stadium deutlich erkennen, dass einige wenige Blastomeren beide Markerproteine nicht mehr enthalten. Solche Leptin- bzw. STAT3-freien Blastomeren sollen, wie Antczak und Van Blerkom (1) postulieren, Vorläufer der Embryoblastzellen (ICM-Zellen) darstellen. Über diesen deskriptiven Ansatz hinaus könnte der wissenschaftlich-experimentelle Beweis hierfür geliefert werden, indem molekular-genetische Marker für nicht-differenzierte Blastomeren verfolgt werden, wie z.b. der Transkriptionsfaktor oct-4 (19). Dieses DNA-bindende Protein reguliert die Transkription durch Erkennung des oktameren Motivs AT-GCAAAT. Wie Palmieri et al. (17) in einer Studie an Eizellen, Furchungsstadien und Blastozysten der Maus zeigten, wurde oct-4 im 8-Zellstadium nur in 5 von 8 Blastomeren sowie im Morulastadium nur in 10 von 18 Blastomeren exprimiert. Molekulargenetische Methoden eröffnen somit die Aussicht auf neue embryologische Grundlagenerkenntnisse. Es wird aus diesen jüngst verfügbaren Befunden deutlich, dass bereits im 4-Zell-Stadium, ganz sicher schließlich im 8-Zell-Stadium nicht mehr alle Blastomeren eines Embryos totipotent sein können, sondern die meisten von ihnen bereits so weit differenziert sind, dass sie ihre Totipotenz verloren haben. Wie morphologisch-wissenschaftliche Beobachtungen im IVF-Labor zeigen, lassen menschliche Furchungsstadien während ihres kurzen Aufenthaltes im Kulturmedium in unterschiedlicher Ausprägung Fragmentierungen einer oder mehrerer Blastomeren erkennen. Diese zellulären Fragmente sind unter den üblichen lichtmikroskopischen Bedingungen als Zelltrümmer, Granula oder dunkle Vesikel beschrieben worden. Offensichtlich erfahren zahlreiche Blastomeren in der frühesten Entwicklungsphase Störungen, die zum Zelltod führen. Bei Furchungsstadien von Laboratoriumssäugern und von Nutztieren sind 356

folgt. Auch diese embryonale Gewebepotenz kann man dann Totipotenz nennen, aber nicht mehr einer einzelnen Zelle, sondern sozusagen Teamwork einer bestimmten, artspezifisch bekannten Zahl von Zellen. Diese sind schließlich befähigt, ein ganzes, lebensfähiges Individuum zu bilden, indem eine Regulation der Entwicklungsbeeinträchtigung erfolgt, d.h. eine Regulation zum harmonischen Ganzen. Pluripotenz ist im klassischen embryologischen Sinne verstanden worden als Entwicklung einer Stammzelle zu zahlreichen Geweben oder Organen oder auch als Entwicklung eines Gewebeverbandes, zum Beispiel dem embryonalen oder fetalen Mesenchym, in verschiedene Gewebetypen, jedoch niemals zu einem ganzen Individuum. Diese wissenschaftliche Definition unterscheidet sich eindeutig von der in der Stammzellforschung früher üblichen Gebrauchsdefinivöllig identische Phänomene beschrieben worden. Es scheint indessen aber eher zur normalen Entwicklung zu gehören, dass die eine oder andere Blastomere zugrunde geht, ohne jedoch die Gesamtentwicklung des Embryos zu beeinträchtigen. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit den Erfahrungen aus Seidels Untersuchungen, bei denen stets die Zelltrümmer der abgetöteten Blastomeren innerhalb der Zona blieben, ohne dass die lebende isolierte Blastomere Schaden für ihre Entwicklung nahm. Auch für menschliche Präimplantationsstadien (8- Zell-Stadien), die biopsiert wurden, konnte gezeigt werden, dass in zahlreichen publizierten Fällen dieser mechanisch-mikrochirurgische Eingriff die Entwicklungspotenz und die tatsächliche weitere Entwicklung nicht beeinträchtigte (12, 13, 14). ZUR DEFINITION VON TOTI- POTENZ UND PLURIPOTENZ tion, die bei Totipotenz von der Beteiligung embryonaler Stammzellen an allen sich differenzierenden