Untersuchung zur Gefriertrocknung antagonistischer Mikroorganismen

Untersuchung zur Gefriertrocknung ntgonistischer Mikroorgnismen Diplomreit im Studiengng Biotechnologie der Fchhochschule Bingen vorgelegt von An Pul Mtos d Silv Bingen, im Juni 2005

Die vorliegende Areit wurde m Institut für iologischen Pflnzenschutz der Biologischen Bundesnstlt für Lnd- und Forstwirtschft in Drmstdt ngefertigt.

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Mteril und Methoden 4 2.1 Nährmedien 4 2.2 Lösungen 5 2.3 Mikroorgnismen und Stmmhltung 6 2.4 Anzucht und Aufreitung 7 2.4.1 Strterkulturen 7 2.4.2 Fermenttion in Kolen 7 2.4.3 Aufreitung 7 2.4.3.1 Zellernte und Aufreinigung 7 2.4.3.2 Einstellung der Keimzhlkonzentrtion 7 2.4.3.3 Einstellung der Keimzhl durch Bestimmung der Asorption 8 2.5 Einfrierversuche 8 2.5.1 Proenvorereitung 8 2.5.2 Einfluss von Mgermilch uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen eim Einfrieren 9 2.5.3 Vergleich verschiedener Einfrierprozesse 9 2.5.4 Bestimmung der Leendkeimzhl 10 2.6 Gefriertrocknungsversuche 11 2.6.1 Einfluss der Stellflächentempertur 11 2.6.2 Bestimmung der Restfeuchte 11 2.6.3 Einfluss verschiedener Schutzstoffe 12 2.7 Lgerungsversuche 14 2.7.1 Einfluss des Schutzstoffes uf die Lgerstilität 14 2.7.2 Einfluss der Lngzeitlgerung 15 2.8 Biotests 15 2.8.1 Biotest mit Krtoffellättern 15 2.8.1.1 Aufreitung der P. infestns-kulturen für den Biotest 15 2.8.1.2 Aufreitung des Testisolts P. fluorescens - Pf153 16 2.8.1.3 Appliktion 16 2.8.1.4 Versuchsuswertung 18 2.8.2 Biotest mit Möhren 19 2.8.2.1 Aufreitung des Testisolts P. putid SLU5 19 2.8.2.2 Behndlung des Möhrenstguts 20 2.8.2.3 Durchführung des Biotests 20 i

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.8.2.4 Auswertung des Biotests 21 3 Ergenisse 22 3.1 Einfrierversuche 22 3.1.1 Einfluss von Mgermilch uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen eim Einfrieren 22 3.1.1.1 Vergleich verschiedener Einfrierprozesse 23 3.2 Gefriertrocknungsversuche 27 3.2.1 Einfluss der Stellflächentempertur 27 3.2.2 Einfluss verschiedener Schutzstoffe 30 3.3 Lgerungsversuche 32 3.3.1 Einfluss des Schutzstoffes uf die Lgerstilität 32 3.3.2 Einfluss der Lngzeitlgerung 37 3.4 Biotests 38 3.4.1 Biotest mit Krtoffellättern 38 3.4.2 Biotest mit Möhren 40 4 Diskussion 43 5 Zusmmenfssung 52 6 Literturverzeichnis 55 ii

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie ABBILDUNGSVERZEICHNIS Aildung 1: Mikroprozessorgesteuerter Gefriertrockner (A); Gefriertrocknungskmmer mit Stellfläche, Kondenstor, Windmühle und Temperturfühler, welche in die Proe eingercht ist (B) 10 Aildung 2: Verschließvorrichtung im Gefriertrockner (A); Lgerung der gefriergetrockneten Proen im Wsserd (B) 15 Aildung 3: Sprühppliktion der Testsustnzen 17 Aildung 4: P. infestns Befll n Krtoffellätter ei den Befllsklssen 0 4 18 Aildung 5: Krnkheitserreger von Schwrzfäule (A. rdicin) und Möhrenschwärze (A. duci) n Krotten (Messlken: 100 µm). 20 Aildung 6: Einfluss von Mgermilch uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] der Mikroorgnismen vor und nch dem Einfrieren 22 Aildung 7: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min 25 Aildung 8: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,6 12 C/sec 25 Aildung 9: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,6 0,8 C/min 26 Aildung 10: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,04 0,12 C/min 26 Aildung 11: Kurvenverluf der Produkttempertur ei einer Stellflächentempertur von 5 C 27 Aildung 12: Kurvenverluf der Produkttempertur ei einer Stellflächentempertur von 20 C 28 Aildung 13: Kurvenverluf der Produkttempertur ei einer Stellflächentempertur von 30 C 28 Aildung 14: Einfluss der Gefriertrocknung uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] der Mikroorgnismen 29 Aildung 15: Einfluss verschiedener Schutzstoffe uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] von Pseudomons fluorescens - Pf153 ei der Gefriertrocknung 31 iii

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Aildung 16: Einfluss verschiedener Schutzstoffe und Lgerungsduer uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] des gefriergetrockneten Pseudomons fluorescens CHA0 ei 40 C Lgerungstempertur 32 Aildung 17: Einfluss verschiedener Schutzstoffe und Lgerungsduer uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] des gefriergetrockneten Pseudomons chlororphis - PCL1391 ei 40 C Lgerungstempertur 33 Aildung 18: Einfluss verschiedener Schutzstoffe und Lgerungsduer uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] des gefriergetrockneten Pseudomons fluorescens - Pf153 ei 40 C Lgerungstempertur 35 Aildung 19: Einfluss verschiedener Schutzstoffe und Lgerungsduer uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] des gefriergetrockneten Pseudomons putid I112 ei 40 C Lgerungstempertur 36 Aildung 20: Lgerstilität von gefriergetrockneten Pseudomons fluorescens Pf153 ei verschiedenen Schutzstoffen 37 Aildung 21: Wirkung von frischen und gefriergetrockneten Pseudomons fluorescens Pf153 Versuchspräprten, mit Lktose* und Scchrose** ls Schutzstoffe, uf den Befll von Krtoffellättern mit Phytophthor infestns zwischen dem fünften und 10. Tg nch der Inokultion 39 Aildung 22: Befllene Möhrensprosse us infiziertem Möhrenstgut mit A. rdicin und A. duci im Biotest 41 Aildung 23: Wirkung von verschiedenen Pseudomons putid SLU5 Versuchspräprten uf den Befll von Möhrenstgut mit Alternri rdicin und Alternri duci zwnzig Tge nch der Inokultion 42 iv

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS % Prozent C Grd Celsius BBA Biologische Bundesnstlt für Lnd- und Forstwirtschft c. circ, lteinisch für ungefähr cm Centimeter DSMZ Deutsche Smmlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen g Erdeschleunigung oder Grmm (Bezug us Kontext) h Stunde Kp. Kpitel l Liter mr Millir = 0,75 Torr min Minute ml Milliliter mm Millimeter nm Nnometer Nr. Nummer ph -lg [H + ] sec Sekunde Upm Umdrehungen pro Minute w/v Gewicht pro Volumen w/w Gewicht pro Gewicht W Wtt v

