Stunde 4: Beispiele für die Wirkung von Histon modifierenden Enzymen bei der Genaktivierung. Wie analysiert man das? Analyse der lokalen Histonmodifikation Analyse der globalen Histonmodifikation 64
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Schrittweise Rekrutierung von Komponenten des Transkriptionsapparates über Genspezifische Aktivatoren durch lokale Änderung der Chromatinstruktur: 1. POL II + gen. TF 2. Chromatin Remodelling 3. (Swi/SNF) Histon-Acetylase (SAGA-Komplex) 4. Mediator und schließlich Polymerase können am Promoter binden. 1. Promoter ansonsten für PolII nicht zugänglich 2. Histonmodifikation schafft spezifische Bindungstellen für Proteine (z.b. Bromodomäne) 66
2 Beispiele für die Rolle der Histonmodifikation für lokale Änderungen der Chromatinstruktur und desse Bedeutung für die Regulation eukaryontischer Genexpression 67
Beispiel 1: Der Histon Code am INF ß -locus Spezifische Transcriptionsfaktoren NF-kappa B; ATF-2/c-jun IRF erkennen mit Hilfe von HGM Protein den Enhancer. 68
Schritte zur Aktivierung der Genexpresion am INF ß Lokus Die DNA wird von Aktivatorproteinen (Enhanceosom) erkannt. Diese binden an die HATs CBP und Gcn5 (SAGA), Diese modifizieren Histon H3 an Lys 9 und H4 an Lys 8. Histon H3 wird an Ser 10 modifiziert. Diese Modifikation ist Vorrausetzung für die weitere Modifikation von Histon H3 an Lys 14 durch Gcn5 69
Schritte zur Aktivierung der Genexpresion am INF-ß Lokus Diese Modifikationen werden gelesen : Der Chromatin Remodelling Faktor SWI/SNF wird über H4 K8 und H3K9 und H3K14 rekrutiert. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIID erkennt die Phosphorylierung und über seine Bromodomänen die Histonmodifikation H3 K9 und K14. H4K8 Die restlichen Faktoren und RNA Polymerase werden gebunden und die Transkription kann beginnen 70
Beispiel 2: mating type switching der Bäckerhefe Der HO Promoter der Bäckerhefe wird sehr komplex reguliert Das HO - Gen codiert für eine Endonuklease, die zum Wechsel des Mating types führt. SWI Gene wurden als Mutanten identifiziert, die die HO Nuklease nicht exprimieren. SWI1, SWI2, SWI3: SWI/SNF Komplex Chromatin Remodelling Faktor URS1 URS2 HO Swi5p Aktivator Swi4p /Swi6p Aktivator mat a1 /α2 -Repressor verhindert Expression in Diploiden Ash1 -Repressor verhindert Expression in Tochterzellen 71
Der HO Promoter der Hefe 1. Swi5- Regulator bindet 2. GCN5 bindet 3. Swi/SNF bindet 4. Swi4/Swi6 (SBF) bindet 5. Der Mediator bindet. 72
verschiedene Regulatoren der Chromatinstruktur kooperieren bei der lokalen Aktivierung von Promotoren Die Reihenfolge mit der genspezifische Faktoren, Modifizierende Enzyme und /oder Chromatin Remodulatoren rekrutiert werden, variiert (A,B,C) 73
Woher weiss man das? Analyse der Protein-DNA Wechselwirkung Gelelektrophoretisch mit Bandshift / EMSA Footprinting Tafel - 74
Methode: Chromatin-Immunpräzipitation ChIP Nachweis, dass die Rekrutierung von Histonacetylasen und SWI/SNF in vivo von der Bindung genspezifischer Transkriptionsfaktoren abhängig ist: in vivo Vernetzung von Chromatin Immunpräzipitation von Protein Ab Nachweis der gebundenen DNA über PCR-Analysen in Abwesenheit des Aktivators ist SWI/SNF oder PolII nicht am Promoter gebunden 75