Geweben, einschließlich der Keimbahn, spricht. In den älteren Publikationen versteht man unter totipotent stem cells, dass diese Zellen sich an allen Gewebebildungen einschließlich der Keimbahn beteiligen. Diese Zellen können alles mitmachen, was letztlich bedeutet, dass sie einen ganzen Menschen oder eine ganze Maus nicht allein machen können. Man muss hier unbedingt zwischen Mitmachen und Machen unterscheiden. Unter Pluripotenz wurde von den Pionieren der Stammzellforschung entsprechend konsequent die Beteiligung von embryonalen Stammzellen an zahlreichen bzw. allen sich differenzierenden Geweben, jedoch nur außerhalb der Keimbahn, verstanden. Der deutsche Gesetzgeber hat uns die Aufgabe gestellt, über die Dauer der Die beiden Begriffe Totipotenz und Pluripotenz sind, wenn wir die Weltliteratur der letzten 30 Jahre vergleichen und studieren, sehr unscharf von unterschiedlichen Wissenschaftlern benutzt worden. Es gibt auf der einen Seite die klassische Embryologie, und es gibt schon seit vielen Jahren die Stammzellforschung, ganz besonders bei der Maus. Wir finden erstaunlicherweise unterschiedliche Inhalte, wenn wir die Frage nach der Totipotenz und Pluripotenz stellen. In der Weltliteratur ist embryologisch-klassisch Totipotenz immer verstanden worden als die Entwicklung oder die Entwicklungsbefähigung einer Zelle zu einem ganzen Individuum. Ferner hat sich herausgestellt, dass klar wissenschaftlich definiert ist, dass auch die Entwicklung eines embryonalen Zellverbands, zum Beispiel der inneren Zellmasse oder der Keimscheibe einer Blastozyste, zu einem harmonischen ganzen Individuum noch gelingen kann, wenn eine Teilung dieses Zellverbands er- Tabelle 1. Das Phänomen Totipotenz in der Embryologie sowie in der experimentellen, reproduktionsbiologischen und genetischen Zellforschung. Totipotenz einer Zelle Natürliche Totipotenz befruchtete Eizelle (Zygote) isolierte Blastomere bis zum Entwicklungsstadium des 8-Zellers Experimentell erzeugte Totipotenz Zellkerntransfer in eine entkernte Eizelle (Nuclear transfer cloning) Regulationsfähigkeit zum Natürliche Regulationsfähigkeit zum harmonischen Ganzen harmonischen Ganzen (Totipotenz eines embryonalen Zellverbands, z. B. Embryo- monozygote Zwillingsbildung beim Menschen blasten*) Experimentell erzeugte Regulationsfähigkeit zum harmonischen Ganzen Embryo-Splitting in der Tierzucht zur Herstellung identischer Mehrlinge Zell-Cluster-Züchtung aus embryonalen Stammzell-Linien zur Herstellung identischer Mehrlinge und transgener Tiere mittels tetraploid embryo complementation (9) * Die in früheren Publikationen und Vorträgen verwendete Terminologie (3, 4) wird zugunsten der klassischen embryologischen Bezeichnung Regulationsbefähigung oder Regulationsfähigkeit nach Seidel (20) geändert. 357

Totipotenz zu urteilen. Er ist dabei von der Definition der klassischen Embryologie ausgegangen: solange noch eine Zelle zu einem ganzen Embryo werden kann, ist sie ebenso zu schützen wie ein Embryo (ESchG 8). Es geht nicht um die Frage im Embryonenschutzgesetz, ob eine Stammzelle sich in ihrer Entwicklung an der Keimbahn beteiligt oder nicht. Im gleichen Zusammenhang habe ich schon in zahlreichen Referaten und Publikationen die Totipotenz einer Zelle definitionsgemäß abgegrenzt von der Totipotenz eines Teils des Embryoblasten, also von der Teamarbeit von Zellen der Keimscheibe oder der inneren Zellmasse (3, 4). Es dient der Klarheit der Definition, wenn wir diese Form der Ganzbildung aus einem Teil des Embryoblasten als Regulationsbefähigung oder Regulationsfähigkeit bezeichnen (Tabelle 1). In