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 1 Einleitung Im Vergleich zum Pflnzenschutz mit chemisch-synthetischen Mitteln gewinnt die iologische Bekämpfung von Pflnzenkrnkheiten mit mikroiellen Antgonisten immer mehr n Bedeutung. Als Ursche dfür wird die wchsende Akzeptnz dieser Mittel durch den Anwender ngesehen, er uch der Zuwchs n Kenntnissen üer die Mikroorgnismen und deren ntgonistische Beziehungen zu Schdorgnismen (Bode, 2000). Die Antgonisten eeinträchtigen die Üerleensrte oder die Pthogenität entsprechender Schdorgnismen (Heitefuss, 2000). Die uf ihr ntgonistisches Potentil untersuchten Mikroorgnismen umfssen verschiedene Gttungen Grm-negtiver und Grm-positiver Eukterien sowie Actinomyceten, Pilze und Bkteriophgen. Als Wirkungsmechnismen spielen Konkurrenz, Prsitismus, Antiiose und induzierte Resistenz eine Rolle. Sowohl in der Anzhl wie uch in der Art der Wirkungsmechnismen zeigen mikroielle Antgonisten von Pflnzenkrnkheiten Unterschiede (Koch, 1996). Von entscheidender Bedeutung für einen wirkungsvollen Schutz der Pflnzen durch Antgonisten ist deren Formulierung. Um ei der Formulierung ein wirksmes, lgerfähiges und somit nwendres Produkt zu erhlten, müssen Konservierungsverfhren so usgewählt werden, dss die Produkte estimmten Anforderungen genügen. Nch Gehrke (1991) hen getrocknete Präprte gegenüer tiefgefrorenen Präprten den entscheidenden Vorteil, dss sie uch ohne ufwendige Kühlung lgerstil sind und ihre Aktivität ehlten. Jedoch lssen sich einige Antgonisten nur schwer konservieren, wie zum Beispiel Pseudomonden, die ufgrund ihrer physiologischen Eigenschften (Grm-negtiv, keine Sporenildner) gegenüer Trocknungsverfhren empfindlich sind. Unter den verschiedenen Konservierungsverfhren ht sich die Gefriertrocknung ls die schonendste Trocknungsmethode etliert. Kirsop (1974) verglich zwei Konservierungsmethoden ei verschiedenen Hefen und untersuchte dei ihre iochemischen und morphologischen Eigenschften nch der Lgerung ei 4 C. Sie stellte fest, dss die iochemischen und die morphologischen Eigenschften der Mikroorgnismen durch die Gefriertrocknung stiler wren ls durch die Rekultivierungsmethode, in dem die Hefen lle sechs Monte neu üerimpft wurden. Mit Hilfe der Verkpselungstechnik konnten Ptel et l. (2005) zeigen, dss die Lgerfähigkeit von trocknungsempfindlichen kteriellen Antgonisten und die Wirkung eines nemtophgen Pilzes deutlich erhöht wurden. Verkpselte Zellen eines Pseudomons fluorescens BA2002 Stmms wiesen unmittelr nch der Trocknung eine Üerleensrte von 45 % zw. 17 % nch 4 Wochen Lgerung ei 20 C uf. 1

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Auch die verkpselten pilzlichen Mycel von Hirsutell rhossiliensis ewirkten eine Reduzierung von 86 % des pflnzenprsitären Nemtoden-Bestzes im Boden. Nch Berny und Henneert (1991) ist die Gefriertrocknung die geeignetste und erfolgreichste Methode zur Konservierung von Bkterien, Hefe und Pilzsporen. Lut Popescu et l. (1995) grntiert die Gefriertrocknung die Erhltung von Produkten, welche empfindlich und leicht veränderlich ei Rumtempertur sind. Sie ht gegenüer der Kryokonservierung den entscheidenden Vorteil, dss sie ds Einfrieren mit dem Dehydrieren kominiert. Wird ds Lösungs- und / oder Suspensionsmittel einer Sustnz ei tiefen Temperturen direkt us der festen in die gsförmige Phse üerführt, um die verleiende Festsustnz zu trocknen, nennt mn dieses Verfhren Gefriertrocknung oder uch Lyophilistion (Oetjen, 1997). Die Gefriertrocknung knn in drei Huptschritte unterteilt werden. Im ersten Schritt, dem Einfrieren, wird die wässrige Lösung us dem zu trocknenden Gut unter ihren eutektischen Punkt gekühlt is sie vollständig zu Eis gefriert. So entstehen im Einfrierereich erst Eiskristlle des Wssers, und die verleiende Lösung wird konzentriert, woei sich uch der ph-wert verändern knn. O die gelösten Sustnzen uskristllisieren, hängt von ihren Eigenschften, der Akühlungsgeschwindigkeit und der Endtempertur des Einfriervorgngs (Oetjen, 1997). Beim zweiten Schritt, der Trocknung, wird der Luftdruck üer dem Eis vermindert (Vkuum), wodurch ds gefrorene Wsser sulimiert und somit us dem Produkt entweicht. Die zur Sulimtion der Eiskristlle enötigte Energie wird durch Strhlung, Leitung und / oder Konvektion n ds gefrorene Produkt üertrgen. Die zugeführte Wärme wird dnn durch Leitung im Produkt n die Grenzfläche zwischen der porösen, ereits eisfreien Schicht und der noch gefrorenen Schicht trnsportiert. Der dort geildete Wsserdmpf diffundiert durch eine immer dicker werdende poröse Schicht zur Gutsoerfläche und von dort schließlich zum Kondenstor, n dem es sich im Form von Eis lgert (Gehrke, 1991). Die Nchtrocknung ist der dritte Schritt. Hier wird ds Wsser entfernt, ds mit der Festsustnz in so strker Wechselwirkung steht, dss dieses Wsser nicht mehr ls Eis kristllisiert (geundenes Wsser). Die Gefriertrocknung stellt ei geeigneter Prozessführung eine sehr schonende Trocknungsmethode dr, d sie sehr hohe Üerleensrten erzielt (Gehrke, 1991). Allerdings wird ei vielen der isher zur Gefriertrocknung von Mikroorgnismen veröffentlichen Areiten üer Zellschäden zw. Verluste der Leensfähigkeit während dieses Prozesses und ei nschließender Lgerung erichtet (Plmfeldt et l., 2003; Tsvetkov und Brnkov, 1983; Zyed und Roos, 2003). Zhlreiche Fktoren wie Akühlungsrten, Gefrierschutzmittel, physiologischer Zustnd der Zelle und 2

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Lgertmosphäre zw. tempertur können die Leensfähigkeit der Mikroorgnismen während und nch der Gefriertrocknung eeinflussen (Gehrke, 1991). Um den Einfluss einiger dieser Fktoren uf die Leensfähigkeit ntgonistischer Mikroorgnismen zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Areit versucht, den Gefriertrocknungsprozess zu optimieren, um die Üerleensfähigkeit der Mikroorgnismen nch diesem Prozess zu veressern. Besondere Bedeutung wurde dem Einfluss von verschiedenen Akühlungsrten und Stellflächentemperturen sowie dem Einfrieren mit und ohne Schutzstoff uf die Leensfähigkeit der Mikroorgnismen eigemessen. Sowohl der Zustz verschiedener Schutzstoffe eim Gefriertrocknen ls uch der Einfluss des Schutzstoffes während der Lgerung wurden in Betrcht gezogen. Des weiteren wurde die Wirksmkeit gefriergetrockneter Antgonisten uf phytopthogene Pilze untersucht. 3

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2 Mteril und Methoden 2.1 Nährmedien Zur Kultivierung der verwendeten Mikroorgnismen wurden folgende Medien eingesetzt: Hefeextrkt-Pepton-(HEP-) Medium 1,0 % (w/v) Proteose-Pepton Nr. 3 (Difco Lortories # 211693) 0,5 % (w/v) Hefeextrkt (Merck # 1.03753) 0,5 % (w/v) Ntriumchlorid (Roth # 3957.1) Mlzextrkt-Sojpepton-(MEP-) Medium 3,0 % (w/v) Mlzextrkt (Merck # 1.05391) 0,3 % (w/v) Pepton us Sojmehl (Merck # 1.07212) Nähr-Bouillon-(NB-) Medium 1,3 % (w/v) Nähr-Bouillon (Oxoid # CM1) Mlzextrkt-Sojpepton-(MEA-) Agr 3,0 % (w/v) Mlzextrkt (Merck # 1.05391) 1,5 % (w/v) Agr-Agr (700-800 Gel; Insul) 0,3 % (w/v) Pepton us Sojmehl (Merck # 1.07212) Tryptische Soj-Nährouillon-(TSA-) Agr 1,5 % (w/v) Agr-Agr (700-800 Gel; Insul) 0,3 % (w/v) Tryptische Soj-Nährouillon (Difco Lortories # 211822) Tryptische Soj-Nährouillon-(TSB-) Medium 3,0 % (w/v) Tryptische Soj-Nährouillon (Difco Lortories # 211822) Roggen-ß-Sitosterol-(R+S-) Agr 20 % (w/v) Roggen (unehndelt) 0,5 % (w/v) D(+)-Glucose-Monohydrt (Merck # 1.08342) 0,005 % (w/v) ß-Sitosterol (Fluk # 85451) 2,0 % (w/v) Agr-Agr (700-800 Gel; Insul) 4