Chromatin Immunopräzipitation kann nicht nur verwendet wewden, um die Anwesenheit bestimmter ausgesuchter DNA-Sequenzen in den Immunpräzipitaten zu testen, sondern es ist auch möglich, gleich ganze Genome auf DNA-Arrays zu analysieren. Dann nennt man diese Technik ChIP on CHIP ChIP on CHIP 76
Protein-Bindestellen für Proteine in ganzen Genomen mit DNA- Microarrays Immunpräzipitat enthält viele verschiede, spezifische DNA-Stücke. Objektträger Vermehrung der Stücke mit PCR nach Ligation von sequenzspezifischen Oligos an die Enden. Dabei Einsatz farbig markierter Nukleotide (z.b. Cy3-dUTP) Hybridisierung Fluoreszenzmarkierte DNA 40000 verschiedene DNA-Fragmente (Oligonukleotide) über das ganze Genom verteilt (Beispiel aus der folgenden Folie)
genomeweite Verteilung von acetylierten Histonen in der Bäckerhefe: ChIP on CHIP chip on chip? 44000 verschiedene Oligonukleotide je 60-nt lang (Agilent DNA chip) Isolierung von kovalenten Histon-DNA Addukten mit Antikörpern, die spezifische Histonmodifikationen erkenen. 78
Es gibt Antikörper, die spezifische kovalente Modifikationen erkennen können: Cultures were treated with formaldehyde (1%) for 30 min, and cells were collected by centrifugation, washed with ice-cold TBS, and disrupted by vortexing in lysis buffer in the presence of glass beads. The chromatin was sonicated to yield an average DNA fragment of 500 bp. The DNA fragments crosslinked to the proteins were enriched by immunoprecipitation with specific antibodies. After reversal of the crosslinks and purification, the immunoprecipitated and input DNA was labeled by ligation-mediated PCR with Cy5 and Cy3 fluorescent dyes, respectively. Both pools of labeled DNA were hybridized to a single DNA microarray (described above). Images of Cy5 and Cy3 fluorescence intensities were generated by scanning array using GenePix 5000 scanner and were analyzed with GenePix Pro 5.1 software. Experiments were carried out at least in duplicate. Anti-H3K9ac Upstate Biotechnology Anti-H3K14ac Upstate Biotechnology Anti-H4ac Upstate Biotechnology Anti-H3K4me3 Abcam ab8580 Anti-H3K4me2 Abcam ab7766 Anti-H3K4me1 Abcam ab8895 Anti-H3K36me3 Abcam ab9050 Anti-H3K79me3 Abcam ab2621 gebundene DNA: Cy5-markierte Nukleotide Cy5-dUTP Kontroll-DNA nicht immunpräzipitierte gesamt DNA (input): Cy3-markierte Nukleotide 79
Acetylierung H3K79- Trimethylierung in aktiven ORFs Verteilung durchschnittlicher Histonmodifikation im Hefegenome 80
Unterschiedliche Modifikationen in euchromatischen Bereichen reprimierte Gene: hypoacetyliert und hypomethylierte Histone Keine Nukleosomen an der Initiationsstelle der Polymerase. 2 Nukleosomen um die Initiationsstelle enthalten Hzt1(H2A.Z) statt H2A 81
Wer modifiziert wo? 82
Zusammenfassung Stunde 4 Die Bedeutung der Chromatinstruktur für die Regulation der Genexpression Die schrittweise Rekrutierung von Histonmodifizierenden Enzymen am INF-ß Lokus Die schrittweise Rekrutierung von Histonmodifizierenden Enzymen am HO- Lokus Methoden zur Analyse der Chromatinstruktur ChIP: Chromatin Immunpräzipitation erlaubt es, vorrausgestzt es gibt geeignete Antikörper, festzustellen wo in einem Chromosom welche Histonmodifikationen zu finden sind. 83