den letzten Jahren ist noch ein Drittes hinzugekommen, nämlich die ständige Diskussion um die Frage: Gibt es die Totipotenz eines Zellkerns? Hier müssen wir erkennen, dass diese Problematik in der klassischen Embryologie nicht vorkam, bevor nicht nuclear transfer experiments durchgeführt wurden, die erfolgreich waren. Wir sehen heute, dass der Kerntransfer zu einem rein experimentellen Phänomen führt, also nichts mit der natürlichen Totipotenz einer Zelle zu tun hat (Tabelle 1). Die experimentell erzeugte Totipotenz Betrachten wir das berühmte Schaf Dolly bzw. den Kerntransfer in eine enukleierte Eizelle. Bei der Entstehung Dollys hat genau genommen kein Kerntransfer stattgefunden, sondern eine Fusion einer in vitro kultivierten adulten Zelle mit einer entkernten Eizelle. Durch Elektrofusion wurde hierbei mehr oder weniger auch Zytoplasma mit in die entkernte Eizelle eines Schafes eingebracht. Und aus diesem Kerntransfer, grob ausgedrückt, wurde dann in einem von 277 Versuchen ein lebensfähiges Schaf, das geklonte Schaf Dolly geschaffen (22). Dieses bedeutet nicht, dass die Milchdrüsenzelle, die aus der Zellkultur entnommen wurde oder ihr Zellkern totipotent gewesen wäre. Denn diese hätten niemals die geringste Chance gehabt, Totipotenz zeigen zu können, wenn sie nicht in eine entkernte Empfänger-Eizelle übertragen worden wären. Wir müssen also davon ausgehen, dass Totipotenz in diesem Falle eine Fähigkeit ist, die entweder wieder erweckt wird oder in diesem Genom durch das Zytoplasma einer solchen Eizelle induziert wird. Es ist folglich das Eizell-Zytoplasma, welches das Entscheidende bewirkt, d.h. die Reprogrammierung eines bereits differenzierten Genoms. Wir wissen nicht, wie dies erreicht wird, sehen jedoch das Phänomen. Konsequent entwickelt sich hier ein riesiges Forschungsgebiet. Teilung der Keimscheibe Das weitere Phänomen, die so genannte Teilung der Keimscheibe, ist in der Tat etwas Natürliches, denn natürliche Vierlinge finden sich in der Fortpflanzungsbiologie des Gürteltiers. Gürteltiere entstehen durch eine Viertelung der Keimscheibe. Dabei hat der Wurf von vier Gürteltieren nur eine einzige Plazenta. Das ist Ökonomisierung der Reproduktion, wie sie sich allerdings phylogenetisch nicht durchgesetzt hat, sondern nur beim Gürteltier und bei wenigen verwandten Arten vorkommt. Die Entwicklung des Gürteltiers demonstriert uns eine natürliche Mehrlingsbildung. Wir können deshalb, weil auch die Gesamtbildung eines Individuums folgt, von einer Totipotenz eines Teils der Keimscheibe, des Embryoblasten, sprechen. Aber hierbei geht es nicht um eine einzelne Zelle, die die Totipotenz hätte. Denn wenn wir aus einer Keimscheibe bzw. aus einem Sektor der geviertelten Keimscheibe, eine Zelle herausnehmen würden, hätte diese Zelle keine Chance, ein ganzes Tier zu bilden. Also im Sinne unserer intellektuellen und wissenschaftlichen Auseinandersetzung mit dem Embryonenschutzgesetz: hier liegt nicht die Totipotenz einer einzelnen Zelle vor. ABSCHÄTZUNG DER ENTWICKLUNGSCHANCEN Die Entwicklungschancen eines frühen menschlichen Embryonalstadiums sind nach unserem heutigen Kenntnisstand relativ klar abschätzbar, von 100 befruchteten Eizellen schaffen es ca. 30 sich zu implantieren und eine Schwangerschaft zu etablieren. Wesentliche Ursache dieses hohen Verlustes in der menschlichen Embryonalentwicklung vor und unmittelbar nach der Implantation sind genetische und chromosomale Aberrationen (6). Betrachten wir die Entwicklungschancen von isolierten Blastomeren aus 2-, 4-, 8- oder 16-Zellern, so sehen wir eine signifikante Abnahme der Entwicklungspotenz