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Alle Medien wurden in entionisiertem Wsser gelöst und ei 121 C für 20 Minuten utoklviert. Bei der Erstellung des Roggen-ß-Sitosterol-(R+S-) Agr wurde zuerst nur der Roggen in 1 Liter entionisiertem Wsser ei 121 C für 20 Minuten utoklviert. Nch der Quellung üer Ncht wurden die Körner üer zweilgigem Mull filtriert und der Üerstnd mit entionisiertem Wsser uf einen Liter ufgefüllt. Die Lösung wurde uf einen ph-wert von 6,5 eingestellt. Anschließend wurden Agr-Agr, Glucose und ß-Sitosterol dzugegeen und erneut ei 121 C für 20 Minuten utoklviert. Die mit Agr-Agr versetzten Medien wurden nch dem Akühlen uf unter 50 C in Petrischlen (Durchmesser 9 cm) gegossen. 2.2 Lösungen Für die Aufreitungsschritte wurde folgende Lösung verwendet: Phospht-Puffer - ph ei 20 C ~ 7,0 0,170 % (w/v) Kliumdihydrogenphospht - wsserfrei (Roth # 3904.2) 0,220 % (w/v) Dintriumhydrogenphospht-Dihydrt (Roth # 4984.1) in entionisiertem Wsser gelöst und ei 121 C für 20 Minuten utoklviert. 5

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.3 Mikroorgnismen und Stmmhltung Folgende, in Telle 1 ufgelistete Isolte wurden getestet: Telle 1: Getestete Isolte Isolt Nr. Spezies Herkunft Nährmedium Fest Flüssig Kultivierungszeit [h] MSK1 Metschnikowi pulcherrim Bio protect, Deutschlnd MEA MEP 48 CF10 Aureosidium pullulns Bio protect, Deutschlnd MEA MEP 48 WT Brevicillus revis Universität Aerdeen, Schottlnd TSA NB 24 4766 Xenorhdus ovienii DSMZ TSA HEP 48 PCL1391 Pseudomons chlororphis Universität Leiden, Hollnd TSA NB 24 CHA0 Pseudomons fluorescens ETH, Zürich, Schweiz TSA NB 24 Pf153 Pseudomons fluorescens ETH, Zürich, Schweiz TSA NB 24 3A Pseudomons putid Universität Aerdeen, Schottlnd TSA NB 24 1.1.31.0 Pseudomons putid BBA TSA NB 24 E183 Pseudomons putid BBA TSA NB 24 I112 Pseudomons putid BBA TSA NB 24 II79/2 Pseudomons putid BBA TSA NB 24 SLU5 Pseudomons putid BBA TSA NB 24 220 Pseudomons sp. BBA TSA NB 24 Die Mikroorgnismen wurden in Kryoröhrchen (Micronk TM, Pro-L Dignostics) ei -80 C gelgert, ei Bedrf entnommen und uf Schrägröhrchen mit verschiedenen festen Medien (s. Telle 1) usplttiert und ei 25 C im Brutschrnk inkuiert. Nch c. 3-4 Tgen wurden die Schrägkulturen im Kühlschrnk ei 5 C ufewhrt. 6

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.4 Anzucht und Aufreitung 2.4.1 Strterkulturen Für die Strterkulturen wurden 25 ml des Nährmediums in 50 ml Erlenmeyerkolen gefüllt und 20 Minuten ei 121 C utoklviert. Unter sterilen Bedingungen wurden die Kolen mit einer vollen Ösenspitze us den Röhrchen der Stmmhltung inokuliert. Anschließend wurden die Kolen für 72 Stunden ei 150 Upm und einer Tempertur von 28 C uf einem Horizontlschüttler (Novotron, INFORS, Schweiz) inkuiert. 2.4.2 Fermenttion in Kolen Sowohl für die Strter- ls uch für die Huptkulturen wurden die gleichen Nährmedien verwendet. Für die Huptkulturen wurden 250 ml Erlenmeyerkolen mit 100 ml Flüssigmedium efüllt und nschließend, wie oen eschrieen, utoklviert. Die Inokultion erfolgte durch Zuge von 1 ml der Strterkultur unter sterilen Bedingungen. Die Huptkulturen wurden je nch Kultivierungszeit (s. Telle 1) ei 150 Upm und einer Tempertur von 28 C uf einem Horizontlschüttler (Novotron, INFORS, Schweiz) inkuiert. 2.4.3 Aufreitung Bei der Aufreitung wurden folgende Schritte durchgeführt: 2.4.3.1 Zellernte und Aufreinigung Die Huptkulturen wurden nch Ende der exponentiellen Wchstumsphse, die nhnd eines Vorversuches ermittelt wurde, geerntet und ufgereinigt. Der Kulturrühe wurden jeweils 1,5 ml entnommen und in einer Lorzentrifuge (HERAEUS, Biofuge) für 5 Minuten ei 8240 g zentrifugiert. Der Üerstnd wurde verworfen und ds Pellet wurde mit je 1,5 ml Phospht-Puffer ph 7,0 resuspendiert. Dieser Vorgng wurde dreiml wiederholt. Die Suspensionen wurden is zum Weitergeruch im Kühlschrnk ei 5 C ufewhrt. 2.4.3.2 Einstellung der Keimzhlkonzentrtion Die Zählkmmer-Methode eignet sich esonders gut für größere Mikroorgnismen, wie z.b. Hefen. Mit Hilfe einer Thom-Zählkmmer wurde die Gesmtkeimzhl von Hefezellen ermittelt und durch geeignete Verdünnung eingestellt. Hierzu wurden die ufgereinigten Hefesuspensionen uf eine Konzentrtion von 10 7 Zellen pro ml mit 7

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Phospht-Puffer ph 7,0 eingestellt. Die Zählung erfolgte mit Hilfe eines Lichtmikroskops (Leitz, Dipln) ei 40fcher Vergrößerung. 2.4.3.3 Einstellung der Keimzhl durch Bestimmung der Asorption Eine indirekte Methode zur Bestimmung der Keimzhl wurde für die ufgereinigten Bkteriensuspensionen verwendet. Bei dieser Methode wird die durch die Trüung der Kultur hervorgerufene Asorption ls optische Dichte erfsst. Die Messung der optischen Dichte erfolgte mit Hilfe eines Zweistrhl-Spektrlphotometers (UVIKON, Spectrophotometer 922). Eine mit Phospht-Puffer ph 7,0 efüllte Einmlküvette (Plstirnd, Schichtdicke 10 mm, Roth) diente ei der Messung ls Kontrolle. Die resuspendierten Bkterien wurden uf eine optische Dichte von 0,95 (± 0,05) mit Phospht-Puffer ph 7,0 ei einer Wellenlänge von 595 nm eingestellt. Eine optische Dichte von 0,9 entspricht einer Keimzhl von c. 10 8 Leendzellen pro ml. 2.5 Einfrierversuche Um den Einfluss des Einfriervorgngs uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen zu untersuchen, wurden mehrere getrennte Einfrierversuche durchgeführt. Dei wurden verschiedene Akühlungsrten verglichen und ds Einfrieren in An- und Awesenheit eines Schutzstoffes nlysiert. Alle Einfrierversuche wurden zeitunhängig dreiml durchgeführt. 2.5.1 Proenvorereitung Bei llen Versuchen wurden die Mikroorgnismen frisch fermentiert und ufgereitet (s. Kp. 2.4). Um die Schutzfunktion des Schutzstoffes zu üerprüfen, wurde eine 25%-ige (w/v) Mgermilchlösung (Sliter, 1% Fettgehlt) erstellt. D sich die Mgermilchlösung schlecht utoklvieren lässt, wurde diese zweiml ei 600 W in der Mikrowelle (Bosch) kurz ufgekocht und nch dem Akühlen weiterverreitet. Unmittelr vor dem Einfrieren wurden die Mikroorgnismensuspensionen unter sterilen Bedingungen 1:1 mit der Mgermilchlösung vermischt und in utoklvierten Glsfläschchen (Rotilo, Volumen 10 ml, Durchmesser 22 mm, Roth) mit jeweils 3 ml efüllt. Zur Anlyse des Einfrierens ohne Schutzstoffe wurden die Mikroorgnismensuspensionen unter sterilen Bedingungen 1:1 mit Phospht-Puffer ph 7,0 gemischt. Als Kontrolle diente eine 1:1 gemischte Mgermilch-Phospht-Puffer- Lösung. Die Leendkeimzhl wurde vor dem Einfrieren estimmt. Die Proen wurden is zum Weitergeruch im Kühlschrnk ei 5 C ufewhrt. 8