nach jeder Zellteilung (Abb. 5). Die Totipotenz einer isolierten Blastomere eines 2-Zellers erreicht noch bis zu 50%, vorausgesetzt, die Lebensbedingungen in vitro und danach in vivo sind optimal. Bei der Blastomere aus einem 4-Zeller reduziert sich die Entwicklungschance auf 20 40%, bei einer Blastomere aus einem 8-Zeller auf 8 12%. Bis heute ist es niemandem gelungen, einer vereinzelten Blastomere aus einem 16-Zeller jemals zur Entwicklung bis zu einem ganzen Individuum zu verhelfen. Unter Berücksichtigung aller wissenschaftlicher Ergebnisse der Weltliteratur ist somit erneut festzuhalten, die Potenz zur Ganzbildung geht mit dem 8-Zellstadium für eine einzelne Blastomere zu Ende (Abb. 5). Über die Totipotenz und Regulationsfähigkeit menschlicher Embryoblast-Anteile, -Hälften oder gar noch kleinerer Anteile, ist eine Einschätzung aus wissenschaftlichen Untersuchungen nicht möglich, da solche Studien nicht bekannt sind, 358

zudem bei uns in Deutschland ebenso wie Studien an einzelnen Blastomeren durch das Embryonenschutzgesetz verboten sind. Die nicht so seltene natürliche Bildung von monozygoten Zwillingen weist jedoch darauf hin, dass auch beim Menschen eine spontane Teilung des Embryoblasten zur Entwicklung lebensfähiger Individuen führen kann (Abb. 7b c). Höchstwahrscheinlich stellt dieser Weg die Entstehungsursache für monozygote Zwillinge beim Menschen dar. Eine Trennung im frühen Furchungsstadium ist theoretisch und experimentell denkbar (Abb. 7a), indessen ist es schwer vorstellbar, dass eine derart frühe Trennung und Isolierung von Blastomeren und Zona pellucida spontan geschehen könnte. DER SCHUTZ DER MENSCHENWÜRDE Wie aus den Intentionen des deutschen Gesetzgebers und aus Einschätzungen des Verfassungsgerichts hervorgeht, ist bei uns in Deutschland der Artikel 1 des Grundgesetzes (der Schutz der Menschenwürde) und der Artikel 2 (Lebensrecht) auch auf den Beginn der menschlichen Entwicklung anzuwenden. Mit Abschluss der Befruchtung liegt ein neues menschliches, individuelles Genom vor, dessen Potentialität der Entwicklung zu einem Menschen den Schutz der Menschenwürde generell ebenso beanspruchen darf wie ein geborener Mensch. Der deutsche Gesetzgeber fordert jedoch, den sich entwickelnden Menschen im Mutterleib gemäß 218 Strafgesetzbuch erst mit Bestehen einer Schwangerschaft ab seiner Implantation zu schützen. Die frühen embryonalen Entwicklungsstadien in vivo fallen expressis verbis vor der Implantation nicht unter den Schutz des Strafgesetzes. Anders ist die Situation indessen in vitro. Der Gesetzgeber sieht frühe embryonale Entwicklungsstadien in vitro einer offenbar größeren Gefährdung ausgesetzt als entsprechende Entwicklungsstadien in vivo. Wie wir alle wissen, wird bei zahlreichen Maßnahmen zur Kontrazeption oder Implantationshemmung (z.b. mit intrauterinen mechanischen und chemischen Interventionen) stets die Tötung eventuell entstandener früher embryonaler Ent- Abb. 7a c Schematische Darstellung der Möglichkeiten, nach denen eine monozygote Zwillingsbildung bei Säugetieren und dem Menschen erfolgen kann. Die Trennung von Blastomeren in der frühen Furchungsphase (a) innerhalb einer gemeinsamen Zona pellucida zur Heranbildung von zwei Furchungsstadien und zwei getrennten Blastozysten ist äußerst unwahrscheinlich, da experimentelle Prüfungen an Säugetier-Forschungsstadien zeigten, daß stets eine gesonderte Zona pellucida für die Entwicklung eines frühen Furchungsstadiums nötig ist. Dagegen scheint die Trennung im Blastozysten-Stadium (b) am wahrscheinlichsten und am häufigsten zu monozygoten Zwillingen zu führen. Gerade auch beim Schlüpfen einer Blastozyste aus der Zona pellucida könnte es zur mechanischen Teilung der Keimscheibe, bzw. zur Trennung von Embryoblastzellen kommen. Dieses Phänomen der Embryoblasttrennung wäre auch noch denkbar, wenn bereits eine Amnionhöhle entstanden ist (c), so daß folglich monozygote, monoamniotische Zwillinge entstehen würden. 359