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.5.2 Einfluss von Mgermilch uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen eim Einfrieren Um den Einfluss des Schutzstoffes uf die Üerleensrte eim Einfrieren zu nlysieren, wurden die Isolte 4766, PCL1391, Pf153 und MSK1 in An- und Awesenheit von Mgermilch ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min uf -40 C eingefroren. Die Proenvorereitung erfolgte wie unter Kpitel 2.5.1 eschrieen. Anschließend wurden die Proen im Gefrierschrnk ei -20 C üer Ncht ufewhrt und im Kühlschrnk ei 5 C für c. 2,5 Stunden ufgetut. Die Leendkeimzhl wurde vor und nch dem Einfrieren estimmt. 2.5.3 Vergleich verschiedener Einfrierprozesse In mehreren Vorversuchen wurden die verschiedenen Akühlungsrten ei Anwesenheit des Schutzstoffes festgelegt. Dzu diente ein mikroprozessorgesteuerter Gefriertrockner (VirTis, AdVntge EL utomted Version) mit vier Temperturfühlern. Die Tempertur in der Gefriertrocknungskmmer wurde gemäß dem eingegeen Progrmm üer die Stellflächentempertur gesteuert. Die Akühlungsrte v wurde us der direkt in der Proe mit einem Temperturfühler gemessenen Tempertur nch der Beziehung v = T / t erechnet. Für t wurde jeweils die Zeitspnne eingesetzt, die nötig wr, um die Proe von 5 C uf -40 C zukühlen. Die Temperturdifferenz T entsprch der Differenz zwischen der Tempertur zu Beginn des Einfriervorgnges, 5 C, und der Einfriertempertur, -40 C. Die vorgekühlten Proen (s. Kp. 2.5.1) wurden unterschiedlich schnell uf -40 C eingefroren. Die Einfriervorgänge erfolgten ei Akühlungsrten von 0,6 0,8 C/min, 0,04 0,12 C/min und 1,3 1,9 C/min. Zusätzlich wurden Proen schockgefroren. Dzu wurden die mit 3 ml Proe efüllten Glsfläschchen in einen Styroporkiste pltziert und durch ständige Zuge von flüssigem Stickstoff uf -150 C in 2,4 Minuten gekühlt. Mit Hilfe der Temperturfühler us dem Gefriertrockner wurden die Proetemperturen erfsst. Bei diesem Vorgng etrug die Akühlungsrte 0,6-12 C/sec. Nch Aschluss des Einfriervorgnges wurden die Proen im Gefrierschrnk ei -20 C üer Ncht ufewhrt. Ds Auftuen der Proen erfolgte im Kühlschrnk ei 5 C für c. 2,5 Stunden. Die Leendkeimzhl wurde vor und nch dem Einfrieren estimmt. 9

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie A B Aildung 1: Mikroprozessorgesteuerter Gefriertrockner (A); Gefriertrocknungskmmer mit Stellfläche, Kondenstor, Windmühle und Temperturfühler, welche in die Proe eingercht ist (B) 2.5.4 Bestimmung der Leendkeimzhl Die Leendkeimzhl wurde vor und nch den Versuchen mit Hilfe einer modifizierten Most-prole-numer-(MPN-) Methode estimmt. Die Most-prole-numer-(MPN-) Methode ist ein sttistisch gesichertes Verfhren, welches einen Schätzwert für die Keimkonzentrtion in einer Proe liefert. Die Mikroorgnismensuspensionen wurden mit Hilfe einer Mehrknlpipette (Eppendorf) in sterilen 96-Kvitäten-Mikrotiterpltten mit Deckel (VWR TM ) unter sterilen Bedingungen pipettiert. Insgesmt wurden 16 Verdünnungsreihen in 5-er Schritten mit entsprechendem Flüssigmedium erstellt. Die Anzhl der Wiederholungen pro Isolt etrug vier. Die Inkution erfolgte im Brutschrnk ei 25 C. Anhnd eines Vorversuches wurde ermittelt, dss nch 72 Stunden Inkution kein signifikntes Wchstum mehr vorhnden wr. Dher wurden die Proen unmittelr nch der Proeuftrgung, 0 Stunden, und nch 72 Stunden Inkution mit einem mikroprozessorgesteuerten Photometer (Tecn-Spectr) gemessen. Zuerst wurde die Pltte im Photometer für 20 Sekunden geschüttelt und nschließend ei 595 nm die optische Dichte gemessen. Mit Hilfe eines Computerprogrmms (Most Prole Numer Clcultor Version 4.04 (c) 1996 Alert J. Klee Risk Reduction Ingineering Lortory, United Sttes Environmentl Protection Agency, Cincinnti, Ohio) wurde die whrscheinlichste Keimzhl us der Zhl der ewchsenen Kvitäten uf jeder Verdünnungsreihe erechnet. Die sttistische Auswertung erfolgte mit der Softwre SAS System for Windows v9.1. Ds Zählen der ewchsenen Kvitäten us der Mikrotiterpltte erfolgte mit Hilfe von Excel. Hierei wurden die Differenz zwischen der Asorptionen ei 0 Stunden und nch 72 Stunden Inkution geildet und durch Vergleich mit einem Grenzwert die Anzhl der ewchsenen Kvitäten gezählt. Die ewchsenen Kvitäten wurden mit 10

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie einer und die nicht ewchsenen mit einer null zugeordnete. Auf diese Weise wurde je Vrinte die Anzhl der ewchsenen Kvitäten pro Verdünnungsreihe ermittelt und nschließend die whrscheinlichste Keimzhl errechnet. Signifiknte Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Vrinten wurden mit dem Student-Newmn-Keuls Test (P 0,05) der log 10 trnsformierten Dten ermittelt. Die Vrinzhomogenität wurde mit Hilfe des Levene-Tests (P > 0,1) durchgeführt. 2.6 Gefriertrocknungsversuche Bei den Gefriertrocknungsversuchen wurde der Einfluss der Stellflächentempertur und der verschiedenen Schutzstoffe uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen untersucht. Zusätzlich wurde der Feuchtegehlt des gefriergetrockneten Mterils estimmt. Die gesmten Versuche wurden zeitunhängig dreiml durchgeführt. 2.6.1 Einfluss der Stellflächentempertur Um den Einfluss der Stellflächentempertur uf die Üerleensrte der usgewählten Mikroorgnismen zu üerprüfen, wurden zeitunhängige Versuche mit den Isolten 4766, PCL1391, Pf153 und MSK1 suspendiert in einer Mgermilchlösung durchgeführt. Die Proenvorereitung erfolgte wie unter Kpitel 2.5.1 eschrieen. Pro Isolt wurden 2 Proenehälter gefriergetrocknet, die vor dem Prozess efüllt gewogen wurden. Für die gesmten Trocknungsversuche wurden die Proen gemeinsm ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min uf -40 C eingefroren und nschließend getrennt ei 0,2 mr Kmmerdruck für jeweils 18 Stunden ei 5 C, 20 C und 30 C getrocknet. Die Trocknung ei 5 C erfolgte unmittelr nch dem Einfrieren. Die restlichen gefrorenen Proen wurden im Gefrierschrnk ei -20 C ufewhrt und nch einem zw. zwei Tgen ei 20 C zw. 30 C getrocknet. Direkt nch der Trocknung wurden die Proen mit einem Deckel verschlossen und im Kühlschrnk ei 5 C ufewhrt. Mit Hilfe einer Lorwge wurden ein Teil der getrockneten Proen mit sterilem entionisierten Wsser uf ihr Anfngsgewicht resuspendiert. Der ndere Teil der Proen wurde zur Bestimmung des Feuchtgehltes verwendet. Die Leendkeimzhl wurde nch 72 Stunden Inkution mit den resuspendierten Proen vor und nch der Gefriertrocknung nch der modifizierten Most-prole-numer- (MPN-) Methode (s. Kp. 2.5.4) estimmt. 2.6.2 Bestimmung der Restfeuchte Die Restfeuchte der Proe wurde in Ahängigkeit von der Stellflächentempertur nch jedem Gefriertrocknungsprozess mit Hilfe einer Feuchtigkeitsestimmungswge (M30, Srtorius, Deutschlnd) ermittelt. Dzu wurde ein Aluminiumteller ustriert 11