wicklungsstadien nicht nur in Kauf genommen, sondern gezielt unternommen. Der Status eines frühen embryonalen Entwicklungsstadiums ist aus medizinisch-wissenschaftlicher Sicht in vivo identisch mit dem in vitro. Gesetzgeber und Gesellschaft nehmen offensichtlich ethisch und rechtlich einen Unterschied bewusst und billigend hin. Abgestufte Schutzwürdigkeit Aus der vergleichenden Betrachtung der Totipotenz und Pluripotenz erwächst die Frage, ob bei der bestehenden unterschiedlichen Potentialität, einen Menschen bilden zu können, unter besonderen Bedingungen medizinischer Dilemmasituationen eine abgestufte Schutzwürdigkeit für unterschiedliche frühe embryonale Entwicklungsstadien gerechtfertigt sein könnte. Bei jeder IVF-Therapie kann es zur Dilemmasituation kommen, bei der sich die behandelnden Ärzte entsprechend dem gesundheitlichen Befinden und Willen der Patientin gegen einen Transfer von Embryonen ( 4, Abs. 2 ESchG) und damit gleichzeitig nicht für die gesetzlich geforderte optimale Entwicklungsmöglichkeit für die Embryonen entscheiden müssen. Entgegen der in jedem Falle gesetzlich geforderten optimalen Lebens- und Entwicklungschance für die Embryonen müssen sich die Ärzte in dieser Situation zur Kryokonservierung der Embryonalstadien entschließen. Wie die Auswertung der weltweit bekannten Entwicklung nach Kryokonservierung zeigt, sinken die Entwicklungs- und Schwangerschaftschancen in der Folge auf die Hälfte, d.h. nach dem deutschen IVF-Register 1998 von 22,64% auf 11,34%. Entscheidet sich ein Paar auch nach längerer Kryokonservierung seiner Embryonen nicht mehr für einen Transfer, gerät der Arzt erneut in ein Dilemma, dieses Mal zwischen der gesetzlich verbotenen Embryonenspende bzw. -adoption, und der ihm vom Gesetz auferlegten Pflicht, alles für die Entwicklungsmöglichkeit der frühen Embryonalstadien zu unternehmen. Der Arzt wird aber folglich zur fatalen Alternative gezwungen, die kryokonservierten, verwaisten Embryonen ihrem Schicksal zu überlassen, d.h. sie absterben zu lassen. DIE ORGANSPENDE ALS EIN MODELL FÜR DIE SCHAFFUNG VON EMBRYONALEN STAMMZELLLINIEN Sofern die Gesellschaft in Anerkennung der medizinischen Dilemmasituation eine abgestufte Schutzwürdigkeit für diese Embryonalstadien vor einer Implantation akzeptieren könnte, wäre ein Modell zur Diskussion zu stellen, wie wir es bei der Organspende für die Transplantationsmedizin kennen. Die genetischen Eltern müssten einer therapeutisch anwendbaren Blastomerenspende zustimmen, bei der aus einzelnen oder mehreren nicht mehr totipotenten Blastomeren embryonale Stammzelllinien erzeugt werden könnten. Bei einer solchen Spende zöge sich der Gesetzgeber und die Exekutive zurück und suspendierte zum Teil die im 2 EschG poenalisierte fremdnützige Verwendung junger Embryonalstadien oder ihrer Zellen zugunsten einer heilsamen Anwendung in der Transplantationsmedizin. Für die Zukunft ist nicht ausgeschlossen, dass die mehrheitliche Zustimmung für eine derartige abgestufte Schutzwürdigkeit für jüngste Entwicklungsstadien vor der Implantation (vgl. 218 StGB) in unserer Gesellschaft zu Stande kommt, zumal wenn das therapeutische Potential klarer und seine Realisierung greifbarer werden wird. Wie soll der Gesetzgeber einer