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie und ds getrocknete Mteril us dem Glsfläschchen druf eingewogen. Die Proen wurden ei 90 C solnge getrocknet, is die Wge keine Gewichtsveränderung mehr registrierte. Somit wurde die prozentule Restfeuchte erfsst. 2.6.3 Einfluss verschiedener Schutzstoffe Auf ihren Schutzeffekt hin wurden 21 verschiedene Schutzstoffe in unterschiedlichen Konzentrtionen eim Gefriertrocknen der Mikroorgnismen untersucht, mit dem Ziel eine hohe Üerleensrte zu erreichen. Die zu diesem Versuch verwendeten Schutzstoffe sind in Telle 2 ufgelistet. Diese Versuche wurden mit dem Isolt P. fluorescens Pf153 durchgeführt. Für jeden Trägerstoff wurde eine sterile Stmmlösung hergestellt, welche ei 115 C für 10 Minuten utoklviert wurde. Die Eiweiß-, Eigel-, Lecithin-, lösliche Stärke- und die Mgermilch-Stmmlösung wurden zweiml ei 600 W in der Mikrowelle (Bosch) kurz ufgekocht. Unmittelr vor dem Gefriertrocknen wurde die Mikroorgnismussuspension unter sterilen Bedingungen 1:1 mit je einen Trägerstoff gemischt und in utoklvierte Glsfläschchen mit 3 ml gefüllt. Für die Untersuchung ohne Schutzstoffe wurde die Mikroorgnismussuspension 1:1 mit Phospht-Puffer ph 7,0 vermischt. Anschließend wurden die efüllten Glsfläschchen gewogen und in den Gefriertrockner gestellt. Die Proen wurden uf -40 C ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min eingefroren und ei 5 C und 0,2 mr Kmmerdruck für 18 Stunden getrocknet. Ds getrocknete Mteril wurde uf sein ursprüngliches Gewicht in sterilem und entionisiertem Wsser resuspendiert. Die Bestimmung der Leendkeimzhl nch der Gefriertrocknung erfolgte nch der modifizierten Most-prole-numer-(MPN-) Methode (s. Kp. 2.5.4) nch 72 Stunden Inkutionszeit. 12

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Telle 2: Schutzstoffe Konzentrtion der Schutzstoffe Stmmlösung [%] Aktivkohle (Merck # 2184) 10 Bentonit (Roth # 0113) 10 Croxymethylcellulose Ntriumslz (Fluk #21902) 5 Eigel 25, 100 Eiweiß 25, 100 D(+)-Glucose-Monohydrt (Merck # 1.08342) 25 Glutthion-reduziert (Merck # 1.04090.0005) 2 Glycerin (Roth # 3783.1) 25 Lktose (Edelweiss) 25 Lecithin-Grnult (Vitli GmH) 18 Lignin, lklisch (Aldrich Chemicl Compny, Inc # 47,100-3) 25 Lignin, suer (Aldrich Chemicl Compny, Inc # 47,103-8) 25 Lösliche Stärke (Difco Lortories # 0178-17-7) 25 Mgermilch (Sliter) 25 N-Algint (Roth # 9180) 5 N-Glutmt (Fluk # 49621) 25 Nähr-Bouillon (Oxoid # CM1) 25 Scchrose (Merck # 1.07651) 25 Spn60 (Fluk # 85546) + Xnthn Gummi (Roth # 3557.1) 20 + 0,18 Spn80 (Fluk # 85548) + Xnthn Gummi (Roth # 3557.1) 25 + 0,08 Xnthn Gummi (Roth # 3557.1) 0,9 13

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.7 Lgerungsversuche Um die Lgerstilität zw. um den Einfluss der Schutzstoffe uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen zu üerprüfen, wurden die gefriergetrockneten Mikroorgnismen unter unterschiedlichen Bedingungen gelgert. Die gesmten Versuche wurden zeitunhängig dreiml durchgeführt. 2.7.1 Einfluss des Schutzstoffes uf die Lgerstilität Ds Ziel dieses Versuches wr, für jene Schutzstoffe, ei denen ds Isolt Pf153 nch dem Gefriertrocknen die höchste Üerleensrte zeigte, nun uch ei hoher Lgerungstempertur die höchste Üerleensrte zu ermitteln. Die Isolte CHA0, I112, PCL1391 und Pf153 wurden für diesen Versuch usgewählt. Die Aufreitungsschritte erfolgten wie im Kpitel 2.4.3 eschrieen. Zum Gefriertrocknen wurden die Gefrierund Trocknungsedingungen gewählt, ei denen die Üerleensfähigkeit des Isoltes m höchsten wr. Alle Proen wurden in An- und Awesenheit von Schutzstoffen ei verschiedener Akühlungsrte uf -40 C eingefroren und ei 30 C und 0,2 mr Kmmerdruck für 18 Stunden getrocknet. Die Akühlungsrten etrugen 1,3 1,9 C/min ei den Isolten CHA0 und PCL1391, 0,6 0,8 C/min ei dem Isolt I112 und 0,04 0,12 C/min ei dem Isolt Pf153. Zu diesem Versuch wurden 25%-ige Glucose-, sure Lignin-, Mgermilch-, Lktose- und Scchrose-Lösungen verwendet. Die Mikroorgnismussuspension wurde unter sterilen Bedingungen 1:1 mit den Schutzstoffen vermischt und in spezielle, utoklvierte Phiolen (VirTis, Volumen 10 ml, Durchmesser 23 mm) mit 3 ml efüllt und gewogen. Für die Untersuchung ohne Schutzstoffe wurde die Mikroorgnismussuspension 1:1 mit Phospht-Puffer ph 7,0 vermischt. Die Glsfläschchen wurden mit einem seitlich perforierten Gummistöpsel versehen und in den Gefriertrockner gestellt. Nch Beendigung des Gefriertrocknungsprozesses wurden die Proen mit Hilfe einer im Gerät integrierten Verschließvorrichtung ei 0,2 mr Kmmerdruck unter Vkuum dicht verschlossen. Anschließend wurden die verschlossenen Glsfläschchen mit Prfilm versehen und im 40 C Wsserd (Köttermnn) für jeweils 1, 2, 4 und 7 Tge gelgert. Die Leendkeimzhl wurde nch der Gefriertrocknung und nch den verschiedenen Lgerungszeiten nch der modifizierten Most-prole-numer-(MPN-) Methode (s. Kp. 2.5.4) estimmt. Dzu wurden die Proen in steril entionisiertes Wsser uf ihr Anfngsgewicht resuspendiert und die Keimzhl, wie unter Kpitel 2.5.4 eschrieen, nch 72 Stunden Inkutionszeit estimmt. 14

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie A B Aildung 2: Verschließvorrichtung im Gefriertrockner (A); Lgerung der gefriergetrockneten Proen im Wsserd (B) 2.7.2 Einfluss der Lngzeitlgerung Um die Lgerstilität des gefriergetrockneten Mikroorgnismus zu ermitteln, wurde eine Lngzeitlgerung ei 25 C mit dem Isolt Pf153 durchgeführt. Als Schutzstoffe wurden nur die gewählt, ei denen ds Isolt Pf153 nch der 40 C Lgerung die höchste Üerleensrte zeigte. Hierzu wurden 25%-ige Lösungen us Mgermilch, Lktose und Scchrose 1:1 mit der Mikroorgnismussuspension vermischt und, wie unter Kpitel 2.7.1 eschrieen, gefriergetrocknet. Die Proen wurden eenflls ei 0,2 mr Kmmerdruck unter Vkuum dicht verschlossen und mit Prfilm versehen. Die Lgerung der Glsfläschchen erfolgte im Wsserd (Köttermnn) ei 25 C für jeweils 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 Wochen. Die Bestimmung der Leendkeimzhl erfolgte wie unter Kpitel 2.7.1 eschrieen. 2.8 Biotests Um den Einfluss der Gefriertrocknung uf die Wirksmkeit gefriergetrockneter Mikroorgnismen uf phytopthogene Pilze zu untersuchen, wurden Biotests mit Krtoffellättern und mit Möhrenstgut durchgeführt. 2.8.1 Biotest mit Krtoffellättern Die Wirkung des Isolts P. fluorescens Pf153 uf den Befll mit Phytophthor infestns wurde n Krtoffellättern untersucht. 2.8.1.1 Aufreitung der P. infestns-kulturen für den Biotest Die Kultivierung von P. infestns, der Krnkheitserreger der Krut- und Knollenfäule n Krtoffeln, wurde in Anlehnung n die von Fores (1997) eschrieene Methode durchgeführt. Nch c. 14 Tgen Kultivierung wurden us den ewchsenen 15

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Petrischlen (Durchmesser 9 cm) mit Hilfe eines Sklpells 1x1 cm große Agrstücke usgeschnitten, von denen je vier uf eine frische Petrischle mit R+S-Agr üerimpft wurden. Die ngeimpften Petrischlen wurden in Dunkelheit für c. 14 Tge ei 15 C inkuiert. Anschließend wurden die mit usreichend sporulierenden P. infestns Kulturen mit entionisiertem Wsser geschwemmt und die Sporngiensuspension durch zweilgigen Mull gefiltert, um Mycelreste zu entfernen. Schönhls (pers. Mitteilung) konnte nchweisen, dss die Sporngienuseute des P. infestns Isolts uf den R+S-Agr esonders hoch wr. Deswegen wurde ds Isolt uf diesem Agr kultiviert. Mit Hilfe einer Thom-Kmmer wurde die Sporngiensuspension uf eine Konzentrtion von 1 x 10 5 Sporngien pro ml mit entionisiertem Wsser eingestellt. Die Zählung erfolgte mit Hilfe eines Lichtmikroskops (Leitz, Dipln) ei 40fcher Vergrößerung. Um den Zoosporenschlupf zu induzieren, wurde die Sporngiensuspension direkt nch der Konzentrtionseinstellung für 1 Stunde unter leichtem Rühren in den Kühlschrnk ei 5 C gestellt. Der Schlupf der Zoosporen wurde mikroskopisch kontrolliert und die Sporngiensuspension unmittelr dnch für den Biotest verwendet. 2.8.1.2 Aufreitung des Testisolts P. fluorescens - Pf153 Ds Isolt Pf153 wurde frisch fermentiert und nschließend ufgereitet (s. Kp. 2.4). Die ufgereinigte Suspension wurde unter sterilen Bedingungen jeweils 1:1 mit einer 25%-igen Lktose- und Scchroselösung vermischt und gewogen. Die Gefrier- und Trocknungsedingungen sind im Kpitel 2.7.1 eschrieen. Nch Aschluss des Gefriertrocknungsprozesses wurde ds getrocknete Mteril uf sein ursprüngliches Gewicht in steril entionisiertem Wsser resuspendiert. Die nicht- und die gefriergetrockneten Proen wurden teilweise für die Bestimmung der Leendkeimzhl verwendet. Der ndere Teil wurde für die Appliktion uf die Krtoffellätter ufewhrt. Die Leendkeimzhl wurde vor und nch der Gefriertrocknung nch der modifizierten Most-prole-numer-(MPN-) Methode (s. Kp. 2.5.4) estimmt. 2.8.1.3 Appliktion Die Appliktion der Testsustnzen wurde in Anlehnung n die von Stephn et l. (2005) eschrieene Methode durchgeführt. Zuerst wurden in dicht verschließre Gerdschlen von 20 x 20 x 5 cm zwei Ppiertücher ufgelegt und mit 50 ml entionisiertem Wsser durchfeuchtet. Auf diesen efeuchteten Ppiertüchern wurde ein Drhtgitter eingelegt, 4 Krtoffellätter der Sorte Leyl ufgelegt und der Deckel ufgesetzt. Durch diesen Versuchsufu konnte eine hohe Luftfeuchtigkeit 16

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie gewährleistet werden, d P. infestns sechs Stunden Blttnässe für die Infizierung enötigt. Mit Hilfe eines Lorsprühers (s. Aildung 3) wurde zuerst die Blttunter- dnn die Blttoerseite mit jeweils 2,5 ml der zu prüfenden Sustnzen vollständig enetzt. Die getesteten Sustnzen wren eine frisch und eine gefriergetrocknete Pf153- Suspension, die jeweils 1:1 mit Lktose und Scchrose gemischt wurden. Pro Vrinte wurden drei Gerdschlen esprüht. Zu jedem Versuchsnstz wurden jeweils drei positive und drei negtive Kontrollen getestet. Als positive Kontrolle diente entionisiertes Wsser und ls negtive Kontrolle eine 0,5%-ige (w/v) Kupferklklösung (Wirkstoff: Kupferoxychlorid; Atempo, Neudorf). Nch einer Stunde Behndlung erfolgte die Inokultion der Blttoerseiten mit 2,5 ml einer P. infestns Sporngiensuspension von 1 x 10 5 Sporngien pro ml. Nch der Appliktion wurden die Gerdschlen dicht verschlossen. Die Inkution erfolgte für c. fünf Tge in einem Klimschrnk (Rurth Apprte GmH Hnnover) mit einer Tg- / Nchteleuchtung von 16 / 8 Stunden ei 15 C. Diese Versuche wurden zeitunhängig dreiml durchgeführt. Aildung 3: Sprühppliktion der Testsustnzen 17

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.8.1.4 Versuchsuswertung Die Bonitur der Krtoffellätter erfolgte m fünften is 10. Tg nch der Inokultion. Die Blätter wurden nch einer Befllsklsse von 0 is 4 (0, Kein Befll; 1, 1 10 % Befll; 2, 11 25 % Befll; 3, 26-50 %; 4, 51 100 % Befll) usgewertet (s. Aildung 4). 0 1 2 3 4 Aildung 4: P. infestns Befll n Krtoffellätter ei den Befllsklssen 0 4 Anschließend wurde der prozentule Befll pro Schle ermittelt (Jmes, 1971) und us insgesmt fünf Boniturtgen die AUDPC - Are Under the Disese Progress Curve (Krnz nd Holz, 1993) nch folgender Formel errechnet: n = 1 AUDPC i ( y + y ) i i+ 1 * 2 ( t t ) i+ 1 i mit: t = Bonitur Tg y = Prozentzhl der efllenen Blätter pro Bonitur n = Anzhl der Bonitur 18

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Die AUDPC ist ein Befllsprmeter, der us der Summe der efllenen Blttfläche zu verschiedenen Zeitpunkten erechnet wird. Der Vergleich signifiknter Unterschiede der Mittelwerte der AUDPC-Werte wurde mit dem Student-Newmn-Keuls-Test (P 0,05) ermittelt. Die sttistische Auswertung erfolgte mit der Softwre SAS System for Windows v9.1. Die Vrinzhomogenität wurde mit Hilfe des Levene-Tests (P > 0,1) durchgeführt. 2.8.2 Biotest mit Möhren Die Wirkung des Isolts Pseudomons putid SLU5 uf den Alternri - Befll von Möhrenstgut wurde untersucht. 2.8.2.1 Aufreitung des Testisolts P. putid SLU5 Um die Wirksmkeit des Isolts SLU5 uf infiziertes Möhrenstgut zu testen, wurde ds Isolt uf verschiedenen Kulturmedien ngezogen und gefriergetrocknet. Im Rhmen des Projekts STOVE (Seed tretments for orgnic vegetle production) wurde die Wirksmkeit von SLU5 Kulturen uf infiziertes Blttsltstgut untersucht. Die im TSB Medium ngezogenen SLU5 Kulturen zeigten sich sehr wirksm gegen ds mit Phom vlerinell infizierte Blttsltstgut. Aus dieser Erkenntnis erfolgte die Fermenttion ei diesem Versuch zum Teil in NB Medium (Fermenttionsedingungen und Aufreitungsschritte s. Kp. 2.4) und zum Teil in TSB Medium, woei hier keine Strterkultur verwendet wurde. Für die Kultivierung in TSB wurden 50 ml des Nährmediums in 300 ml Erlenmeyerkolen gefüllt und 20 Minuten ei 121 C utoklviert. Unter sterilen Bedingungen wurde der Kolen mit zwei vollen Ösenspitzen us den Röhrchen der Stmmhltung inokuliert. Anschließend wurde der Kolen für 48 Stunden ei 130 Upm und einer Tempertur von 25 C uf einem Horizontlschüttler (INFORS, Novotron ) inkuiert. Nur die in NB fermentierte und ufgereinigte Vrinte (s. Kp. 2.4) wurde gefriergetrocknet. Diese wurde unter sterilen Bedingungen 1:1 mit einer 25%-igen Lktoselösung gemischt und in utoklvierte Glsfläschchen mit 3 ml gefüllt. Anschließend wurden die efüllten Glsfläschchen gewogen und in den Gefriertrockner gestellt. Die Proen wurden uf -40 C ei einer Akühlungsrte von 0,04 0,12 C/min eingefroren und ei 30 C und 0,2 mr Kmmerdruck für 18 Stunden getrocknet. Ds getrocknete Mteril wurde uf sein ursprüngliches Gewicht in steril entionisiertem Wsser resuspendiert und die Leendkeimzhl vor und nch der Gefriertrocknung nch der modifizierten Most-prole-numer-(MPN-) Methode (s. Kp. 2.5.4) nch 72 Stunden Inkutionszeit estimmt. 19