pluralistischen Gesellschaft sich Respekt und Glaubwürdigkeit erhalten, wenn die gleichen menschlichen Entwicklungsstadien zwischen Befruchtung und Implantation in vivo und in vitro im identischen embryonalen Status einzustufen sind, aber mit deutlich unterschiedlichem strafrechtlichen Maß in ihrer Menschenwürde in vivo und in vitro geschützt werden? SCHLUSSFOLGERUNGEN Nach Abwägung aller wissenschaftlichen Erkenntnisse über den biologischen Status des menschlichen Embryos in der frühesten Entwicklungsphase zwischen Befruchtung und Implantation fordert mein Diskussionsvorschlag eine gemäßigte Öffnung der Restriktionen des deutschen Embryonenschutzgesetzes (ESchG), jedoch keinesfalls eine Änderung oder Verschärfung des 218. Jede differenzierte Öffnung des Forschungsverbots des ESchG muss mit einer sorgfältigen, verantwortungsbewussten und effektiven Kontrolle einhergehen. Dafür brauchen wir in Deutschland unbedingt eine gesetzlich verankerte Instanz, etwa nach dem Vorbild der Human Fertilization and Embryology Authority in Großbritannien. Kontrolle und Offenlegung der Technologien schafft Vertrauen in Wissenschaft und Wissenschaftler. Da die Diskussion um die Forschung an menschlichen embryonalen Stammzellen und Embryonen inzwischen im weitesten Rahmen in der Öffentlichkeit geführt wird, wächst das Wissen der Laien. Es ist zu hoffen, dass mit dem Zugewinn an Wissen ein mehrheitlich getragenes Vertrauen in die Sozialverträglichkeit biomedizinischer Forschung und medizin-technologischer Neuerungen in unserer pluralistischen Gesellschaft entsteht. ABSTRACT Early Embryo Development from an Embryological Perspective Human development commences with a fertilisation cascade, initiated when the haploid chromosomes of the oocyte and the sperm unite, thereby forming a programme for the creation of a human being. During the first few days devel- 360

opment proceeds to implantation and placentation in only 30% of cases. The frailty of this early development shows that a human blastocyst, should it manage to emerge from the zygote, will only succeed in turning into a human being if there is a maternal contribution to implantation and placenta formation. The obstacles to early development represent basic genetic and epigenetic phenomena within the cytoplasm and in the genome of the blastomeres and are the results of the operation of natural laws the exact causal concatenations of which remain yet to be determined in detail by science. Philosophers, ethicists and lawyers seem to have difficulties in accepting that more research in this field is required. Finally, a look at the legal protection of the human embryo in Germany reveals that the earliest stage of human development prior to implantation is legally protected in vitro, whereas there is no such legal protection in vivo, owing to Germany s abortion law (StGB (German Penal Code) 218), before implantation. Aspects of the research on human embryos and embryonic stem cells are here discussed from this point of view. Key Words: pronucleus stage, cleavage stage, blastocyst, pluripotency, totipotency, gene activation, embryonic loss. LITERATUR 1. Antczak M, Van Blerkom J (1997) Oocyte influences on early development: the regulatory proteins leptin and STAT3 are polarized in mouse and human oocytes and differentially distributed within the cells of the preimplantation stage embryo. Mol Hum Reprod 3: 1067 1086 2. Beier HM (1992) Die molekulare Biologie der Befruchtungskaskade und der beginnenden Embryonalentwicklung. Annals of Anatomy 174: 491 508 3. 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