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 2.8.2.2 Behndlung des Möhrenstguts Die Behndlung des ntürlicherweise mit Alternri rdicin (c. 65 % Befll) und Alternri duci (c. 25 % Befll) infizierten Möhrenstguts der Sorte Lgun F1 (Hild Smen GmH # U422.P) mit den zu testenden Vrinten erfolgte 24 Stunden vor der Ausst. Pro Vrinte wurden 100 Smen in jeweils 3 ml Flüssigkeit für 15 Minuten gerührt. Anschließend wurden die Smen durch ein Sie filtriert und ei c. 25 C Rumtempertur für 24 Stunden uf Petrischlen getrocknet. Als Vrinten dienten die in TSB und NB frisch fermentierten Huptkulturen sowie die frischen und gefriergetrockneten ufgereinigten NB Kulturen mit Lktose Zustz. Ds Stgut wurde eenso mit entionisiertem Wsser ls positive Kontrolle ehndelt. Als Vergleichsmittel diente ds Fungizid Atirm (Wirkstoff: Thirm # 1616-00 / Stähler Deutschlnd) in einer Konzentrtion von 0,75 % (w/w). Hierei wurden die Smen mit dem Fungizidpulver vermischt und im Kühlschrnk ei 5 C is zum Weitergeruch ufewhrt. A. rdicin A. duci Befllene Möhrensprosse Aildung 5: Krnkheitserreger von Schwrzfäule (A. rdicin) und Möhrenschwärze (A. duci) n Krotten (Messlken: 100 µm). Schdild (rechts): der Spross ist im oeren Teil noch grün und m Stängelgrund schwrz 2.8.2.3 Durchführung des Biotests Um ds ehndelte Stgut uszusäen, wurden 1,5 Liter Erde des Typs P (Fruhstorfer Erde ) in 28 x 18 x 7 cm großen Plstikschlen verteilt und gleichmäßig mit 500 ml Leitungswsser durchfeuchtet. Mit Hilfe einer Schlone wurden jeweils hundert ehndelte Smen in die Schlen gegeen und dnch mit c. 270 ml Vermiculit zugedeckt. Anschließend wurden die Schlen mit Leitungswsser nss esprüht und in einen ei 20-22 C klimtisierten Rum mit leicht ufgelegtem Deckel ei einer Tg- / Nchteleuchtung von 16 / 8 Stunden is zur Keimung ufewhrt. Nch c. einer 20

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Woche wurden die Schlen geöffnet und die Keimlinge weitere zwei Wochen kultiviert. Innerhl dieser Zeit wurden die Pflnzen zweiml mit jeweils 200 ml Leitungswsser nur m Schlenrnd gegossen. Pro Vrinte wurden drei Plstikschlen usgesät und zu jedem Versuchsnstz jeweils eine negtive und drei positive Kontrollen getestet. Es wurden drei zeitlich unhängige Wiederholungen durchgeführt. 2.8.2.4 Auswertung des Biotests Die Bonitur erfolgte c. 20 Tge nch der Ausst der ehndelten Smen. Hierei wurden die Anzhl der gesunden Pflnzen us den drei Wiederholungen je Vrinte innerhl eines Versuchs erfsst und die Mittelwerte geildet. Die sttistische Auswertung erfolgte mit der Softwre SAS System for Windows v9.1. Signifiknte Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Vrinten wurden mit dem Student- Newmn-Keuls Test (P 0,05) der log 10 trnsformierten Dten ermittelt. Die Vrinzhomogenität wurde mit Hilfe des Levene-Tests (P > 0,1) durchgeführt. 21

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 3 Ergenisse 3.1 Einfrierversuche 3.1.1 Einfluss von Mgermilch uf die Üerleensrte der Mikroorgnismen eim Einfrieren Der Einfluss von Mgermilch uf den Einfriervorgng wurde nhnd eines Versuches gezeigt. Dei wurden die Isolte Xenorhdus ovienii - 4766, Pseudomons chlororphis - PCL1391, Pseudomons fluorescens - Pf153 und Metschnikowi pulcherrim - MSK1 in An- und Awesenheit von Mgermilch ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min uf -40 C eingefroren. Bei den Isolten 4766, PCL1391 und Pf153 führte ds Einfrieren ohne Mgermilch zu einer Anhme der Üerleensrte. Bei dem Hefeisolt MSK1 wurde kein signifiknter Unterschied ei den verschiedenen Vrinten festgestellt. Einen Üerlick üer die Ergenisse ietet Aildung 6. Üerleensrte [MPN / ml] 10 9 10 8 10 7 10 6 10 10 Nicht gefroren mit Mgermilch Gefroren mit Mgermilch Nicht gefroren ohne Mgermilch Gefroren ohne Mgermilch 10 5 10 4 PCL1391 Pf153 MSK1 4766 Isolte Aildung 6: Einfluss von Mgermilch uf die Leensfähigkeit [MPN / ml] der Mikroorgnismen vor und nch dem Einfrieren Die Isolte wurden in An- und Awesenheit von Mgermilch ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min uf -40 C eingefroren. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen mit jeweils drei Wiederholungen n. Bei verschiedenen Buchsten innerhl eines Isoltes unterscheiden sich die log 10 trnsformierten Werte nch Anlyse mit dem Student-Newmn- Keuls - Test (P 0,05) signifiknt. 22

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 3.1.1.1 Vergleich verschiedener Einfrierprozesse Die Üerleensrte der Mikroorgnismen wurde vor und nch dem Einfrieren in Anwesenheit einer Mgermilchlösung estimmt, um festzustellen, in welchem Umfng ds Einfrieren und ds Auftuen die Üerleensfähigkeit eeinträchtigt. Die Einfriervorgänge erfolgten ei verschiedenen Akühlungsrten. Ein signifiknter Unterschied hinsichtlich der Üerleensrten vor und nch dem Einfrieren ei dem verschiedenen Akühlungsrten konnte nur ei Pseudomons putid 1.1.31.0, Xenorhdus ovienii 4766 und Aureosidium pullulns CF10 ermittelt werden. Ds Schockgefrieren wies ei llen drei Isolten niedrigere Üerleensrten im Vergleich zu den nderen Akühlungsrten uf. Der sttistische Vergleich der Leensfähigkeiten vor und nch dem Einfrieren ller nderen Isolte erg keinen signifiknten Unterschied. In Telle 3 sind die Leensfähigkeiten von llen getesteten Mikroorgnismen vor und nch dem Einfrieren in einer Mgermilchlösung ei verschiedenen Akühlungsrten drgestellt. 23

Telle 3: Einfluss der verschiedenen Einfrierprozesse uf die Leensfähigkeit [MPN/ml] der Mikroorgnismen in Anwesenheit von Mgermilch Schockgefrieren Akühlungsrte Isolt Vor Einfrieren 0,6-12 C/sec 0,6 0,8 C/min 0,04 0,12 C/min 1,3 1,9 C/min 1.1.31.0 4,58 (± 0,75)* x 10 8 (,)** 2,77 (± 0,58) x 10 8 () 1,07 (± 0,43) x 10 9 () 4,23 (± 1,33) x 10 8 (,) 8,13 (± 5,18) x 10 8 () 3A 1,50 (± 0,98) x 10 9 () 7,12 (± 4,15) x 10 8 () 9,87 (± 1,95) x 10 8 () 4,48 (± 5,48) x 10 9 () 1,47 (± 0,63) x 10 9 () E183 1,29 (± 1,12) x 10 9 () 2,08 (± 1,57) x 10 9 () 1,31 (± 1,00) x 10 9 () 1,87 (± 0,26) x 10 9 () 9,27 (± 7,35) x 10 8 () II79/2 1,51 (± 1,23) x 10 9 () 1,13 (± 0,71) x 10 9 () 1,06 (± 0,37) x 10 9 () 1,18 (± 0,45) x 10 9 () 1,09 (± 0,49) x 10 9 () SLU5 1,45 (± 1,99) x 10 9 () 8,09 (± 5,26) x 10 8 () 7,65 (± 3,33) x 10 8 () 9,55 (± 2,69) x 10 8 () 8,57 (± 2,12) x 10 8 () CHA0 6,03 (± 7,11) x 10 8 () 4,73 (± 2,12) x 10 8 () 6,32 (± 3,31) x 10 8 () 8,41 (± 4,92) x 10 8 () 1,04 (± 0,10) x 10 9 () Pf153 1,89 (± 0,93) x 10 9 () 1,20 (± 0,18) x 10 9 () 1,01 (± 1,00) x 10 9 () 2,08 (± 0,67) x 10 9 () 6,15 (± 4,29) x 10 8 () PCL1391 1,15 (± 0,62) x 10 9 () 1,03 (± 0,62) x 10 9 () 8,48 (± 5,24) x 10 8 () 9,19 (± 4,35) x 10 8 () 1,02 (± 0,06) x 10 9 () I112 1,29 (± 0,77) x 10 9 () 7,25 (± 3,75) x 10 8 () 1,90 (± 1,11) x 10 9 () 7,26 (± 3,91) x 10 8 () 9,87 (± 1,95) x 10 8 () 220 1,06 (± 0,63) x 10 9 () 9,50 (± 1,72) x 10 8 () 8,45 (± 7,14) x 10 8 () 8,62 (± 7,64) x 10 8 () 4,76 (± 2,48) x 10 8 () 4766 6,57 (± 2,14) x 10 7 () 2,24 (± 0,08) x 10 7 () 2,28 (± 0,82) x 10 7 () 2,27 (± 1,48) x 10 7 () 3,28 (± 0,58) x 10 7 (,) CF10 4,32 (± 1,93) x 10 6 (,) 1,78 (± 0,79) x 10 6 () 3,19 (± 0,46) x 10 6 (,) 4,67 (± 1,73) x 10 6 (,) 5,34 (± 2,29) x 10 6 () MSK1 6,51 (± 2,08) x 10 6 () 3,04 (± 0,40) x 10 6 () 5,15 (± 3,39) x 10 6 () 3,46 (± 0,79) x 10 6 () 5,65 (± 1,95) x 10 6 () WT 4,49 (± 3,25) x 10 5 () 1,16 (± 1,67) x 10 5 () 1,93 (± 2,71) x 10 5 () 3,08 (± 2,69) x 10 5 () 1,15 (± 1,19) x 10 6 () *Stndrdweichung des Mittelwertes von drei Wiederholungen. **Bei verschiedenen Buchsten innerhl einer Zeile unterscheiden sich die log 10 trnsformierten Werte nch Anlyse mit dem Student-Newmn-Keuls - Test (P 0,05) signifiknt. 24

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie In den Aildungen 7 is 10 sind die Aläufe der verschiedenen Einfrierprozesse drgestellt. Akühlungsrte v : 1,3-1,9 C/min 40 Produkttempertur [ C] 20 0-20 -40 y = 1,23 * x + 26,63 R = 0,980-60 0 10 20 30 40 50 60 70 Zeit [min] Aildung 7: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 1,3 1,9 C/min Ds Einfrieren erfolgte stufenweise ei folgender Geräteinstellung: 1. Stufe: 5 C, 10 Minuten ei Hold-Modus; 2. Stufe: -70 C, 50 Minuten ei Hold-Modus. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen n. Die Mittelwerte der Produkttempertur wurden durch eine Regressionsgerde ngepsst. 50 Akühlungsrte v : 0,6-12 C/sec Produkttempertur [ C] 0-50 -100-150 y = 1,40 * x + 37,74 R = 0,977-200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Zeit [sec] Aildung 8: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,6 12 C/sec Die Produkttempertur etrug m Anfng c. 25 C. Nch c. 2,4 Minuten erreichte die Produkttempertur durch Stickstoff-Zuge -150 C. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen n. Die Mittelwerte der Produkttemperturen wurden durch eine Regressionsgerde ngepsst. 25

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie Produkttempertur [ C] 30 20 10 0-10 -20-30 -40-50 Akühlungsrte v : 0,6-0,8 C/min y = 0,68 * x + 25,94 R = 0,991 0 20 40 60 80 100 Zeit [min] Aildung 9: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,6 0,8 C/min Ds Einfrieren erfolgte stufenweise ei folgender Geräteinstellung: 1. Stufe: 5 C, 20 Minuten ei Hold-Modus; 2. Stufe: -50 C, 50 Minuten ei Rmp-Modus. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen n. Die Mittelwerte der Produkttemperturen wurden durch eine Regressionsgerde ngepsst. Produkttempertur [ C] 30 20 10 0-10 -20-30 -40-50 Akühlungsrte v : 0,04-0,12 C/min (64,12 * 525,77) y = 51,93 + (525,77 + x) R = 0,989 0 200 400 600 800 1000 1200 Zeit [min] Aildung 10: Tempertur im Produkt ls Funktion der Einfrierzeit ei einer Akühlungsrte von 0,04 0,12 C/min Ds Einfrieren erfolgte stufenweise ei folgender Geräteinstellung: 1. Stufe: 5 C, 20 Minuten ei Hold-Modus; 2. Stufe: -20 C, 315 Minuten ei Rmp-Modus; 3. Stufe: -40 C, 685 Minuten ei Rmp-Modus. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen n. Die Mittelwerte der Produkttempertur wurden durch eine Regressionsgerde ngepsst. 26

FH-Bingen Studiengng Biotechnologie 3.2 Gefriertrocknungsversuche 3.2.1 Einfluss der Stellflächentempertur Der Verluf der Produkttempertur ls Funktion der Stellflächentempertur ei 5 C, 20 C und 30 C ist in den Aildungen 11 is 13 drgestellt. Um eine genuere Beziehung zwischen der Produkttempertur und der Stellflächentempertur während der Trocknung zu finden, wurden die Mittelwerte der Produkttempertur durch eine Regressionskurve mit entsprechender Regressionsgleichung ngepsst. Die 5 C Stellflächentempertur wurde nch c. 670 Minuten erreicht (Aildung 11). 10 5 C Produkttempertur [ C] 0-10 -20-30 -40 y = 27,97 R = 0,928 + ( 36,32 * x) ( 68,72 + x) -50 0 200 400 600 800 1000 Zeit [min] Aildung 11: Kurvenverluf der Produkttempertur ei einer Stellflächentempertur von 5 C Die Produkttempertur wurde us insgesmt vier Proen erfsst und etrug zu Beginn der Trocknung -40 C. Die Fehlerlken geen die Stndrdweichung des Mittelwerts von drei zeitunhängigen Versuchen n. Die Mittelwerte der Produkttempertur wurden durch eine Regressionskurve ngepsst. Nch c. 618 Minuten (Aildung 12) und nch c. 700 Minuten (Aildung 13) stellten sich die Stellflächentemperturen uf 20 C zw. 30 C ein. Beim Einsetzen einer elieigen Zeit in die Regressionsgleichung stellt mn fest, dss die Trocknung ei der 5 C Stellflächentempertur schneller ls die ei 30 C läuft. 27